Protokół do śledzenia pojedynczych cząstek 3D w czasie rzeczywistym
January 3rd, 2018
Ten protokół szczegółowo opisuje budowę i działanie mikroskopu 3D do śledzenia pojedynczych cząstek w czasie rzeczywistym, zdolnego do śledzenia nanoskalowych sond fluorescencyjnych przy wysokich prędkościach dyfuzyjnych i niskich szybkościach zliczania fotonów.
Ogólnym celem tego protokołu jest wdrożenie mikroskopu 3D do śledzenia pojedynczych cząstek w czasie rzeczywistym. Główną zaletą tej techniki jest to, że pojedynczy rozpraszający obiekt w skali nano może być monitorowany w sposób ciągły z ograniczoną rozdzielczością czasową fotonów. Technika ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wirusologii, takie jak śledzenie pojedynczego wirionu przez cały proces infekcji.
Przygotuj aparat na stole optycznym. Ta konfiguracja jest gotowa do kalibracji. Kluczowe elementy obejmują laser na ciele stałym o długości fali 488 nanometrów, dwa deflektory elektrooptyczne, które znajdują się wzdłuż ścieżki wiązki, przestrajalną soczewkę gradientu akustycznego oraz stolik na próbki z mikro i nanopozycjonerami.
Ten schemat konfiguracji zawiera dodatkowe szczegóły. Oto ścieżka wiązki laserowej do stolika na próbkę. Deflektory elektrooptyczne i przestrajalna soczewka akustyczna znajdują się wzdłuż toru wiązki.
Urządzenia te dynamicznie sterują plamką lasera na etapie próbki. Fotony z próbki są zliczane przez fotodiodę lawinową. Kamera monitoruje położenie cząstki.
Pozycja próbki jest ustawiana za pomocą mikro i nano sterowników. Programowalna przez użytkownika matryca bramek steruje plamką lasera, obliczaniem pozycji cząstek w czasie rzeczywistym, sprzężeniem zwrotnym stopnia i zliczaniem fotonów. Należy przygotować dwie próbki.
Pierwsza, wymaga 190-nanometrowych kulek fluorescencyjnych rozcieńczonych w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Użyj szkiełka nakrywkowego, aby przygotować utrwaloną próbkę cząstek. Umieścić 400 mikrolitrów roztworu kulki na szkiełku nakrywkowym.
Teraz wyprodukuj próbkę swobodnie poruszających się cząstek. Wymaga 110 nanometrowych kulek fluorescencyjnych rozcieńczonych w wodzie. Stwórz swobodnie poruszającą się próbkę cząstek, umieszczając 400 mikrolitrów roztworu na szkiełku nakrywkowym.
Zabierz utrwaloną próbkę cząstek do mikroskopu w celu zamontowania. Próbka znajduje się na pozycjonerze XY nano. Włącz laser, fotodetektor, sterowniki elementów linii wiązki i pozycjonerów.
Uruchom pozycjoner Piezo nano w zamkniętej pętli. Następnie wyjmij filtr emisji fluorescencji sprzed fotodetektora. Następnie zmieniaj pozycję Z próbki za pomocą mikropozycjonera.
Ponieważ pozycja się zmienia, użyj fotodetektora, aby monitorować intensywność odbicia lasera. Zmaksymalizuj intensywność, aby zidentyfikować płaszczyznę ogniskową soczewki obiektywu. Gdy próbka znajduje się w płaszczyźnie ogniskowej, wymień filtr emisji fluorescencji.
Teraz pracuj z oprogramowaniem sterującym komputerem. Użyj niestandardowego oprogramowania, aby zeskanować rastrowe próbkę. Najpierw ustaw duży zakres skanowania, różnicę między początkiem a końcem.
Tutaj zakres wynosi 10 mikrometrów w Y i 10 mikrometrów w X.Ustaw również duży rozmiar kroku w każdym kierunku. Tutaj 200 nanometrów. Ustaw oba pola Z na poprzednio określone położenie płaszczyzny ogniskowej.
Skanowanie w trybie push rozpocznie skanowanie rastrowe. Rozpocznij skanowanie. Oprogramowanie steruje deflektorami elektrooptycznymi podczas nocnej wycieczki, zbiera zliczenia z fotodetektora, steruje pozycjonerem nano i wykonuje obliczenia położenia.
Skan znajdzie cząstkę, którą można zidentyfikować w oprogramowaniu za pomocą fluorescencji plata. Dla każdego miejsca w skanie oprogramowanie określi również szacunkowe położenie cząstek w X i Y względem środka skanu deflektora elektroobiektu. Po znalezieniu cząstki zmniejsz zakres skanowania wokół niej do dwóch mikrometrów w X i Y.Zmniejsz również rozmiar kroku dla obu do 100 nanometrów.
Dodaj zakres skanowania w kierunku Z dwóch mikrometrów, aby wziąć w nawias ogniskową fluorescencyjną. Ustaw rozmiar kroku Z na 200 nanometrów. Rozpocznij skanowanie rastrowe 3D, aby znaleźć ogniskową fluorescencyjną.
