Name: Unieruchomienie Caenorhabditis elegans w celu analizy transportu wewnątrzkomórkowego w neuronach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj metodę obserwacji transportu wewnątrzkomórkowego w neuronach Caenorhabditis elegans przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego in vivo. Technika umożliwia wizualizację transportu aksonalnego bez konieczności preparacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor bardzo dziękuje dr Asako Sugimoto (Uniwersytet Tohoku) za jej pomocną dyskusję. wyIs251 był hojnym darem od dr Kang Shena (Uniwersytet Stanforda). mnIs17 został dostarczony przez CGC, który jest finansowany przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). Prace te były wspierane przez granty JSPS KAKENHI #17H05010 i #16H06536 oraz fundację Daiichi Sankyo, Fundację Nauki o Mózgu i Fundację Naito.

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Wygeneruj interesujący transgeniczny szczep C. elegans przy użyciu metodologii transgenicznych18. Alternatywnie, należy zaopatrzyć się w odpowiednie szczepy w Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC). Aby zobrazować transport aksonalny prekursorów pęcherzyków synaptycznych, użyj linii transgenicznej wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3]7. Aby zaobserwować IFT, uzyskaj linię transgeniczną mnIs17 [osm-6::gfp]19. Szczepy te są używane w tym protokole. 
	UWAGA: Działa albo macierz pozachromosomalna, integracja genomowa, albo nawet GFP knock-in. Aby zredukować sygnały tła, należy stosować promotory specyficzne dla komórki, a nie promotory panneuronalne. 
	UWAGA: Opieka nad robakami jest opisana w innych protokołach20. Szczepy utrzymywano na trawnikach karmnika Escherischia coli OP50 na płytkach z pożywką dla nicieni (NGM) (1,7% (w/v) agarozy, 50 mM NaCl, 0,25% (w/v) peptonu, 1 mM CaCl2, 5 mg/ml cholesterolu, 25 mM KH2PO4, 1 mMMgSO4 na plastikowych szalkach o średnicy 60 mm) w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Hoduj robaki w temperaturze 20 °C na płytkach NGM do dowolnego etapu cyklu życia robaków. 
	UWAGA: Na każdym etapie można zaobserwować zarówno transport aksonalny, jak i IFT. Późny L4 do młodego dorosłego jest dobrą kontrolą pozytywną, ponieważ wiele publikacji wykorzystywało te etapy i wizualizowało zdarzenia związane z handlem ludźmi14,21,22,23.</li>
</ol>
2. Przygotowanie 10% agarozy
UWAGA: Wielu sprzedawców oferuje podobne produkty, takie jak agar, proszki agarowe i agaroza. Użyj agarozy klasy do elektroforezy (moc żelu >1200 g/cm2). Tanie proszki agarowe nie działają, ponieważ powstały żel nie jest wystarczająco silny, aby unieruchomić robaki.
<ol>
	<li>Wymieszaj 0,4 g agarozy w 4 ml wody destylowanej (DW) w szklanej probówce (1,5 cm x 10,5 cm). Przykryj szklaną rurkę pokrywką, aby uniknąć parowania.</li>
	<li>Umieść szklaną rurkę na bloku grzewczym o temperaturze 95 °C na 90 minut. Ponadto przygotuj kolejną szklaną rurkę (1,5 cm x 10,5 cm) wypełnioną DW i utrzymuj ją w temperaturze 95 °C. Umieść pipetę Pasteura w DW 95 °C (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1A). W probówce agarozy będzie widać dużo małych pęcherzyków, a roztwór powinien być mętny. Pozostaw to, aż roztwór stanie się klarowny. Następnie mieszać, pipetując w górę i w dół, aż roztwór agarozy stanie się jednorodny. 
	UWAGA: Kuchenki mikrofalowe nie mogą być używane do przygotowania 10% roztworu agarozy, jeśli są wykonane z DW i agarozy. Małe pęcherzyki powodowane przez mikrofale zapobiegają topnieniu agarozy. Jednak zestalony 10% żel agarozowy można łatwo ponownie stopić za pomocą kuchenki mikrofalowej. Szklane probówki zawierające 10% żelu agarozowego można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 6 miesięcy. W takim przypadku rozpuść wywar za pomocą kuchenki mikrofalowej w razie potrzeby i zacznij od kroku 3 w tym protokole. 
	UWAGA: Agaroza stopniowo traci zdolność krzepnięcia, jeśli jest inkubowana w temperaturze 95 °C przez długi czas lub po wielokrotnym krzepnięciu i stopieniu. Jeśli tak się stanie, przygotuj nowe 10% agarozy.</li>
</ol>
3. Przygotowanie podkładki agarozowej
<ol>
	<li>Używając podgrzanej pipety Pasteura przygotowanej w kroku 2.2, umieść 2 krople 10% agarozy na szkiełku o wymiarach 76 x 22 mm.</li>
	<li>Szybko przykryj drugim szkiełkiem o wymiarach 76 x 22mm2, zanim kropla agarozy zestali się, jak pokazano na Rysunek 1B, i dociśnij drugi szkiełko, aby spłaszczyć roztwór agarozy. Grubość powinna wynosić 0,5-1 mm.</li>
	<li>Szybko przepłucz pipetę Pasteura, pipetując w górę i w dół o temperaturze 95 °C, aż roztwór agarozy zostanie wypłukany. W przeciwnym razie pipeta zostanie zatkana przez żel agarozowy. Pozostaw pipetę w temperaturze DW 95 °C.</li>
	<li>Odczekaj 1 minutę. Podkładka agarozowa tworzy się i staje się mętna. Następnie rozsuń slajdy ręcznie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
</ol>
4. Montaż robaków
UWAGA: Nawet niewielkie ruchy robaków uniemożliwiają dobrą obserwację. Lewaizol był tradycyjnie stosowany w celu zapobiegania przemieszczaniu się robaków na podkładce agarozowej24,25. Jednak lewamizol hamuje receptory neuronalne u C. elegans, a zatem może wpływać na zdarzenia związane z transportem w neuronach15. Użycie opisanych tutaj mikrogranulek polistyrenowych jest dobrą alternatywą17.
<ol>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w przesuwane lustrzane oświetlenie przenieś ~30 transgenicznych robaków wyrażających odpowiednie markery na nową płytkę NGM bez bakterii za pomocą platynowego drucianego kilofa. 
	UWAGA: Szpikulec z drutu platynowego wykonany jest z drutu platynowego i pipety Pasteura (5 cali), a końcówka drutu platynowego została spłaszczona. Przygotowanie wykałaczek z drutu platynowego i obchodzenie się z robakami za ich pomocą są opisane w Wormbook (http://www.wormbook.org).</li>
	<li>Pozostaw płytkę na 1 minutę. Bakterie są automatycznie usuwane z powierzchni robaków, gdy robaki poruszają się po żelu agarozowym NGM bez bakterii.</li>
