Name: Dorosłe myszy DRG eksplantowane i zdysocjowane modele komórkowe w celu zbadania neuroplastyczności i reakcji na zniewagi środowiskowe, w tym infekcje wirusowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę eksplantacji i dysocjacji komórek z dorsal root ganglia myszy w celu badania neuroplastyczności oraz odpowiedzi neuronów na infekcje wirusowe i czynniki środowiskowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Serdecznie dziękujemy ośrodkowi obrazowania na Uniwersytecie Środkowo-Zachodnim (MWU) oraz grupie studentów [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo i Casey Sigerson] za ich wkład w hodowlę komórkową i obrazowanie. Prace badawcze były wspierane przez dotacje MWU dla M.F. oraz fundusze na rozpoczęcie badań dla V.T.

Wszystkie procedury, w tym wykorzystanie zwierząt, zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną (IACUC- Midwestern University).
1. Pobieranie DRG z embrionów myszy
<ol>
	<li>Poddać eutanazji dorosłe myszy metodą uduszenia (CO2 ), a następnie dekapitacji. Natychmiast przystąp do chirurgicznego usunięcia kręgosłupa.
	<ol>
		<li>Odsłoń kręgosłup, przecinając warstwę skóry grzbietowo za pomocą cienkich nożyczek. Odizolować kręgosłup, przecinając żebra po obu stronach kręgosłupa i przez kość krzyżową oddzielającą kręgosłup od reszty zwierzęcia.</li>
		<li>Zamontuj kręgosłup (brzuszną stroną do góry) na macie chirurgicznej za pomocą igieł/szpilek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą cienkich nożyczek wykonaj podwójne cięcie po obu stronach trzonów kręgów, aby odsłonić brzuszną stronę kanału kręgowego.</li>
	<li>Pod mikroskopem chirurgicznym (powiększenie ustawione na 4X) użyj nożyczek, aby delikatnie przesunąć rdzeń kręgowy z boku, aby odsłonić przeciwległe grzbietowe korzenie rdzeniowe i zlokalizować DRG wzdłuż korzeni grzbietowych nerwów obwodowych. Każdy ganglion jest częściowo ukryty w otworze międzykręgowym.</li>
	<li>Aby zebrać DRG, uszczypnij korzeń grzbietowy (między rdzeniem kręgowym a DRG) jednym kleszkiem i delikatnie wyciągnij DRG z otworu międzykręgowego.</li>
	<li>Umieść drugie kleszcze na nerwie rdzeniowym na obrzeżach DRG i pociągnij DRG razem z nerwem rdzeniowym i korzeniem rdzeniowym.</li>
	<li>Umieść zebrany DRG na szalce Petriego o średnicy 35 mm zawierającej 3 ml lodowatej pożywki wolnej od surowicy (SFM)34.</li>
	<li>Przenieś każdą pojedynczą DRG na suchą szklaną szalkę Petriego i pod mikroskopem chirurgicznym oczyść i odetnij nadmiar włókien i tkanki łącznej nadal przyczepionych do DRG za pomocą ostrza. DRG jest łatwo rozpoznawalny jako wybrzuszona, przezroczysta struktura wzdłuż białego nerwu rdzeniowego / korzenia. Naczynia krwionośne często znajdują się wokół DRG.</li>
	<li>Umieść oczyszczony DRG na nowej szalce Petriego zawierającej lodowato zimne podłoże SFM.</li>
	<li>Rozcieńczyć galaretowatą mieszaninę białek (patrz tabela materiałów) w lodowato zimnym SFM (1:1).</li>
	<li>Umieść DRG ex vivo w 12-dołkowych płytkach wstępnie pokrytych 10/20 μl galaretowatej mieszaniny białek i umieść je w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 30-60 minut.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 1,5-2 ml SFM do systemu hodowlanego, aby pokryć cały eksplant i utrzymać eksplantaty w warunkach hodowli (37 °C i 5% CO2 ). 
	UWAGA: Jest to krytyczny krok, ponieważ DRG jest zakotwiczony w szklanych naczyniach tylko przez spolimeryzowaną galaretowatą mieszaninę białek. Czas polimeryzacji i umiejętności pipetowania mają kluczowe znaczenie dla uniknięcia unoszenia się na wodzie.</li>
	<li>Zmieniaj podłoże do uprawy DRG co 72 godziny i pozwól DRG rosnąć tak długo, jak to konieczne.</li>
</ol>
2. Izolowanie neuronów jednokomórkowych od DRG
<ol>
	<li>Umieścić cały zebrany DRG w sterylnej probówce o pojemności 1,5 ml z 1,2 ml pożywki F12 zawierającej 1,25 mg/ml kolagenazy dożylnej i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 45 minut. Powtarzać ten krok przez kolejne 45 minut po pierwszej inkubacji.</li>
	<li>Traktować eksplantaty 2 ml pożywki F12 zawierającej trypsynę (0,025%) przez 30 minut bezpośrednio po zabiegu kolagenazy dożylnej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Inkubować z 2 ml pożywki F12 zawierającej płodową surowicę bydlęcą (FBS; 33%) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 15 minut.</li>
