Mysi model chirurgii ortopedycznej do badania pooperacyjnych dysfunkcji poznawczych i regeneracji tkanek
27 lutego 2018
Ten protokół opisuje mysi model chirurgii ortopedycznej, który był używany do badania mechanizmów pooperacyjnego zapalenia nerwów i zmian w zachowaniu, a w połączeniu z parabiozą, do badania regeneracji tkanek podczas starzenia.
Ogólnym celem tych metod chirurgicznych jest obserwacja wpływu urazu na dysfunkcję wielonarządową, w szczególności parabioza zostanie wykorzystana do zespolenia młodej i starej myszy, co spowoduje wspólne ukrwienie. Jedna z myszy w tym modelu zostanie następnie podzielona na części, aby zaobserwować efekty regeneracyjne i wpływ na funkcje poznawcze w odniesieniu do wspólnego systemu młodej i starej myszy. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z dziedziną immunologii, starzenia się, regeneracji tkanek i funkcji poznawczych.
Główną zaletą zabiegu ortopedycznego jest kliniczne zastosowanie tych wyników do częstych powikłań po operacji, na przykład majaczenia i pooperacyjnej dysfunkcji poznawczych. Przed eksperymentem trzymaj myszy w klimatyzowanym środowisku z 12-godzinnymi cyklami światła i ciemności oraz odpowiednim dostępem do standardowego pożywienia i wody. Nie trzymaj więcej niż pięciu kolegów z miotu w klatce i unikaj warunków, które mogłyby zachęcać do walki.
Użyj jednej myszy płci żeńskiej w wieku trzech miesięcy i jednej starej myszy w wieku 17 miesięcy. W przypadku parabiozy należy zaaklimatyzować dwie myszy razem przez co najmniej dwa tygodnie przed zabiegiem. Codziennie sprawdzaj stan ciała i ogólny wygląd myszy.
Aby przygotować się do operacji, zważ dwie myszy. Po podaniu znieczulenia ogólnego umieść myszy na podgrzewanej podkładce w pozycji leżącej. Na koniec utrzymuj prawidłowy poziom znieczulenia dla każdej myszy.
Następnie ogol każdą z dwóch myszy wzdłuż ciągłej linii od łokcia, boku i kolana po stronie, która ma być połączona. Dezynfekuj jodem i 70% alkoholowym peelingiem skóry w trzech naprzemiennych cyklach, przygotowując się do nacięcia. Zacznij od podania środka przeciwbólowego po indukcji i przed manipulacją chirurgiczną.
Wstrzyknąć 0,25% bupiwakainy na boki tuż przed otwarciem. Na każdej myszy użyj skalpela, aby wykonać nacięcie skóry wzdłuż boku, rozciągając się od proksymalnego kolana do tylko proksymalnego łokcia i bez naruszania mięśni pod skórą. Połącz triceps zwierząt za pomocą dwóch przerwanych szwów.
Następnie połącz ściany ciała wzdłuż boków za pomocą biegnącego ciągłego szwu składającego się z siedmiu do dziewięciu przejść. Następnie połącz mięsień czworogłowy zwierzęcia dwoma przerwanymi szwami i zamknij skórę dwóch parabiontów przerwanymi szwami. Wykonaj przerwane szwy za pomocą myszy w pozycji leżącej.
Pozwól myszom obudzić się w otaczającym powietrzu. Trzymaj każdą parę indywidualnie i pamiętaj, aby codziennie monitorować pary, wykonując ocenę kondycji ciała dwa razy w tygodniu i ważąc pary dwa razy w tygodniu. Na koniec odczekaj cztery tygodnie rekonwalescencji, aby zapewnić wspólne krążenie między parabiontami podczas wykonywania operacji złamania piszczeli.
Następnie ogol przyśrodkową część prawej tylnej kończyny myszy, aby odsłonić obszar operacyjny i zdezynfekuj jodem i 70% alkoholowym peelingiem skóry w trzech naprzemiennych cyklach. Zacznij od podania środka przeciwbólowego po indukcji i przed manipulacją chirurgiczną. Wstrzyknąć 0,25% bupiwakainy w miejsce operowane proksymalnie do kolana tuż przed otwarciem.
Utrzymuj sterylne pole operacyjne przez cały czas trwania zabiegu, używając narzędzi sterylizowanych w autoklawie. Wykonaj nacięcie nożyczkami proksymalnie do kolana wzdłuż przyśrodkowej części prawej kończyny tylnej w dół do środkowej części kości piszczelowej u lewej myszy. Odsłoń środkową część kości piszczelowej i wizualnie zlokalizuj trzon.
