Name: Sekcja i hodowla eksplantatów mysiego allantois do analizy in vitro przyczepu omoczniowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj metodę sekcji i hodowli eksplantatów mysiego allantois do analizy przyczepu omoczniowego in vitro. Technika ta pozwala modelować kluczowy etap formowania się łożyska u ssaków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB688 (do A.G.).

Hodowla myszy została zatwierdzona przez Regierung Unterfranken, a wszystkie analizy zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności ze wszystkimi obowiązującymi w Niemczech i Unii Europejskiej przepisami i regulacjami dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Powlekanie płytek mikromiareczkowych integryną α4β1 do hodowli eksplantatów ex utero allantois
<ol>
	<li>Rozpuść liofilizowaną mysią integrynę α4β1 w stężeniu 200 μg/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Rozcieńczyć do końcowego stężenia 10 μg/ml we wstępnie podgrzanym (37 °C) PBS. Odpipetować 20 μl/basenik rozcieńczonego roztworu integryny α4β1 do wymaganej liczby dołków płytki mikromiareczkowej (1 alantois/basenik). 
	UWAGA: Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas powlekania dołków płytki mikromiareczkowania.</li>
	<li>Inkubować płytki do mikromiareczkowania przez 60 minut w temperaturze 37 °C, umieszczając je w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety. Użyj delikatnego ssania i pochyl płytkę, aby uniknąć dotykania dna studzienki końcówką pipety. Umyć studzienki dwukrotnie, dodając 50 μl wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki hodowlanej, takiej jak zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, i usunąć pożywkę myjącą przez delikatne odsysanie.</li>
	<li>Etap krytyczny: Zablokować wolne miejsca wiązania, dodając 50 μl/basenik 0,1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/DMEM i inkubować przez ≥ 30 minut w temperaturze 37 °C, umieszczając płytki mikromiareczkowania w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych. 
	UWAGA: Eksplantaty allantois mogą przyczepiać się do różnych powierzchni w obecności surowicy. Dlatego konieczne jest zablokowanie niespecyficznych miejsc wiązania, po pokryciu studzienek integryną, a przed dodaniem wypreparowanej allantois do hodowli eksplantatów w pożywce zawierającej surowicę (patrz krok 4.4).</li>
	<li>Utrzymać powleczone studzienki w roztworze blokującym w temperaturze 37 °C do czasu, gdy będą potrzebne w kroku 4.4.</li>
</ol>
2. Wycięcie macicy u ciężarnej myszy w temperaturze dpc 8
UWAGA: Zmniejsz liczbę fałszywie dodatnich ciąż poprzez dyskryminację przyrostu masy ciała15.
<ol>
	<li>Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy. Zdezynfekuj sierść w okolicy brzucha, spryskując ją 70% (v/v) etanolem. 
	UWAGA: Podczas obchodzenia się z myszami należy nosić rękawice. Eutanazja poprzez zwichnięcie szyjki macicy bez środków znieczulających zapobiega chemicznemu zanieczyszczeniu okrzewiastki, które może zakłócać przyczep okrzewiasty.</li>
	<li>Otwórz skórę brzucha, wykonując nożyczkami małe nacięcie na linii środkowej. Użyj palców w rękawiczkach, aby przytrzymać skórę powyżej i poniżej nacięcia i rozsuń skórę w kierunku klatki piersiowej i ogona myszy.</li>
	<li>Chwyć otrzewną kleszczami. Drugą ręką wykonaj nacięcie w kształcie litery V od przodu do tyłu za pomocą nożyczek i odsuń tkankę, aby odsłonić jamę brzuszną. Użyj kleszczy, aby odepchnąć jelita na bok, aby uzyskać dostęp do macicy.</li>