	<li>Umyj eksplantaty trzykrotnie 2 ml pożywki F12 i przystąp do mechanicznej dysocjacji za pomocą szklanej pipety, aż podłoże stanie się mętne. 
	UWAGA: Ta procedura polega na pobraniu czystego/przyciętego DRG od zwierzęcia, jak wyjaśniono w poprzednim rozdziale. Podczas wykonywania mechanicznej dysocjacji eksplantatów należy zachować ostrożność i nie używać nadmiernej siły, ponieważ może to prowadzić do rozlania i utraty materiału roboczego.</li>
	<li>Przefiltruj zdysocjowaną kulturę komórkową przez filtr 0,22 μm, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i nadmiar tkanki łącznej. Odwirować przefiltrowany lizat komórkowy w temperaturze (2 500 x g) przez 2 minuty.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl podłoża neurobazalnego zawierającego suplement do hodowli neuronów (1x), mieszaninę antybiotyków (1x), L-glutaminian (0,5 mM) i czynnik wzrostu nerwów (5 μg/ml) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Umieścić zdysocjowane komórki na szkiełkach pokrytych lamininą (50 μg/ml; patrz Tabela Materiałów) z preferowaną gęstością komórek. Określ gęstość komórek za pomocą licznika komórek. 
	UWAGA: Posialiśmy ogniwa na 25 000 ogniw / szkiełko okładkowe. Technika ta umożliwia dysocjację zarówno neuronów, jak i komórek satelitarnych gleju. Komponent glejowy hodowany wspólnie z neuronami pseudojednobiegunowymi odgrywa kluczową rolę w przetrwaniu neuronów.</li>
</ol>
3. Zakażenie HSV-1 eksplantatów DRG i komórek dysocjacyjnych pochodzących z DRG
UWAGA: Ta praca została wykonana poprzez ścisłe przestrzeganie wymagań poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2), do których mamy w pełni wyposażone laboratorium, które jest zatwierdzone przez komitet ds. bezpieczeństwa biologicznego Uniwersytetu Środkowo-Zachodniego. W badaniu wykorzystano szczep KOS HSV-1. Podczas pracy ze szczepami wirusa należy wykonać odpowiednie pomiary i zachować środki ostrożności zgodnie z wytycznymi lokalnych instytucji.
<ol>
	<li>Określ i przygotuj wirusa w odpowiednich rozcieńczeniach w pożywkach SFM, aby zainfekować model. Wirusem użytym w tym badaniu był szczep KOS HSV-1. Podczas pracy z komórkami zdysocjowanymi pochodzącymi z DRG należy użyć 1 jednostki wielokrotności infekcji (MOI) dla infekcji, co oznacza, że liczba wirusa jest równa liczbie komórek.</li>
	<li>W przypadku infekowania eksplantatów DRG należy użyć liczby wirionów (np. 10 000 wirionów), ponieważ nie można określić dokładnej liczby komórek w eksplantacie.</li>
	<li>Umieścić eksplantat/komórki, które mają być zakażone wirusem, w sterylnej płytce komórkowej lub probówce zawierającej mieszaninę pożywki SFM i wirusa. 
	UWAGA: Użyliśmy 25 000 wirionów do szkiełka okładkowego zawierającego 25 000 komórek (1 MOI). Do zainfekowania eksplantatu używamy 10 000 wirionów.</li>
	<li>Umieścić płytkę lub probówkę komórkową w temperaturze 37 °C, aby doszło do zakażenia; czas ekspozycji na wirusa może się różnić w zależności od zakaźności wirusa. 
	UWAGA: Wejście wirusa zostało potwierdzone za pomocą testów orto-nitrofenylo-β-galaktozydu (ONPG) i 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-D-galaktopyranozydu (X-gal) 26.</li>
</ol>
4. Immunofluorescencja
<ol>
	<li>Utrwalić eksplantaty i próbki pojedynczych komórek w 4% formalinie przygotowanej w buforze soli fizjologicznej (PBS). Próbki należy myć 3 razy przez 10 minut każda w PBS.</li>
	<li>Inkubować próbki z pożądanymi przeciwciałami pierwszorzędowymi (anty-β-tubuliną, antyperyferyną, siarczanem anty-heparanu (HS) i/lub przeciwciałem przeciwko glikoproteinie D (gD); patrz Tabela materiałów dla rozcieńczeń) rozcieńczonymi w buforze PBS z 0,3% Triton-X (PBST) i 10% normalną surowicą kozą. Próbki należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Próbki należy przemywać 3 razy przez 10 minut za pomocą PBS. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w odpowiednim przeciwciałie drugorzędowym (488 i/lub Cy3; rozcieńczenia patrz tabela materiałów) rozcieńczonym w PBS.</li>
	<li>Próbki należy przemywać 3 razy przez 10 minut za pomocą PBS. Próbki należy inkubować z barwnikiem Hoechst (1,5 μM) w PBS przez 20 minut przed etapem montażu.</li>
	<li>Umieścić próbki na szkiełkach podstawowych za pomocą fluorescencyjnego podłoża montażowego i szkiełka nakrywkowego.</li>
</ol>

