Name: Mysi model chirurgii ortopedycznej do badania pooperacyjnych dysfunkcji poznawczych i regeneracji tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj model chirurgii ortopedycznej u myszy do badania neurozapalenia i dysfunkcji poznawczych pooperacyjnych. Metoda obejmuje parabiozę młodych i starych osobników oraz złamanie kości piszczelowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Kathy Gage, BS (Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center, Durham, NC) za pomoc redakcyjną. NT dziękuje za wsparcie z grantu DREAM Innovation Grant od Duke Anesthesiology i NIH/NIA R01 AG057525-01.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz zatwierdzone przez Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Duke'a.
1. Zwierzęta doświadczalne
<ol>
	<li>Trzymaj myszy w klimatyzowanym środowisku z 12-godzinnymi cyklami światła/ciemności i odpowiednim dostępem do standardowego jedzenia i wody. Nie więcej niż 5 rodzeństwa z miotu w klatce i unikaj warunków, które mogłyby zachęcać do walki.</li>
	<li>Użyj samic myszy C57BL6/J w wieku 3 miesięcy (młode) lub 18 miesięcy (stare).</li>
	<li>W przypadku parabiozy aklimatyzuj 2 myszy razem przez co najmniej dwa tygodnie przed zabiegiem. Myszy są albo typu dzikiego C57BL6/J, albo eGFP+.</li>
	<li>Codziennie sprawdzaj stan ciała i ogólny wygląd myszy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie przedoperacyjne do parabiozy i chirurgii ortopedycznej
<ol>
	<li>Zważ 2 myszy.</li>
	<li>Znieczulenie ogólne należy podawać za pomocą systemu anestezjologicznego przy stałym natężeniu przepływuO2 wynoszącym 0,2 l/min. Do indukcji w komorze indukcyjnej należy użyć 5% izofluranu. 
	UWAGA: Głębokość znieczulenia można potwierdzić za pomocą uszczypnięcia palca u nogi.</li>
	<li>Umieść myszy na podgrzewanej podkładce w pozycji leżącej. Użyj sondy doodbytniczej, aby monitorować temperaturę ciała przez cały zabieg chirurgiczny.</li>
	<li>Aby utrzymać znieczulenie, należy obniżyć stężenie izofluranu wdychanego do 2,0% w ciągu 0,2 l/min przez maskę na twarz. Monitoruj, aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia.</li>
	<li>Monitoruj parametry fizjologiczne (częstość oddechów, saturację tlenem i bicie serca) nieinwazyjnie za pomocą pulsoksymetru (opcjonalnie).</li>
</ol>
3. Chirurgia parabiozy (Protokół 1A)
<ol>
	<li>Analgezję należy podawać (buprenorfina, SR/o powolnym uwalnianiu, 0,1 mg/kg podskórnie) po indukcji i przed manipulacją chirurgiczną. Wstrzyknąć bupiwakainę (0,25%) w boki tuż przed otwarciem. Zastosuj lubrykant do oczu. 
	UWAGA: Protokół parabiozy może być wykonany niezależnie od złamania kości piszczelowej.</li>
	<li>Do wszystkich wewnętrznych szyć ciała należy używać materiału do szycia z polidioksanonu 4-0. Do wszystkich szyć zewnętrznych należy używać materiału do szycia polipropylenowego 4-0.</li>
	<li>Ogol każdą z 2 myszy wzdłuż ciągłej linii od łokcia, boku i kolana po stronie, która ma być połączona. Dezynfekuj jodem + 70% alkoholowym peelingiem do skóry w 3 naprzemiennych cyklach w ramach przygotowań do nacięcia. 
	Używaj narzędzi sterylizowanych w autoklawie i utrzymuj sterylne pole. 
	UWAGA: Umieść mysz typu dzikiego po prawej stronie myszy eGFP i przygotuj lewą flankę myszy typu dzikiego oraz prawą flankę myszy eGFP do operacji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Na każdej myszy użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie skóry wzdłuż boku, rozciągając się od proksymalnego kolana do tylko proksymalnego łokcia i bez naruszania mięśni pod skórą.</li>
	<li>Połącz triceps zwierząt za pomocą 2 przerwanych szwów.</li>
	<li>Połącz ściany ciała wzdłuż boków za pomocą biegnącego, ciągłego szwu składającego się z 7-9 przejść.</li>
	<li>Połącz mięsień czworogłowy uda zwierzęcia za pomocą 2 przerwanych szwów.</li>
	<li>Zamknij skórę 2 parabiontów za pomocą przerwanych szwów.</li>
	<li>Pozwól myszom obudzić się w otaczającym powietrzu.</li>
	<li>Aby zapewnić powodzenie tego protokołu, zdrowie par musi być utrzymane: monitoruj pary codziennie, wykonuj ocenę kondycji ciała dwa razy w tygodniu i waż pary dwa razy w tygodniu><.
	UWAGA: Każda para jest przechowywana indywidualnie. 
	UWAGA: Jeśli używasz zwykłej buprenorfiny (tj. Nie SR/o powolnym uwalnianiu), podawaj 0,1 mg/kg podskórnie w 1 ml soli fizjologicznej na mysz dwa razy dziennie przez 3 dni.</li>
	<li>Odczekaj 4 tygodnie rekonwalescencji, aby zapewnić wspólne krążenie między parabiontami podczas wykonywania operacji złamania kości piszczelowej.</li>
</ol>
4. Operacja złamania kości piszczelowej (Protokół 1B)
<ol>
	<li>Analgezję (buprenorfina, 0,1 mg/kg mc. podskórnie) należy podawać po indukcji i przed manipulacją chirurgiczną. Wstrzyknąć bupiwakainę (0,25%) w miejsce operowane proksymalnie do kolana tuż przed otwarciem. Nałóż smar do oczu. </li>
	<li>Ogol przyśrodkową część prawej tylnej kończyny myszy, aby odsłonić obszar chirurgiczny, i zdezynfekuj jodem + 70% alkoholowym peelingiem skóry w 3 naprzemiennych cyklach. Utrzymuj sterylne pole operacyjne przez cały czas trwania zabiegu. Aby ograniczyć zanieczyszczenie; używać autoklawowanych narzędzi i rękawiczek; przeprowadzić operację pod mikroskopem preparacyjnym (opcjonalnie); i używaj poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała. 
	UWAGA: Jeśli protokół jest wykonywany na parabiontach, tylko 1 mysz jest złamana w parze (prawa kość piszczelowa prawej myszy). Zobacz Rysunek 1B dla schematycznego schematu złamania na parabiontach.</li>
	<li>Użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie skóry wzdłuż przyśrodkowej części prawej kończyny tylnej proksymalnie do kolana w dół do środkowej części kości piszczelowej po prawej stronie.</li>
	<li>Odsłoń środkową część kości piszczelowej i wizualnie zlokalizuj trzon. Zegnij kolano i uwidocznij płaskowyż piszczelowy, używając więzadła rzepkowo-udowego jako punktu orientacyjnego.</li>
	<li>Wizualizacja ścięgna rzepki; ręcznie wywierć, tocząc kciukiem i palcem wskazującym otwór o średnicy 0,5 mm w kanale śródszpikowym za pomocą igły o rozmiarze 25. 
	UWAGA: Wywiercony otwór będzie przebiegał równolegle wzdłuż kości piszczelowej, przez płaskowyż piszczelowy.</li>
	<li>Włóż szpilkę ze stali nierdzewnej o średnicy 0,38 mm przez otwór na około 15 mm do jamy szpikowej, aż poczujesz opór, i przetnij równo z płaskowyżem kości piszczelowej za pomocą przecinaka do drutu (patrz film uzupełniający 1, aby zapoznać się z rekonstrukcją 3D).</li>
	<li>Za pomocą prostych nożyczek Bonn złam trzon środkowy kości piszczelowej (trzon). Zobacz Rysunek 1C dla schematycznego schematu złamania.</li>
	<li>Obserwuj wzrokowo miejsce złamania i sąsiednie tkanki, aby sprawdzić, czy wzrok złamania jest stabilny.</li>
	<li>Zamknij zszywkami skórnymi.</li>
	<li>Umieść myszy na podgrzewanych podkładkach, aby się zregenerowały, zanim włożysz je do czystej klatki domowej. Wstrzyknąć podskórnie 1 ml podgrzanej (37 °C) soli fizjologicznej w celu uzupełnienia płynów.</li>
	<li>Codziennie sprawdzaj myszy pod kątem oznak kulawizny, infekcji lub krwawienia. 
	UWAGA: W przypadku stosowania zwykłej buprenorfiny (tj. Nie SR/o powolnym uwalnianiu) należy podawać 0,1 mg/kg podskórnie w 1 ml soli fizjologicznej dziennie przez 3 dni.</li>
</ol>