	<li>Zlokalizuj dwa rogi macicy. Przytrzymaj szyjkę macicy (odcinek ogonowy) kleszczami i przetnij więzadła cienkimi nożyczkami. Następnie odłącz oba rogi macicy, przecinając jajowody nożyczkami.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieś macicę do sterylnego 10-centymetrowego naczynia zawierającego sterylny PBS o temperaturze pokojowej (RT). Usuń tkankę tłuszczową, naczynia i nerwy otaczające rogi macicy za pomocą cienkich kleszczy i/lub nożyczek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
</ol>
3. Sekcja zarodków
UWAGA: Wykonaj następujące kroki pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w zakres zoomu 8:1.
<ol>
	<li>Oddziel zarodki, przecinając je nożyczkami między miejscami implantacji. Chwyć muskularną wyściółkę macicy pąków macicy kleszczami i rozsuń ją, aby odsłonić decidua (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B).</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieś pąki macicy do nowego 10-centymetrowego naczynia zawierającego sterylny RT PBS.</li>
	<li>Przymocuj decidua wokół zarodka za pomocą końcówek kleszczy.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie po stronie antymesometrialnej decyduy za pomocą cienkich kleszczy (<silna klasa="xfig">Ryc. 1C) i oderwij decyduę kleszczami, aby odsłonić zarodek (<silna klasa="xfig">Rycina 1D). 
	UWAGA: Biegun mesometrialny decidua jest silnie unaczyniony i może być szerszy u podstawy niż część antymesometrialna, która zawiera zarodek i wydaje się jaśniejsza.</li>
	<li>Wypreparuj zarodek kleszczami (<silna klasa="xfig">Ryc. 1E, F).</li>
	<li>Za pomocą mikrołyżeczki przenieś zarodek do kropli sterylnego PBS znajdującej się w sterylnym naczyniu o średnicy 3,5 cm.</li>
	<li>Przenieś zarodek do świeżej kropli PBS w tym samym naczyniu o średnicy 3,5 cm za pomocą mikrołyżki i wypreparuj zarodek z woreczka żółtkowego za pomocą kleszczy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1G, H).</li>
	<li>Opcjonalnie, w razie potrzeby (np. do genotypowania za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy), przenieść woreczek żółtkowy do sterylnej probówki, zasysając go z ~ 5 μL PBS do dużej kryzy 200 μL końcówki pipety. Przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Tkanka matczyna (tj. woreczek żółtkowy ciemieniowy, w tym błona Reicherta i stożek ektołożyskowy), która może zanieczyścić preparat woreczka żółtkowego, może prowadzić do błędnych wyników genotypowania. Usunięcie tych tkanek najłatwiej jest przeprowadzić preparację zarodka z woreczka żółtkowego.</li>
</ol>
4. Rozwarstwienie oświecenia i posiew ex utero na unieruchomionej integrynie α4β1
<ol>
	<li>Wytnij allantois z podstawnego miejsca przyczepu na tylnym końcu zarodka za pomocą cienkich kleszczyków (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1H).</li>
	<li>Opcjonalnie, jeśli wymagana jest ocena stopnia zaawansowania, należy policzyć pary somitów zarodka poprzez oględziny przy użyciu mikroskopu wyposażonego w optykę z kontrastem fazowym i obiektyw 5× i 10×. 
	UWAGA: Zarodek można przedłużyć za pomocą kleszczy, aby ułatwić liczenie somitów. Przyczepienie i fuzja kosmówkowo-omoczniowa zachodzi między E 8,0 i E 9,0 w zarodkach z ≥ 6 parami somitów. Toczenie rozpoczyna się w zarodkach z 6-8 parami somitów.</li>
	<li>Odpipetować 40 μl/basenik DMEM uzupełniony 10% (v/v) płodową surowicą bydlęcą, L-glutaminą i antybiotykami w wymaganej liczbie wstępnie pokrytych dołków na płytki do mikromiareczkowania (patrz sekcja 1).</li>
	<li>Zebrać pływającą alantois, zasysając ją za pomocą ~ 5 μL PBS do dużego otworu końcówki pipety o pojemności 200 μL. Przenieś 1 allantois/studzienkę.</li>