<ol><li>Muratori, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+new+neurons+in+dorsal+root+Ganglia+in+adult+rats+after+peripheral+nerve+crush+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury.</a> Neural Plast. , 860546(2015).</li>
<li>Dellarole, A., Grilli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+dorsal+root+ganglia+sensory+neurons+express+the+early+neuronal+fate+marker+doublecortin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin.</a> J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).</li>
<li>Devor, M., Govrin-Lippmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+adult+rat+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia.</a> Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).</li>
<li>Farel, P. B., Boyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+effects+of+nerve+injury+on+estimates+of+sensory+neuron+number+in+juvenile+bullfrog%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog.</a> J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).</li>
<li>Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+morphometrical+changes+in+dorsal+root+ganglion+neurons+innervating+the+regenerated+lizard+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail.</a> Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).</li>
<li>La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+neurogenesis+of+adult+rat+dorsal+root+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosens+Mot+Res%22%5BJournal%5D)">Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells.</a> Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).</li>
<li>Pannese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+on+the+Ultrastructural+Changes+of+the+Spinal+Ganglion+Neurons+in+the+Course+of+Axon+Regeneration+and+Cell+Hypertrophy+I.+Changes+during+Axon+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Zellforsch+Mikrosk+Anat%22%5BJournal%5D)">Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration.</a> Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).</li>
<li>Popken, G. J., Farel, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neuron+number+in+neonatal+and+adult+rats+estimated+by+means+of+stereologic+and+profile-based+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods.</a> J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).</li>
<li>Tandrup, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+estimates+of+number+and+size+of+rat+dorsal+root+ganglion+cells+in+studies+of+structure+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival.</a> J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).</li>
<li>Sarikcioglu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+severe+crush+injury+on+axonal+regeneration%3A+a+functional+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reconstr+Microsurg%22%5BJournal%5D)">Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study.</a> J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).</li>
<li>Varejao, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+assessment+of+a+standardized+rat+sciatic+nerve+crush+injury+with+a+non-serrated+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp.</a> J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).</li>
<li>Hanack, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+blocks+pathological+but+not+acute+TRPV1+pain+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals.</a> Cell. 160 (4), 759-770 (2015).</li>
<li>Pagadala, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+NR1+subunit+of+NMDARs+in+primary+sensory+neurons+leads+to+hyperexcitability+and+pain+hypersensitivity%3A+involvement+of+Ca%282%2B%29-activated+small+conductance+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels.</a> J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).</li>
<li>Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-induced+increase+in+nicotinic+acetylcholine+receptor+current+in+cutaneous+nociceptive+DRG+neurons+from+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat.</a> Neuroscience. 284, 483-499 (2015).</li>
<li>Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+inflammation+increases+GABA-induced+depolarization+of+rat+cutaneous+dorsal+root+ganglion+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro.</a> Neuroscience. 220, 330-340 (2012).</li>
<li>Amir, R., Devor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cross-excitation+between+afferent+A-+and+C-neurons+in+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia.</a> Neuroscience. 95 (1), 189-195 (2000).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+Activation+of+Primary+Sensory+Neurons+Contributes+to+Chronic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li>
<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).</li>
<li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li>
<li>Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+Schwann+cell+growth+on+micropatterned+biodegradable+polymer+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates.</a> Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).</li>
<li>Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+control+of+cell+behaviour%3A+II.+Multiple+grooved+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata.</a> Development. 108 (4), 635-644 (1990).</li>
<li>Antinone, S. E., Smith, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+axon+transport+of+herpes+simplex+virus+and+pseudorabies+virus%3A+a+live-cell+comparative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis.</a> J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).</li>
<li>Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+transport+of+herpes+simplex+virus+proteins+in+axons+of+peripheral+human+fetal+neurons%3A+an+immunoelectron+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study.</a> J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).</li>
<li>Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+interaction+to+3-O-sulfated+heparan+sulfate+in+mouse-derived+DRG+explant+and+profiles+of+inflammatory+markers+during+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection.</a> J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).</li>
<li>Zerboni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+1+tropism+for+human+sensory+ganglion+neurons+in+the+severe+combined+immunodeficiency+mouse+model+of+neuropathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis.</a> J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).</li>
<li>Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+infections+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Virus infections in the nervous system.</a> Cell Host Microbe. 13 (4), 379-393 (2013).</li>
<li>Swanson, P. A. 2nd, McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+diseases+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">Viral diseases of the central nervous system.</a> Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).</li>
<li>Tyler, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+viral+infections+of+the+central+nervous+system%3A+part+2%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Neurol%22%5BJournal%5D)">Emerging viral infections of the central nervous system: part 2.</a> Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).</li>
<li>Preston, C., Efstathiou, S., et al. Ch 33. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPreston%2C+C+%22Human+Herpesviruses+Biology%2C+Therapy%2C+and+Immunoprophylaxis%22">Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis</a>. Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E., et al. , Cambridge University Press. (2007).</li>
<li>Roizman, B., Whitley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inquiry+into+the+molecular+basis+of+HSV+latency+and+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation.</a> Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).</li>
<li>Arvin, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhitley%2C+R+%22Human+Herpesviruses%3A+Biology%2C+Therapy%2C+and+Immunoprophylaxis%22">Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis</a>. , (2007).</li>
<li>Fueshko, S., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LHRH+cells+migrate+on+peripherin+fibers+in+embryonic+olfactory+explant+cultures%3A+an+in+vitro+model+for+neurophilic+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration.</a> Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).</li>
<li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+heparan+sulphate+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of heparan sulphate in inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).</li>
<li>Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+heparan+sulfate+and+heparanase+in+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation.</a> Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).</li>
<li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+GABAergic+signaling+within+sensory+ganglia+controls+peripheral+nociceptive+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission.</a> J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Model DRG ex vivo jest niezwykle przydatny do badania szerokiego spektrum zdarzeń, takich jak interakcja neuron-glej, a także wpływ mikrośrodowiska na metabolizm neuronalny i glejowy37. Co więcej, model DRG może być wykorzystany jako opłacalne narzędzie do odpowiedzi na istotne pytania dotyczące mechanizmu patogennego i związanych z nim markerów poprzez opracowanie systemów ex vivo dla ostrej, przewlekłej i utajonej fazy infekcji lub w danej chorobie. Ponadto biblioteka przesiewo...

