Protokół do śledzenia pojedynczych cząstek 3D w czasie rzeczywistym
3 stycznia 2018
Ten protokół szczegółowo opisuje budowę i działanie mikroskopu 3D do śledzenia pojedynczych cząstek w czasie rzeczywistym, zdolnego do śledzenia nanoskalowych sond fluorescencyjnych przy wysokich prędkościach dyfuzyjnych i niskich szybkościach zliczania fotonów.
Ogólnym celem tego protokołu jest wdrożenie mikroskopu 3D do śledzenia pojedynczych cząstek w czasie rzeczywistym. Główną zaletą tej techniki jest to, że pojedynczy rozpraszający obiekt w skali nano może być monitorowany w sposób ciągły z ograniczoną rozdzielczością czasową fotonów. Technika ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wirusologii, takie jak śledzenie pojedynczego wirionu przez cały proces infekcji.
Przygotuj aparat na stole optycznym. Ta konfiguracja jest gotowa do kalibracji. Kluczowe elementy obejmują laser na ciele stałym o długości fali 488 nanometrów, dwa deflektory elektrooptyczne, które znajdują się wzdłuż ścieżki wiązki, przestrajalną soczewkę gradientu akustycznego oraz stolik na próbki z mikro i nanopozycjonerami.
Ten schemat konfiguracji zawiera dodatkowe szczegóły. Oto ścieżka wiązki laserowej do stolika na próbkę. Deflektory elektrooptyczne i przestrajalna soczewka akustyczna znajdują się wzdłuż toru wiązki.
Urządzenia te dynamicznie sterują plamką lasera na etapie próbki. Fotony z próbki są zliczane przez fotodiodę lawinową. Kamera monitoruje położenie cząstki.
Pozycja próbki jest ustawiana za pomocą mikro i nano sterowników. Programowalna przez użytkownika matryca bramek steruje plamką lasera, obliczaniem pozycji cząstek w czasie rzeczywistym, sprzężeniem zwrotnym stopnia i zliczaniem fotonów. Należy przygotować dwie próbki.
Pierwsza, wymaga 190-nanometrowych kulek fluorescencyjnych rozcieńczonych w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Użyj szkiełka nakrywkowego, aby przygotować utrwaloną próbkę cząstek. Umieścić 400 mikrolitrów roztworu kulki na szkiełku nakrywkowym.
Teraz wyprodukuj próbkę swobodnie poruszających się cząstek. Wymaga 110 nanometrowych kulek fluorescencyjnych rozcieńczonych w wodzie. Stwórz swobodnie poruszającą się próbkę cząstek, umieszczając 400 mikrolitrów roztworu na szkiełku nakrywkowym.
Zabierz utrwaloną próbkę cząstek do mikroskopu w celu zamontowania. Próbka znajduje się na pozycjonerze XY nano. Włącz laser, fotodetektor, sterowniki elementów linii wiązki i pozycjonerów.
Uruchom pozycjoner Piezo nano w zamkniętej pętli. Następnie wyjmij filtr emisji fluorescencji sprzed fotodetektora. Następnie zmieniaj pozycję Z próbki za pomocą mikropozycjonera.
Ponieważ pozycja się zmienia, użyj fotodetektora, aby monitorować intensywność odbicia lasera. Zmaksymalizuj intensywność, aby zidentyfikować płaszczyznę ogniskową soczewki obiektywu. Gdy próbka znajduje się w płaszczyźnie ogniskowej, wymień filtr emisji fluorescencji.
Teraz pracuj z oprogramowaniem sterującym komputerem. Użyj niestandardowego oprogramowania, aby zeskanować rastrowe próbkę. Najpierw ustaw duży zakres skanowania, różnicę między początkiem a końcem.
Tutaj zakres wynosi 10 mikrometrów w Y i 10 mikrometrów w X.Ustaw również duży rozmiar kroku w każdym kierunku. Tutaj 200 nanometrów. Ustaw oba pola Z na poprzednio określone położenie płaszczyzny ogniskowej.
Skanowanie w trybie push rozpocznie skanowanie rastrowe. Rozpocznij skanowanie. Oprogramowanie steruje deflektorami elektrooptycznymi podczas nocnej wycieczki, zbiera zliczenia z fotodetektora, steruje pozycjonerem nano i wykonuje obliczenia położenia.