	<li>Inkubować allantoidy, umieszczając płytki do mikromiareczkowania w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ) np. przez 6, 12 i 24 godziny. Aby zapobiec zakłóceniom w przyczepianiu się omocznika, nie należy przesuwać płytek mikromiareczkowych między tymi punktami czasowymi.</li>
	<li>W każdym punkcie czasowym naciąć przyczepienie allantois (np. brak przyczepu/pływające allantois; częściowo lub całkowicie przyczepione allantois; całkowicie rozłożone allantois) za pomocą mikroskopu wyposażonego w kontrast fazowy lub kontrastowy z interferencją różnicową oraz obiektyw 5× lub 10× (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: Reprezentatywne przykłady świeżo wyizolowanych i w pełni przyłączonych allantoidów pokazano na Rysunek 2. Ex utero, dystalna końcówka allantoides wyizolowanych od myszy C57BL / 6J typu dzikiego przyczepia się w ciągu 4-6 godzin (jest to określane jako częściowe przyczepienie allantois), a pełne przyczepienie całej allantois osiąga się w ciągu ~ 12 godzin hodowli. Po 18-24 godzinach eksplant spłaszczył się i przybrał okrągły kształt (określany jako w pełni rozłożona alantoza) ze splotem naczyniowym CD31-dodatnim9,16.</li>
</ol>
5. Barwienie potwierdzające eksplantowanego allantois dla markera komórek śródbłonka CD31
<ol>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną w pełni rozłożonych eksplantatów i utrwalić komórki, dodając 40 μl/studzienkę 4% (w/v) paraformaldehydu/PBS. 
	UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Nosić rękawice i okulary ochronne, aby uniknąć kontaktu ze skórą i oczami.</li>
	<li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odessać supernatant. Przemyć trzykrotnie, dodając 40 μl/studzienkę PBS i usunąć pożywkę myjącą przez delikatne odsysanie.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek i zablokowanie niespecyficznych miejsc wiązania poprzez dodanie 40 μl/basenik 0,1% (v/v) Triton X-100/0,1% (w/v) BSA/10% (v/v) normalnej surowicy koziej w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć dwukrotnie, dodając 40 μl/studzienkę PBS i usunąć pożywkę myjącą przez delikatne odsysanie. 
	UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany na noc.</li>
	<li>Wybarwić komórki, dodając 20 μl/studzienkę pierwszorzędowych przeciwciał anty-CD31 rozcieńczonych w stosunku 1:50 w 0,1% (w/v) BSA/PBS przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyć trzykrotnie, dodając 40 μl/studzienkę PBS i usunąć pożywkę myjącą przez delikatne odsysanie.</li>
	<li>Wykryć związane przeciwciała pierwszorzędowe, dodając 20 μl / basenik znakowanych fluorescencyjnie drugorzędowych przeciwciał antyszczurzych kóz rozcieńczonych w stosunku 1:200 w 0,1% (w/v) BSA/PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Chronić płytki do mikromiareczkowania przed światłem, owijając je folią aluminiową lub umieszczając w ciemnej komorze. Przemyć trzykrotnie, dodając 40 μl/studzienkę PBS i usunąć pożywkę myjącą przez delikatne odsysanie.</li>
	<li>Osadź komórki, dodając 20 μl/studzienkę pożywki montażowej. Inkubować przez ~ 1 h w temperaturze pokojowej aż do zestalenia się podłoża mocującego. Płytki do mikromiareczkowania przechowywać w temperaturze pokojowej lub 4 °C, chroniąc je przed światłem.</li>
	<li>Zobrazuj splot naczyniowy eksplantatów okrzewka pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w obiektyw 5× lub 10× i odpowiednie filtry fluorescencyjne. 
	UWAGA: Reprezentatywne obrazy CD31-dodatniego splotu naczyniowego w pełni rozłożonego allantois są pokazane na <silna klasa="xfig">Rysunek 3. Można również użyć innych markerów splotu naczyniowego, takich jak przeciwciała skierowane przeciwko Flk-1, Flt, Tie-1 lub Tie-216.</li>
</ol>

