Wizualizacja tworzenia się biofilmu u Candida albicans za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego
14 grudnia 2017
Ten protokół opisuje użycie konfigurowalnego zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego do wizualizacji tworzenia biofilmu u Candida albicans w warunkach fizjologicznych gospodarza.
Ogólnym celem tego protokołu jest wizualizacja tworzenia się biofilmu Candida albicans w czasie rzeczywistym w warunkach fizjologicznych gospodarza. Metoda ta umożliwia obserwację procesu powstawania biofilmu w czasie rzeczywistym i może być wykorzystana do testowania skuteczności środków przeciwdrobnoustrojowych lub do oceny mutantów genetycznych. Technika ta może być wykorzystana do badania przesiewowego potencjalnych środków terapeutycznych pod kątem aktywności przeciwko biofilmom w sposób wysokoprzepustowy, a ich skuteczność może być mierzona, wizualizowana i porównywana z obecnymi metodami leczenia.
Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do badania tworzenia biofilmu w kilku różnych warunkach, które są interesujące dla badaczy. Chociaż metoda ta została opracowana specjalnie do badania tworzenia biofilmu Candida albicans, można ją również zastosować do innych mikroorganizmów tworzących biofilm, w tym innych gatunków grzybów, a także bakterii. Na początek przygotuj pojedyncze kultury kolonijne różnych szczepów C.albicans z komórek posianych na dekstrozie peptonu z ekstraktem drożdżowym lub pożywką z agaru YPD zgodnie ze standardowymi praktykami mikrobiologicznymi.
Następnie włącz układ mikroprzepływowy, który obejmuje sterownik, dwa zasilacze, mikroskop, kamerę i komputer podłączony do systemu. Po załadowaniu komputera otwórz oprogramowanie sterujące systemem. Znajdź numer kodu kreskowego używanej tabliczki i wprowadź numer, gdy pojawi się monit w oprogramowaniu.
Następnie w module sterującym należy ustawić temperaturę układu mikroprzepływowego na 37 stopni Celsjusza. Następnie kliknij studzienki wlotowe I1, I7, I13 i I19 i przepływaj sterylne powietrze przez rurki z płytą interfejsową przez pięć minut, aby usunąć kondensację. Gdy cała kondensacja wyparuje, umieść 48-dołkową płytkę mikroprzepływową 0-20 dyny na stoliku mikroskopu.
W przypadku 12-godzinnego eksperymentu tworzenia biofilmu zacznij od dodania 600 mikrolitrów wstępnie podgrzanego podłoża do studzienek wlotowych. Powoli opuść oczyszczoną płytkę interfejsu na 48-dołkową płytkę mikroprzepływową. Następnie przesuń płytkę interfejsu lekko w lewo, aż rurki zostaną umieszczone na górze studni wlotowej i wylotowej i zostaną zablokowane na swoim miejscu.
W sekcji oprogramowania dotyczącej kontroli ścinania ustaw tryb przepływu na stały i ustaw maksymalne ścinanie na jedną dynę na centymetr kwadratowy. Następnie kliknij studzienki wlotowe z mediami, aby rozpocząć przepływ mediów ze studzienek wlotowych do studni wylotowych w celu zalania kanału. Po pięciu minutach przepływu kliknij przycisk stop w sekcji sterowania płytką studzienki w oprogramowaniu.
Następnie zdejmij płytkę interfejsową i obserwuj dołki płytki mikroprzepływowej. W studzienkach wylotowych powinna być widoczna tylko niewielka kropla nośnika. Aby przetestować szczepy C.albicans typu dzikiego i zmutowanego, dodaj 50 mikrolitrów hodowli komórkowej SC5314 typu dzikiego w pożywce pająka do dwóch studzienek wylotowych, dodaj mutanta bcr1 w pożywce pająka do dwóch studzienek wylotowych i dodaj mutanta EFG1 w pożywce pająka do dwóch studzienek wylotowych.
Umieść płytkę interfejsu z powrotem na płytce mikroprzepływowej i zablokuj pokrywę na swoim miejscu. Wróć do sekcji kontroli ścinania w oprogramowaniu, ustaw tryb przepływu na stały i ustaw maksymalne ścinanie na dwie dyny na centymetr kwadratowy. Kliknij studzienki wylotowe z komórkami, aby rozpocząć przepływ pożywki z wylotu do studni wlotowych, aby rozpocząć wysiew C. albicans.