W tym manuskrypcie opisujemy metodę uzyskania organotypowego modelu ex vivo mysiego systemu modelowego DRG jako zachowanego mikrośrodowiska podobnego do tkanki, aby zbadać szeroki zakres reakcji biologicznych na uszkodzenia PNS, począwszy od interakcji neuron-glej, neuroplastyczności, markerów stanu zapalnego, aż po infekcję wirusową. Ponadto opracowaliśmy protokół tworzenia pierwotnej kokultury pojedynczych neuronów czuciowych i komórek satelitarnych pochodzących z DRG.
DRG to satelitarne jednostki istoty szarej zlokalizowane poza ośrodkowym układem nerwowym (OUN) wzdłuż grzbietowych korzeni rdzeniowych nerwów rdzeniowych. DRG, zlokalizowany w pobliżu otworów międzykręgowych, mieści pseudojednobiegunowe neurony czuciowe i satelitarne komórki glejowe. Neurony pseudojednobiegunowe zawierają pojedynczy neuryt, który dzieli się na proces obwodowy przenoszący somatyczne i trzewne dane wejściowe z celów obwodowych do ciała komórki oraz proces centralny, który przesyła informacje sensoryczne z ciała komórki do OUN. Torebka łączna definiuje i izoluje to obwodowe skupisko neuronów i komórek glejowych od OUN. Nigdy nie opisano migracji komórek pourodzeniowych do lub z DRG, a lokalna nisza komórek macierzystych jest odpowiedzialna za zdarzenia neurogenne występujące przez całe życie1. Dlatego model ten jest szczególnie odpowiedni do badania neurogenezy dorosłych, aksonogenezy, odpowiedzi na zmiany pourazowe i śmierci komórki2,3,4,5,6,7,8,9 .
W dziedzinie neuroregeneracji, DRG zebrany in vivo i eksplantowany in vitro odtwarza aksonomezę, stan urazu, w którym aksony są całkowicie odcięte, a ciało komórki neuronalnej jest odłączone od unerwionego celu10,11. Powszechnie wiadomo, że uszkodzenie nerwów obwodowych może powodować zmniejszoną i zwiększoną ekspresję genów w DRG, a wiele z tych zmian jest wynikiem procesów regeneracyjnych, ale wiele z nich może być również wynikiem odpowiedzi immunologicznej lub innej odpowiedzi komórek nieneuronalnych. Dzięki zastosowaniu systemu ex vivo izolowanego DRG, część tej złożoności została usunięta, a szlaki mechanistyczne mogą być łatwiej badane.
Oprócz jego centralnej roli w przekazywaniu bodźców sensorycznych do OUN, obfitość receptorów dla wielu neuroprzekaźników, w tym GABA12,13,14,15 na poziomie somy neuronalnej, jak również dowody na międzyneuronalne pobudzenie krzyżowe mogą sugerować, że DRG są wyrafinowanymi wstępnymi integratorami wejść sensorycznych16,17. Te nowe odkrycia nadają DRG cechy mini-systemu sieci neuronalnej podobnego do innych modeli "mini-mózgu", które są organoidami specyficznymi dla tkanki nerwowej, używanymi w szerszych eksperymentalnych obszarach badań i terapeutycznym podejściu do chorób neurologicznych18,19. Dowody te, w połączeniu z faktem, że DRG jest dyskretnym i dobrze zdefiniowanym skupiskiem tkanki neuronalnej otoczonym torebką łączną, sprawiają, że jest to odpowiedni narząd do przeszczepu ex vivo.
Hodowla myszy DRG stanowi atrakcyjną opcję wielokomórkową do modelowania ludzkich patofizjologii ze względu na strukturalne i genetyczne podobieństwa między gatunkami. Ponadto duże repozytorium transgenicznych szczepów myszy jest bardzo korzystne dla przyszłych badań mechanistycznych. Ekspansja neurytu zarówno w trakcie rozwoju, jak i po urazie wymaga mechanicznych interakcji między stożkiem wzrostu a substratem20,21. Podłoża o nano- i mikrowzorach wykorzystano jako narzędzia do kierowania wzrostem neurytów i wykazania ich zdolności do reagowania na cechy topograficzne w swoich mikrośrodowiskach. Wykazano, że neurony przeżywają, przylegają, migrują i orientują swoje aksony, aby poruszać się po elementach powierzchni, takich jak rowki w podłożach22,23. Jednak badania te zazwyczaj wykorzystywały hodowane linie komórkowe i trudno jest przewidzieć, jak pierwotne komórki neuronalne zareagują na dobrze zdefiniowane, fizyczne sygnały in vivo lub ex vivo.
Model eksplantatu ex vivo myszy DRG użyty w tej propozycji naśladuje rzeczywistą interakcję komórka-komórka i biochemiczne wskazówki otaczające rosnące aksony. Wśród wielu różnych paradygmatów eksperymentalnych, począwszy od regeneracji aksonów, produkcji neurosfery, a skończywszy na zapaleniu nerwów, model eksplantatu DRG nadal służy jako cenne narzędzie do badania infekcji wirusowej i aspektu latencji w zwojach czuciowych24,25,26,27.
Układ nerwowy (NS) ogólnie jest celem infekcji wirusowych28,29,30. Większość wirusów infekuje powierzchnie komórek nabłonka i śródbłonka i przedostaje się z tkanki powierzchniowej do NS przez włókna czuciowe i ruchowe nerwów obwodowych. W szczególności wirus opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) po początkowym zakażeniu komórek nabłonka powoduje trwające całe życie utajenie w zwojach czuciowych, najlepiej DRG klasy PNS31,32. Neuroptropowa zdolność HSV-1 do infekowania PNS ostatecznie prowadzi do chorób neurologicznych33.

