Name: Wizualizacja tworzenia się biofilmu u Candida albicans za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji tworzenia się biofilmu u Candida albicans w czasie rzeczywistym przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego. Technika umożliwia testowanie skuteczności środków przeciwdrobnoustrojowych i ocenę mutantów genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Nobile za pomocne dyskusje na temat testów biofilmu. Badanie to było wspierane przez National Institutes of Health (NIH) grant R21 AI125801 (dla C.J.N.). Projekt D.L.R. był wspierany przez stypendium doktoranckie w Instytucie Uniwersytetu Kalifornijskiego dla Meksyku i Stanów Zjednoczonych (UC-MEXUS) oraz Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).

<ol><li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+Biofilms+and+Human+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans Biofilms and Human Disease.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).</li>
<li>Kojic, E. M., Darouiche, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+infections+of+medical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Candida infections of medical devices.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).</li>
<li>Fox, E. P., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFox%2C+EP+%22Candida+albicans%3A+Symptoms%2C+Causes+and+Treatment+Options%22">Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options</a>. Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. , Nova Science Publishers. 1-24 (2013).</li>
<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilms%3A+development%2C+regulation%2C+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).</li>
<li>Uppuluri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersion+as+an+important+step+in+the+Candida+albicans+biofilm+developmental+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle.</a> PLoS Pathog. 6 (3), e1000828(2010).</li>
<li>Andes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+in+vivo+central+venous+catheter+Candida+albicans+biofilm+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model.</a> Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).</li>
<li>Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+in+vivo+Candida+albicans+biofilm+denture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model.</a> Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).</li>
<li>Nett, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+indwelling+urinary+catheter+model+of+Candida+albicans+biofilm+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection.</a> Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).</li>
<li>Krom, B. P., Willems, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Models+for+Candida+Biofilm+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In Vitro Models for Candida Biofilm Development.</a> Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).</li>
<li>Hawser, S. P., Douglas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Candida+species+on+the+surface+of+catheter+materials+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro.</a> Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).</li>
<li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).</li>
<li>Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+a+Candida+biofilm+microtiter+plate+model+for+measurement+of+antifungal+susceptibility+by+tetrazolium+salt+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay.</a> J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).</li>
<li>Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+candidal+biofilm+microtiter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized candidal biofilm microtiter assay.</a> J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).</li>
<li>Lohse, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+Optimizations+of+Candida+albicans+In+Vitro+Biofilm+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).</li>
<li>Winter, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Identification+of+Biofilm-Specific+Proteolysis+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans.</a> mBio. 7 (5), (2016).</li>
<li>Nobile, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recently+evolved+transcriptional+network+controls+biofilm+development+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans.</a> Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).</li>
<li>Fox, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+regulatory+network+temporally+controls+Candida+albicans+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation.</a> Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).</li>
<li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation+by+the+C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p.</a> Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).</li>
<li>Baker, K. <a target="_blank" href="https://www.cshlpress.com/link/atbench2.htm">At the bench: A laboratory navigator</a>. 27, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
</ol>

Clarissa J. Nobile jest założycielką BioSynesis, Inc., firmy zajmującej się opracowywaniem inhibitorów i diagnostyki biofilmów C. albicans .

Opisany tutaj konfigurowalny test biofilmu mikroprzepływowego pozwala na wizualizację tworzenia biofilmu w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczej komórki po wystawieniu na działanie przepływu laminarnego o stałej szybkości i stałej temperaturze. Stanowi on potężny środek do badania rozwoju biofilmów w szczepach typu dzikiego i zmutowanego oraz wpływu leczenia środkami przeciwdrobnoustrojowymi na biofilmy w warunkach, które naśladują warunki fizjologiczne obserwowane w warunkach klinicznych. W przeciwieństwie do więk...