Po trzech sekundach kliknij przycisk stop w sekcji kontrolnej płytki studziennej, aby zapobiec przedostawaniu się komórek do studzienek wlotowych. Pozwól komórkom pozostać nieruchomymi bez przepływu przez 10-20 minut w viewkanał w celu początkowego przylegania komórek. W oknie modułu obrazowania otwórz moduł akwizycji wielowymiarowej i kliknij zakładkę etapu w menu po lewej stronie.
W sekcji stage załaduj główną listę etapów dla 48-dołkowej płytki mikroprzepływowej 0-20 dyne. Następnie otwórz regulację przeładowania próbki i przenieś stolik do modułów pozycji bezwzględnej. W module regulacji przeładowania próbki naciśnij przycisk na żywo, aby zobaczyć podgląd obrazu z celownikiem.
Za pomocą joysticka ustaw płytkę studzienki tak, aby końcówka strzałki przylegająca do viewkanał czwarty wyrównuje się z krzyżykiem na oprogramowaniu. Następnie przejdź do menu przenieś stage do pozycji bezwzględnej i naciśnij przycisk ustaw początek. Następnie wróć do modułu regulacji przeładowania próbki, kliknij sekcję początkowego punktu odniesienia w menu po lewej stronie i załaduj plik dla 48-dołkowej płytki mikroprzepływowej 0-20 dyny.
W sekcji stolika modułu akwizycji wielowymiarowej kliknij dwukrotnie pozycję stolika 22.2, aby zbliżyć stolik do oglądania mikroskopu i ostrość kamery na znacznik strzałki, patrząc na kanał 22. Następnie użyj joysticka, aby ustawić płytkę studzienki tak, aby końcówka strzałki przylegająca do viewkanał 22 zrównała się z krzyżykiem. Skopiuj współrzędną Y w module akwizycji wielowymiarowej do pozycji Y.
2 w zakładce Update Reference Points (Punkty odniesienia aktualizacji) modułu Sample Reload Adjustment (Regulacja przeładowania próbki). Na koniec, w zakładce pozycje etapu aktualizacji w module regulacji przeładowania próbki, kliknij na apply to MDA stage list. W oknie modułu obrazowania skorzystaj z modułu akwizycji wielowymiarowej i kliknij zakładkę zapisz w menu po lewej stronie.
Następnie wybierz nazwę pliku eksperymentu i folder, w którym mają być przechowywane uzyskane obrazy na komputerze. Następnie kliknij zakładkę timelapse i ustaw ją tak, aby uzyskać łącznie 145 zdjęć w ciągu pięciu minut między każdym zdjęciem. Następnie w zakładce długości fal ustaw liczbę długości fal na jedną i uchwyć przy 50% jasnego pola i 50% aparatu z czasem naświetlania 12-20 milisekund.
Ustaw wzmocnienie na 0,6, a digitizer na 20 miliherców. Po ustawieniu fokusu zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym wybierz opcję acquire, aby rozpocząć przechwytywanie obrazów wstępnie opróżnianych przylegających komórek dla wszystkich podetapów. W sekcji kontroli ścinania ustaw tryb przepływu na stały, a maksymalne ścinanie na jedną dynę na centymetr kwadratowy.
Następnie kliknij studzienki wlotowe, aby rozpocząć przepływ mediów z dołków wlotowych do wylotowych w celu usunięcia wszelkich niezainfekowanych komórek. Po pięciu minutach kliknij przycisk stop w sekcji kontroli płytki studzienki. Poczekaj na uzyskanie drugiej rundy obrazów, a następnie w sekcji kontroli ścinania dostosuj maksymalny przepływ ścinania do 0,5 dyn na centymetr kwadratowy i potwierdź zmianę.
W oknie modułu obrazowania wybierz zakładkę Narzędzia analizy i z menu rozwijanego kliknij opcję przejrzyj dane wielowymiarowe. Następnie kliknij wybierz plik podstawowy. Spowoduje to otwarcie okna narzędzi wielowymiarowego zestawu danych.
Następnie kliknij przycisk wyboru katalogu i wybierz folder, który został użyty do zapisania eksperymentu. Na liście zestawów danych wybierz dziennik pliku eksperymentu. Po załadowaniu dziennika kliknij przycisk widoku.
Wybierz długość fali, klikając opcje w menu długości fal po lewej stronie i wybierz pozycję sceny do wyświetlenia z menu rozwijanego. Wybierz obraz do załadowania z liczb w górnej części modułu, klikając prawym przyciskiem myszy numer obrazu. Następnie wybierz wszystkie obrazy, aby nakręcić film poklatkowy.