<ol><li>Terrando, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perioperative+cognitive+decline+in+the+aging+population%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clin+Proc%22%5BJournal%5D)">Perioperative cognitive decline in the aging population.</a> Mayo Clin Proc. 86 (9), 885-893 (2011).</li>
<li>Lord, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+systemic+immune+response+to+trauma%3A+an+overview+of+pathophysiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">The systemic immune response to trauma: an overview of pathophysiology and treatment.</a> Lancet. 384 (9952), 1455-1465 (2014).</li>
<li>Inouye, S. K., Westendorp, R. G., Saczynski, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delirium+in+elderly+people%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Delirium in elderly people.</a> Lancet. 383 (9920), 911-922 (2014).</li>
<li>Han, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delirium+in+the+emergency+department%3A+an+independent+predictor+of+death+within+6+months%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Emerg+Med%22%5BJournal%5D)">Delirium in the emergency department: an independent predictor of death within 6 months.</a> Ann Emerg Med. 56 (3), 244-252 (2010).</li>
<li>Marcantonio, E. R., Flacker, J. M., Wright, R. J., Resnick, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+delirium+after+hip+fracture%3A+a+randomized+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Geriatr+Soc%22%5BJournal%5D)">Reducing delirium after hip fracture: a randomized trial.</a> J Am Geriatr Soc. 49 (5), 516-522 (2001).</li>
<li>Cibelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+interleukin-1beta+in+postoperative+cognitive+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction.</a> Ann Neurol. 68 (3), 360-368 (2010).</li>
<li>Terrando, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+triggers+a+cytokine+cascade+yielding+postoperative+cognitive+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha triggers a cytokine cascade yielding postoperative cognitive decline.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20518-20522 (2010).</li>
<li>Harry, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+healing+of+open+tibial+fractures+covered+with+either+muscle+or+fasciocutaneous+tissue+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of the healing of open tibial fractures covered with either muscle or fasciocutaneous tissue in a murine model.</a> J Orthop Res. 26 (9), 1238-1244 (2008).</li>
<li>Hirsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perioperative+cerebrospinal+fluid+and+plasma+inflammatory+markers+after+orthopedic+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Perioperative cerebrospinal fluid and plasma inflammatory markers after orthopedic surgery.</a> J Neuroinflammation. 13 (1), 211(2016).</li>
<li>Neerland, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+Between+Delirium+and+Preoperative+Cerebrospinal+Fluid+C-Reactive+Protein%2C+Interleukin-6%2C+and+Interleukin-6+Receptor+in+Individuals+with+Acute+Hip+Fracture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Geriatr+Soc%22%5BJournal%5D)">Associations Between Delirium and Preoperative Cerebrospinal Fluid C-Reactive Protein, Interleukin-6, and Interleukin-6 Receptor in Individuals with Acute Hip Fracture.</a> J Am Geriatr Soc. 64 (7), 1456-1463 (2016).</li>
<li>Terrando, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspirin-triggered+resolvin+D1+prevents+surgery-induced+cognitive+decline%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Aspirin-triggered resolvin D1 prevents surgery-induced cognitive decline.</a> FASEB J. 27 (9), 3564-3571 (2013).</li>
<li>Baht, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+a+youthful+circulaton+rejuvenates+bone+repair+through+modulation+of+beta-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Exposure to a youthful circulaton rejuvenates bone repair through modulation of beta-catenin.</a> Nat Commun. 6, 7131(2015).</li>
<li>Brack, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Wnt+signaling+during+aging+alters+muscle+stem+cell+fate+and+increases+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and increases fibrosis.</a> Science. 317 (5839), 807-810 (2007).</li>
<li>Villeda, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ageing+systemic+milieu+negatively+regulates+neurogenesis+and+cognitive+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function.</a> Nature. 477 (7362), 90(2011).</li>
<li>Terrando, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+postoperative+neuroinflammation+and+cognitive+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Resolving postoperative neuroinflammation and cognitive decline.</a> Ann Neurol. 70 (6), 986-995 (2011).</li>
<li>Terrando, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+the+alpha7+Nicotinic+Acetylcholine+Receptor+Protects+against+Neuroinflammation+after+Tibia+Fracture+and+Endotoxemia+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Stimulation of the alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor Protects against Neuroinflammation after Tibia Fracture and Endotoxemia in Mice.</a> Mol Med. 20 (1), 667-675 (2015).</li>
<li>Vacas, S., Degos, V., Tracey, K. J., Maze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-mobility+group+box+1+protein+initiates+postoperative+cognitive+decline+by+engaging+bone+marrow-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">High-mobility group box 1 protein initiates postoperative cognitive decline by engaging bone marrow-derived macrophages.</a> Anesthesiology. 120 (5), 1160-1167 (2014).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+mitochondrial+DAMPs+cause+inflammatory+responses+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury.</a> Nature. 464 (7285), 104-107 (2010).</li>
<li>Degos, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+bone+marrow-derived+macrophages+perturbs+the+innate+immune+response+to+surgery+and+reduces+postoperative+memory+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Depletion of bone marrow-derived macrophages perturbs the innate immune response to surgery and reduces postoperative memory dysfunction.</a> Anesthesiology. 118 (3), 527-536 (2013).</li>
<li>Zhang, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthopedic+surgery+modulates+neuropeptides+and+BDNF+expression+at+the+spinal+and+hippocampal+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Orthopedic surgery modulates neuropeptides and BDNF expression at the spinal and hippocampal levels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (43), E6686-E6695 (2016).</li>
<li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A8+contributes+to+postoperative+cognitive+dysfunction+in+mice+undergoing+tibial+fracture+surgery+by+activating+the+TLR4%2FMyD88+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">S100A8 contributes to postoperative cognitive dysfunction in mice undergoing tibial fracture surgery by activating the TLR4/MyD88 pathway.</a> Brain Behav Immun. 44, 221-234 (2015).</li>
<li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+mediate+postoperative+hippocampal+inflammation+and+cognitive+decline+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Microglia mediate postoperative hippocampal inflammation and cognitive decline in mice.</a> JCI Insight. 2 (7), e91229(2017).</li>
<li>Lugo, J. N., Smith, G. D., Holley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+fear+conditioning+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Trace fear conditioning in mice.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Kamran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parabiosis+in+mice%3A+a+detailed+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Parabiosis in mice: a detailed protocol.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li>
<li>Ning, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgicallyinduced+mouse+models+in+the+study+of+bone+regeneration%3A+Current+models+and+future+directions+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Surgicallyinduced mouse models in the study of bone regeneration: Current models and future directions (Review).</a> Mol Med Rep. 15 (3), 1017-1023 (2017).</li>
<li>Giannoudis, P. V., Einhorn, T. A., Marsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture+healing%3A+the+diamond+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Fracture healing: the diamond concept.</a> Injury. 38, Suppl 4. S3-S6 (2007).</li>
<li>Zwingenberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+femoral+critical-size+bone+defect+model+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice.</a> J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).</li>
<li>Yang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+prosthesis+failure+for+the+long-term+study+of+aseptic+loosening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Murine model of prosthesis failure for the long-term study of aseptic loosening.</a> J Orthop Res. 25 (5), 603-611 (2007).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+osteoprotegerin+gene+modification+on+wear+debris-induced+osteolysis+in+a+murine+model+of+knee+prosthesis+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of osteoprotegerin gene modification on wear debris-induced osteolysis in a murine model of knee prosthesis failure.</a> Biomaterials. 30 (30), 6102-6108 (2009).</li>