Candida albicans jest komensalnym członkiem ludzkiej mikrobioty, jednak jest również patogenem oportunistycznym, zdolnym do wywoływania powierzchownych i poważnych infekcji grzybiczych1,2. Główną cechą zjadliwości C. albicans jest jego zdolność do tworzenia odpornych i odpornych na leki biofilmów, społeczności komórek przylegających do powierzchni i zamkniętych w materiale macierzy zewnątrzkomórkowej1,3. Biofilmy C. albicans są wysoce ustrukturyzowane, zawierają kilka warstw wielu typów komórek (okrągłe pączkujące komórki w postaci drożdży, owalne pseudostrzępkowe komórki i rurkowe komórki strzępkowe)4. Rozwój biofilmu C. albicans rozpoczyna się od przylegania okrągłych komórek drożdży do powierzchni (wysiewu biofilmu), po czym następuje proliferacja tych komórek na powierzchni, a następnie dojrzewanie niedojrzałej struktury biofilmu do w pełni uformowanego biofilmu, który jest otoczony materiałem macierzy zewnątrzkomórkowej4. Dojrzały biofilm składa się głównie z wydłużonych komórek strzępkowych, które tworzą gęste i łączące się sieci, zapewniając stabilność architektoniczną biofilmu4. Przez cały cykl życia biofilmu okrągłe pączkujące komórki drożdży rozpraszają się z dojrzałego biofilmu i mogą przemieszczać się do innych regionów ciała, powodując rozsiane infekcje lub zasiewając nowe biofilmy w innych miejscach4,5. C. albicans może tworzyć biofilmy na powierzchniach biotycznych, takich jak powierzchnie błony śluzowej i w całej tkance gospodarza, oraz na powierzchniach abiotycznych, takich jak cewniki, rozruszniki serca, protezy i protezy stawów. Ze względu na oporne właściwości biofilmów, są one niezwykle trudne do wyeliminowania, a w wielu przypadkach jedyną skuteczną strategią leczenia jest usunięcie zainfekowanego urządzenia4. Dlatego tak ważne jest zbadanie procesu powstawania biofilmu w warunkach podobnych do tych, które obserwuje się w warunkach klinicznych.
Istnieje kilka krytycznych modeli zwierzęcych in vivo wykorzystywanych do badania tworzenia biofilmu C. albicans6,7,8; jednak te badania mogą być kosztowne, czasochłonne i ograniczone przez liczbę szczepów i środków przeciwdrobnoustrojowych, które można przetestować w danym momencie. Z drugiej strony, testy biofilmu in vitro pozwalają na szybką, wysokoprzepustową ocenę związków przeciwgrzybiczych i zmutowanych szczepów oraz są znacznie bardziej opłacalne i etyczne niż testy biofilmu przeprowadzane na modelach zwierzęcych9,10,11,12,13,14. Tutaj opisujemy test in vitro, który opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy, aby obserwować czasowe tworzenie się biofilmu pod przepływem laminarnym za pomocą konfigurowalnego urządzenia mikroprzepływowego14,15. Test pozwala na wizualizację każdego etapu tworzenia biofilmu, w tym początkowego etapu przylegania, proliferacji komórek, dojrzewania biofilmu i dyspersji komórek. Test jest również przydatny do wizualizacji zmian morfologii komórek w trakcie rozwoju biofilmu.
Płytki mikromiareczkowe, które są zazwyczaj używane do testów biofilmu in vitro, mimo że są wysokoprzepustowe, nie pozwalają na kontrolowane warunki przepływu. Tradycyjne systemy komórek z przepływem laminarnym pozwalają na ciągłą ocenę tworzenia się biofilmu w warunkach kontrolowanego przepływu, ale ich konfiguracja jest często czasochłonna i zwykle mają ograniczoną kontrolę zakresu dynamiki i przepustowość. Zastosowane tutaj urządzenie mikroprzepływowe pokonuje te ograniczenia, łącząc płytki o wysokiej przepustowości (zawierające 48 dołków) z wbudowaną komorą przepływu laminarnego i jest wysoce powtarzalne, wszechstronne i konfigurowalne.
Tutaj opisujemy protokół użycia dostępnego na rynku automatycznego urządzenia mikroprzepływowego do oceny tworzenia biofilmu dzikiego szczepu C. albicans, wpływu znanego środka przeciwgrzybiczego na rozwój biofilmu oraz tworzenie biofilmu w dwóch zmutowanych szczepach (bcr1Δ/Δ i efg1 Δ/Δ), które wcześniej zgłaszano jako posiadające defekty biofilmu in vitro i in vivo16, 17,18. Opisany protokół może być wykorzystany do zbadania skuteczności środków przeciwdrobnoustrojowych w hamowaniu tworzenia biofilmu przez cały okres rozwoju biofilmu oraz do identyfikacji genów wymaganych do prawidłowego rozwoju biofilmu poprzez badania przesiewowe bibliotek mutantów.