<ol><li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+development%3A+lessons+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).</li>
<li>Segerer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+developmental+function+for+murine+phosphoglycolate+phosphatase+in+safeguarding+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An essential developmental function for murine phosphoglycolate phosphatase in safeguarding cell proliferation.</a> Sci Rep. 6, 35160(2016).</li>
<li>Kane, S. V., Acquah, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+transport+of+immunoglobulins%3A+a+clinical+review+for+gastroenterologists+who+prescribe+therapeutic+monoclonal+antibodies+to+women+during+conception+and+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Placental transport of immunoglobulins: a clinical review for gastroenterologists who prescribe therapeutic monoclonal antibodies to women during conception and pregnancy.</a> Am J Gastroenterol. 104 (1), 228-233 (2009).</li>
<li>Xu, X., Vugmeyster, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+in+absorption%2C+distribution%2C+metabolism%2C+and+excretion+studies+of+therapeutic+biologics%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities in absorption, distribution, metabolism, and excretion studies of therapeutic biologics.</a> AAPS J. 14 (4), 781-791 (2012).</li>
<li>Wesolowski, S. R., Kasmi, K. C., Jonscher, K. R., Friedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origins+of+NAFLD%3A+a+womb+with+a+clue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Developmental origins of NAFLD: a womb with a clue.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 81-96 (2017).</li>
<li>Racicot, K., Mor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+associated+with+viral+infections+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Risks associated with viral infections during pregnancy.</a> J Clin Invest. 127 (5), 1591-1599 (2017).</li>
<li>Grandjean, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life-Long+Implications+of+Developmental+Exposure+to+Environmental+Stressors%3A+New+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Life-Long Implications of Developmental Exposure to Environmental Stressors: New Perspectives.</a> Endocrinology. 156 (10), 3408-3415 (2015).</li>
<li>Inman, K. E., Downs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+allantois%3A+emerging+paradigms+in+development+of+the+mammalian+umbilical+cord+and+its+relation+to+the+fetus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The murine allantois: emerging paradigms in development of the mammalian umbilical cord and its relation to the fetus.</a> Genesis. 45 (5), 237-258 (2007).</li>
<li>Arora, R., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+allantois%3A+a+model+system+for+the+study+of+blood+vessel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The murine allantois: a model system for the study of blood vessel formation.</a> Blood. 120 (13), 2562-2572 (2012).</li>
<li>Watson, E. D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+structures+and+transport+functions+in+the+mouse+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Development of structures and transport functions in the mouse placenta.</a> Physiology (Bethesda). 20, 180-193 (2005).</li>
<li>Yang, J. T., Rayburn, H., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+events+mediated+by+alpha+4+integrins+are+essential+in+placental+and+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion events mediated by alpha 4 integrins are essential in placental and cardiac development.</a> Development. 121 (2), 549-560 (1995).</li>
<li>Gurtner, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+murine+VCAM1+gene%3A+essential+role+of+VCAM-1+in+chorioallantoic+fusion+and+placentation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the murine VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in chorioallantoic fusion and placentation.</a> Genes & development. 9 (1), 1-14 (1995).</li>
<li>Kwee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+development+of+the+embryonic+and+extraembryonic+circulatory+systems+in+vascular+cell+adhesion+molecule+%28VCAM-1%29+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice.</a> Development. 121 (2), 489-503 (1995).</li>
<li>Downs, K. M., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+into+early+placental+ontogeny%3A+allantoic+attachment+to+the+chorion+is+selective+and+developmentally+regulated%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An investigation into early placental ontogeny: allantoic attachment to the chorion is selective and developmentally regulated.</a> Development. 121 (2), 407-416 (1995).</li>
<li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).</li>
<li>Downs, K. M., Temkin, R., Gifford, S., McHugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+murine+allantois+by+allantoic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Study of the murine allantois by allantoic explants.</a> Dev Biol. 233 (2), 347-364 (2001).</li>
<li>Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+pre-placental+tissues+reveals+that+the+allantois+is+required+for+maintained+expression+of+Gcm1+and+Tpbpalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha.</a> Placenta. 47, 12-23 (2016).</li>
<li>Zeigler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allantois+and+chorion%2C+when+isolated+before+circulation+or+chorio-allantoic+fusion%2C+have+hematopoietic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential.</a> Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).</li>
<li>Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17671451">Functional atlas of the integrin adhesome.</a> Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W obecności surowicy, która jest bogatym źródłem proadhezyjnych cząsteczek macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak fibronektyna, eksplantaty alantois łatwo przyczepiają się do różnych powierzchni plastikowych, szklanych lub filtracyjnych 9,16. Tak więc, jeśli celem przeprowadzonego testu jest specyficzne zbadanie wpływu modyfikacji genetycznej lub jakiegokolwiek innego leczenia na przyłączanie się oallantois do unieruchomionego α4β1, kluczowe znaczenie ma zabloko...

