Name: Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa w połączeniu z metodami spektrometrii mas do analizy proteomu tkanki gruczolaka przysadki mózgowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Poznaj dwuwymiarową elektroforezę żelową połączoną ze spektrometrią mas do analizy proteomu gruczolaka przysadki mózgowej. Ta metoda umożliwia identyfikację białek o niskiej obfitości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 81572278 i 81272798 dla XZ), granty z chińskiego projektu planu "863" (Grant nr 2014AA020610-1 dla XZ), Fundusze Szpitala Xiangya na Wprowadzenie Talentów (do XZ) oraz Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Hunan (Grant nr 14JJ7008 dla XZ). Autorzy doceniają również wkład naukowy dr Dominica M. Desiderio z Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Tennessee. Począwszy od 2001 roku, X.Z. stale rozwijał i stosował metody 2DE-MS do analizy proteomu gruczolaka przysadki, opracował koncepcję niniejszego manuskryptu, napisał i poprawił manuskrypt, koordynował odpowiednie prace i był odpowiedzialny za wsparcie finansowe i odpowiednie prace. Y.L. brał udział w rewizji rękopisu. Y.H brał udział w zbieraniu piśmiennictwa i rewizji rękopisu. Ostateczny tekst został zatwierdzony przez wszystkich autorów.

<ol><li>Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pituitary+adenoma+proteomics%3A+new+progresses+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives.</a> Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+analysis+of+human+pituitary+adenomas%3A+Current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives.</a> Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).</li>
<li>Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+functional+profiles+of+a+follicle-stimulating+hormone-positive+human+nonfunctional+pituitary+adenoma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma.</a> Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+microscopic+to+endoscopic+transsphenoidal+surgery+for+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas.</a> World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).</li>
<li>Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiproliferative%2C+antiinvasive%2C+and+proapoptotic+activity+of+folate+receptor+%CE%B1-targeted+liposomal+doxorubicin+in+nonfunctional+pituitary+adenoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells.</a> Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+adenoma+nitroproteomics%3A+current+status+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid.+Med.+Cell.+Longev%22%5BJournal%5D)">Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710(2013).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reference+map+of+a+pituitary+adenoma+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A reference map of a pituitary adenoma proteome.</a> Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).</li>
<li>Desiderio, D. M., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+human+pituitary+proteome%3A+The+characterization+of+differentially+expressed+proteins+in+an+adenoma+compared+to+a+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control.</a> Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+analysis+of+the+human+pituitary+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome.</a> Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+and+tanscriptomics+analyses+of+secretagogin+down-regulation+in+human+non-functional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Pituitary%22%5BJournal%5D)">Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas.</a> Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).</li>
<li>Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+molecular+signaling+in+human+clinically+non-functional+pituitary+adenomas+identified+by+gene+expression+profiling+and+proetomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses.</a> Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+analysis+of+the+proteomes+in+clinically+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas.</a> BMC Med. Genomics. 7, (2014).</li>
<li>Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+growth+hormone+isoforms+in+the+human+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary.</a> Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).</li>
<li>Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+pituitary+growth+hormone+variants+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+pituitary+nitroproteome%3A+detection+of+nitrotyrosyl-proteins+with+two-dimensional+Western+blotting%2C+and+amino+acid+sequence+determination+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+ion-trap+mass+spectrometric+characterization+of+human+pituitary+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins.</a> Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+proteomic+variations+of+invasive+relative+to+noninvasive+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas.</a> Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+pathway+networks+mined+from+human+pituitary+adenoma+proteomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data.</a> BMC Med. Genomics. 3, 13(2010).</li>
<li>O’Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).</li>
<li>Klose, J., Kobalz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%3A+an+updated+protocol+and+implications+for+a+functional+analysis+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome.</a> Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).</li>
<li>Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+two-dimensional+gel+electrophoresis+and+multi-dimensional+liquid+chromatography+as+proteomic+separation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Chromatogr.+Sep.+Tech%22%5BJournal%5D)">Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques.</a> Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009(2015).</li>
<li>Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+with+gene-product+mapping+of+the+Mollicutes%3A+Mycoplasma+genitalium%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium.</a> Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+spatial+and+quantitative+reproducibility+between+two+second-dimensional+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot+volume+vs.+amount+of+protein+loaded+onto+a+gel.+A+detailed%2C+statistical+comparison+of+two+gel+electrophoresis+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems.</a> Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).</li>
<li>Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhan%2C+X+%22Experimental+Protocols+for+Medical+Molecular+Biology+in+Chinese+and+English%22">Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English</a>. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Electrophoresis+in+Practice%3A+A+guide+to+Methods+and+Applications+of+DNA+and+Protein+Separations%22">Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations</a>. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).</li>
<li>Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+proteins+can+be+identified+in+a+2DE+gel+spot+within+an+analysis+of+a+complex+human+cancer+tissue+proteome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?</a> Electrophoresis. , (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie występuje konflikt interesów.