<table><tbody><tr><td>BioFlux 1000z</td><td>Fluxion</td><td></td><td>Zautomatyzowane urządzenie mikroprzepływowe do analizy żywych komórek</td></tr><tr><td>48-dołkowa płytka 0-20 dyne</td><td>Fluxion</td><td>910-0047</td> Oprogramowanie do montażu <td>płytek mikroprzepływowych</td></tr><tr><td></td><td>Fluxion</td><td>w wersji 7.8.4.0</td><td>Oprogramowanie do analizy wizualizacji</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Ekstrakt</td> <td>drożdżowyKryterium</td><td>C7341</td><td></td></tr><tr><td>Pepton baktonowy</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza (D-glukoza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D163</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>Bulion odżywczy</td><td></td><td>Kryterium C6471</td><td></td></tr><tr><td>Difco D-Mannitol</td><td>BD Biosciences</td><td>217020</td><td></td></tr><tr><td>Kryterium agarowe</td><td></td><td>C5001</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pętle inokulacyjne</td><td>VWR</td><td>30002-094</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego z przezroczystą pokrywką</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety jednorazowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>Papier do soczewek</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikropłytkowy i kuwetowy</td><td>Inkubator wytrząsający BioTek</td><td>EPOCH2TC</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>M12820004</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja tworzenia się biofilmu u candida albicans za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans jest najczęstszym patogenem grzybiczym u ludzi, powodującym około 15% przypadków sepsy nabytej w szpitalu. Główną cechą zjadliwości C. albicans jest jego zdolność do tworzenia biofilmów, strukturalnych zbiorowisk komórek przyczepionych do powierzchni biotycznych i abiotycznych. Biofilmy C. albicans mogą tworzyć się na tkankach gospodarza, takich jak warstwy błony śluzowej, oraz na wyrobach medycznych, takich jak cewniki, rozruszniki serca, protezy i protezy stawów. Biofilmy stanowią poważne wyzwanie kliniczne, ponieważ są wysoce odporne na zakłócenia fizyczne i chemiczne i mogą działać jako rezerwuary do zasiewania rozsianych infekcji. Do badania tworzenia biofilmu C. albicans wykorzystano różne testy in vitro, takie jak testy mikromiareczkowe, pomiary suchej masy, testy żywotności komórek i konfokalna skaningowa mikroskopia laserowa. Wszystkie te testy są testami pojedynczego punktu końcowego, w których tworzenie się biofilmu jest oceniane w określonym punkcie czasowym. W tym miejscu opisujemy protokół badania tworzenia się biofilmu w czasie rzeczywistym za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego w warunkach przepływu laminarnego. Metoda ta pozwala na obserwację powstawania biofilmu w miarę rozwoju biofilmu w czasie, przy użyciu konfigurowalnych warunków, które naśladują warunki gospodarza, takie jak te spotykane w cewnikach naczyniowych. Protokół ten może być wykorzystany do oceny defektów biofilmu mutantów genetycznych, a także hamującego wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych na rozwój biofilmu w czasie rzeczywistym.

Przeprowadziliśmy opisany tutaj mikroprzepływowy test biofilmu z użyciem szczepu dzikiego typu C. albicans w dwóch rodzajach pożywek (RPMI-1640 i pożywka Spider), szczepu dzikiego typu w obecności znanego leku przeciwgrzybiczego amfoterycyny B (16 µg/mL) w pożywce RPMI oraz dwóch szczepów mutantów, u których wcześniej zgłoszono defekty w tworzeniu biofilmu (bcr1Δ/Δ i efg1 Δ/Δ) w pożywce Spider.
Wideo 1...

Ten protokół opisuje użycie konfigurowalnego zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego do wizualizacji tworzenia biofilmu u Candida albicans w warunkach fizjologicznych gospodarza.