Łożysko jest niezbędne do wzrostu i rozwoju embrionalnego w środowisku macicy. Stanowi interfejs dla wymiany tlenu, metabolitów i składników odżywczych między krążeniem płodowym i matczynym, a także pełni funkcję narządu endokrynnego i immunologicznego. Każde endogenne lub egzogenne uszkodzenie, które upośledza rozwój łożyska, może prowadzić do wewnątrzmacicznego opóźnienia wzrostu, utraty płodu lub powikłań ciąży, zarówno u myszy, jak i u ludzi1. Podczas gdy liczba docelowych mutacji myszy, które powodują nieprawidłową fizjologię łożyska, stale rośnie2, z 219 genotypami obecnie wymienionymi na stronie internetowej Mouse Genome Informatics (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology/MP:0010038), wiele z tych fenotypów nie jest dobrze poznanych z mechanistycznego punktu widzenia. Oprócz zmian genetycznych, leki małocząsteczkowe, przeciwciała monoklonalne, toksyny, patogeny, nadmiar metabolitów lub różne czynniki środowiskowe mogą wpływać na rozwój i funkcję łożyska3,4,5,6,7. Jednak proste testy in vitro, które modelują krytyczne etapy rozwoju łożyska, są rzadkością.
Rozwój łożyska u myszy rozpoczyna się we wczesnej ciąży, kiedy allantois (prekursor rozwojowy pępowiny) wyłania się z tylnego końca zarodka jako pączek, który rośnie w kierunku kosmówki8. Komórki kosmówkowe w zewnętrznej warstwie pąka omoczniowego pośredniczą w przyczepianiu i rozprzestrzenianiu się okrzewka na powierzchni kosmówki ("fuzja" kosmówka-omoczniowa). Kosmówka następnie składa się w kosmki, w których rośnie unaczynienie allantois, tworząc labirynt, wewnętrzną warstwę łożyska, w której składniki odżywcze i tlen są wymieniane między ściśle przylegającymi do siebie sinusoidami krwi matki a naczyniami embrionalnymi9,10.
Przywiązanie allantois do kosmówki jest początkowym i krytycznym krokiem w tworzeniu labiryntu, a defekty w tym procesie są jedną z najczęstszych przyczyn śmiertelności zarodka w połowie ciąży1. Chociaż opisano szereg mutantów myszy, u których nie występuje przyczepienie kosmówkowo-omoczniowe10, a baza danych MGI zawiera obecnie listę 108 mutantów myszy, które charakteryzują się nieprawidłową fuzją kosmówkowo-omocznikową (http://www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824), interakcją międzykomórkową między cząsteczką adhezyjną komórek naczyniowych-1 (VCAM-1, wyrażoną na mezodermie omocznikowej) a integryną α4β1 (wyrażoną na mezotelium kosmówkowym, który pochodzi z mezodermy pozaembrionalnej) wydaje się być niezbędny do przyczepiania i fuzji kosmówki11,12,13. Barwienie immunohistochemiczne całych zarodków typu dzikiego wykazało, że VCAM-1 ulega ekspresji w dystalnych dwóch trzecich łodygi omoczniowej około dnia embrionalnego (E) 7,513 (stadium 1-4 somitu), i że jego ekspresja pozostaje wysoka podczas przyczepiania kosmówkowo-omoczniowego i -fusion11,12. Brak przyczepienia omocznika do kosmówki jest zwykle wykrywany za pomocą analiz histologicznych zawiązków macicy. Jednak rozmiary allantois są fizjologicznie bardzo zmienne pomiędzy, a nawet w miotach na tym samym etapie rozwoju14, a allantois może przyczepić się do kosmówki tylko wtedy, gdy osiągnie wystarczający rozmiar, aby nawiązać kontakt fizyczny. Odzwierciedlając tę naturalną zmienność, przyczepienie kosmówkowo-omocznikowe ma miejsce gdzieś między ~ E 8,0 a E 9,0 w macicy, a statystycznie wiarygodna ocena tego procesu za pomocą histologii zależy zatem od analizy dużej liczby pojęć w celu uzyskania wystarczającej liczby okazów w odpowiednim stadium rozwoju.
Tutaj opisujemy metodę oceny przylegania omocznika ex utero, która jest mniej zależna od wielkości allantois. Pokazujemy sekcję zarodków myszy i ich allantoidów z macicy ciężarnych myszy ~ 8 dni po stosunku (dpc; dpc 0,5 oznacza wykrycie czopa pochwowego), a następnie hodowlę eksplantatów allantois na unieruchomionych integrynach α4β1. Metoda ta umożliwia szybką, funkcjonalną ocenę przyczepiania i rozprzestrzeniania się wielu eksplantatów okrzewiaków równolegle i w różnych kolejnych punktach czasowych. Protokół może być stosowany do badań przesiewowych pod kątem wpływu docelowych mutacji, leków lub różnych czynników środowiskowych na przyczep allantois ex vivo.