	<li>Umieść kroplę 0,5-1,0 μl 2,6% mikrogranulek polistyrenowych o średnicy 100 nm w wodzie na wacik agarowy (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1D). Przenieś 10-20 robaków z wolnej od bakterii płytki NGM do mikrogranulek. Upuść i rozłóż robaki za pomocą szpikulca z drutu platynowego, aby uniknąć nakładania się ciał robaków (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1E).</li>
	<li>Nałożyć szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 x 40 mm2 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F). Delikatnie dociśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza, ale unikaj zgniatania robaków. Próbka jest teraz gotowa do obrazowania. 
	UWAGA: Ponieważ nie podaje się znieczulenia, robaki są mocowane tylko przez siłę tarcia generowaną przez podkładkę agarową, mikrogranulki polistyrenu i szkiełko nakrywkowe17. Obecność bakterii karmiących i/lub zbyt dużo roztworu sprawi, że siła tarcia będzie słabsza. 
	UWAGA: Sprawdzają się różne rozmiary szkiełek nakrywkowych (np. 22 x 22 mm2, 18 x 18 mm2). Jednak większe szkiełka nakrywkowe mogą zapobiec przedostawaniu się wody zanurzeniowej lub oleju z soczewki obiektywu do próbek podczas obserwacji.</li>
</ol>
5. Obserwacja
UWAGA: Odpowiednie parametry obrazowania (moc lasera, wzmocnienie, binning, itp.) będą się różnić dla każdego systemu mikroskopu i kamery. W tym przypadku używany jest mikroskop szerokokątny wyposażony w skaner konfokalny z wirującym dyskiem i cyfrową kamerę CCD.
<ol>
	<li>Ustaw regulator temperatury stage na 20 °C lub ustaw temperaturę w pomieszczeniu na 20 °C.</li>
	<li>Umieść szkiełko z próbką na stoliku mikroskopu. Użyj soczewki obiektywowej 100x (przysłona numeryczna = 1,3 lub lepsza).</li>
	<li>Poszukaj obszarów wskazanych w <silna klasa="xfig">Rysunek 2A (dla wyIs251 i transportu aksonalnego) lub <silna klasa="xfig">Rysunek 2B (dla mnIs17 i IFT) jako kontrole pozytywne. Inne obszary również mogą być analizowane22.</li>
	<li>Ustaw parametry (wzmocnienie CCD = 200, binning = 1 lub 2, moc lasera przy 488 nm = 1,0-1,3 mW). Nagrywanie poklatkowe z prędkością 4 kl./s przez maksymalnie 1 min. Zapisywanie plików w formacie mutli-TIFF. 
	UWAGA: Jeśli sygnały GFP zanikną i trudno jest kontynuować obserwację GFP::RAB-3 lub OSM-6::GFP przez 30 s, moc lasera jest zbyt duża. W takim przypadku zmniejsz moc lasera. I odwrotnie, jeśli nie rejestruje się ruchu pęcherzykowego, moc lasera jest zbyt słaba. W takim przypadku zwiększ moc lasera.</li>
	<li>Obserwuj innego robaka i powtórz 5.3 i 5.4. Obserwacje mogą trwać do 20 minut, ale każdy robak powinien być zarejestrowany tylko raz, aby uniknąć skutków uszkodzeń fotograficznych. 
	UWAGA: Robaki były obserwowane przez co najmniej 20 minut bez znaczących defektów7,27,28. Dłuższa obserwacja może być możliwa, ale nie została jeszcze przetestowana. Wyraźnym znakiem śmierci neuronów jest zmiana morfologii neuronów, taka jak obrzęk neurytów. Ponieważ słabe sygnały GFP można zaobserwować w aksonach i dendrytach zarówno w wyIs251, jak i mnIs17, morfologię neurytów można łatwo sprawdzić, patrząc tylko na aksony lub dendryty. Morfologia neuronów jest pokazana w <silna klasa="xfig">Rysunek 2.</li>
	<li>Generuj pliki filmowe.
	<ol>
		<li>Otwórz plik multi-TIFF za pomocą oprogramowania Fiji. Przejdź do File>Open, a następnie wybierz plik multi-TIFF zapisany w kroku 5.4. 
		UWAGA: Fidżi można pobrać pod adresem jttps://fiji.sc. Obraz J i wtyczki mogą być również używane do generowania kimografów. W takim przypadku postępuj zgodnie z odpowiednimi instrukcjami dla wybranej wtyczki. </li>
		<li>Kliknij przycisk "Prostokątne zaznaczenie" (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A, strzałka) i wybierz interesujący obszar, rysując prostokąt za pomocą myszy komputerowej (żółty prostokąt w <silna klasa="xfig">Rysunek 3A). Przejdź do Image>Stacks>Tools>Make Substacks i wybierz numery plasterków, które są zawarte w filmie. Generowany jest stos podrzędny.</li>
		<li>Aktywuj okno stosu podrzędnego, klikając i przejdź do Image>Adjust>Brightness/Contrast. Pojawi się okno do regulacji jasności i kontrastu. W oknie przesuń górny pasek (Minimum) w prawo, aby sygnał tła zniknął, a drugi górny pasek (Maksimum) w lewo, aby poruszające się pęcherzyki i cząstki były dość dobrze widoczne na tle.</li>
		<li>Przejdź do Image>Stacks>Time Stamper. Ponieważ film jest nagrywany z szybkością 4 kl./s w kroku 5.4, interwał czasowy wynosi 0,25 s. Dlatego wpisz "0.25" w Interwałze.</li>
		<li>Wygeneruj plik filmowy, wybierając polecenie Zapisz jako>AVI z menu Plik (Film 1 i 2). 
		UWAGA: Korzystając z odpowiednich wtyczek, możesz zapisać plik w innych formatach, takich jak pliki "mpeg4" lub "mov".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie kimografów.
	<ol>
		<li>Otwórz ponownie oryginalne pliki filmowe za pomocą oprogramowania FIji i powtórz kroki 5.6.2 i 5.6.3, aby dostosować jasność i kontrast.</li>
		<li>Kliknij "linia segmentowa" (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B, strzałka). Za pomocą myszy narysuj odcinkową linię wzdłuż rzęsek lub aksonu (żółta linia, w <silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
		<li>Przejdź do Analyze>Multi Kymograph>Multi Kymograph (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). Pojawi się okno szerokości linii (Rysunek 3D). Wpisz "3" w oknie Linewidth (Szerokość linii) i kliknij przycisk OK (Rysunek 3D).</li>
		<li>Zostanie utworzone okno Kymograph. Zapisz obraz w formacie TIFF lub JPEG.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+in+neurons%3A+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function%2C+development%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).</li>
<li>Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules%2C+axonal+transport%2C+and+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Microtubules, axonal transport, and neuropathy.</a> N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).</li>
<li>Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversity+of+axonemal+dyneins+as+studied+in+Chlamydomonas+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants.</a> Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).</li>