2DE, w połączeniu z metodami MS, w tym 2DE-MS PMF i 2DE-MS/MS, został z powodzeniem wykorzystany w naszym długoterminowym programie - wykorzystaniu proteomiki do badania ludzkich zmian proteomicznych NFPA i zmian sieci molekularnych w celu wyjaśnienia mechanizmów molekularnych i odkrycia skutecznych biomarkerów dla NFPA. Proteomika porównawcza oparta na 2DE o dobrej odtwarzalności odgrywa ważną rolę w identyfikacji zmian proteomicznych NFPA 9,10,11,12,13,19, a 2DE w połączeniu z metodą ...

PA to powszechny nowotwór, który występuje w ludzkiej przysadce mózgowej w systemach osi podwzgórze-przysadka, które odgrywają ważną rolę w ludzkim układzie hormonalnym. PA obejmuje klinicznie funkcjonalne i niefunkcjonalne PA (FPA i NFPA)1,2. NFPA jest trudna we wczesnej diagnostyce i terapii ze względu na tylko nieznacznie podwyższony poziom hormonów (np. LH i FSH) we krwi w porównaniu z FPA, który znacznie zwiększył poziom odpowiednich hormonów we krwi3,4,5. Wyjaśnienie mechanizmów molekularnych i odkrycie skutecznych biomarkerów ma istotne znaczenie kliniczne w diagnostyce, terapii i rokowaniu NFPA. Naszym długoterminowym celem jest opracowanie i wykorzystanie metod proteomicznych do badania NFPA w celu odkrycia wiarygodnych biomarkerów, wyjaśnienia jego mechanizmów molekularnych oraz rozpoznania skutecznych celów terapeutycznych, a także markerów diagnostycznych i prognostycznych. 2-DE w połączeniu z metodami MS były szeroko stosowane w naszym długoterminowym programie badawczym dotyczącym ludzkiego proteomu PA 1,2,6,7, w tym ustanowienie map referencyjnych proteomu3,8, analiza profili białek o zróżnicowanej ekspresji9,10,11,12,13, warianty hormonów14,15, modyfikacje potranslacyjne, takie jak fosforylacja14 i nitracja tyrozyny16,17,18, proteomiczna odmiana inwazyjnej w stosunku do nieinwazyjne NFPAs19, oraz heterogeniczność proteomiczna podtypów NFPA13, co doprowadziło do odkrycia wielu ważnych sieci szlaków (dysfunkcja mitochondriów, dysregulacja cyklu komórkowego, stres oksydacyjny i nieprawidłowość systemu sygnalizacji MAPK), które są zmienione w NFPA13,19,20.
2DE rozdziela białka zgodnie z ich punktem izoelektrycznym (pI) (ogniskowanie izoelektryczne, IEF) i masą cząsteczkową (za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu, SDS-PAGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20,21,22,23. Jest to powszechna i klasyczna technika separacji w dziedzinie proteomiki, od czasu wprowadzenia koncepcji proteomu i proteomiki w 1995 roku24. SM jest kluczową techniką ustalania tożsamości białek oddzielonych od 2DE, w tym strategii PMF i MS/MS. Bardzo szybki rozwój instrumentów do MS, szczególnie w aspektach czułości wykrywania i rozdzielczości, w połączeniu z ulepszeniem systemu LC, znacznie poprawia tożsamość białek o niskiej lub bardzo niskiej liczebności w proteomie, aby zmaksymalizować pokrycie proteomu. Rzuca to również wyzwanie naszym tradycyjnym koncepcjom, że tylko jedno lub dwa białka są obecne w plamce żelu 2D w analizie złożonego proteomu tkanki ludzkiej i daje możliwość identyfikacji wielu białek w plamce żelowej 2D w analizie złożonego proteomu tkanki ludzkiej i maksymalizacji pokrycia proteomu NFPA.
Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły 2DE-MALDI MS PMF, 2DE-MALDI MS/MS i 2DE-LC-MS/MS, które zostały z powodzeniem wykorzystane w analizie ludzkiego proteomu NFPA. Protokoły obejmują przygotowanie próbek, pierwszy wymiar (ogniskowanie izoelektryczne, IEF), drugi wymiar (SDS-PAGE), wizualizację białek (barwienie srebrem i barwienie niebieskim Coomassie), analizę obrazu żelu 2D, trawienie trypsyny w żelu, oczyszczanie peptydów tryptycznych, PMF, MS/MS i nasycanie bazy danych3,8,25,26. Co więcej, protokół ten łatwo przekłada się na analizę innych proteomów tkanek ludzkich.