<table><tbody><tr><td>Myszy typu dzikiego C57BL / 6J</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>Nr magazynowy:&nbsp; </td><td></td>000664</tr><tr><td>70 % (v/v) Etanol</td><td>Kleszcze VWR International</td><td>930031006</td><td></td></tr><tr><td>Standard</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>Kleszcze używane do otwierania jamy brzusznej.</td></tr><tr><td>Mikro kleszcze preparacyjne</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Dumont # 5 biologia medyczna forcepty z cienką, ostrą końcówką.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Ostrza proste.</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td>Noyes nożyczki sprężynowe z ostrzami 14 mm do preparowania pąków macicy.</td></tr><tr><td>Łyżka Microspoon</td><td>Carl Roth</td><td>AT18.1</td><td>5 mm Średnica łyżki.</td></tr><tr><td>Płytki do mikromiareczkowania</td><td>ibidi</td><td>81501</td><td>Używamy niepowlekanych, sterylnych szkiełek do angiogenezy (objętość wewnętrzna 50 &mikro; L) z hydrofobową powierzchnią, która nie jest poddawana działaniu hodowli tkankowej w celu redukcji non-&#945; 4&#946; Wiązanie za pośrednictwem 1 z tworzywem sztucznym.</td></tr><tr><td>Naczynie 10 cm</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Sterylne szalki do hodowli tkankowych.</td></tr><tr><td>Naczynie 3,5 cm</td><td>Nunc</td><td>150288</td><td>Sterylne naczynia do hodowli tkankowych.</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z dużą kryzą&nbsp;</td><td>Biozym</td><td>VT0140X</td><td>Końcówki do pipet o niskim stopniu wiązania, 200 &micro;L.</td></tr><tr><td>&#945; 4&#946; 1 integryna</td><td>R& D Systems</td><td>6054-A4</td><td>Murine &#945; 4&#946; 1 integryna rekombinowana i oczyszczona z linii komórkowej jajnika chomika chińskiego.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td>bez Ca2+ i Mg2+.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03600</td><td>Preparat zawiera 4,5 g/L glukozy, 110 mg/L pirogronianu sodu i 3,7 g/L NaHCO3 ale nie zawiera L-glutaminy, która jest dodawana osobno.</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140-122</td><td>100 x (10 000 U/ml Penicyliny i 10 000 &mikro; g/ml streptomycyny) roztwór podstawowy.&nbsp; Przygotuj i przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 &deg; C, aby uniknąć zamarznięcia/rozmrożenia.</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>100 x (200 mM) Roztwór podstawowy. Przygotuj i przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 &deg; C, aby uniknąć zamarznięcia/rozmrożenia.</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td>Stosujemy inaktywowany termicznie FBS (podgrzany do 56 & deg; C przez 30 minut z mieszaniem w celu dezaktywacji dopełniacza).</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>Używamy albuminy wolnej od proteaz i kwasów tłuszczowych. Przygotować 0,1 % (w/v) roztwór w DMEM. Sterylny przefiltruj roztwór przez jednorazowy filtr do hodowli komórkowych o 0,22 &mikro; m wielkość porów i błona o niskim poziomie wiązania z białkami i przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>para-Formaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>0335.2</td><td>Aby przygotować roztwór formaldehydu w PBS, odważ para-formaldehyd w proszku w wentylowanym kapturze i dodaj go do PBS podgrzanego do ok. 60 &deg; C w zlewce na talerzu do mieszania. Dodaj 1 N NaOH kroplami, aż roztwór się klaruje. Pozostaw roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej i przefiltruj przez strzykawkę filtrującą 0,22 mm. Dostosować pH rozcieńczonym HCl do ok. 6,9 i dostosować do końcowej objętości za pomocą PBS. Roztwór rozdzielamy i zamrażamy, ale można go również przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C przez około cztery tygodnie.&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Do pracy z nierozcieńczonym Triton X-100 należy używać końcówek do pipet z szerokim otworem.</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>Blokowanie niespecyficznego wiązania przeciwciał w analizach immunofluorescencyjnych.</td></tr><tr><td>&#945;-CD31 Przeciwciała</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>Oczyszczone szczurze przeciwciała monoklonalne przeciwko myszy, klon MEC 13.3.</td></tr><tr><td>Wtórne kozie przeciwciała antyszczurze</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11006</td><td>Kozie przeciwciała antyszczurze IgG (łańcuchy ciężkie i lekkie), adsorbowane krzyżowo, znakowane fluorescencyjnie Alexa Fluor 488. Możliwe są również inne etykiety fluorescencyjne.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td>Pożywka montażowa do cytochemii. MW ~31,000</td></tr><tr><td>Labovert&nbsp;</td><td>Leitz</td><td>Labovert&nbsp;</td><td>Mikroskop z kontrastem z odwróconymi fazami wyposażony w obiektyw 4x i 10x do zliczania par somitów. Odpowiednie są również inne mikroskopy z kontrastem fazowym (takie jak te, które są rutynowo używane w hodowlach tkankowych). &nbsp;</td></tr><tr><td>M80</td><td>Leica Microsystems</td><td>M80</td><td>Stereoskop o zakresie ogniskowych 8 : 1 (dający powiększenie od 7,5 x do 60 x) do preparowania zarodków i okrzewków.</td></tr><tr><td>DM4000B</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM4000B</td><td>System mikroskopowy do histologii z oświetleniem LED. Używamy obiektywów HCX PL FLUOTAR 5 x/0,15 oraz HC PL FLUOTAR 10 x/0,30. Inne mikroskopy wyposażone w kontrast fazowy i optykę fluorescencyjną mogą być używane do nacinania mocowania alantois.&nbsp;</td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>JVC</td><td>KY-F75U</td><td>Cyfrowa kamera przechwytująca 3-CCD podłączona do mikroskopu LED DM4000B. Używamy oprogramowania Diskus (Hilgers) do obsługi zarówno mikroskopu, jak i kamery.</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Mikroskop konfokalny do obrazowania śródbłonka w splocie naczyniowym eksplantatów allantois w wyższej rozdzielczości. Obrazy immunofluorescencyjne wykonano obiektywem 40x.</td></tr></tbody></table>