<table><tbody><tr><td>Dorosłe myszy NIH/Swiss</td><td>Harlan Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm szalka Petriego</td><td>Cell Treat</td><td>229635</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel ECM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1270</td><td>galaretowata mieszanina białek</td></tr><tr><td>F12 Media</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td> <td>* Część podłoża SFM</td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>Filtr 0,22um</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka neurobazalna</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Suplement do hodowli neuronów</td></tr><tr><td>Antybiotyki PSN</td><td>Gibco</td><td>15640-055</td><td>*Część SFM media Mieszanina antybiotyków</td></tr><tr><td>L-glutaminian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>*Część pożywki SFM</td></tr><tr><td>NGF</td><td>Alomone Labs</td><td>N-100</td><td>Czynnik wzrostu nerwów</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe pokryte laminą</td><td>Neuvitro</td><td>GG-14-Laminin</td><td></td></tr><tr><td>ONPG subtrate</td><td>Pierce</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520034</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-B-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8328</td><td>1:2000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-peryferyna</td><td>Millipore</td><td>AB1530</td><td>1:1000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Hoechst barwnik Thermo</td><td>Fisher</td><td>62249</td><td>1,5 &micro; M końcowe stężenie</td></tr><tr><td>Siarczan antyheparanu</td><td>US Biological</td><td>H1890-10</td><td>0,1805555556</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty gD</td><td>Virostat</td><td>196</td><td>1:10 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td>*Część pożywki SFM</td></tr><tr><td>BME</td><td>Gibco</td><td>21010-046</td><td>*Część pożywki SFM</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG*</td><td>Część zestawu mediów SFM</td></tr><tr><td>(insulina-transferyna-selen-A)</td><td>Gibco</td><td>51300-044</td><td>*Część podłoża SFM</td></tr><tr><td>Vitamin-C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td>*Część podłoża SFM</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7505</td> <td>* Część mediów SFM</td></tr><tr><td>488 (koza anty-mysz)</td> <td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 (koza anty-królika)</td> <td>Jackson Immunoresearch laboratories</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia&nbsp;</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Formalin Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5014-120ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector</td><td>H-1500</td><td>Flurescence</td></tr> Mount <tr><td>Diamond White Glass</td><td>Crystal Scientific</td><td>1380-20</td><td></td></tr></tbody></table>