Wizualizacja tworzenia się biofilmu u Candida albicans za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Ogólnym celem tego protokołu jest wizualizacja tworzenia się biofilmu Candida albicans w czasie rzeczywistym w warunkach fizjologicznych gospodarza. Metoda ta umożliwia obserwację procesu powstawania biofilmu w czasie rzeczywistym i może być wykorzystana do testowania skuteczności środków przeciwdrobnoustrojowych lub do oceny mutantów genetycznych. Technika ta może być wykorzystana do badania przesiewowego potencjalnych środków terapeutycznych pod kątem aktywności przeciwko biofilmom w sposób wysokoprzepustowy, a ich skuteczność może być mierzona, wizualizowana i porównywana z obecnymi metodami leczenia.Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do badania tworzenia biofilmu w kilku różnych warunkach, które są interesujące dla badaczy. Chociaż metoda ta została opracowana specjalnie do badania tworzenia biofilmu Candida albicans, można ją również zastosować do innych mikroorganizmów tworzących biofilm, w tym innych gatunków grzybów, a także bakterii. Na początek przygotuj pojedyncze kultury kolonijne różnych szczepów C.albicans z komórek posianych na dekstrozie peptonu z ekstraktem drożdżowym lub pożywką z agaru YPD zgodnie ze standardowymi praktykami mikrobiologicznymi.Następnie włącz układ mikroprzepływowy, który obejmuje sterownik, dwa zasilacze, mikroskop, kamerę i komputer podłączony do systemu. Po załadowaniu komputera otwórz oprogramowanie sterujące systemem. Znajdź numer kodu kreskowego używanej tabliczki i wprowadź numer, gdy pojawi się monit w oprogramowaniu.Następnie w module sterującym należy ustawić temperaturę układu mikroprzepływowego na 37 stopni Celsjusza. Następnie kliknij studzienki wlotowe I1, I7, I13 i I19 i przepływaj sterylne powietrze przez rurki z płytą interfejsową przez pięć minut, aby usunąć kondensację. Gdy cała kondensacja wyparuje, umieść 48-dołkową płytkę mikroprzepływową 0-20 dyny na stoliku mikroskopu.W przypadku 12-godzinnego eksperymentu tworzenia biofilmu zacznij od dodania 600 mikrolitrów wstępnie podgrzanego podłoża do studzienek wlotowych. Powoli opuść oczyszczoną płytkę interfejsu na 48-dołkową płytkę mikroprzepływową. Następnie przesuń płytkę interfejsu lekko w lewo, aż rurki zostaną umieszczone na górze studni wlotowej i wylotowej i zostaną zablokowane na swoim miejscu.W sekcji oprogramowania dotyczącej kontroli ścinania ustaw tryb przepływu na stały i ustaw maksymalne ścinanie na jedną dynę na centymetr kwadratowy. Następnie kliknij studzienki wlotowe z mediami, aby rozpocząć przepływ mediów ze studzienek wlotowych do studni wylotowych w celu zalania kanału. Po pięciu minutach przepływu kliknij przycisk stop w sekcji sterowania płytką studzienki w oprogramowaniu.Następnie zdejmij płytkę interfejsową i obserwuj dołki płytki mikroprzepływowej. W studzienkach wylotowych powinna być widoczna tylko niewielka kropla nośnika. Aby przetestować szczepy C.albicans typu dzikiego i zmutowanego, dodaj 50 mikrolitrów hodowli komórkowej SC5314 typu dzikiego w pożywce pająka do dwóch studzienek wylotowych, dodaj mutanta bcr1 w pożywce pająka do dwóch studzienek wylotowych i dodaj mutanta EFG1 w pożywce pająka do dwóch studzienek wylotowych.Umieść płytkę