Zegnij kolano i uwidocznij płaskowyż piszczelowy, używając więzadła rzepkowo-udowego jako punktu orientacyjnego. Wizualizuj ścięgno rzepki. Następnie ręcznie wywierć otwór w kanale śródszpikowym za pomocą igły o rozmiarze 25, wykonując ruch toczny palca i kciuka.
Następnie włóż szpilkę ze stali nierdzewnej o grubości 0,38 milimetra przez otwór około 15 milimetrów do jamy szpikowej, aż poczujesz opór i przetnij miąższ z płaskowyżem piszczelowym za pomocą przecinaka do drutu. Następnie użyj nożyczek do prostego spoiwa, aby złamać środkową trzon kości piszczelowej. Obserwuj wzrokowo miejsce złamania i sąsiednie tkanki, aby sprawdzić, czy miejsce złamania jest ustabilizowane.
Następnie zamknij skórę za pomocą zszywek skórnych. Na koniec wstrzyknij podskórnie jedną mililitrową wstępnie podgrzaną normalną sól fizjologiczną w temperaturze 37 stopni Celsjusza każdej myszy w celu wymiany płynów. Umieść myszy na podgrzewanych podkładkach, aby się zregenerowały, zanim włożysz je do czystej klatki domowej.
Codziennie sprawdzaj myszy pod kątem oznak kulawizny, infekcji lub krwawienia. Zdjęcia rentgenowskie złamanej kości piszczelowej trzonu wykazały więcej odkładania się tkanek w modzelach po złamaniach młodych myszy niż w modzelach po złamaniach u starszych myszy. Co więcej, modzele po złamaniach młodych myszy zawierały więcej kości i mniej tkanki zwłóknieniowej niż modzele po złamaniach u starszych myszy.
Operacja złamania kości piszczelowej wywołała większe zapalenie nerwu hipokampa u myszy w wieku 20 miesięcy w porównaniu z myszami czteromiesięcznymi. Ponadto myszy po operacji wykazują również upośledzenie funkcji pamięci zależnej od hipokampa, na przykład za pomocą oceny behawioralnej warunkującej strach. Narażenie na młodzieńcze krążenie poprawiło naprawę kości z wcześniejszym zrostem, zwiększonym odkładaniem się kości i zmniejszonym zwłóknieniem.
To odmłodzenie regeneracji kości nastąpiło niezależnie od endogennych osteokalcyny dodatnich osteoblastów, ale raczej opierało się na komórkach CD45-dodatnich, które migrowały z młodego parabiontu. Po opanowaniu technikę parabiozy można wykonać w ciągu 1-1/2 godziny, a model złamania kości piszczelowej można wykonać w ciągu 15 minut. W razie potrzeby obie procedury mogą być również wykonywane niezależnie od siebie.
Podczas próby zabiegu złamania kości piszczelowej ważne jest, aby zachować wysterylizowane pole operacyjne oraz zapewnić prawidłowe umieszczenie szpilki i prawidłową osteotomię. Na koniec pamiętaj o uważnym monitorowaniu myszy przez cały czas trwania badania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać model parabiozy i operację złamania kości piszczelowej.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje model myszy poddanych operacji ortopedycznej w celu zbadania pooperacyjnego stanu zapalnego układu nerwowego oraz zmian behawioralnych. Przedstawia on również badanie regeneracji tkanek w procesie starzenia za pomocą parabiozy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Starzenie się
Wstęp
- Badanie analizuje wpływ urazów na niewydolność wielonarządową.
- Parabioza łączy młode i stare myszy w celu wymiany krwi.
- Modele złamań pomagają ocenić efekty regeneracyjne oraz funkcje poznawcze.
- Wyniki mogą mieć związek z powikłaniami pooperacyjnymi, takimi jak majaczenie.
Cel badania
- Obserwacja wpływu urazu na neurozapalenie i zachowanie.
- Ocena regeneracji tkanek u myszy w starszym wieku.
- Zrozumienie funkcji poznawczych w związku ze wspólnym krwiobiegiem.
Zastosowane Metody
- Aklimatyzacja myszy i przygotowanie do zabiegu chirurgicznego.
- Operacja parabiozy w celu połączenia myszy młodych i starych.
- Operacja złamania kości piszczelowej w celu oceny gojenia i neurostanu zapalnego.
- Oceny behawioralne w celu ewaluacji funkcji poznawczych po operacji.
Główne wyniki
- Młodsze myszy wykazały lepsze gojenie kości w porównaniu z myszami starszymi.
- U starszych myszy po złamaniu zaobserwowano zwiększony stan zapalny układu nerwowego.