<li>Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+motors+in+cilia%3A+moving+along+the+cell%27s+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna.</a> J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).</li>
<li>Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).</li>
<li>Ishikawa, H., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliogenesis%3A+building+the+cell%27s+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ciliogenesis: building the cell's antenna.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).</li>
<li>Niwa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoinhibition+of+a+Neuronal+Kinesin+UNC-104%2FKIF1A+Regulates+the+Size+and+Density+of+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses.</a> Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).</li>
<li>Snow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).</li>
<li>Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+coordination+of+intraflagellar+transport+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional coordination of intraflagellar transport motors.</a> Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).</li>
<li>Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF26A+is+an+unconventional+kinesin+and+regulates+GDNF-Ret+signaling+in+enteric+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development.</a> Cell. 139 (4), 802-813 (2009).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charcot-Marie-Tooth+disease+type+2A+caused+by+mutation+in+a+microtubule+motor+KIF1Bbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta.</a> Cell. 105 (5), 587-597 (2001).</li>
<li>Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF1Bbeta-+and+KIF1A-mediated+axonal+transport+of+presynaptic+regulator+Rab3+occurs+in+a+GTP-dependent+manner+through+DENN%2FMADD%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD.</a> Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).</li>
<li>Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+motor%2C+KIF13A%2C+controls+anxiety+by+transporting+the+serotonin+type+1A+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor.</a> Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).</li>
<li>Klassen, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arf-like+small+G+protein%2C+ARL-8%2C+promotes+the+axonal+transport+of+presynaptic+cargoes+by+suppressing+vesicle+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation.</a> Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).</li>
<li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+microfluidic+devices+for+in+vivo+imaging+of+C.+elegans%2C+Drosophila+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Chai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cellular+dynamics+during+Caenorhabditis+elegans+postembryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li>
<li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS One. 8 (1), 53419(2013).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), (2008).</li>
<li>Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+osm-6%2C+a+gene+that+affects+sensory+cilium+structure+and+sensory+neuron+function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nephronophthisis-related+gene+ift-139+is+required+for+ciliogenesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Sci Rep. 6, 31544(2016).</li>
<li>Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+neuron-wide+analysis+of+synaptic+vesicle+precursor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking.</a> Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).</li>
<li>Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+balance+between+capture+and+dissociation+of+presynaptic+proteins+controls+the+spatial+distribution+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses.</a> Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).</li>
<li>Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+dendritic+transport+and+the+AP-1+mu1+clathrin+adaptor+UNC-101+localize+odorant+receptors+to+olfactory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia.</a> Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).</li>
<li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).</li>
<li>Kumar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104%2FKIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6 (11), 1001200(2010).</li>
<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vesicle+protein+SAM-4+regulates+the+processivity+of+synaptic+vesicle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport.</a> PLoS Genet. 10 (10), 1004644(2014).</li>
<li>Blacque, O. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WD+repeat-containing+protein+IFTA-1+is+required+for+retrograde+intraflagellar+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport.</a> Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).</li>
<li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modulation+of+IFT+kinesins+extends+the+sensory+repertoire+of+ciliated+neurons+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mScarlet%3A+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li>
<li>Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differentiation+of+cooperating+kinesin-2+motors+orchestrates+cargo+import+and+transport+in+C.+elegans+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia.</a> Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).</li>
<li>Robison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detyrosinated+microtubules+buckle+and+bear+load+in+contracting+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes.</a> Science. 352 (6284), 0659(2016).</li>
<li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Ograniczenia w stosunku do istniejących metod Opisana tutaj metoda jest zoptymalizowana pod kątem obserwacji szybkich zdarzeń, takich jak transport aksonalny i IFT. W związku z tym unieruchomienie jest bardziej priorytetowe niż dłuższa inkubacja. Chociaż byliśmy w stanie obserwować zdarzenia związane z handlem przez co najmniej 20 minut bez znaczących zakłóceń, ta metoda może nie zawsze być odpowiednia do obserwowania powolnych zdarzeń wymagających dłuższych obserwacji, takich jak wydłużenie aksonów...