interfejsu z powrotem na płytce mikroprzepływowej i zablokuj pokrywę na swoim miejscu. Wróć do sekcji kontroli ścinania w oprogramowaniu, ustaw tryb przepływu na stały i ustaw maksymalne ścinanie na dwie dyny na centymetr kwadratowy. Kliknij studzienki wylotowe z komórkami, aby rozpocząć przepływ pożywki z wylotu do studni wlotowych, aby rozpocząć wysiew C. albicans.Po trzech sekundach kliknij przycisk stop w sekcji kontrolnej płytki studziennej, aby zapobiec przedostawaniu się komórek do studzienek wlotowych. Pozwól komórkom pozostać nieruchomymi bez przepływu przez 10-20 minut w viewkanał w celu początkowego przylegania komórek. W oknie modułu obrazowania otwórz moduł akwizycji wielowymiarowej i kliknij zakładkę etapu w menu po lewej stronie.W sekcji stage załaduj główną listę etapów dla 48-dołkowej płytki mikroprzepływowej 0-20 dyne. Następnie otwórz regulację przeładowania próbki i przenieś stolik do modułów pozycji bezwzględnej. W module regulacji przeładowania próbki naciśnij przycisk na żywo, aby zobaczyć podgląd obrazu z celownikiem.Za pomocą joysticka ustaw płytkę studzienki tak, aby końcówka strzałki przylegająca do viewkanał czwarty wyrównuje się z krzyżykiem na oprogramowaniu. Następnie przejdź do menu przenieś stage do pozycji bezwzględnej i naciśnij przycisk ustaw początek. Następnie wróć do modułu regulacji przeładowania próbki, kliknij sekcję początkowego punktu odniesienia w menu po lewej stronie i załaduj plik dla 48-dołkowej płytki mikroprzepływowej 0-20 dyny.W sekcji stolika modułu akwizycji wielowymiarowej kliknij dwukrotnie pozycję stolika 22.2, aby zbliżyć stolik do oglądania mikroskopu i ostrość kamery na znacznik strzałki, patrząc na kanał 22. Następnie użyj joysticka, aby ustawić płytkę studzienki tak, aby końcówka strzałki przylegająca do viewkanał 22 zrównała się z krzyżykiem. Skopiuj współrzędną Y w module akwizycji wielowymiarowej do pozycji Y.2 w zakładce Update Reference Points (Punkty odniesienia aktualizacji) modułu Sample Reload Adjustment (Regulacja przeładowania próbki). Na koniec, w zakładce pozycje etapu aktualizacji w module regulacji przeładowania próbki, kliknij na apply to MDA stage list. W oknie modułu obrazowania skorzystaj z modułu akwizycji wielowymiarowej i kliknij zakładkę zapisz w menu po lewej stronie.Następnie wybierz nazwę pliku eksperymentu i folder, w którym mają być przechowywane uzyskane obrazy na komputerze. Następnie kliknij zakładkę timelapse i ustaw ją tak, aby uzyskać łącznie 145 zdjęć w ciągu pięciu minut między każdym zdjęciem. Następnie w zakładce długości fal ustaw liczbę długości fal na jedną i uchwyć przy 50% jasnego pola i 50% aparatu z czasem naświetlania 12-20 milisekund.Ustaw wzmocnienie na 0,6, a digitizer na 20 miliherców. Po ustawieniu fokusu zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym wybierz opcję acquire, aby rozpocząć przechwytywanie obrazów wstępnie opróżnianych przylegających komórek dla wszystkich podetapów. W sekcji kontroli ścinania ustaw tryb przepływu na stały, a maksymalne ścinanie na jedną dynę na centymetr kwadratowy.Następnie kliknij studzienki wlotowe, aby rozpocząć przepływ mediów z dołków wlotowych do wylotowych w celu usunięcia wszelkich niezainfekowanych komórek. Po pięciu minutach kliknij przycisk