<li>AGS/NIA Delirium Conference Writing Group, Planning Committee and Faculty. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+American+Geriatrics+Society%2FNational+Institute+on+Aging+Bedside-to-Bench+Conference%3A+Research+Agenda+on+Delirium+in+Older+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Geriatr+Soc%22%5BJournal%5D)">The American Geriatrics Society/National Institute on Aging Bedside-to-Bench Conference: Research Agenda on Delirium in Older Adults.</a> J Am Geriatr Soc. 63 (5), 843-852 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deferoxamine+regulates+neuroinflammation+and+iron+homeostasis+in+a+mouse+model+of+postoperative+cognitive+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Deferoxamine regulates neuroinflammation and iron homeostasis in a mouse model of postoperative cognitive dysfunction.</a> J Neuroinflammation. 13 (1), 268(2016).</li>
<li>Tang, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+murine+Alzheimer+pathogenesis+and+behavior+by+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Modulation of murine Alzheimer pathogenesis and behavior by surgery.</a> Ann Surg. 257 (3), 439-448 (2013).</li>
<li>Ren, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgery+plus+anesthesia+induces+loss+of+attention+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Surgery plus anesthesia induces loss of attention in mice.</a> Front Cell Neurosci. 9, 346(2015).</li>
<li>Fan, D., Li, J., Zheng, B., Hua, L., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriched+Environment+Attenuates+Surgery-Induced+Impairment+of+Learning%2C+Memory%2C+and+Neurogenesis+Possibly+by+Preserving+BDNF+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Enriched Environment Attenuates Surgery-Induced Impairment of Learning, Memory, and Neurogenesis Possibly by Preserving BDNF Expression.</a> Mol Neurobiol. 53 (1), 344-354 (2016).</li>
<li>Rosczyk, H. A., Sparkman, N. L., Johnson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+and+cognitive+function+in+aged+mice+following+minor+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation and cognitive function in aged mice following minor surgery.</a> Exp Gerontol. 43 (9), 840-846 (2008).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+incision-induced+nociception+causes+cognitive+impairment+and+reduction+in+synaptic+NMDA+receptor+2B+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Surgical incision-induced nociception causes cognitive impairment and reduction in synaptic NMDA receptor 2B in mice.</a> J Neurosci. 33 (45), 17737-17748 (2013).</li>
<li>Villeda, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ageing+systemic+milieu+negatively+regulates+neurogenesis+and+cognitive+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function.</a> Nature. 477 (7362), 90-94 (2011).</li>
<li>Villeda, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Young+blood+reverses+age-related+impairments+in+cognitive+function+and+synaptic+plasticity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice.</a> Nat Med. 20 (6), 659-663 (2014).</li>
<li>Smith, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta2-microglobulin+is+a+systemic+pro-aging+factor+that+impairs+cognitive+function+and+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">beta2-microglobulin is a systemic pro-aging factor that impairs cognitive function and neurogenesis.</a> Nat Med. 21 (8), 932-937 (2015).</li>
<li>Katsimpardi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+and+neurogenic+rejuvenation+of+the+aging+mouse+brain+by+young+systemic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors.</a> Science. 344 (6184), 630-634 (2014).</li>
<li>Sinha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+systemic+GDF11+levels+reverses+age-related+dysfunction+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Restoring systemic GDF11 levels reverses age-related dysfunction in mouse skeletal muscle.</a> Science. 344 (6184), 649-652 (2014).</li>
<li>Castellano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+plasma+proteins+revitalize+hippocampal+function+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord plasma proteins revitalize hippocampal function in aged mice.</a> Nature. 544 (7651), 488-492 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Złamania są powszechnym problemem klinicznym i pozostają główną przyczyną zachorowalności, szczególnie w szybko rosnącej populacji seniorów. W tym miejscu wprowadzamy protokół krok po kroku dla mysiego modelu złamania kości piszczelowej w celu zbadania mechanizmów odpowiedzialnych za pooperacyjne zapalenie nerwów i upośledzenie funkcji poznawczych. Model ten można połączyć z chirurgią parabiozy w celu zbadania interakcji neuroimmunologicznych, regeneracji tkanek i innych procesów sygnalizacyjnych. Zrozumienie tych mechanizmów pozwoli na określenie celów strategicznych w celu zminimalizowania ryzyka powikłań pooperacyjnych i optymalizacji wyników.
Opracowano kilka modeli ortopedycznych do badania naprawy kości u gryzoni25. Przyjęliśmy i zmodyfikowaliśmy tę procedurę złamania kości piszczelowej, pierwotnie opisaną przez Harry'ego i wsp.8, w celu zbadania wpływu chirurgii ortopedycznej na funkcjonowanie mózgu. Wykorzystaliśmy również ten model złamania w połączeniu z naszym modelem parabiozy, aby zbadać czynniki odpowiedzialne za gojenie się kości i regenerację tkanek w zależności od wieku. Wykonywana w znieczuleniu ogólnym w lotnym znieczuleniu ogólnym, ta procedura złamania kości piszczelowej wymaga tylko około 15 minut na zwierzę, powoduje zerową lub minimalną śmiertelność (w zależności od wieku myszy i podstawowej podatności genetycznej) i podsumowuje typowe urazy związane ze złamaniem kości długiej i ortopedycznym urazem chirurgicznym. W związku z tym model ten jest idealny do badania szlaków biologicznych i przeprowadzania ocen podłużnych. Jednak bardzo ważne jest, aby osteotomia i szpilkowanie były powtarzalne, a uszkodzenia tkanek miękkich były spójne. Uszkodzenie tkanek miękkich można modulować, na przykład poprzez zdzieranie okostnej i szczypanie otaczających mięśni, aby operacja była bardziej traumatyczna. Modele złamań urazowych wywołanych nieutrwalonym urazem lub zgięciem trzypunktowym nie zapewniłyby takiej spójności i dokładności. Zabiegi te często prowadzą do ponownego urazu, co prowadzi do przedłużonej reakcji zapalnej. I odwrotnie, modele złamań polegających na sztywnym unieruchomieniu mają bardziej umiarkowany stan zapalny, który nie oddaje w pełni uszkodzeń związanych z chirurgią ortopedyczną26,27.
Inne modele wykorzystujące pinowanie ze stopu tytanu zostały opracowane w celu ścisłego naśladowania ludzkiej endoprotezoplastyki i mogą być bardziej istotne w badaniu niestabilności protezy, osteolizy i powikłań związanych z protezą u myszy28,29. Modele z otworami wiertniczymi, takie jak ten przedstawiony tutaj, zapewniają odpowiednią stabilizację, a myszy mogą być testowane w paradygmatach behawioralnych bez znaczących deficytów, które mogłyby zakłócić takie zadania, jak warunkowanie strachu lub testowanie lokomocji/lęku w otwartym polu 6,7,11,15,19,20 . Jednak deformacje rotacyjne mogą wystąpić, jeśli fiksacja nie jest prawidłowo zablokowana. Niektóre modele wykorzystują zewnętrzny stabilizator, który zapewnia doskonałą stabilizację, ale jest trudny do wdrożenia w kości piszczelowej myszy, chociaż można go z powodzeniem zaimplementować w kości udowej myszy27.
Upośledzenie funkcji poznawczych, w tym majaczenie i pooperacyjne dysfunkcje poznawcze, są częstymi powikłaniami po operacjach ortopedycznych w celu naprawy złamań, zwłaszcza u pacjentów w podeszłym wieku i słabych30. Ten klinicznie istotny mysi model operacji złamania kości piszczelowej pokazuje, że pooperacyjne ogólnoustrojowe uwalnianie cytokin 6,7,17, upośledzona funkcja bariery krew-mózg15,19 i zmieniona morfologia mikrogleju16,22 przyczyniają się do upośledzenia pamięci i mogą stanowić krytyczne cechy pooperacyjnych powikłań neurologicznych obserwowanych u wielu pacjentów po ortopedii chirurgia. Należy zauważyć, że inne procedury chirurgiczne zostały wykorzystane do modelowania pooperacyjnej dysfunkcji poznawczej u myszy. Należą do nich chirurgia jamy brzusznej 31,32,33 i chirurgii naczyniowej34, a także urazy powierzchowne 35,36. Technika parabiozy ma zastosowanie do wszystkich tych modeli, które mają podobne punkty końcowe, w tym stan zapalny, aktywację glejową i deficyty behawioralne, w których mogą pośredniczyć wspólne mechanizmy.
Badania, które obejmują parabiozę, ujawniły nowe role czynników krążących, które mogą wpływać na funkcje poznawcze, zapalenie nerwów i odmładzanie tkanek u starszych zwierząt 37,38,39,40,41,42. Wykazaliśmy, że parabiozę można z powodzeniem połączyć z opisanym tutaj modelem złamania kości piszczelowej w celu zbadania szlaków regeneracyjnych i zbadania mechanizmów obejmujących czynniki przenoszone przez krew, które wpływają na gojenie i naprawę złamań12. Tutaj wykazaliśmy, że zdolność do naprawy złamań u starszego zwierzęcia może zostać odmłodzona, gdy starzejące się zwierzę zostanie zespolene z młodym zwierzęciem. To odwrócenie wieku było zakorzenione w wszczepieniu komórek krwiotwórczych w miejscu złamania. Co ciekawe, takie odmłodzenie można również osiągnąć poprzez przeszczepienie młodego szpiku kostnego starszym myszom. W związku z tym przeszczep szpiku kostnego można uznać za bardziej bezpośrednie i prostsze alternatywne podejście do parabiozy. Jednak parabioza jest bardziej solidnym modelem do badania funkcji krążących komórek i czynników. Oczekujemy, że połączenie modeli parabiozy i chirurgii ortopedycznej odegra ważną rolę w udzielaniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące opieki okołooperacyjnej i biologii starzenia się.
Podsumowując, wprowadzamy protokół krok po kroku dla mysiego modelu złamania piszczeli w celu zbadania mechanizmów odpowiedzialnych za pooperacyjne zapalenie nerwów i upośledzenie funkcji poznawczych po ortopedycznych zabiegach chirurgicznych. Model ten można połączyć z procedurą parabiozy w celu zbadania interakcji neuroimmunologicznych, regeneracji tkanek i innych szlaków. Zdefiniowanie tych mechanizmów zapewni strategiczne cele w celu zminimalizowania ryzyka powikłań pooperacyjnych i optymalizacji wyników.