- Wspólny obieg poprawił regenerację kości i zmniejszył włóknienie.
- U starszych myszy po operacji odnotowano zaburzenia poznawcze.
Wnioski
- Model parabiozy skutecznie służy do badania procesów starzenia i regeneracji.
- Urazy wpływają na funkcje poznawcze i neuroinflamację u myszy w wieku starszym.
- Wspólny krwiobieg wspomaga regenerację tkanek u osobników starszych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model ten umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka powikłań pooperacyjnych związanych z wiekiem poprzez powiązanie urazu chirurgicznego z neuroinflamacją i upośledzoną regeneracją tkanek. Stanowi on system predykcyjny służący do oceny strategii odmładzania systemowego w badaniach przedklinicznych. Podejście to wspiera walidację celów terapeutycznych oraz identyfikację biomarkerów translacyjnych dla wyników neuropoznawczych i mięśniowo-szkieletowych w populacjach starzejących się.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych dotyczących czynników systemowych wpływających na neurozapalenie po urazach chirurgicznych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów zaanganozowanych w zależny od wieku spadek funkcji poznawczych oraz naprawę tkanek.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez modelowanie majaczenia pooperacyjnego u ludzi oraz opóźnionego zrastania się złamań u osobników starszych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do oceny wpływu związków na regenerację kości oraz markery neurozapalne.
- Wartość operacyjna: Dostarczenie standaryzowanych i powtarzalnych wyników ilościowych, w tym histomorfometrii oraz odczytów behawioralnych.
- Skalowalność: Umożliwienie ponownego wykorzystania platformy do przesiewania związków immunomodulujących lub pro-regeneracyjnych w modelach starzenia.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy mechanizmy z fazy odkryć z przedkliniczną walidacją regeneracji tkanek oraz powrotu funkcji poznawczych.
- Dopasowanie biomarkerów: Umożliwia korelację czynników systemowych z neuroinflamacją hipokampa i tworzeniem się kostnina jako punktami końcowymi badania translacyjnego.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza podstaw do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez modelowanie odpowiedzi na stres chirurgiczny z rozbiciem na grupy wiekowe.
Integracja potoków i przepływów pracy
Model ten integruje kontinuum odkryć, od testowania hipotez dotyczących punktów uchwytu, przez identyfikację związków wiodących, aż po przedkliniczną ocenę skuteczności, w szczególności w przypadku chorób współistniejących związanych ze starzeniem się.
- Biologia odkrywcza: Wspiera analizę mechanistyczną szlaków zmienionych przez uraz chirurgiczny w układach neuroimmunologicznych i mięśniowo-szkieletowych.
- Przesiewanie: Dostarcza systemów gotowych do testów z mierzalnymi punktami końcowymi do przesiewania związków w kontekście osobników starych w porównaniu z młodymi.
- Analityka: Generuje mierzalne wyniki, takie jak objętość kostna zrostu, stopień włóknienia oraz wyniki warunkowania lękowego do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy efekty krążenia systemowego z naprawą tkanek i funkcją poznawczą, wspierając ciągłość przedkliniczną opartą na biomarkerach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę chirurgiczną do badania dysfunkcji wielu organów w ramach programów z zakresu immunologii, starzenia się i neuronauki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w powikłaniach pooperacyjnych związanych z wiekiem.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane procedury o wysokiej wierności i niskiej zmienności technicznej pomiędzy ośrodkami.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka w przypadku kandydatów celujących w szlaki neurozapalne lub regeneracyjne.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację interwencji dla starzejących się populacji chirurgicznych, skorygowaną o ryzyko, poprzez zwalidowane modele przedkliniczne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach mikrochirurgicznych, w tym w parabiozie i stabilizacji ortopedycznej.
- Wymaga sterylnej infrastruktury chirurgicznej oraz monitorowania stanu pooperacyjnego pod kątem infekcji i analgesji.
- Wymaga standaryzacji działań pomiędzy zespołami ds. chirurgii, behawiorystyki i histologii w celu zapewnienia powtarzalności wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania modelu przy rozszerzaniu go na inne miejsca złamań lub stany chorobowe współistniejące.
- Ograniczony przez długość życia myszy oraz gatunkowo specyficzne odpowiedzi immunologiczne, co może wpływać na skalowanie translacyjne na ludzi.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Preoperative Setup for Parabiosis and Orthopedic Surgery
1:48
Parabiosis Surgery
4:02
Tibial Fracture Surgery
6:23
Results: Parabiosis Surgery Leads to Rejuvenation of Fracture Healing, Blood-sharing, and Donor-cell Engraftment
7:36
Conclusion