Skan znajdzie cząstkę, którą można zidentyfikować w oprogramowaniu za pomocą fluorescencji plata. Dla każdego miejsca w skanie oprogramowanie określi również szacunkowe położenie cząstek w X i Y względem środka skanu deflektora elektroobiektu. Po znalezieniu cząstki zmniejsz zakres skanowania wokół niej do dwóch mikrometrów w X i Y.Zmniejsz również rozmiar kroku dla obu do 100 nanometrów.
Dodaj zakres skanowania w kierunku Z dwóch mikrometrów, aby wziąć w nawias ogniskową fluorescencyjną. Ustaw rozmiar kroku Z na 200 nanometrów. Rozpocznij skanowanie rastrowe 3D, aby znaleźć ogniskową fluorescencyjną.
Dane uzyskane ze skanu pokazują płaszczyznę ogniskową przed włączeniem przestrajalnej soczewki gradientu akustycznego. Przejdź do pracy z ustawieniem przestrajalnej soczewki akustycznej w oprogramowaniu sterującym. Najpierw kliknij połącz, a następnie włącz.
Przejdź do sekcji sterowania impulsami i bramkowaniem, zmień tryb wyzwalania wyjścia z RGB na wielopłaszczyznowy. Następnie zmień go z powrotem na RGB, aby umożliwić zmianę fazy wyjściowej. Użyj suwaków, aby ustawić fazę wyjściową między zerem stopni, 90 stopniami i 270 stopniami.
Następnie przejdź do sekcji kontroli częstotliwości. Tam wybierz częstotliwość rezonansową 68 500 Hz. Przejdź na górę ekranu i kliknij zaawansowane.
Następnie wybierz zakładkę ustawień. Na nowym ekranie znajdź maksymalną częstotliwość kolumny zerowej. Dostosuj go, aby zmienić zakres wyszukiwania częstotliwości.
Kliknij, zapisz kalibrację, a następnie zakończ kalibrację. Wróć do regulatorów częstotliwości i zmień częstotliwość rezonansową. Natychmiast zmień go z powrotem na 68 500 Hz, aby kalibracja odniosła skutek.
W sekcji kontroli amplitudy użyj suwaka, aby powoli zwiększyć amplitudę do 35%Następnie kliknij zablokuj rezonans. Gdy częstotliwość jest zablokowana, kliknij odblokuj rezonans. Wróć do oprogramowania do skanowania rastrowego.
Wprowadź dwa zakresy skanowania mikrometrycznego wyśrodkowane na cząstce w X i Y. Użyj kroku o rozmiarze 100 nanometrów. Wyśrodkuj cząstkę w zakresie czterech mikrometrów w Z, z krokiem o wielkości 200 nanometrów. Na obrazie skaningowym, który powstał, obszar oświetlenia reprezentujący cząstkę ma szerokość około jednego mikrometra.
Na tej podstawie dostosuj parametr skali XY tak, aby szacowane pozycje w X i Y mieściły się w zakresie od minus 0,5 do 0,5 mikrometra. Po podobnej procedurze ze skalą Z ustaw pozycjoner nano w pozycji zerowej. Wyłącz zasilanie pozycjonera nano przed kontynuowaniem.
Zastąp nieruchomą próbkę cząstek swobodnie poruszającą się próbką cząstek. Następnie upewnij się, że wszystkie urządzenia są włączone. Uruchom pozycjoner Piezo nano w otwartej pętli.
Na komputerze ustaw oprogramowanie przestrajalnego akustycznego gradientu soczewkowego tak jak poprzednio. Usuń filtr emisji fluorescencji ze ścieżki do detektora zdjęć. Znajdź płaszczyznę ogniskowej, zmieniając położenie Z próbki i maksymalizując intensywność odbicia laserowego od szkiełka nakrywkowego.
Po znalezieniu płaszczyzny ogniskowej zwiększ pozycję ostrości o 15 mikrometrów w roztwór. Wymień filtr emisji fluorescencji. Otwórz niestandardowe oprogramowanie śledzące.
Ustaw parametry szacowania pozycji na wartości znalezione podczas optymalizacji. Teraz ustaw integralne stałe kontrolne, które dyktują szybkość reakcji pozycjonera nano. Zacznij od stałej X.
Wprowadź niską wartość i powoli ją zwiększaj. Gdy w odczycie położenia cząstek rozpoczynają się oscylacje, należy zanotować wartość stałej kontrolnej. Zmniejsz stałą regulacji całkowej do około 70% jej wartości na początku oscylacji.