Obrazowanie żywych komórek jest niezbędnym narzędziem do analizy transportu wewnątrzkomórkowego. W biologii komórki neuronalnej analizy transportu aksonalnego z obrazowaniem żywych komórek są niezbędne do zrozumienia funkcji neuronów i morfogenezy1. Zaburzenia transportu aksonalnego leżą u podstaw kilku zaburzeń neurodegeneracyjnych2. Białka nadrodziny kinezyny i dyneina przeprowadzają transport aksonalny odpowiednio w przód i w tył1,2.
Rzęski to kolejny przedział komórkowy, w którym sieć mikrotubul i maszyneria transportowa są bardzo rozwinięte3. Maszyneria syntezy białek nie jest zlokalizowana w rzęskach, co oznacza, że białka rzęskowe muszą być transportowane z cytoplazmy do końcówek rzęsek. Kinezyna i dyneina specyficzne dla rzęsek, zwane odpowiednio kinezyną-2 i cytoplazmatyczną dyneiną-2, transportują składniki rzęsek4, w zjawisku zwanym transportem wewnątrzrzęskowym (IFT)5. Upośledzenie IFT powoduje spektrum chorób zwanych ciliopatiami6. W związku z tym analiza mechanizmu IFT za pomocą obrazowania żywych komórek jest wymagana do zrozumienia podstawowych mechanizmów tworzenia i patogenezy rzęsek.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest dobrym modelem do badania transportu aksonalnego i IFT7,8,9. Do obserwacji IFT, Chlamydomonas jest szeroko stosowany jako organizm modelowy5,6. Ponieważ Chlamydomonas jest organizmem jednokomórkowym, związek IFT ze starzeniem się, funkcjonowaniem neuronów i zachowaniem byłby trudny do przeanalizowania. Ponadto podstawowe techniki genetyczne, takie jak CRISPR/Cas9, nie zostały zastosowane do Chlamydomonas. W organizmach modelowych o wyższym poziomie, takich jak myszy i Drosophila, zakłócenie transportu aksonalnego i IFT często powoduje fenotypy letalne, ponieważ transport aksonalny i IFT są niezbędne dla morfogenezy i homeostazy zwierząt 10,11. W przypadku myszy hodowla komórkowa i transfekcja są zazwyczaj potrzebne do obserwacji transportu aksonalnego i IFT, co wymaga wielu umiejętności i dużo czasu12,13. Ponadto wiele ważnych kontekstów fizjologicznych może zostać utraconych w hodowanych komórkach i liniach komórkowych. Ponieważ układ nerwowy nie jest niezbędny do przetrwania robaków, mutanty C. elegans, u których transport aksonalny lub IFT są zakłócone, często nie są śmiertelne7,9,14. Transport aksonalny i IFT można bezpośrednio obserwować in vivo bez preparacji, ponieważ C. elegans jest przezroczysty i dlatego łatwo jest zaobserwować markery znakowane GFP.
Istnieje kilka protokołów do unieruchamiania C. elegans, takich jak użycie urządzenia mikroprzepływowego15, podkładki agarozowe ze znieczuleniem16, lub mikrogranulki17. Włączenie znieczulenia może zahamować zdarzenia związane z transportem w neuronach15. Wyraźną wadą metody mikroprzepływowej jest to, że przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego nie zawsze jest łatwe. Zamiast tego unieruchomienie za pomocą opuszków agarozowych i mikrogranulek jest wygodnym i łatwym sposobem wykonywania obrazowania poklatkowego u C. elegans. Tutaj opisuję ten podstawowy protokół unieruchamiania C. elegans i wizualizacji transportu aksonalnego i IFT in vivo u C. elegans. W porównaniu z innymi metodami, opisana tutaj metoda nie wymaga specjalnego sprzętu i jest znacznie tańsza i łatwiejsza do wykonania.