<table><tbody><tr><td>Ettan IPGphor 3&nbsp;</td><td>Izoelektryczny system ustawiania ostrości</td> <td>GE Healthcare</td><td></td>.</tr><tr><td>Ettan DALTsix multigel caster</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System Ettan DALT II</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Pionowy system elektroforezy</td></tr><tr><td>Ettan IPGphor uchwyt na paski</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTsix multigel caster</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Kółko Multigel</td></tr><tr><td>Voyager DE STR MALDI-TOF MS&nbsp;</td><td>ABI, Foster City, CA</td><td>MALDI-MS</td><td></td> PMF</tr><tr><td>MALDI-TOF-TOF</td><td>Autoflex III, spektrometr masowy Bruker</td><td></td><td>MALDI-MS/MS</td></tr><tr><td>LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Spektrometr masowy ESI-MS/MS</td></tr><tr><td>System EASY-nano LC&nbsp;</td><td>Proxeon Biosystems, Odense, Dania</td><td></td><td>Wysokosprawny system chromatografii cieczowej</td></tr><tr><td>Kolumna pułapkowa PepMap C18&nbsp;</td><td>300 &mu; m i.d. & czasy; Długość 5 mm; Dionex Corp., Sunnyvale, Kalifornia, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RP C18 kolumna</td><td>75 &; m i.d., długość 15 cm; Dionex Corp., Sunnyvale, Kalifornia, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KimWipe</td><td>Kimvipe&nbsp;</td><td></td><td>Nierozpuszczalny ręcznik papierowy</td></tr><tr><td>Watter</td><td>Wykonane przez elastyczny instrument</td><td></td><td></td>PURELAB</tr><tr><td>Homogenizator Polytron Model P710/35</td><td>Brinkmann Instruments, Westbury, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDQuest</td><td>Bio-Rad,&nbsp; Hercules, CA</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu żelu 2D</td></tr><tr><td>SEQUEST&nbsp;</td><td>Thermo Proteome Discoverer 1.3 (wersja nr 1.3.0.339)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td> DataExplore (ver. 4.0.0.0) <td>Oprogramowanie do przetwarzania widma MS</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td> Mascot <td>Oprogramowanie do wyszukiwania białek oparte na PMF&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr>Oprogramowanie <td></td><td></td><td>maskotka</td><td>Oprogramowanie do wyszukiwania białek oparte na MS/MS</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Proteome Discoverer v.1.3 beta</td><td>Oprogramowanie Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur v.2.1</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do zarządzania danymi pozyskanymi przez MS/MS&nbsp;</td></tr><tr><td>Uniprot wersja 201410.1_HUMAN.fasta</td><td></td><td></td><td>Baza danych białek ludzkich</td></tr><tr><td>SEQUEST (wersja nr 1.3.0.339)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do wyszukiwania białek oparte na MS/MS I</td></tr><tr><td>MASCOT (wersja 2.3.02)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do wyszukiwania białek oparte na MS/MS II</td></tr><tr><td>C18 ZipTip mikrokolumna</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PeptideMass Standard kit&nbsp;</td>Zestaw do oznaczania białek <td>BCA Pierce Perspective Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Termo&nbsp; Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw 2-D Quant GE</td><td>Healthcare</td><td>80-6483-56</td><td></td></tr><tr><td>BIS-AKRYLAMID</td><td>AMRESCO</td><td>0172</td><td></td></tr><tr><td>AKRYLAMID</td><td>AMRESCO</td><td>0341</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tiomocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>VETEC</td><td>V900119</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>AMRESCO</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>AMRESCO</td><td>0465</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>AMRESCO</td><td>M146</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>AMRESCO</td><td>M133</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Promega, Madison, WI, USA</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Bufor IPG pH 3-10, NL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6000-87</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1235-01</td><td></td></tr></tbody></table>