Powtórz kroki ze stałymi kontrolnymi Y i Z. Ustaw spust, aby rozpocząć śledzenie progu ścieżki na trzy kiloherce. Ustaw minimum ścieżki, spust do zakończenia śledzenia, na 1.5 kiloherca.
Rozpocznij eksperyment, klikając przycisk wyszukiwania, a następnie klikając opcję automatyczne śledzenie. Ten film pokazuje wyniki użycia trójwymiarowego, dynamicznego mikroskopu śledzenia lokalizacji fotonów do śledzenia dyfuzyjnego ruchu 110-nanometrowej fluorescencyjnej nanocząstki w wodzie. Położenie cząstki, mierzone za pomocą odczytu położenia pozycjonera nano, jest pokazane na osiach 3D.
Wstawka to odczyt z naukowej kamery do mchu morskiego. Pokazuje on, że cząstka jest utrzymywana, zablokowana w objętości ogniskowej, przez system śledzący. Cząstka była śledzona, a jej pozycja rejestrowana przez ponad dwie minuty.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż 50 minut, jeśli system jest odpowiednio wyrównany, a parametry kalibracji ustawione. Po opracowaniu technika ta pomoże naukowcom zajmującym się dostarczaniem leków badać szlaki internalizacji i transportu ładunku komórkowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obsługiwać mikroskop 3D do śledzenia pojedynczych cząstek w czasie zerowym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje implementację mikroskopu do śledzenia pojedynczych cząsteczek w 3D w czasie rzeczywistym, zaprojektowanego do monitorowania nanometrowych sond fluorescencyjnych. Technika ta umożliwia ciągłą obserwację pojedynczych dyfundujących obiektów, nawet w warunkach ograniczonej liczby fotonów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia
- Śledzenie pojedynczych cząsteczek
- Wirusologia
Wstęp
- Śledzenie nanocząsteczek w czasie rzeczywistym jest kluczowe w wielu dziedzinach nauki.
- Zrozumienie dynamiki pojedynczych wirionów może dostarczyć wiedzy na temat procesów infekcji.
- Technika ta zwiększa możliwość badania cząsteczek o wysokich prędkościach dyfuzyjnych.
- Ograniczenia w liczbie fotonów są rozwiązywane za pomocą zaawansowanych układów optycznych.
Cel badania
- Opracowanie mikroskopu umożliwiającego śledzenie pojedynczych cząstek w czasie rzeczywistym.
- Ułatwienie badania infekcji wirusowych poprzez monitorowanie poszczególnych wirionów.
- Poprawa rozdzielczości czasowej śledzenia obiektów w skali nanometrów.
Zastosowane metody
- Budowa mikroskopu do śledzenia pojedynczych cząstek w 3D.
- Wykorzystanie laseru półprzewodnikowego o długości fali 488 nm.
- Zastosowanie odchylników elektrooptycznych oraz regulowanej soczewki gradientu akustycznego.
- Kalibracja aparatury na stole optycznym z precyzyjnym pozycjonowaniem.
Główne wyniki
- Mikroskop skutecznie śledzi fluorescencyjne sondy nanostrukturalne.
- Wykazana zdolność do monitorowania cząsteczek przy niskich częstotliwościach zliczania fotonów.
- Umożliwiono ciągłą obserwację pojedynczych wirionów podczas infekcji.
- Uzyskano wgląd w dynamikę procesów wirusowych.
Wnioski
- Niniejszy protokół ustanawia niezawodną metodę śledzenia cząsteczek w czasie rzeczywistym.
- Otwiera on nowe możliwości badawcze w wirusologii i dziedzinach pokrewnych.
- Technika ta może znacząco poszerzyć naszą wiedzę na temat zachowania wirusów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Śledzenie pojedynczych cząstek w 3D w czasie rzeczywistym umożliwia ciągłe monitorowanie obiektów w skali nanometrycznej w warunkach ograniczonego strumienia fotonów, co wypełnia krytyczną lukę w obserwacji szybkich, trójwymiarowych procesów komórkowych. Możliwość ta wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć, dostarczając dynamicznych danych o wysokiej rozdzielczości na temat oddziaływań molekularnych i szlaków transportu. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu i identyfikacji liderów (leadów), dostarczając ilościowych, powtarzalnych danych czasoprzestrzennych, które są niezbędne do podejmowania świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań w obszarze dostarczania leków oraz wirusologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez śledzenie pojedynczych wirionów lub nanocząsteczek w procesach infekcji z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną.