Chirurgia przekształciła system opieki zdrowotnej i nieustannie przyczynia się do rozwoju technologii, poprawy bezpieczeństwa i utrzymania jakości życia. Niestety, operacja wywołuje również reakcje patofizjologiczne, które mogą prowadzić do powikłań pooperacyjnych, w tym infekcji ran, zaburzeń neurologicznych, a nawet śmiertelności, szczególnie u pacjentów w podeszłym wieku1,2. Chirurgia ortopedyczna jest wykonywana rutynowo, zwłaszcza u osób starszych, w celu poprawy jakości życia i naprawy typowych urazów kości. Jednak nawet 50% pacjentów po operacjach ortopedycznych w wieku 65 lat i starszych doświadcza zaburzeń neurologicznych, takich jak majaczenie pooperacyjne. To konsekwentnie koreluje ze złym rokowaniem, tj. 5-krotnym wzrostem ryzyka śmiertelności po 6 miesiącach, utrzymującym się pogorszeniem funkcjonalnym, wydłużeniem czasu opieki nad pacjentem, wydłużeniem czasu pobytu w szpitalu i wyższymi wskaźnikami umieszczania w domach opieki3,4,5. Zidentyfikowano pewne czynniki ryzyka, w tym zaawansowany wiek, ale niewiele wiadomo na temat mechanizmów odpowiedzialnych za zaburzenia neurologiczne po operacji.
Ponieważ złamania są bardzo częste u osób starszych, stworzyliśmy mysi model złamania kości piszczelowej, aby określić wpływ urazów obwodowych na powrót do zdrowia po operacji, w tym zapalenie nerwów i zdrowie mózgu (funkcje poznawcze)6,7. Model ten, pierwotnie opisany przez Harry'ego i wsp.8, składa się z śródszpikowego unieruchomienia i złamania piszczeli w znieczuleniu ogólnym i analgezji, a tym samym naśladuje uraz skóry, uraz mięśni i naprawę kości związane z powszechnymi złamaniami i naprawą kości długich u ludzi. Po tej procedurze myszy wykazują zmiany w markerach stanu zapalnego podobne do zmian obserwowanych u ludzi9,10, a także aktywację mikrogleju w hipokampie, co jest związane z deficytami pamięci deklaratywnej i neuroplastycznością hipokampa6,7,11. Wcześniej połączyliśmy ten model złamania z parabiozą. Parabioza to model chirurgiczny, w którym 2 myszy są zespolene, a tym samym mają wspólny układ krążenia. Model ten przyniósł przełom w zrozumieniu regulacyjnego wpływu krążących komórek i czynników humoralnych na funkcjonowanie narządów w kontekście wieku i choroby12,13,14. Korzystając z tego podejścia, niedawno odkryliśmy czynniki ogólnoustrojowe związane z gojeniem się złamań w zależności od wieku12.
Tutaj wprowadzamy protokół, który łączy model złamania kości piszczelowej z parabiozą, aby badać mechanizmy zależne od wieku od kości do mózgu, które są istotne dla medycyny regeneracyjnej i neuroimmunologii. Protokół 1A opisuje procedurę parabiozy, a Protokół 1B szczegółowo opisuje procedurę złamania kości piszczelowej (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A). Mogą one być wykonywane niezależnie lub w połączeniu, w zależności od charakteru przesłuchania.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NDC 66794-017-25</td><td>Można również stosować inne środki lotne lub znieczulenie iniekcyjne</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals</td><td>NDC 12496-6757-1</td><td>Opcjonalnie i w zależności od indywidualnych zaleceń Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td>70% roztwór do leczenia antyseptycznego skóra i oczyszczanie</td></tr><tr><td>10% powidon Jod</td><td>Dynarex</td><td></td><td>Do antyseptycznego leczenia skóry</td></tr><tr><td>SomnoSuite</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td>Low Flow&nbsp; System anestezjologiczny</td></tr><tr><td>MouseSTAT</td><td>Kent Scientific</td><td>PS1161</td><td>Pulsoksymetr i Golarka do monitora pracy serca</td></tr><tr><td></td><td>Wahl</td><td>9854L</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela - #11</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Adson</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>11006-12</td><td>Potrzebne do usuwania okostnej</td></tr><tr><td>tęczówki Kleszcze</td><td>Precyzyjne narzędzia naukowe</td><td>11066-07</td><td>Przydatne (zęby 1x2) do powodowania miejscowego urazu mięśni/tkanek miękkich</td></tr><tr><td>Nożyczki Bonn (proste)</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>14084-08</td><td>Dobre do osteotomii, należy pamiętać, aby regularnie zmieniać, gdy staje się</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki</td><td>Precyzyjne narzędzia naukowe</td><td>14058-09</td><td>Ostre nożyczki do przecinania szwów</td></tr><tr><td>22G x 3,5 In Quincke&nbsp; Igła rdzeniowa</td><td>BD</td><td>405181</td><td>Użyj wewnętrznego pręta do przypinania</td></tr><tr><td>Uchwyty igieł</td><td>Precyzyjne narzędzia naukowe</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Wygląd</td><td>szwu</td><td>1079B</td><td></td></tr><tr><td>C57BL6/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>&nbsp; nr katalogowy 000664</td><td></td></tr><tr><td>eGFP+ (wszechobecna ekspresja wzmocnionego białka zielonej fluorescencji)</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>&nbsp; Nr magazynowy 003291</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model chirurgii ortopedycznej do badania pooperacyjnych dysfunkcji poznawczych i regeneracji tkanek