dorosłe myszy drg eksplantowane i zdysocjowane modele komórkowe w celu zbadania neuroplastyczności i reakcji na zniewagi środowiskowe, w tym infekcje wirusowe

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

Ten protokół opisuje model ex vivo eksplantatu zwojów korzenia grzbietowego (DRG) pochodzących z myszy oraz pochodzącą z DRG kokulturę in vitro zdysocjowanych neuronów czuciowych i komórek satelitarnych gleju. Są to użyteczne i wszechstronne modele do badania różnych reakcji biologicznych związanych z fizjologicznymi i patologicznymi stanami obwodowego układu nerwowego (PNS), począwszy od interakcji neuron-glej, neuroplastyczności, zapalenia nerwów i infekcji wirusowych. Zastosowanie eksplantatu DRG jest naukowo korzystne w porównaniu z uproszczonymi modelami pojedynczych komórek z wielu powodów. Na przykład, jako hodowla organotypowa, eksplant DRG umożliwia transfer ex vivo całej sieci neuronalnej, w tym mikrośrodowiska zewnątrzkomórkowego, które odgrywają znaczącą rolę we wszystkich funkcjach neuronalnych i glejowych. Co więcej, eksplantaty DRG mogą być również utrzymywane ex vivo przez kilka dni, a warunki hodowli mogą być zaburzone zgodnie z życzeniem. Ponadto zebrany DRG można dalej dysocjować do wspólnej hodowli in vitro pierwotnych neuronów czuciowych i satelitarnych komórek glejowych w celu zbadania interakcji neuronalno-glejowej, neurytogenezy, interakcji stożka aksonalnego z mikrośrodowiskiem zewnątrzkomórkowym i bardziej ogólnie, dowolnego aspektu związanego z metabolizmem neuronalnym. W związku z tym system DRG-explant oferuje dużą elastyczność w badaniu szerokiego zakresu zdarzeń związanych ze stanami biologicznymi, fizjologicznymi i patologicznymi w opłacalny sposób.