stop w sekcji kontroli płytki studzienki. Poczekaj na uzyskanie drugiej rundy obrazów, a następnie w sekcji kontroli ścinania dostosuj maksymalny przepływ ścinania do 0,5 dyn na centymetr kwadratowy i potwierdź zmianę.W oknie modułu obrazowania wybierz zakładkę Narzędzia analizy i z menu rozwijanego kliknij opcję przejrzyj dane wielowymiarowe. Następnie kliknij wybierz plik podstawowy. Spowoduje to otwarcie okna narzędzi wielowymiarowego zestawu danych.Następnie kliknij przycisk wyboru katalogu i wybierz folder, który został użyty do zapisania eksperymentu. Na liście zestawów danych wybierz dziennik pliku eksperymentu. Po załadowaniu dziennika kliknij przycisk widoku.Wybierz długość fali, klikając opcje w menu długości fal po lewej stronie i wybierz pozycję sceny do wyświetlenia z menu rozwijanego. Wybierz obraz do załadowania z liczb w górnej części modułu, klikając prawym przyciskiem myszy numer obrazu. Następnie wybierz wszystkie obrazy, aby nakręcić film poklatkowy.Wybrane obrazy otworzą się jako wideo w nowym oknie. Kliknij zakładkę plik w oknie modułu obrazowania i wybierz zapisz jako z menu rozwijanego. Zapisz wynikowe wideo jako domyślny format pliku.Na koniec otwórz i załaduj zapisany plik wideo do obrazu J.In obrazu J, kliknij kartę pliku, a następnie kliknij Zapisz jako. Wybierz AVI z menu rozwijanego i przekonwertuj plik na plik AVI przy użyciu konwersji JPEG ustawionej na 10 klatek na sekundę. W warunkach typu dzikiego w pożywkach RPMI 1640 kilka komórek silnie przylegało do kanału.Tworzą strzępki i można zaobserwować gruby biofilm z interkalującymi strzępkami i komórkami drożdży. Pod koniec eksperymentu mikroprzepływowego biofilm typu dzikiego całkowicie wypełnia ten kanał widzenia. Obecność amfoterycyny B ma jednak wyraźny wpływ na zmniejszenie tworzenia się biofilmu.W szczególności przyleganie komórek jest zmniejszone i można zaobserwować, jak kilka komórek odpływa wraz z przepływem ścinającym pożywki. Komórki kontrolne typu dzikiego, tym razem wyhodowane w pożywkach pająków, utworzyły biofilm podobny do tego, który właśnie pokazano, rosnąc w RPMI. W pożywce tej hodowane są również dwa mutanty z wadami biofilmu.Oba szczepy wykazują znacznie zmniejszone tworzenie biofilmu w porównaniu z kontrolą. W tej populacji komórek przylegające komórki nie tworzą strzępek, a powstały biofilm jest poważnie uszkodzony. Ten drugi szczep jest wadliwy zarówno pod względem tworzenia biofilmu, jak i zdolności do przylegania do kanału.Po opanowaniu eksperymentu można go przeprowadzić w mniej niż godzinę. Korzystając z tej metody, można dowiedzieć się wiele o wielu różnych aspektach tworzenia biofilmu, w tym o początkowym przyleganiu komórek, dojrzewaniu biofilmu i rozpraszaniu komórek. Ten protokół jest wysoce konfigurowalny i wszechstronny.Można go dostosować do oceny różnych gatunków drobnoustrojów w różnych królestwach. Natężenia przepływu, temperatury, czasy inkubacji i pożywki można również wykorzystać do badania biofilmów gatunków mieszanych. Zdecydowanie zalecamy ten test biofilmu mikroprzepływowego jako test in vitro, który można wykorzystać przed testami in vivo na zwierzętach.Z naszego doświadczenia wynika, że wyniki tego testu bardzo dobrze korelują z istniejącymi testami biofilmu in vivo.