dwuwymiarowa elektroforeza żelowa w połączeniu z metodami spektrometrii mas do analizy proteomu tkanki gruczolaka przysadki mózgowej

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Ludzki gruczolak przysadki (PA) jest powszechnym nowotworem, który występuje w ludzkiej przysadce mózgowej w systemach osi narządów docelowych podwzgórze-przysadka, i może być klasyfikowany jako klinicznie funkcjonalny lub niefunkcjonalny PA (FPA i NFPA). NFPA jest trudna do wczesnej diagnozy i terapii ze względu na ledwo podnoszący poziom hormonów we krwi w porównaniu z FPA. Naszym długoterminowym celem jest wykorzystanie metod proteomicznych do odkrycia wiarygodnych biomarkerów do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych PA i rozpoznania skutecznych markerów diagnostycznych, prognostycznych i celów terapeutycznych. Zaprezentowano efektywną dwuwymiarową elektroforezę żelową (2DE) w połączeniu z metodami spektrometrii mas (MS) w celu analizy ludzkich proteomów PA, w tym przygotowania próbek, elektroforezy żelowej 2D, wizualizacji białek, analizy obrazu, trawienia trypsyny w żelu, odcisku palca masy peptydowej (PMF) i tandemowej spektrometrii mas (MS/MS). Procedury 2-wymiarowej spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą do elektroforezy żelowej PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS i chromatografii cieczowej 2DE (LC) MS/MS zostały z powodzeniem zastosowane w analizie proteomu NFPA. Za pomocą spektrometru mas o wysokiej czułości zidentyfikowano wiele białek metodą 2DE-LC-MS/MS w każdej plamce żelu 2D w analizie złożonej tkanki PA, aby zmaksymalizować pokrycie ludzkiego proteomu PA.

1. 2DE-MALDI MS PMF: Zgodnie z opisaną powyżej procedurą eksperymentalną, z tkanek NFPA wykazujących ekspresję FSH (kobieta; 50 lat, ACTH (-), GH (-), PRL (-), LH (-), FSH (+) i TSH (-)) wyekstrahowano łącznie 150 µg białek, które rozdzielono za pomocą paska IPG o długości 18 cm (pH 3-10 NL) oraz żelu SDS-PAGE w dużym formacie, a następnie wizualizowano za pomocą barwienia srebrem. Uzyskano powtarzalny i wysokiej jakości wzór żelu 2DE proteomu tkanki NFPA...

Tutaj prezentujemy dwuwymiarową elektroforezę żelową (2DE) w połączeniu ze spektrometrią mas (MS) w celu oddzielenia i identyfikacji proteomu tkankowego ludzkiego gruczolaka przysadki, który przedstawia dobry i powtarzalny wzór 2DE. Wiele białek obserwuje się w każdym miejscu 2DE podczas analizy złożonego proteomu nowotworu przy użyciu MS o wysokiej czułości.

Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa w połączeniu z metodami spektrometrii mas do analizy proteomu tkanki gruczolaka przysadki mózgowej