Dane uzyskane ze skanu pokazują płaszczyznę ogniskową przed włączeniem przestrajalnej soczewki gradientu akustycznego. Przejdź do pracy z ustawieniem przestrajalnej soczewki akustycznej w oprogramowaniu sterującym. Najpierw kliknij połącz, a następnie włącz.
Przejdź do sekcji sterowania impulsami i bramkowaniem, zmień tryb wyzwalania wyjścia z RGB na wielopłaszczyznowy. Następnie zmień go z powrotem na RGB, aby umożliwić zmianę fazy wyjściowej. Użyj suwaków, aby ustawić fazę wyjściową między zerem stopni, 90 stopniami i 270 stopniami.
Następnie przejdź do sekcji kontroli częstotliwości. Tam wybierz częstotliwość rezonansową 68 500 Hz. Przejdź na górę ekranu i kliknij zaawansowane.
Następnie wybierz zakładkę ustawień. Na nowym ekranie znajdź maksymalną częstotliwość kolumny zerowej. Dostosuj go, aby zmienić zakres wyszukiwania częstotliwości.
Kliknij, zapisz kalibrację, a następnie zakończ kalibrację. Wróć do regulatorów częstotliwości i zmień częstotliwość rezonansową. Natychmiast zmień go z powrotem na 68 500 Hz, aby kalibracja odniosła skutek.
W sekcji kontroli amplitudy użyj suwaka, aby powoli zwiększyć amplitudę do 35%Następnie kliknij zablokuj rezonans. Gdy częstotliwość jest zablokowana, kliknij odblokuj rezonans. Wróć do oprogramowania do skanowania rastrowego.
Wprowadź dwa zakresy skanowania mikrometrycznego wyśrodkowane na cząstce w X i Y. Użyj kroku o rozmiarze 100 nanometrów. Wyśrodkuj cząstkę w zakresie czterech mikrometrów w Z, z krokiem o wielkości 200 nanometrów. Na obrazie skaningowym, który powstał, obszar oświetlenia reprezentujący cząstkę ma szerokość około jednego mikrometra.
Na tej podstawie dostosuj parametr skali XY tak, aby szacowane pozycje w X i Y mieściły się w zakresie od minus 0,5 do 0,5 mikrometra. Po podobnej procedurze ze skalą Z ustaw pozycjoner nano w pozycji zerowej. Wyłącz zasilanie pozycjonera nano przed kontynuowaniem.
Zastąp nieruchomą próbkę cząstek swobodnie poruszającą się próbką cząstek. Następnie upewnij się, że wszystkie urządzenia są włączone. Uruchom pozycjoner Piezo nano w otwartej pętli.
Na komputerze ustaw oprogramowanie przestrajalnego akustycznego gradientu soczewkowego tak jak poprzednio. Usuń filtr emisji fluorescencji ze ścieżki do detektora zdjęć. Znajdź płaszczyznę ogniskowej, zmieniając położenie Z próbki i maksymalizując intensywność odbicia laserowego od szkiełka nakrywkowego.
Po znalezieniu płaszczyzny ogniskowej zwiększ pozycję ostrości o 15 mikrometrów w roztwór. Wymień filtr emisji fluorescencji. Otwórz niestandardowe oprogramowanie śledzące.
Ustaw parametry szacowania pozycji na wartości znalezione podczas optymalizacji. Teraz ustaw integralne stałe kontrolne, które dyktują szybkość reakcji pozycjonera nano. Zacznij od stałej X.
Wprowadź niską wartość i powoli ją zwiększaj. Gdy w odczycie położenia cząstek rozpoczynają się oscylacje, należy zanotować wartość stałej kontrolnej. Zmniejsz stałą regulacji całkowej do około 70% jej wartości na początku oscylacji.
Powtórz kroki ze stałymi kontrolnymi Y i Z. Ustaw spust, aby rozpocząć śledzenie progu ścieżki na trzy kiloherce. Ustaw minimum ścieżki, spust do zakończenia śledzenia, na 1.5 kiloherca.
Rozpocznij eksperyment, klikając przycisk wyszukiwania, a następnie klikając opcję automatyczne śledzenie. Ten film pokazuje wyniki użycia trójwymiarowego, dynamicznego mikroskopu śledzenia lokalizacji fotonów do śledzenia dyfuzyjnego ruchu 110-nanometrowej fluorescencyjnej nanocząstki w wodzie. Położenie cząstki, mierzone za pomocą odczytu położenia pozycjonera nano, jest pokazane na osiach 3D.