A Mouse Model of Orthopedic Surgery to Study Postoperative Cognitive Dysfunction and Tissue Regeneration

Chirurgia jest powszechnie stosowana w celu poprawy i utrzymania jakości życia. Niestety, u wrażliwych pacjentów, takich jak osoby starsze, mogą wystąpić powikłania i znacznie pogorszyć wynik. Rzeczywiście, po rutynowej operacji ortopedycznej w celu naprawy złamania aż 50% starszych pacjentów cierpi na powikłania neurologiczne, takie jak majaczenie. Ponadto zdolność do gojenia i regeneracji tkanek po operacji zmniejsza się wraz z wiekiem i może wpływać na jakość naprawy złamań, a nawet integracji kostnej implantów. W związku z tym lepsze zrozumienie mechanizmów, które napędzają te zależne od wieku zmiany, może zapewnić strategiczne cele w celu zminimalizowania ryzyka takich powikłań i optymalizacji wyników. W tym miejscu przedstawiamy klinicznie istotny mysi model złamania kości piszczelowej. Zmiany pooperacyjne u tych myszy naśladują niektóre z zaburzeń poznawczych powszechnie obserwowanych po rutynowych operacjach ortopedycznych u ludzi. Krótko mówiąc, nacięcie wykonuje się w prawej kończynie tylnej w ściśle aseptycznych warunkach. Mięśnie są rozłączone, a szpilka ze stali nierdzewnej o średnicy 0,38 mm jest wkładana do górnego grzebienia kości piszczelowej, wewnątrz kanału śródszpikowego. Następnie wykonywana jest osteotomia, a rana jest zszywana. Wykorzystaliśmy ten model do zbadania wpływu urazu chirurgicznego na pooperacyjne zapalenie nerwów i zmiany w zachowaniu. Stosując ten model złamania w połączeniu z parabiozą, modelem chirurgicznym, w którym 2 myszy są zespolene, zbadaliśmy komórki i wydzielane czynniki, które ogólnoustrojowo odmładzają funkcję narządów i regenerację tkanek po urazie. Postępując zgodnie z naszym protokołem krok po kroku, modele te mogą być odtwarzane z dużą wiernością i mogą być przystosowane do badania wielu szlaków biologicznych, które zostały zmienione przez uraz chirurgiczny.