sekcja i hodowla eksplantatów mysiego allantois do analizy in vitro przyczepu omoczniowego

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Łożysko jest niezbędne do wzrostu i rozwoju zarodków ssaków. Z tego powodu liczne zmiany genetyczne, a prawdopodobnie także zniewagi środowiskowe, które zaburzają rozwój lub funkcję łożyska, mogą powodować wczesną utratę ciąży u myszy i ludzi. Niemniej jednak brakuje prostych testów in vitro do badań przesiewowych pod kątem potencjalnego wpływu na tworzenie się łożyska. Tutaj skupiamy się na modelowaniu pierwszego i krytycznego kroku w tworzeniu łożyska, który polega na przyczepieniu się allantois do kosmówki. Opisujemy metodę szybkiej oceny przyczepiania eksplantatów omoczniowych do unieruchomionej integryny α4β1, która służy jako substrat mówomimetyczny. To podejście in vitro umożliwia jakościową ocenę przyczepiania i rozprzestrzeniania się wielu eksplantatów olantois w różnych następujących po sobie punktach czasowych. Protokół może być wykorzystany do zbadania wpływu docelowych mutacji myszy, leków lub różnych czynników środowiskowych, które zostały powiązane z powikłaniami ciąży lub utratą płodu, na przyczepienie allantois ex vivo.

Niniejszy protokół opisuje metodę izolacji i eksplantacji zarodkowych allantois myszy ex vivo oraz szczegółowo przedstawia jakościową ocenę przylegania allantois do integryny α4β1, co jest kluczowym procesem podczas zrastania się błony chorioallantoicznej in vivo. Reprezentatywne wyniki przedstawione na Rysunku 1A-H demonstrują kolejne etapy izolacji allantois, począwszy od macicy ciążowej. Tkanki macierzyst...

Opisujemy test in vitro do modelowania przyczepu kosmówkowo-omoczniowego, pierwszego kroku w tworzeniu łożyska. Protokół demonstruje preparację i hodowlę eksplantatów mysich allantoidów na unieruchomionej integrynie α4β1. Przyczep oświecenia jest oceniany mikroskopowo w określonych wcześniej punktach czasowych.

Sekcja i hodowla eksplantatów mysiego allantois do analizy in vitro przyczepu omoczniowego

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

Ogólnym celem tej procedury jest rozbiór i eksplantacja mysiego allantois w celu analizy przyczepu omoczniowego in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju zarodków ssaków, takie jak kontrola przyczepiania się omoczników do tworzenia łożyska. Główną zaletą tej techniki jest to, że modeluje ona pierwszy i krytyczny etap tworzenia łożyska in vitro.Procedurę zademonstruje Kerstin Hadamek, technik z mojego laboratorium. Aby ustawić płytki, najpierw dodaj 20 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu integryny Alpha 4/Beta 1 do każdej studzienki. Zaplanuj jeden allantois na studzienkę.Nie osadzaj żadnego roztworu z pęcherzykami powietrza, ponieważ uniemożliwi to prawidłowe pokrycie. Po załadowaniu studzienek inkubuj płytkę przez godzinę w nawilżonym inkubatorze. Po inkubacji odessać supernatant ze studzienek, trzymając płytkę pod kątem, aby pipeta mogła delikatnie odessać roztwór bez dotykania dna studzienki.Następnie umyj studzienki dwukrotnie za pomocą 50 mikrolitrów ciepłej pożywki hodowlanej. Podczas usuwania środka myjącego należy stosować delikatne odsysanie. Nałożyć 50 mikrolitrów roztworu blokowego na każdą studzienkę.Następnie inkubuj pł

dissection-explant-culture-murine-allantois-for-vitro-analysis

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Hodowla organów płuc wczesnego embrionu jest bardzo użytecznym systemem do badania oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych. Zarówno morfogeneza nabłonka, jak i mezenchymy przebiegają w specyficznych warunkach, które można łatwo manipulować w tym systemie.