Wiele aspektów neuroplastyczności i interakcji neuron-środowisko można badać za pomocą zwojów korzeni grzbietowych (DRG) oraz modelu hodowli pojedynczych dysasocjowanych komórek. Badania rozpoczęliśmy od wyizolowania eksplantu DRG oraz pochodzących z DRG dysasocjowanych komórek, co przedstawiono schematycznie na Rysunku 1. Zarówno modele tkankowe, jak i modele pojedynczych komórek mogą być analizowane przy użyciu różnorodnych technik molekularnych, takich jak immunofluorescencja, Western blo...

W tym raporcie, zalety kultur organotypowych i dysocjacji kultur pierwotnych zwojów korzenia grzbietowego pochodzących od myszy są podkreślone w celu zbadania szerokiego zakresu mechanizmów związanych z interakcją neuron-glej, neuroplastycznością, zapaleniem nerwów i reakcją na infekcję wirusową.

Dorosłe myszy DRG eksplantowane i zdysocjowane modele komórkowe w celu zbadania neuroplastyczności i reakcji na zniewagi środowiskowe, w tym infekcje wirusowe

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie modelu ex vivo eksplantatu zwojów korzenia grzbietowego i/lub pierwotnego modelu komórki dysocjacyjnej pochodzącego z DRG w celu zbadania reakcji neuronów na sygnały środowiskowe. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neuroplastyczności, czyli zapalenia nerwów w odpowiedzi na ekspozycję na patogeny. Główną zaletą tej techniki jest to, że eksplantaty zwojów korzenia grzbietowego zachowują złożoność podobną do narządu, przydatną do uruchomienia cyklu komórkowego i zmian w mikrośrodowisku międzykomórkowym dzięki specyficznym zabiegom.Staranne zademonstrowanie tej metody jest bardzo ważne, ponieważ identyfikacja DRG, jak również ich zbieranie, może być dość trudne ze względu na ich rozmiar i lokalizację. Aby rozpocząć tę procedurę, odsłoń kręgosłup, przecinając warstwę skóry zwierzęcia, grzbietowo za pomocą cienkich nożyczek. Następnie odizoluj kręgosłup, przecinając żebra po obu stronach kolumny i kość krzyżową, oddzielając kręgosłup od reszty zwierzęcia.Następnie zamontuj kręgosłup brzuszną stroną do góry na macie chirurgicznej za pomocą igieł i szpilek. Następnie wykonaj podwójne nacięcie po obu stronach trzonów k

adult-mouse-drg-explant-dissociated-cell-models-to-investigate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje metodę rozwoju zwojów korzenia grzbietowego lub hodowli eksplantatów DRG i modeli komórek zdysocjowanych DRG przy użyciu izolowanych tkanek DRG myszy. Modele te pomagają badać różne mechanizmy interakcji neuron-glej w kontrolowanym środowisku.

Generowanie eksplantatu zwoju korzenia grzbietowego i zdysocjowanej hodowli komórkowej

Ten film demonstruje generowanie modelu uszkodzenia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy. Przedstawiono w nim etapy związane z indukcją uszkodzenia neuronów za pomocą NMDA, agonisty receptora neuroprzekaźnika pobudzającego i glicyny, koagonisty. NMDA i glicyna wiążą się ze specyficznymi receptorami neuronalnymi, powodując ich nadmierną stymulację i powodując masowy wewnątrzkomórkowy napływ wapnia, co prowadzi do uszkodzenia i śmierci komórek neuronalnych.

Modelowanie uszkodzenia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Ten film przedstawia generowanie modelu uszkodzenia neuronów przy użyciu reaktywnych form tlenu (ROS) w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy. Szczegółowo opisuje proces wywoływania stresu oksydacyjnego poprzez dodawanie wysokich stężeń nadtlenku wodoru. Narażenie na ROS powoduje pęknięcia nici DNA i niestabilność genomu. Dodatkowo utlenianie białek komórkowych upośledza ich funkcje, podczas gdy peroksydacja lipidów narusza integralność błony. Ta kaskada prowadzi do uwalniania...