visualization-biofilm-formation-candida-albicans-using-an-automated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy prostą, szybką i niezawodną metodę tworzenia biofilmów Candida albicans z wykorzystaniem 96-dołkowych płytek mikrotytacyjnych oraz jej przydatność w badaniu wrażliwości komórek wewnątrz biofilmów na środki przeciwgrzybicze.

Metoda z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki mikrotytrującej do monitorowania tworzenia się i badania wrażliwości przeciwgrzybiczej biofilmów Candida albicans

Opracowaliśmy platformę wysokiej gęstości do mikromacierzy, składającą się z 3D nano-biofilmów C. albicans, nazwaną CaBChip. Profil wrażliwości leków testowanych na CaBChip jest porównywalny z konwencjonalnym modelem płytki 96-dołkowej, co sugeruje, że chip grzybiczy jest idealnie dostosowany do prawdziwie wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwgrzybiczych.

Chip do hodowli biofilmu Candida albicans (CaBChip) do wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwgrzybiczych

Źródło: Kurz, D. L. i in. Platforma mikrofluidyczna do badania biozatkania w porowatych ośrodkach. J. Vis. Exp. (2022)Film demonstruje użycie urządzenia mikrofluidycznego do badania powstawania biofilmu. Do mikrokanału wprowadzana jest zawiesina bakteryjna, po której następuje inkubacja, umożliwiająca rozwój biofilmu. Następnie wznawia się przepływ, a monitorowanie ciśnienia wraz z obrazowaniem wykorzystuje się do wykrywania powstawania biofilmu i zatkania porów w czasie.

Urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania w czasie rzeczywistym i śledzenia ciśnienia podczas tworzenia biofilmu

Ten film demonstruje rozwój mysiego modelu in vivo do badania tworzenia biofilmu Candida albicans w tkance podskórnej. Eksperyment polega na wszczepieniu urządzeń zakażonych Candida w okolicy pleców zwierzęcia w celu rozwoju biofilmu.

Candida albicans (Candida albicans) Tworzenie biofilmu w mysim modelu in vivo

Ten film opisuje metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii. Biofilmy bakteryjne często tworzą się na powierzchniach grzybów i obejmują liczne procesy interakcji bakteryjno-grzybiczych, takie jak współpraca metaboliczna, konkurencja lub drapieżnictwo.

Metoda przygotowania próbki w celu wizualizacji bakterii tworzących biofilm na strzępkach grzybów

Omawiane są protokoły badania tworzenia się biofilmu w urządzeniu mikroprzepływowym, które naśladuje porowate media. Urządzenie mikroprzepływowe składa się z szeregu mikrofilarów i badane jest tworzenie biofilmu przez Pseudomonas fluorescens w tym urządzeniu.

Protokół tworzenia strumienia biofilmu w urządzeniu mikroprzepływowym z mikrofilarami

Przedstawiamy eksperymentalną procedurę rozwoju biofilmu Candida albicans w mysim modelu podskórnym. Biofilmy grzybów określono ilościowo, określając liczbę jednostek tworzących kolonie oraz nieinwazyjne obrazowanie bioluminescencyjne, w którym ilość wytwarzanego światła odpowiada liczbie żywotnych komórek.

Candida albicans (Candida albicans) Rozwój biofilmu na istotnych z medycznego punktu widzenia ciałach obcych w mysim modelu podskórnym, a następnie obrazowanie bioluminescencyjne

Celem tego artykułu jest opisanie użycia systemu mikroprzepływowego do tworzenia wielogatunkowych biofilmów, które zawierają gatunki typowo identyfikowane w ludzkiej naddziąsłowej płytce nazębnej. Podkreślono metody opisu architektury biofilmu, żywotności biofilmu oraz podejścia do zbierania biofilmu do analiz zależnych od kultury lub niezależnych od kultury.

Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Opisujemy montaż, działanie i czyszczenie urządzenia przepływowego zaprojektowanego do obrazowania tworzenia się biofilmu grzybów w czasie rzeczywistym podczas przepływu. Dostarczamy również i omawiamy algorytmy ilościowe, które można zastosować na pozyskanych obrazach.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym i kwantyfikacja rozwoju biofilmu grzybów przy użyciu dwufazowego systemu przepływu recyrkulacyjnego

Aby zobaczyć i określić ilościowo wewnętrzne cechy biofilmów Candida albicans, przygotowujemy nienaruszone próbki stałe, które są klarowane przez dopasowanie współczynnika załamania. Następnie można wykorzystać optyczną mikroskopię przekrojową do uzyskania trójwymiarowych danych obrazowych na całej grubości biofilmu.

Oczyszczanie i obrazowanie biofilmów Candida albicans

Poznaj metodę wizualizacji tworzenia się biofilmu u Candida albicans w czasie rzeczywistym przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego. Technika umożliwia testowanie skuteczności środków przeciwdrobnoustrojowych i ocenę mutantów genetycznych.

Wizualizacja tworzenia się biofilmu u Candida albicans za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego

Przeglądaj więcej filmów