Kultura zarodkowych płuc myszy – system do oceny molekularnych mechanizmów rozgałęziania

Mezenchyma czaszki ulega gwałtownym ruchom morfogenetycznym, które prawdopodobnie stanowią siłę napędową dla uniesienia fałdów neuronalnych.1,2W niniejszym opracowaniu opisujemy prostą ex vivo test z eksplantem w celu charakterystyki zachowań komórkowych mezenchymy czaszki podczas neurulacji. Metoda ta znajduje liczne zastosowania, w tym możliwość wprowadzania manipulacji farmakologicznych oraz przeprowadzania analiz z wykorzystaniem obrazowania na żywo.

Test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki

Pierwotna hodowla komórkowa jest użyteczną techniką do analizy określonych populacji komórek, szczególnie z transgenicznych zarodków myszy w określonych stadiach rozwoju. W tym przypadku komory embrionalne są preparowane i dysocjowane, a kulki sprzężone z przeciwciałami rozpoznają i oddzielają komórki śródbłonka do dalszej analizy.

Izolacja embrionalnych komórek śródbłonka komór

Prezentujemy test migracji komórek ex vivo, który pozwala na precyzyjne określenie potencjału migracji komórek grzebienia nerwowego jelit w obecności różnych czynników wzrostu.

Ilościowy test migracji komórek dla mysich jelitowych progenitorów nerwowych

Opisujemy sekcję i hodowlę ex vivo skóry embrionalnej myszy. System hodowli utrzymuje granicę faz powietrze-ciecz na powierzchni tkanki i umożliwia obrazowanie pod mikroskopem odwróconym. Melanoblasty, składnik rozwijającej się skóry, są znakowane fluorescencyjnie, co pozwala na obserwację ich zachowania za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ex vivo Hodowla skóry embrionalnej myszy i obrazowanie na żywo migracji melanoblastów

Ulepszona technologia obrazowania pozwala na trójwymiarowe obrazowanie organów podczas rozwoju. W tym miejscu opisujemy cały system hodowli narządów, który umożliwia obrazowanie na żywo rozwijających się kosmków w jelicie płodu myszy.

System hodowli całego jelita moczowego u myszy płodu do manipulacji ex vivo szlakami sygnałowymi i trójwymiarowego obrazowania na żywo rozwoju kosmków

Hodowla pionowych kropelek ex vivo jest alternatywą dla obecnych technik eksperymentalnych in vitro i in vivo. Protokół ten jest łatwy do wykonania i wymaga mniejszych ilości odczynnika, a jednocześnie umożliwia manipulowanie i badanie unaczynienia, morfogenezy i organogenezy płodu.

Wykorzystanie ex vivo pionowych kultur kropelkowych całych narządów płodu do badania procesów rozwojowych podczas organogenezy myszy

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Opisana jest prosta metoda ustalania pierwotnych ludzkich hodowli łożyskowych (kosmków) i narządów dziesiętnych. Hodowle kosmków i narządów dziesiętnych są nieocenionymi narzędziami do badania patogenezy na styku człowieka z matką i płodem. Wykazano zakażenie fakultatywną bakterią wewnątrzkomórkową Listeria monocytogenes.

Ludzkie posiewy łożyska i narządów dziesiętnych w celu zbadania zakażeń na granicy matczyno-płodowej

Prezentujemy metodę izolacji i hodowli mysiego kanału Wolffa (WD). Demonstrujemy również szczegółową procedurę barwienia immunologicznego całej góry hodowanych/świeżo wyizolowanych WD z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami. Razem techniki te umożliwiają badanie rozwoju, zwijania i różnicowania WD.

Hodowla narządów i barwienie immunofluorescencyjne całego wierzchowca mysich przewodów Wolffa

Ten protokół opisuje użycie hodowanych Aorta-Gonad-Mesonephros do analiz ekspresji, jednostek tworzących kolonie w hodowli i śledzionie oraz długoterminowej rekonstytucji w celu określenia wpływu czynników regulacyjnych i szlaków sygnałowych na rozwój hematopoetycznych komórek macierzystych. Wykazano, że jest to skuteczny system do badania biologii i funkcji krwiotwórczych komórek macierzystych.

Zastosowanie systemu hodowli eksplantatów Aorta-gonad-mesonephros w hematopoezie rozwojowej

Poznaj metodę sekcji i hodowli eksplantatów mysiego allantois do analizy przyczepu omoczniowego in vitro. Technika ta pozwala modelować kluczowy etap formowania się łożyska u ssaków.

Sekcja i hodowla eksplantatów mysiego allantois do analizy in vitro przyczepu omoczniowego

Przeglądaj więcej filmów