Wybrane obrazy otworzą się jako wideo w nowym oknie. Kliknij zakładkę plik w oknie modułu obrazowania i wybierz zapisz jako z menu rozwijanego. Zapisz wynikowe wideo jako domyślny format pliku.
Na koniec otwórz i załaduj zapisany plik wideo do obrazu J.In obrazu J, kliknij kartę pliku, a następnie kliknij Zapisz jako. Wybierz AVI z menu rozwijanego i przekonwertuj plik na plik AVI przy użyciu konwersji JPEG ustawionej na 10 klatek na sekundę. W warunkach typu dzikiego w pożywkach RPMI 1640 kilka komórek silnie przylegało do kanału.
Tworzą strzępki i można zaobserwować gruby biofilm z interkalującymi strzępkami i komórkami drożdży. Pod koniec eksperymentu mikroprzepływowego biofilm typu dzikiego całkowicie wypełnia ten kanał widzenia. Obecność amfoterycyny B ma jednak wyraźny wpływ na zmniejszenie tworzenia się biofilmu.
W szczególności przyleganie komórek jest zmniejszone i można zaobserwować, jak kilka komórek odpływa wraz z przepływem ścinającym pożywki. Komórki kontrolne typu dzikiego, tym razem wyhodowane w pożywkach pająków, utworzyły biofilm podobny do tego, który właśnie pokazano, rosnąc w RPMI. W pożywce tej hodowane są również dwa mutanty z wadami biofilmu.
Oba szczepy wykazują znacznie zmniejszone tworzenie biofilmu w porównaniu z kontrolą. W tej populacji komórek przylegające komórki nie tworzą strzępek, a powstały biofilm jest poważnie uszkodzony. Ten drugi szczep jest wadliwy zarówno pod względem tworzenia biofilmu, jak i zdolności do przylegania do kanału.
Po opanowaniu eksperymentu można go przeprowadzić w mniej niż godzinę. Korzystając z tej metody, można dowiedzieć się wiele o wielu różnych aspektach tworzenia biofilmu, w tym o początkowym przyleganiu komórek, dojrzewaniu biofilmu i rozpraszaniu komórek. Ten protokół jest wysoce konfigurowalny i wszechstronny.
Można go dostosować do oceny różnych gatunków drobnoustrojów w różnych królestwach. Natężenia przepływu, temperatury, czasy inkubacji i pożywki można również wykorzystać do badania biofilmów gatunków mieszanych. Zdecydowanie zalecamy ten test biofilmu mikroprzepływowego jako test in vitro, który można wykorzystać przed testami in vivo na zwierzętach.
Z naszego doświadczenia wynika, że wyniki tego testu bardzo dobrze korelują z istniejącymi testami biofilmu in vivo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę wizualizacji tworzenia biofilmu przez Candida albicans w czasie rzeczywistym w warunkach fizjologicznych gospodarza. Technika ta umożliwia ocenę skuteczności środków przeciwdrobnoustrojowych oraz mutantów genetycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Mykologia
- Badania nad biofilmem
Wprowadzenie
- Biofilmy są złożonymi społecznościami mikroorganizmów.
- Candida albicans jest powszechnym grzybiczym patogenem.
- Zrozumienie procesu tworzenia biofilmu jest kluczowe dla opracowania metod leczenia.
- Tę metodę można dostosować do różnych mikroorganizmów.
Cel badania
- W celu wizualizacji tworzenia biofilmu w czasie rzeczywistym.
- W celu przetestowania skuteczności środków przeciwdrobnoustrojowych.
- W celu oceny mutantów genetycznych Candida albicans.
Zastosowane metody
- Przygotowanie kultur pojedynczych kolonii z pożywki YPD.
- Użycie konfigurowalnego zautomatyzowanego urządzenia mikrofluidycznego.
- Obserwacja rozwoju biofilmu w czasie rzeczywistym.
- Hochefektywne przesiewanie w poszukiwaniu potencjalnych środków terapeutycznych.
Główne wyniki
- Wizualizacja tworzenia się biofilmu w czasie rzeczywistym.
- Możliwość porównania skuteczności różnych metod leczenia.
- Zastosowanie w odniesieniu do innych mikroorganizmów tworzących biofilm.
- Wszechstronna metoda, którą można dostosować do różnych warunków eksperymentalnych.
Wnioski
- Metoda ta pozwala na zrozumienie dynamiki biofilmu.
- Może ona wspomagać opracowywanie nowych terapii przeciwgrzybiczych.