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Ogólnym celem tej dwuwymiarowej elektroforezy żelowej połączonej z procedurą spektrometrii mas jest oddzielenie i identyfikacja proteomu tkanki ludzkiego gruczolaka przysadki. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie proteomów. Takich jak wysoki poziom proteomu.I odkrycie sytuacji białkowej, białka czwartego i białka przestrzennego. Główną zaletą tej techniki jest to, że dwuwymiarową elektroforezę żelową można łatwo połączyć ze spektrometrią mas o wysokiej czułości w celu identyfikacji proteomu, zwłaszcza białek o niskiej obfitości. Sytuacja białkowa, białko cztery i białko przestrzenne.Implementacje tej techniki zmierzają w kierunku PQ w terapii zwierząt. Ze względu na kluczowe białko dla białka przestrzennego lub wzorca białkowego jest przydatne w diagnozie pacjentów. Pokazujemy, że demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ dwuwymiarowe etapy elektroforezy żelowej są trudne do nauczenia, ponieważ są czasochłonne, pracochłonne i istnieje kilka eksperymentalnych sztuczek.Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 250 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu próbki białka do każdej szczeliny 13-centymetrowego uchwytu na paski IPG. Umieść 18-centymetrowy pasek IPG, żelową stroną do dołu, na każdym roztworze próbki białka, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Następnie dodaj trzy do czterech mililitrów oleju mineralnego, aby pokryć każdy pasek IPG.Następnie zmontuj każdy uchwyt paska IPG w izoelektryczny system ustawiania ostrości ze spiczastym końcem na tylnej płycie i kwadratowym końcem na przedniej płycie. Po ponownym nawodnieniu pasków IPG przez 18 godzin w temperaturze pokojowej, ustaw parametry IEF w izoelektrycznym systemie ogniskowania z łącznym czasem pracy 7,5 godziny i 36 875 woltami. Po IEF wyjmij każdy pasek IPG z izoelektrycznego układu ogniskowania i usuń nadmiar oleju mineralnego nierozpuszczalnym ręcznikiem papierowym.Następnie zawiń każdy pasek w arkusz folii i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby odlać 12% żel PAGE, dodaj podwójnie destylowaną wodę, 1,5-molowy bufor trisowodorowy, 40% akrylamid, roztwór podstawowy bis-akryloamidu, 10% nadsiarczan immodium i dotrzyj do zlewki. Delikatnie wymieszaj roztwór żelu, uważając, aby nie powstały bąbelki.Delikatnie wlej roztwór żelu do komory wieloodlewniczej do oczekiwanej wysokości żelu 19 centymetrów. Natychmiast dodaj około trzech mililitrów podwójnie destylowanej wody do komory wieloodlewniczej, aby pokryć każdy żel rozdzielczy i pozwól każdemu żelowi polimeryzować przez około godzinę. Ten krok jest bardzo ważny, aby przygotować wysokiej jakości żel SDS-PAGE, a wodę należy natychmiast dodać na wierzch każdego żelu.Przygotuj dwa litry buforu do elektroforezy, a następnie dodaj bufor do zbiornika buforowego jednostki separacji elektroforezy. Po wyjęciu skoncentrowanych pasków IPG z zamrażarki, umieść je w plastikowym naczyniu zawierającym jeden mililitr redukującego buforu równowagi i śladową ilość błękitu bromofenolowego i równoważ je przez 10 minut, delikatnie kołysząc. Po usunięciu redukującego buforu równowagi dodać cztery mililitry buforu równowagi ekskalicyjnej i śladową ilość błękitu bromofenolowego do pasków IPG i równoważyć je przez 10 minut delikatnym kołysaniem.Podczas równowagi żelu należy zdemontować komorę odlewniczą i wyjąć przygotowaną kasetę z żelem rozdzielczym. Wypłucz kasetę z żelem trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną, a następnie usuń wodę dostępową z kasety żelowej nierozpuszczalnym ręcznikiem papierowym i umieść ją w stojaku na żel. Następnie spłucz zrównoważone paski IPG buforem do elektroforezy i usuń nadmiar płynu z każdej powierzchni paska IPG nierozpuszczalnym ręcznikiem papierowym.Umieść pasek IPG na rozdzielczym żelu SDS-PAGE, tak aby plastikowa strona paska IPG stykała się z dłuższą szklaną płytką spiczastym końcem w lewo. Teraz szybko dodaj trzy do czterech mililitrów gorącego 1% buforu agarozowego i buforu do elektroforezy SDS, aby uszczelnić pasek IPG na wierzchu każdego żelu