Po starannym wykonaniu osteotomii poprzecznych w warunkach sterylnych, przy stabilnym wprowadzeniu pinów i prawidłowym założeniu szwów, u myszy nie stwierdzono objawów kulawizny, infekcji ani krwawienia w lewej kończynie po operacji. Gojenie ortopedyczne oceniano za pomocą analizy radiologicznej oraz histomorfometrii po barwieniu Safranin-O (Rysunek 2). Zdjęcia rentgenowskie złamań w połowie trzonu kości piszczelowej wykazały większe odkładanie tkanki w kostninach młodych myszy niż w kostninach myszy starszych. Kostniny złamań poddano dekalcyfikacji i zatopiono w parafinie w celu przygotowania do analizy histologicznej. Przekroje zabarwiono Safranin-O, a ilość odłożonej tkanki określono za pomocą analizy histomorfometrycznej. Kostniny złamań u młodych myszy zawierały więcej tkanki kostnej i mniej tkanki włóknistej niż kostniny u myszy starszych.
Złamanie kości piszczelowej indukuje stan zapalny systemowy i ośrodkowy6,7,11,15,16. Rzeczywiście, obwodowe poziomy cytokin prozapalnych oraz wzorców molekularnych związanych z niebezpieczeństwem (DAMPs) gwałtownie wzrastają po operacjach ortopedycznych, zarówno u myszy, jak i u ludzi7,17,18. Przyczynia się to do aktywacji komórek mikrogleju w mózgu poprzez kilka mechanizmów sygnalizacyjnych obejmujących szlaki humoralne, komórkowe i neuronalne7,15,19,20,21. Po operacji dysfunkcja śródbłonka, otwieranie bariery krew-mózg oraz infiltracja obwodowych makrofagów przyczyniają się do ostrego neurozapalenia hipokampa u dorosłych myszy typu dzikiego oraz Ccr2RFP/+ Cx3cr1GFP/+15,19, a zjawiska te wiązano z późniejszymi deficytami pamięci przypominającymi ludzkie majaczenie oraz pooperacyjne zaburzenia poznawcze15,19,22. Odpowiedź neurozapalna ta jest nasilona u zwierząt w starszym wieku, co objawia się znacznymi zmianami w morfologii mikrogleju, wykrytymi za pomocą immunobarwienia IBA-1 (Rycina 3).
Wykorzystując opisany tutaj model złamania kości piszczelowej, stwierdziliśmy również przejściowe upośledzenie neurogenezy w hipokampie, o czym świadczyło zmniejszenie intensywności barwienia immunohistochemicznego na doublecortin (DCX) w zakręcie zębatym20. Pomiary elektrofizjologiczne długotrwałego wzmocnienia synaptycznego (LTP), będącego wskaźnikiem funkcji pamięci, ujawniły zależne od czasu zaburzenie neuroplastyczności po operacji11. Myszy po zabiegu wykazują również upośledzenie funkcji pamięci zależnej od hipokampa, co można zaobserwować np. podczas behawioralnej oceny warunkowania lękowego (Rycina 4). W warunkowaniu lękowym myszy są umieszczane w komorze i poddawane działaniu sygnału dźwiękowego, po którym następuje bodziec awersyjny (i.e. wstrząs stopy). Trzy dni po operacji piszczeli myszy są testowane w komorze warunkującej, tym razem bez żadnej stymulacji dźwiękowej lub awersyjnej, a zachowanie zamierania (freezing) jest rejestrowane jako wskaźnik pamięci (szczegółowy protokół opisano w23).
Zaawansowany wiek jest krytycznym czynnikiem ryzyka w zakresie pogorszenia pamięci. Jednak wraz z wiekiem zmniejsza się również zdolność do naprawy i regeneracji tkanek, choć mechanizmy te pozostają słabo poznane. W związku z tym wykorzystaliśmy opisane tutaj protokoły do przeprowadzenia parabiozy heterochronicznej (łączenia zwierząt młodych i starych) i oceniliśmy gojenie złamań u starych myszy (szczegółowy protokół parabiozy znajduje się w 24). Potwierdzono współdzielenie krwi między parami parabiontów, które okazało się równomierne12. Ekspozycja na krążenie młodych osobników przyspieszyła naprawę kości, prowadząc do wcześniejszego zrostu, zwiększonego odkładania tkanki kostnej i zmniejszenia włóknienia (Rysunek 5)12. Ta odmłodzenie regeneracji kości nastąpiło niezależnie od endogennych osteoblastów dodatnich pod względem osteokalcyny (Rysunek 5, brązowe komórki), lecz opierało się na komórkach dodatnich pod względem CD45, które migrowały z młodego parabionta (Rysunek 5, niebieskie komórki). Wyniki te wskazują, że hematopoetyczne komórki dodatnie pod względem CD45 wydzielają młodą i zdrową niszę, która jest w stanie sygnalizować do starych komórek osteoblastycznych, indukując ich większą aktywność.
<img alt="Schemat operacji parabiozy przedstawiający protokoły złamania kości piszczelowej w modelu mysim; układ eksperymentalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczna reprezentacja operacji parabiozy i złamania kości piszczelowej. (A) Harmonogram przeprowadzania parabiozy i złamania kości piszczelowej (protokół 1A) lub samego złamania kości piszczelowej (protokół 1B). (B) Kości piszczelowe 20-miesięcznych myszy w izochronicznych lub heterochronicznych parach parabiotycznych zostały złamane (złamanie prawej nogi prawej myszy, oznaczone znakiem X). Myszy szare reprezentują myszy typu dzikiego, natomiast myszy zielone reprezentują myszy eGFP. (C) Schemat modelu złamania kości piszczelowej z gwoździowaniem śródszpikowym i złamaniem w połowie trzonu. Zobacz także Wideo uzupełniające 1 w celu obejrzenia rekonstrukcji 3D kończyny tylnej i gwoździowania kości piszczelowej. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza tkanki kostnej związana z wiekiem: schematy przedstawiające porównanie kości, chrząstki i tkanki włóknistej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Gojenie złamań kości piszczelowej w modelach młodych i starych myszy. Wykonano złamania kości piszczelowych u młodych lub starych myszy, a kostniny złamań badano 21 dni po urazie. (A) Do oceny kostnin 21 dni po złamaniu wykorzystano obrazowanie radiologiczne oraz barwienie histologiczne (Safranin-O). Barwienie wykazuje tkanki kolagenowe w kolorze niebieskim, a proteoglikany (zawarte w chrząstce) w kolorze czerwonym. Linie przerywane wskazują przybliżoną lokalizację kostniny. (B) Do oceny ilości kości, chrząstki i tkanki włóknistej odłożonej w kostninie 21 dni po złamaniu zastosowano histomorfometrię. Dane przedstawiono jako średnia ± 95% przedziały ufności, *P&lt;0.05, istotność statystyczna (jednoczynnikowa ANOVA, test Dunnetta), paski skali reprezentują 2 mm, a obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu z obiektywem 1,25x. n = 9 dla każdej próbki. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ekspresja IBA-1 w komórkach mikrogleju; obrazy immunofluorescencyjne; grupa kontrolna (sham), młode, stare; złamanie kości piszczelowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Zabieg chirurgiczny indukuje zależną od wieku aktywację mikrogleju w hipokampie. Zabieg złamania kości piszczelowej indukuje silniejszą neuroinflamację hipokampa u myszy starych (20-miesięcznych) w porównaniu do 4-miesięcznych myszy C57BL6/J. Barwienie przekrojów mózgu markerem mikrogleju IBA-1 wykazuje więcej komórek pozytywnych oraz zmiany morfologiczne w grupach operowanych 24 h po zabiegu. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przy powiększeniu 100x.; pasek skali reprezentuje 10 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ekspresja DCX/DAPI w hipokampie, wykres nachylenia fEPSP, wykres słupkowy % zamrożenia; badanie złamania kości piszczelowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Zaburzenia neurogenezy, długotrwałego wzmocnienia synaptycznego oraz funkcji pamięci po operacji złamania kości piszczelowej. (A) DCX, ilościowy marker neurogenezy, jest znacząco zredukowany w zakręcie zębatym hipokampa 24 h po operacji. Obrazy uzyskano za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego z obiektywem o powiększeniu 10x; pasek skali reprezentuje 10 µm. (B) Elektrofizjologia w skrawkach hipokampa od myszy kontrolnych lub 24 h po operacji. Długotrwałe wzmocnienie synaptyczne (LTP) indukowano za pomocą stymulacji wysoką częstotliwością (HFS) i rejestrowano przez 1 h. Polowe pobudzeniowe potencjały postsynaptyczne (fEPSPs) rejestrowano z stratum radiatum obszaru CA1, używając pipety do rejestracji zewnątrzkomórkowej wypełnionej standardowym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. 24 h po operacji indukcja LTP jest wyraźnie zredukowana w porównaniu z myszami kontrolnymi. Dane przedstawiono jako średnia ± s.e.m. n = 3, * p &lt; 0.05 ANOVA jednoczynnikowa. (C) Funkcja pamięci zależna od hipokampa (zdefiniowana jako % zamrożenia w teście warunkowania lękowego typu trace fear conditioning) jest zaburzona u myszy po operacji w porównaniu z grupą kontrolną oraz zwierzętami poddanymi jedynie znieczuleniu. Dane przedstawiono jako średnia ± s.e.m. n = 9-10, * p &lt; 0.05 ANOVA jednoczynnikowa. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza kości: (a) obrazy rentgenowskie, (b) fluorescencyjne barwienie komórek, (c) przekrój histologiczny z barwieniem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Operacja parabiozy prowadzi do odmłodzenia procesu gojenia złamań, wymiany krwi oraz przylgnięcia komórek dawcy. Utworzono pary w modelu parabiozy izochronicznej i heterochronicznej, a następnie u starszych myszy z każdej pary wywołano złamanie i oceniono proces gojenia kości.A) Kostniny złamań zbadano przy użyciu obrazowania radiologicznego. Linie przerywane wskazują przybliżoną lokalizację kostniny złamania. (BZakwaterowanie komórek eGFP+ zostało potwierdzone w szpiku kostnym.C) Do identyfikacji eGFP wykorzystano immunohistochemię kostnina złamania+ komórki donora (niebieskie) i osteokalcyna+ komórki osteoblastyczne (brązowe) z parabionta. Paski skali oznaczają 50 µm obrazowanie przeprowadzono przy użyciu obiektywu 40x. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wideo uzupełniające 1: Rekonstrukcja 3Dkończyny tylnej i unieruchomienie kości piszczelowej. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/parte_slow.wmv">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół opisuje mysi model chirurgii ortopedycznej, który był używany do badania mechanizmów pooperacyjnego zapalenia nerwów i zmian w zachowaniu, a w połączeniu z parabiozą, do badania regeneracji tkanek podczas starzenia.