- Wartość operacyjna: Zapewnia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośrednią obserwację dynamiki molekularnej w środowiskach zbliżonych do naturalnych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów badawczych poprzez generowanie ilościowych danych na temat dyfuzji cząstek, wiązania i kinetyki transportu w warunkach fizjologicznie istotnych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowe pomiary zmiennych zależnych (pozycja, trajektoria, współczynnik dyfuzji), które są niezbędne do standaryzacji testów i potwierdzania trafień.
- Wartość operacyjna: Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych analiz przesiewowych dzięki precyzyjnej lokalizacji 3D i śledzeniu sond fluorescencyjnych.
- Skalowalność: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy dzięki stabilnej konfiguracji z pojedynczym wzbudzeniem i pojedynczą detekcją oraz skalibrowanej kontroli elektro-optycznej i akustycznej soczewki gradientowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z pracami przedklinicznymi, umożliwiając obserwację w czasie rzeczywistym internalizacji ładunku komórkowego oraz szlaków transportu istotnych dla dostarczania leków.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Zmniejsza niejednoznaczność w modelach wnikania wirusów i transportu wewnątrzkomórkowego poprzez bezpośrednią wizualizację zachowania pojedynczych cząstek w roztworze.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Wspiera podejmowanie decyzji typu go/no-go, dostarczając powtarzalnych, wysokowiernościowych danych na temat zachowania nanocząstek w warunkach niskiego strumienia fotonów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć – od testowania hipotez, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną – szczególnie w badaniach wymagających dynamicznej rozdzielczości w skali nanometrycznej w trzech wymiarach.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie ciągłego śledzenia pojedynczych cząstek w przestrzeni 3D w warunkach naśladujących fizjologiczne.
- Przesiewy: Zwiększają gotowość testów dzięki powtarzalnej lokalizacji i śledzeniu cząstek, co ułatwia wiarygodną ocenę związków lub nanocząstek.
- Analityka: Generuje wyniki ilościowe (położenie, prędkość, ograniczenie), które pozwalają na obiektywne porównanie warunków eksperymentalnych i kandydatów na leki.
- Badania translacyjne: Łączą się z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie szlaków dostarczania leków i dynamiki infekcji wirusowych w systemach biologicznie istotnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako reużywalna możliwość platformy dzięki modułowemu układowi optycznemu, protokołowi kalibracji oraz przystosowalności do różnych typów próbek i celów śledzenia.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w biologicznych procesach w nanoskali.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki skalibrowanemu skanowaniu rastrowemu, algorytmom szacowania pozycji oraz nanopozycjonowaniu sterowanemu sprzężeniem zwrotnym.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki możliwości wczesnego podejmowania decyzji opartych na danych w zakresie podatności celu na działanie leków oraz wykonalności mechanizmu dostarczania.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka poprzez ilościowe dane śledzenia o wysokiej rozdzielczości, które informują kryteria rozwoju w obszarze dostarczania leków i opracowywania środków przeciwwirusowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie wyrównywania optycznego, bezpieczeństwa pracy z laserami oraz systemów sterowania w czasie rzeczywistym, w tym pętli sprzężenia zwrotnego opartych na FPGA.
- Zależność od specjalistycznej aparatury: laser stały 488 nm, 2D elektrooptyczne deflektory, regulowana soczewka gradientu akustycznego, fotodioda lawinowa oraz stoły nanopozycyjne.
- Konieczność standaryzacji międzyzespołowej w odniesieniu do protokołów kalibracji, parametrów szacowania pozycji oraz strojenia stałych regulacji całkującej pomiędzy użytkownikami i laboratoriami.
- Uwzględnienie kwestii adaptacyjnych podczas przejścia z próbek stałych kulek na swobodnie poruszające się cząstki w lepkim lub złożonym środowisku biologicznym.
- Ograniczenia praktyczne obejmują czułość na szybkość zliczania fotonów oraz konieczność starannej optymalizacji progów śledzenia (np. start 3 kHz, koniec 1,5 kHz) w celu utrzymania blokady przy niskim poziomie sygnału.