SDS-PAGE i umieść górną stronę paska IPG na górze krótszej szklanej płytki, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Te kroki są bardzo ważne, aby uszczelnić pasek IPG z żelem SDS-PAGE.Gorące roztwory agarozy należy natychmiast dodać, a pasek IPG należy natychmiast umieścić w górnej części żelu SDS. Po polimeryzacji należy włożyć zmontowaną kasetę żelową pionowo między plastikowe uszczelki w pionowym systemie elektroforezy. Umieść górną część żelu z paskiem IPG obok katody.Następnie należy wyregulować poziom bufora do elektroforezy, aby zanurzyć kasetę żelową poprzez dodanie odpowiedniej objętości buforu do systemu elektroforezy. Podłącz i ustaw zasilacz w trybie stałego napięcia i pracuj pod napięciem 200 woltów przez około 370 minut, monitorując barwnik. Po zakończeniu biegu wyjmij kasetę z żelem z systemu elektroforezy i delikatnie wyjmij żel z kasety żelowej, uważając, aby nie rozerwać żelu.Ostrożnie przenieś żel na tackę zawierającą 250 mililitrów roztworu utrwalającego i delikatnie potrząsaj żelem przez 20 minut. Następnie wyrzuć roztwór i dodaj 250 mililitrów 50% metanolu do tacy. Następnie delikatnie potrząsaj żelem przez 10 minut.Po wstrząśnięciu żelem w wodzie podwójnie destylowanej dodać 250 mililitrów buforu uczulającego zawierającego 0,02% siarczanu sodu. Delikatnie potrząsaj żelem przez minutę. Po dwukrotnym wstrząśnięciu żelem w podwójnie destylowanej wodzie dodaj 250 mililitrów roztworu reakcyjnego srebra i delikatnie potrząsaj żelem przez 20 minut.Po wstrząśnięciu żelem w podwójnie destylowanej wodzie dodaj 250 mililitrów roztworu rozwojowego i delikatnie wstrząsaj, aż do uzyskania pożądanego zabarwienia, co zwykle trwa od jednej do trzech minut. Teraz dodaj 250 mililitrów 5% kwaśnego kwasu, aby zakończyć barwienie i delikatnie potrząsaj żelem przez 10 minut. Po wstrząśnięciu żelem w podwójnie destylowanej wodzie dodaj 250 mililitrów 8,8% glicerolu i przechowuj żel w temperaturze czterech stopni Celsjusza do analizy.Powtarzalny i dobry dwuwymiarowy wzór żelu proteomu tkankowego NFPA uzyskano z elektroforezy żelowej z około 1200 plamkami białkowymi wykrytymi na dwuwymiarowej mapie żelu, które były rozmieszczone głównie w obszarze pH od czterech do ośmiu i masy od 15 do 150 kilodaltonów. W sumie zidentyfikowano 192 nadmiarowe białka ze 141 z 337 analizowanych plamek żelowych w analizie MALDI-MS PMF, a w pozostałych 196 miejscach nie zidentyfikowano żadnego białka. Barwienie kolorem niebieskim commassie dało powtarzalny i wysokiej jakości dwuwymiarowy wzór żelu inwazyjnego proteomu tkankowego NFPA i około 1100 plamek białkowych wykrytych na dwuwymiarowej mapie żelu, które były rozmieszczone głównie w zakresie pH od czterech do ośmiu i masy od 15 do 150 kilodaltonów.Średnio jedno białko na plamkę zidentyfikowano za pomocą analizy MALDI tof tof MS MS. Gdzie tyle samo białek w każdym odpowiadającym im miejscu zidentyfikowano za pomocą analizy LC-ESI-MS/MS. Dane te wyraźnie pokazują, że każda dwuwymiarowa plamka żelu zawiera wiele białek w złożonym proteomie ludzkiej tkanki nowotworowej.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 32 godzin w celu dwuwymiarowej elektroforezy żelowej, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o postępowaniu zgodnie z instrukcjami, zwłaszcza zgodnie z protokołem. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak stabilne znakowanie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak kodyfikacja białek w proteomie.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mieszanką białek do zbadania na większą skalę modyfikacji potranslacyjnych białek o niskiej liczebności, specjalizacji białek, przestrzenności białka i białka czwartego w warunkach modelowych, pacjentach i układach narządów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać dwuwymiarową elektroforezę żelową w połączeniu ze spektrometrią mas, uzyskując dobry i powtarzalny dwuwymiarowy wzór elektroforezy żelowej i identyfikując wiele białek w każdym miejscu. Nie zapominaj, że praca z SDS achreomią i TEMED może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie plastikowych rękawiczek.