<table><tbody><tr><td>Szkło przesuwne (76&nbsp; x 26 mm)</td><td>Matsunami</td><td>S1111</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe (22&nbsp; x 40 mm)</td><td>Matsunami</td><td>C024401</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Wako</td><td>318-01195</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokulki polistylenowe 0,1 mikrona</td><td>Polysciences</td><td>#00876</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>TAITEC</td><td>0063288-000</td><td>Mikroskop CTU-mini</td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop szerokokątny</td> <td>Olympus</td><td>IX-71</td></tr><tr><td>Skaner z wirującym dyskiem</td><td>Skaner konfokalny z wirującym dyskiem</td> <td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td>&nbsp;</tr><tr><td>Cyfrowa kamera CCD</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C10600-10B</td><td>ORCA-R2 degitalna kamera CCD</td></tr><tr><td>Obiektyw obiektywu (x100, NA1.4)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 100XO</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura (5 cali)</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P</td><td></td></tr><tr><td>Szklana rurka (średnica 1,5 cm x 10,5 cm)</td><td>IWAKI</td><td>9820TST15-105NP</td><td></td></tr><tr><td>TV9211: wyIs251</td><td>Laboratorium Kang Shen</td><td></td><td></td>Nie</tr> dotyczy <tr><td>OTL11: mnIs17</td><td>Ref. 27, 29</td><td>N/A</td><td>SP2101 został skrzyżowany wstecznie z typem dzikim 6 razy</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Carl Zeiss</td><td>435064-9000-000</td><td>STEMI 508&nbsp;</td></tr><tr><td>Jednostka transluminacji lustra</td><td>Carl Zeiss</td><td>435425-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>drut platynowy (0,2 mm)</td><td>Nilaco Corporation</td><td>m78483501</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa miska 60 mm</td><td>Falcon</td><td>#351007</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td></td></tr> https://fiji.sc/ <tr><td>pożywka dla nicieni (NGM)&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>1,7% (w/v) agaroza, 50mM NaCl, 0,25% (w/v) pepton, 1 mM CaCl2, 5 mg/ml cholesterolu, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4&nbsp;</td></tr></tbody></table>