Mysi model chirurgii ortopedycznej do badania pooperacyjnych dysfunkcji poznawczych i regeneracji tkanek

Surgery is commonly used to improve and maintain quality of life. Unfortunately, in vulnerable patients such as the elderly, complications may occur and ...

Ogólnym celem tych metod chirurgicznych jest obserwacja wpływu urazu na dysfunkcję wielonarządową, w szczególności parabioza zostanie wykorzystana do zespolenia młodej i starej myszy, co spowoduje wspólne ukrwienie. Jedna z myszy w tym modelu zostanie następnie podzielona na części, aby zaobserwować efekty regeneracyjne i wpływ na funkcje poznawcze w odniesieniu do wspólnego systemu młodej i starej myszy. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z dziedziną immunologii, starzenia się, regeneracji tkanek i funkcji poznawczych.Główną zaletą zabiegu ortopedycznego jest kliniczne zastosowanie tych wyników do częstych powikłań po operacji, na przykład majaczenia i pooperacyjnej dysfunkcji poznawczych. Przed eksperymentem trzymaj myszy w klimatyzowanym środowisku z 12-godzinnymi cyklami światła i ciemności oraz odpowiednim dostępem do standardowego pożywienia i wody. Nie trzymaj więcej niż pięciu kolegów z miotu w klatce i unikaj warunków, które mogłyby zachęcać do walki.Użyj jednej myszy płci żeńskiej w wieku trzech miesięcy i jednej starej myszy w wieku 17 miesięcy. W przypadku parabiozy należy zaaklimatyzować dwie myszy razem przez co najmniej dwa tygodnie przed zabiegiem. Codziennie sprawdzaj stan ciała i ogólny wygląd myszy.Aby przygotować się do operacji, zważ dwie myszy. Po podaniu znieczulenia ogólnego umieść myszy na podgrzewanej podkładce w pozycji leżącej. Na koniec utrzymuj prawidłowy poziom znieczulenia dla każdej myszy.Następnie ogol każdą z dwóch myszy wzdłuż ciągłej linii od łokcia, boku i kolana po stronie, która ma być połączona. Dezynfekuj jodem i 70% alkoholowym peelingiem skóry w trzech naprzemiennych cyklach, przygotowując się do nacięcia. Zacznij od podania środka przeciwbólowego po indukcji i przed manipulacją chirurgiczną.Wstrzyknąć 0,25% bupiwakainy na boki tuż przed otwarciem. Na każdej myszy użyj skalpela, aby wykonać nacięcie skóry wzdłuż boku, rozciągając się od proksymalnego kolana do tylko proksymalnego łokcia i bez naruszania mięśni pod skórą. Połącz triceps zwierząt za pomocą dwóch przerwanych szwów.Następnie połącz ściany ciała wzdłuż boków za pomocą biegnącego ciągłego szwu składającego się z siedmiu do dziewięciu przejść. Następnie połącz mięsień czworogłowy zwierzęcia dwoma przerwanymi szwami i zamknij skórę dwóch parabiontów przerwanymi szwami. Wykonaj przerwane szwy za pomocą myszy w pozycji leżącej.Pozwól myszom obudzić się w otaczającym powietrzu. Trzymaj każdą parę indywidualnie i pamiętaj, aby codziennie monitorować pary, wykonując ocenę kondycji ciała dwa razy w tygodniu i ważąc pary dwa razy w tygodniu. Na koniec odczekaj cztery tygodnie rekonwalescencji, aby zapewnić wspólne krążenie między parabiontami podczas wykonywania operacji złamania piszczeli.Następnie ogol przyśrodkową część prawej tylnej kończyny myszy, aby odsłonić obszar operacyjny i zdezynfekuj jodem i 70% alkoholowym peelingiem skóry w trzech naprzemiennych cyklach. Zacznij od podania środka przeciwbólowego po indukcji i przed manipulacją chirurgiczną. Wstrzyknąć 0,25% bupiwakainy w miejsce operowane proksymalnie do kolana tuż przed otwarciem.Utrzymuj sterylne pole operacyjne przez cały czas trwania zabiegu, używając narzędzi sterylizowanych w autoklawie. Wykonaj nacięcie nożyczkami proksymalnie do kolana wzdłuż przyśrodkowej części prawej kończyny tylnej w dół do środkowej części kości piszczelowej u lewej myszy. Odsłoń środkową część kości piszczelowej i wizualnie zlokalizuj trzon.Zegnij kolano i uwidocznij płaskowyż piszczelowy, używając więzadła rzepkowo-udowego jako punktu orientacyjnego. Wizualizuj ścięgno rzepki. Następnie ręcznie wywierć otwór w kanale śródszpikowym za pomocą igły o rozmiarze 25, wykonując ruch toczny palca i kciuka.Następnie włóż szpilkę ze stali nierdzewnej o grubości 0,38 milimetra przez otwór około 15 milimetrów do jamy szpikowej, aż poczujesz opór i przetnij miąższ z płaskowyżem piszczelowym za pomocą przecinaka do drutu. Następnie użyj nożyczek do prostego spoiwa, aby złamać środkową trzon kości piszczelowej. Obserwuj wzrokowo miejsce złamania i sąsiednie tkanki, aby sprawdzić, czy miejsce złamania jest ustabilizowane.Następnie zamknij skórę za pomocą zszywek skórnych. Na koniec wstrzyknij podskórnie jedną mililitrową wstępnie podgrzaną normalną sól fizjologiczną w temperaturze 37 stopni Celsjusza każdej myszy w celu wymiany płynów. Umieść myszy na podgrzewanych podkładkach, aby się zregenerowały, zanim włożysz je do czystej klatki domowej.Codziennie sprawdzaj myszy pod kątem oznak kulawizny, infekcji lub krwawienia. Zdjęcia rentgenowskie złamanej kości piszczelowej trzonu wykazały więcej odkładania się tkanek w modzelach po złamaniach młodych myszy niż w modzelach po złamaniach u starszych myszy. Co więcej, modzele po złamaniach młodych myszy zawierały więcej kości i mniej tkanki zwłóknieniowej niż modzele po złamaniach u starszych myszy.Operacja złamania kości piszczelowej wywołała większe zapalenie nerwu hipokampa u myszy w wieku 20 miesięcy w porównaniu z myszami czteromiesięcznymi. Ponadto myszy po operacji wykazują również upośledzenie funkcji pamięci zależnej od hipokampa, na przykład za pomocą oceny behawioralnej warunkującej strach. Narażenie na młodzieńcze krążenie poprawiło naprawę kości z wcześniejszym zrostem, zwiększonym odkładaniem się kości i zmniejszonym zwłóknieniem.To odmłodzenie regeneracji kości nastąpiło niezależnie od endogennych osteokalcyny dodatnich osteoblastów, ale raczej opierało się na komórkach CD45-dodatnich, które migrowały z młodego parabiontu. Po opanowaniu technikę parabiozy można wykonać w ciągu 1-1/2 godziny, a model złamania kości piszczelowej można wykonać w ciągu 15 minut. W razie potrzeby obie procedury mogą być również wykonywane niezależnie od siebie.Podczas próby zabiegu złamania kości piszczelowej ważne jest, aby zachować wysterylizowane pole operacyjne oraz zapewnić prawidłowe umieszczenie szpilki i prawidłową osteotomię. Na koniec pamiętaj o uważnym monitorowaniu myszy przez cały czas trwania badania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać model parabiozy i operację złamania kości piszczelowej.