- Potencjał do szerszych zastosowań w badaniach mikrobiologicznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wizualizacja tworzenia się biofilmu w czasie rzeczywistym w warunkach przepływu odpowiadających warunkom fizjologicznym wypełnia istotną lukę w walidacji celów przeciwgrzybiczych, umożliwiając mechanistyczną minimalizację ryzyka w analizie szlaków wirulencji. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji związków wiodących poprzez powiązanie perturbacji genetycznych lub farmakologicznych z dynamicznymi fenotypami biofilmu. Metoda ta usprawnia ciągłość translacyjną od etapu odkrywania do oceny przedklinicznej, dostarczając ilościowych i powtarzalnych wyników niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację dynamiki rozwoju biofilmu w czasie rzeczywistym przy kontrolowanym naprężeniu ścinającym.
- Wartość naukowa: Wspiera walidację funkcjonalną celów poprzez porównanie tworzenia biofilmu w szczepach typu dzikiego oraz mutantach genetycznych, takich jak bcr1 i EFG1.
- Wartość operacyjna: Ułatwia standaryzację analiz dzięki zautomatyzowanej mikrofluidycznej kontroli temperatury, szybkości przepływu i składu pożywki.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe dane obrazowania poklatkowego do oceny efektów przeciwdrobnoustrojowych, takich jak hamowanie biofilmu przez amfoterycynę B.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wysokoprzepustowe przesiewanie potencjalnych środków terapeutycznych z powtarzalnymi miernikami tworzenia biofilmu w warunkach przepływu laminarnego.
- Wartość operacyjna: Wspiera adaptację analizy dla różnych gatunków drobnoustrojów, w tym bakterii i innych grzybów, co poszerza użyteczność platformy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: dostarcza istotnych w kontekście chorób informacji poprzez naśladowanie warunków gospodarza występujących w cewnikach naczyniowych i warstwach śluzowych.
- Wartość operacyjna: umożliwia prognostyczną redukcję ryzyka poprzez korelację dynamiki biofilmu in vitro z ustalonymi wynikami badań in vivo.
- Wartość strategiczna: wspiera decyzje o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka poprzez identyfikację mutantów z defektem tworzenia biofilmu lub związków o aktywności inhibicyjnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Mikrofluidyczny test biofilmu integruje się z procesem badawczym, od walidacji celu, przez identyfikację wiodących związków, aż po wsparcie przedkliniczne, umożliwiając iteracyjne cykle projektowania, syntezy i testowania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących czynników wirulencji poprzez wizualizację tworzenia strzępek i rozwoju macierzy międzykomórkowej w czasie.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanej akwizycji obrazów i generowaniu filmów poklatkowych do analizy porównawczej.
- Analityka: Umożliwia ilościowe porównanie architektury biofilmu, adhezji i dyspersji w zmiennych warunkach naprężenia ścinającego oraz ekspozycji na leki.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkryć z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie tworzenia biofilmu na powierzchniach abiotycznych istotnych dla urządzeń medycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do przesiewania związków przeciwgrzybiczych i przeciwbiofilmowych w wielu obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach tworzenia biofilmu.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność dzięki zautomatyzowanej kontroli przepływu płynów oraz standaryzowanym protokołom obrazowania.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne ograniczanie ryzyka w przypadku związków aktywnych przeciwko biofilmom przed kosztownymi badaniami in vivo.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka poprzez powiązanie perturbacji genetycznych lub chemicznych z mierzalnymi defektami biofilmu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowywaniu kultur mikrobiologicznych oraz obsłudze systemów mikroprzepływowych.
- Zależne od dostępu do zautomatyzowanych platform mikroprzepływowych z precyzyjną kontrolą naprężenia ścinającego i temperatury.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie akwizycji obrazów, analizy i interpretacji danych pomiędzy zespołami biologicznymi a zespołami zajmującymi się obrazowaniem.
- Wiąże się z koniecznością wprowadzenia modyfikacji przy rozszerzaniu metody na biofilmy wielogatunkowe lub inne królestwa mikroorganizmów.
- Ograniczenia praktyczne obejmują potrzebę optymalizacji barwienia lub zastosowania środków kontrastowych w celu poprawy wizualizacji specyficznych komponentów biofilmu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:02
Preparation of Microfluidic Channels of the Microfluidic Plate
2:08
Candida albicans Biofilm Formation in the Microfluidic System
4:06
Setting Up the Stage Positions for the Microfluidic Experiment
6:01
Microfluidic Experiment Image Acquisition
7:38
Analyzing the Results
9:07
Results: Drug Exposure and Genetic Mutations Can Alter Biofilm Formation
10:20
Conclusion