two-dimensional-gel-electrophoresis-coupled-with-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie demonstrujemy dwuwymiarową metodę elektroforezy żelowej, która oddziela pojedyncze białka od złożonej mieszaniny białek uzyskanej z tkanek nowotworowych ludzkiego niefunkcjonalnego gruczolaka przysadki (NFPA). Białka są rozdzielane na podstawie ich ładunku elektrycznego w pierwszym wymiarze i dalej rozdzielane na podstawie mas cząsteczkowych w drugim wymiarze.

Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika rozdzielania do analizy białek w złożonej mieszaninie białek na podstawie ładunku i masy cząsteczkowej

Źródło: Wulf, M., et.al.  Protokół oparty na mikrodysekcji laserowej do analizy LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny. J. Vis. Exp. (2021). Ten film przedstawia analizę próbek peptydów z granulek neuromelaniny (NMG) wyizolowanych z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej. Peptydy są najpierw rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), a następnie analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu określenia ich stosunku masy do ładunku (m / z). Docelowe...

Analiza LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny wyizolowanych z ludzkiej tkanki mózgowej

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Tutaj opisujemy protokół, który łączy dwie techniki proteomiczne, mianowicie dwuwymiarową elektroforezę (2DE) i spektrometrię mas (MS), w celu identyfikacji różnie wyrażonych/potranslacyjnych zmodyfikowanych białek wśród dwóch lub więcej grup próbek pierwotnych. Takie podejście, wraz z eksperymentami funkcjonalnymi, pozwala na identyfikację i charakterystykę markerów prognostycznych/celów terapeutycznych.

Od plamki 2DE-Gel do funkcji białka: lekcja wyciągnięta z HS1 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Dogłębne analizy proteomów komórek nowotworowych ułatwiają identyfikację nowych celów leków i biomarkerów diagnostycznych. Opisujemy eksperymentalny przepływ pracy do analizy ilościowej (fosfo-)proteomów w subpopulacjach komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych. Osiąga się to poprzez połączenie strategii wzbogacania komórek z ilościową spektrometrią mas opartą na Super-SILAC.

Ilościowe profilowanie spektrometryczne mas proteomów komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Protokół ma na celu wprowadzenie użycia potrójnego kwadrupolowego spektrometru masowego do monitorowania wielu reakcji (MRM) białek z próbek klinicznych. Zapewniliśmy systematyczny przepływ pracy, począwszy od przygotowania próbki po analizę danych dla próbek klinicznych, z zachowaniem wszystkich niezbędnych środków ostrożności, które należy podjąć.

Ilościowy przebieg proteomiki z wykorzystaniem wykrywania białek z ludzkiej tkanki mózgowej w oparciu o monitorowanie wielu reakcji

Ta metoda opisuje prostą i szybką strategię charakterystyki i badania proteoform histonów.

Odsłonięcie proteoform histonów przy użyciu elektroforezy żelowej 2D-TAU

Tutaj tworzymy metodę proteomiczną opartą na spektrometrii mas, używając izolowanych obszarów zainteresowania w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki. Protokół ten służy do analizy proteomu z określonych obszarów tkanek w zarchiwizowanych odcinkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

Protokół ten skutecznie przygotował wystarczającą ilość wysokiej jakości tkanki neowaskularnej z próbek glejaka za pomocą mikrodyssekcji laserowej do ilościowej analizy proteomicznej angiogenezy guza, przezwyciężając ograniczenia badań tradycyjnie koncentrujących się głównie na czynnikach angiogennych oraz dostarczając szeroko zakrojonego profilu proteomicznego angiogenezy glejaka.

Przygotowanie tkanek neowaskularnych z tkanek glejaka ludzkiego do ilościowej analizy proteomiki angiogenezy guza

Poznaj dwuwymiarową elektroforezę żelową połączoną ze spektrometrią mas do analizy proteomu gruczolaka przysadki mózgowej. Ta metoda umożliwia identyfikację białek o niskiej obfitości.

Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa w połączeniu z metodami spektrometrii mas do analizy proteomu tkanki gruczolaka przysadki mózgowej (Wideo) | JoVE Journal

Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa w połączeniu z metodami spektrometrii mas do analizy proteomu tkanki gruczolaka przysadki mózgowej

Przeglądaj więcej filmów