a-mouse-model-orthopedic-surgery-to-study-postoperative-cognitive

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisujemy protokół destabilizacji modelu łąkotki przyśrodkowej (DMM) u myszy, skuteczne narzędzie do badań nad chorobą zwyrodnieniową stawów (OA). Ponadto wykazaliśmy, że niedobór progranuliny może nasilać rozwój i progresję choroby zwyrodnieniowej stawów przy użyciu tego modelu, co wskazuje, że progranulina odgrywa ochronną rolę w patogenezie choroby zwyrodnieniowej stawów.

Stworzenie chirurgicznie indukowanego modelu u myszy w celu zbadania ochronnej roli progranuliny w chorobie zwyrodnieniowej stawów

Chociaż modele mysie są nieocenionymi narzędziami do inżynierii tkanki kostnej, modele długich wad kostnych są rzadkie. Ta potrzeba zmotywowała do opracowania obecnego protokołu, który wykorzystuje płytkę blokującą z czterema i dedykowanym przyrządem do wykonania i ustabilizowania powtarzalnego ubytku udowego o krytycznej wielkości przy niskiej zachorowalności.

Ustalenie segmentalnego modelu ubytku krytycznej wielkości kości udowej u myszy stabilizowanych przez osteosyntezę płytkową

Ten artykuł opisuje metodę generowania powtarzalnego uszkodzenia kompresyjnego rdzenia kręgowego (SCI) u noworodka myszy. Model ten stanowi korzystną platformę do badania mechanizmów plastyczności adaptacyjnej, które leżą u podstaw spontanicznej odbudowy funkcjonalnej.

Model urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego u noworodków myszy

Komórki zrębu pochodzące z tkanki tłuszczowej mogą być przydatne do inżynierii nowej tkanki z własnych komórek pacjenta. Przedstawiamy protokół izolacji subpopulacji ludzkich komórek zrębu pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) o zwiększonym potencjale osteogennym, a następnie zastosowania komórek w teście gojenia kalwaryjnego in vivo.

Szybka izolacja komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej BMPR-IB+ do zastosowania w modelu gojenia ubytków nazębnych

Przeprowadziliśmy jednostronne zamknięcie tętnicy szyjnej w 7-10 dniu po urodzeniu mysich szczeniąt CD-1, aby stworzyć model niedotlenienia niedotlenienia (HI) noworodka i zbadaliśmy skutki uszkodzenia mózgu HI. Badaliśmy funkcje neurobehawioralne u tych myszy w porównaniu z normalnymi myszami, które nie były operowane.

Oceny neurobehawioralne w mysim modelu niedotlenionego i niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u noworodków

Prezentujemy model osteogenezy rozproszenia kości piszczelowej myszy opracowany przy użyciu specjalnie wykonanego dystraktora. Wykorzystanie myszy jako celu analizy jest korzystne dla postępu badań.

Model osteogenezy rozpraszającej uwagę myszy

Obecny protokół ustanawia rygorystyczną i powtarzalną metodę ilościowego oznaczania zmian morfologicznych stawów, które towarzyszą chorobie zwyrodnieniowej stawów. Zastosowanie tego protokołu może być cenne w monitorowaniu postępu choroby i ocenie interwencji terapeutycznych w chorobie zwyrodnieniowej stawów.

Standaryzowana ocena histomorfometryczna choroby zwyrodnieniowej stawów w chirurgicznym modelu myszy

Przeprowadziliśmy symulację kliniczną chirurgii, aby ustalić protokół bezpośredniego zespolenia obustronnych nerwów splotu ramiennego drogą przedrdzeniową u myszy, przyczyniając się do badania mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw rehabilitacji po skrzyżowaniu transferu nerwów po urazach ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego.

Mysi model bezpośredniego zespolenia drogą przedrdzeniową do chirurgii krzyżowania się transferu nerwów

Prezentujemy tutaj nowatorskie zautomatyzowane urządzenie do leczenia urazów rdzenia kręgowego dla myszy, które może dokładnie tworzyć modele urazów rdzenia kręgowego w różnym stopniu.

Zautomatyzowany impaktor do modelu kontuzyjnego uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy

Metoda igłowa asymetrycznego obustronnego zwężenia tętnicy szyjnej wspólnej jest proponowana do stworzenia mysiego modelu dla naczyniowego zaburzenia poznawczego i demencji. Skutkuje długoterminowymi wynikami w porównaniu z wcześniej ustalonymi modelami i jest kompatybilny z MRI na żywo. Wizualna reprezentacja przedstawiająca procedurę stanowi wskazówkę do opanowania operacji.

Mysi model naczyniowych zaburzeń poznawczych i otępienia oparty na asymetrycznym obustronnym zwężeniu tętnicy szyjnej wspólnej prowadzonym igłą

Poznaj model chirurgii ortopedycznej u myszy do badania neurozapalenia i dysfunkcji poznawczych pooperacyjnych. Metoda obejmuje parabiozę młodych i starych osobników oraz złamanie kości piszczelowej.

Mysi model chirurgii ortopedycznej do badania pooperacyjnych dysfunkcji poznawczych i regeneracji tkanek

Przeglądaj więcej filmów