unieruchomienie caenorhabditis elegans w celu analizy transportu wewnątrzkomórkowego w neuronach

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Transport aksonalny i transport wewnątrzwiciowy (IFT) są niezbędne dla morfogenezy i funkcji aksonów i rzęsek. Białka nadrodziny kinezyny i dyneina to silniki molekularne, które regulują odpowiednio transport następczy i wsteczny. Silniki te wykorzystują sieci mikrotubul jako szyny. Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest potężnym organizmem modelowym do badania transportu aksonalnego i IFT in vivo. W tym miejscu opisuję protokół obserwacji transportu aksonalnego i IFT u żyjących C. elegans. Przewożony ładunek można wizualizować poprzez znakowanie białek ładunku za pomocą białek fluorescencyjnych, takich jak białko zielonej fluorescencji (GFP). C. elegans jest przezroczysty, a białka ładunkowe znakowane GFP mogą ulegać ekspresji w określonych komórkach pod promotorami specyficznymi dla komórki. Żywe robaki można utrwalić za pomocą mikrogranulek na 10% żelu agarozowym bez zabijania lub znieczulania robaków. W tych warunkach ruch ładunku można bezpośrednio zaobserwować w aksonach i rzęskach żyjących C. elegans bez sekcji. Metodę tę można zastosować do obserwacji dowolnej cząsteczki ładunku w dowolnych komórkach poprzez modyfikację docelowych białek i/lub komórek, w których ulegają one ekspresji. Większość podstawowych białek, takich jak silniki molekularne i białka adaptorowe, które biorą udział w transporcie aksonalnym i IFT, jest konserwatywna w C. elegans. W porównaniu z innymi organizmami modelowymi, mutanty mogą być łatwiej pozyskiwane i utrzymywane u C. elegans. Połączenie tej metody z różnymi mutantami C. elegans może wyjaśnić mechanizmy molekularne transportu aksonalnego i IFT.