Wstawka to odczyt z naukowej kamery do mchu morskiego. Pokazuje on, że cząstka jest utrzymywana, zablokowana w objętości ogniskowej, przez system śledzący. Cząstka była śledzona, a jej pozycja rejestrowana przez ponad dwie minuty.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż 50 minut, jeśli system jest odpowiednio wyrównany, a parametry kalibracji ustawione. Po opracowaniu technika ta pomoże naukowcom zajmującym się dostarczaniem leków badać szlaki internalizacji i transportu ładunku komórkowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obsługiwać mikroskop 3D do śledzenia pojedynczych cząstek w czasie zerowym.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół szczegółowo opisuje implementację mikroskopii do śledzenia pojedynczych cząstek w czasie rzeczywistym, w 3D, zaprojektowanej do monitorowania nanoskalowych sond fluorescencyjnych. Ta technika pozwala na ciągłe obserwowanie pojedynczych dyfundujących obiektów, nawet w warunkach ograniczonej liczby fotonów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia
- Śledzenie pojedynczych cząstek
- Wirologia
Tło
- Śledzenie w czasie rzeczywistym nanoskalowych cząstek jest kluczowe w różnych dziedzinach nauki.
- Zrozumienie dynamiki pojedynczych wirionów może zapewnić wgląd w procesy infekcji.
- Ta technika poprawia zdolność badania cząstek przy dużych prędkościach dyfuzji.
- Ograniczenia liczby fotonów są zwalczone poprzez zaawansowane układy optyczne.
Cel badania
- Rozwój mikroskopu, który może śledzić pojedyncze cząstki w czasie rzeczywistym.
- Ułatwienie badania infekcji wirusowych poprzez monitorowanie pojedynczych wirionów.
- Poprawa rozdzielczości czasowej śledzenia obiektów nanoskalowych.
Stosowane metody
- Konstrukcja mikroskopii do śledzenia pojedynczych cząstek w 3D.
- Wykorzystanie lasera stanu stałego o długości fali 488 nanometrów.
- Zastosowanie deflektorów elektro-optycznych i strojnika akustycznego z gradientem.
- Kalibracja urządzenia na stole optycznym z precyzyjnym pozycjonowaniem.
Główne wyniki
- Mikroskop z powodzeniem śledzi nanoskalowe sondy fluorescencyjne.
- Wykazano zdolność do monitorowania cząstek przy niskich liczbach fotonów.
- Możliwe jest ciągłe obserwowanie pojedynczych wirionów podczas infekcji.
- Dostarczono wglądu w dynamikę procesów wirusowych.
Wnioski
- Ten protokół ustanawia solidną metodę śledzenia cząstek w czasie rzeczywistym.
- Otwiera nowe szlaki badań w wirologii i pokrewnych dziedzinach.
- Technika ta może znacząco poprawić nasze zrozumienie zachowań wirusów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Real-time 3D single particle tracking enables continuous monitoring of nanoscale objects under photon-limited conditions, addressing a critical gap in observing fast, three-dimensional cellular processes. This capability supports mechanistic de-risking in early discovery by providing high-resolution dynamic data on molecular interactions and trafficking pathways. The method enhances predictive confidence in target validation and lead identification by delivering quantitative, reproducible spatiotemporal data essential for informed go/no-go decisions in drug delivery and virology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking single virions or nanoparticles through infection processes with high spatiotemporal resolution.
- Operational Value: Provides functional target validation through direct observation of molecular dynamics in near-native environments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative data on particle diffusion, binding, and transport kinetics under physiologically relevant conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative dependent variable measurements (position, trajectory, diffusion coefficient) essential for assay standardization and hit confirmation.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening via precise 3D localization and tracking of fluorescent probes.
- Scalability: Supports platform reuse through robust single-excitation/single-detection layout and calibrated electro-optic and acoustic gradient lens control.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling real-time observation of cellular cargo internalization and transport pathways relevant to drug delivery.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in viral entry and intracellular trafficking models through direct visualization of single-particle behavior in solution.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing reproducible, high-fidelity data on nanoparticle behavior under low photon flux conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for studies requiring dynamic, nanoscale resolution in three dimensions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling continuous tracking of single particles in 3D space under physiological mimicry.
- Screening: Enhances assay readiness through reproducible particle localization and tracking, facilitating reliable compound or nanoparticle evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs (position, velocity, confinement) that allow objective comparison of experimental conditions and therapeutic candidates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling drug delivery pathways and viral infection dynamics in biologically relevant systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability due to its modular optical layout, calibration protocol, and adaptability to different sample types and tracking objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in nanoscale biological processes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through calibrated raster scanning, position estimation algorithms, and feedback-controlled nano-positioning.
- Strategic Value: Improves capital efficiency and reduces late-stage biological risk by enabling early, data-driven decisions on target druggability and delivery mechanism feasibility.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, high-resolution tracking data that inform advancement criteria in drug delivery and antiviral development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, laser safety, and real-time control systems including FPGA-based feedback loops.
- Depends on specialized instrumentation: 488 nm solid-state laser, 2D electro-optic deflectors, tunable acoustic gradient lens, avalanche photodiode, and nano-positioning stages.
- Necessitates cross-team standardization for calibration protocols, position estimation parameters, and integral control constant tuning across users and labs.
- Involves adaptation considerations when transitioning from fixed bead samples to freely moving particles in viscous or complex biological media.
- Practical limitations include sensitivity to photon count rates and the need for careful optimization of tracking thresholds (e.g., 3 kHz start, 1.5 kHz end) to maintain lock-on under low-signal conditions.