Transport aksonalny w neuronie DA9 
Wykorzystując linię wyIs251 , można jednocześnie rejestrować anterogradny i retrogradny transport aksonalny GFP::RAB-3 w motoneuronie DA9. Średnia prędkość transportu anterogradnego i retrogradnego w proksymalnym grzbietowym aksonie neuronu DA9 wynosi odpowiednio około 1,8 i 2,6 μm/s22. Liczba poruszających się pęcherzyków wynosi około 0,03 i 0,018 na μm aksonu na s. Zatem podczas 30 s obserwacji 10 ...

Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest dobrym modelem do badania transportu aksonalnego i wewnątrzkomórkowego. W tym miejscu opisuję protokół rejestracji i analizy in vivo transportu aksonalnego i wewnątrzwiciowego u C. elegans.

Unieruchomienie Caenorhabditis elegans w celu analizy transportu wewnątrzkomórkowego w neuronach

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Ogólnym celem tego nagrania poklatkowego jest obserwacja zdarzeń transportu wewnątrzkomórkowego w neuronach Caenorhabditis elegans. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, takie jak transport aksonalny i transport międzywiciowy. Główną zaletą tej techniki jest to, że można zaobserwować transport wewnątrzkomórkowy u C.Elegans bez preparacji. Rozpocznij ten eksperyment od wyhodowania transgenicznego szczepu C.elegans w wieku 20 lat

immobilization-caenorhabditis-elegans-to-analyze-intracellular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowano proste urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania in vivo bez użycia środków znieczulających dla C. elegans, nienaruszonych larw Drosophila oraz larw rybek danio. Urządzenie wykorzystuje odkształcalną membranę z PDMS do unieruchomienia tych organizmów modelowych w celu wykonania obrazowania poklatkowego licznych procesów, takich jak bicie serca, podział komórkowy i podkomórkowy transport neuronalny. Prezentujemy zastosowanie tego urządzenia i pokazujemy przykłady różnych typów danych...

Proste urządzenia mikrofluidyczne do in vivo Obrazowanie C. elegans, Muszka owocówka oraz danio pręgowany

Źródło: Doser, R., et al. Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo subkomórkowego strumienia wapnia w neuronach brzusznego rdzenia nerwowego transgenicznych szczepów Caenorhabditis elegans. Stosowane są dwa różne wskaźniki wapnia: wskaźnik cytoplazmatyczny w jednym szczepie i wskaźnik mitochondrialny w innym. Neurony obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu monitorowania zmian intensywności fluorescencji w...

Obrazowanie subkomórkowej dynamiki wapnia w neuronach Caenorhabditis elegans

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Obrazowanie zachowania i aktywności neuronalnej w długich skalach czasowych bez unieruchomienia zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do zrozumienia zachowania. Obrazowanie komór mikroprzepływowych z agarozą (AMI) może być wykorzystywane do obrazowania aktywności i zachowania neuronów na wszystkich etapach życia Caenorhabditis elegans.

Mikrokomory agarozowe do długoterminowego obrazowania wapnia Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

Ta metoda umożliwia połączenie optogenetyki i genetycznie kodowanych czujników wapnia do obrazowania wyjściowego poziomu cytozolowego wapnia i zmian w wywołanych przejściowych stanach wapnia w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego C. elegans.

Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Artykuł opisuje optymalizację parametrów akwizycji mikroskopii fluorescencyjnej w celu wizualizacji aksonalnego transportu endogennych znakowanych ładunków w rozdzielczości pojedynczego neuronu u żywego nicienia.

Optymalizacja wizualizacji transportu aksonalnego ładunków endogennych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej u żywych Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę obserwacji transportu wewnątrzkomórkowego w neuronach Caenorhabditis elegans przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego in vivo. Technika umożliwia wizualizację transportu aksonalnego bez konieczności preparacji.

Unieruchomienie Caenorhabditis elegans w celu analizy transportu wewnątrzkomórkowego w neuronach

Przeglądaj więcej filmów