Modelowanie śmierci neuronalnej wywołanej reaktywnymi gatunkami tlenu w neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Modele hodowli komórkowych zapewniają szczegółową kontrolę nad warunkami środowiskowymi, a tym samym stanowią potężną platformę do wyjaśnienia wielu aspektów biologii komórek neuronalnych. Opisujemy szybką, niedrogą i niezawodną metodę izolacji, dysocjacji i hodowli neuronów czuciowych z zarodków piskląt. Podano również szczegółowe informacje na temat przygotowania podłoża i immunocytochemii.

Izolacja i hodowla zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodków piskląt

W tym artykule szczegółowo opisujemy protokół generowania kultur neurosfery z pourodzeniowych mysich nerwowych komórek macierzystych pochodzących z głównych nisz neurogennych myszy. Neurosfery służą do identyfikacji nerwowych komórek macierzystych z tkanki mózgowej, co pozwala na oszacowanie liczby komórek prekursorowych. Co więcej, te struktury 3D mogą być powlekane w warunkach różnicowania, dając początek neuronom, oligodendrocytom i astrocytom, umożliwiając badanie losu komórek.

Izolacja i ekspansja neurosfer z postnatalnych (P1−3) mysich nisz neurogennych

Model inokulacji opuszki stopy jest cennym narzędziem do charakteryzowania indukowanych przez wirusy reakcji neurozapalnych in vivo. W szczególności zapewnia jasną ocenę kinetyki wirusa i związanych z nią procesów immunopatologicznych inicjowanych w obwodowym układzie nerwowym.

Model inokulacji opuszki stopy myszy do badania reakcji neurozapalnych wywołanych wirusem

Tutaj prezentujemy protokół izolacji in vitro wielu populacji komórek glejowych z ośrodkowego układu nerwowego myszy. Metoda ta pozwala na segregację regionalnego mikrogleju, komórek prekursorowych oligodendrocytów i astrocytów w celu zbadania fenotypów każdego z nich w różnych systemach hodowli.

Rozwarstwienie i izolacja mysiego gleju z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego

Prezentujemy model in vitro do oceny zdolności neuroregeneracyjnej gleju otoczającego węch (OEG) po uszkodzeniu neuronalnym. Opiera się na kokulturze aksotomijnych dorosłych neuronów zwojowych siatkówki (RGN) na monowarstwach OEG, a następnie badaniu regeneracji aksonów, poprzez analizę markerów aksonalnych i somatodendrytycznych RGN.

Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych

Ten protokół prezentuje unikalny sposób generowania kultur komórkowych ośrodkowego układu nerwowego z embrionalnych mózgów myszy w 17. dniu do badań neuro(immunologicznych). Model ten można analizować przy użyciu różnych technik eksperymentalnych, w tym RT-qPCR, mikroskopii, ELISA i cytometrii przepływowej.

Ustanowienie mieszanych kultur komórek neuronalnych i glejowych z embrionalnych mózgów myszy w celu zbadania infekcji i odporności wrodzonej

Ten protokół opisuje ektopową ekspresję Neurod1 za pośrednictwem wirusa po korowym udarze niedokrwiennym. Neurod1 jest dostarczany (1) za pomocą systemu Cre-Flex AAV u myszy typu dzikiego w fazie podostrej po udarze (7 dni) oraz (2) przy użyciu pojedynczego wektora AAV u myszy z warunkowym reporterem w fazie przewlekłej po udarze (21 dni).

Systemy AAV i modele mysie do badania ektopowej ekspresji Neurod1 w transdukowanych komórkach w czasie podostrym i przewlekłym po udarze niedokrwiennym

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodologię izolowania siatkówki od oka myszy w celu przeprowadzenia rozszerzonych eksperymentów ex vivo. Protokół ten kładzie nacisk na udostępnienie tego wymagającego technicznie podejścia badaczom, którzy chcieliby skorzystać z możliwości badawczych, jakie daje utrzymanie gleju siatkówki in situ w żywej tkance.

Model eksplantatu ex vivo do badania interakcji glejowych w siatkówce myszy

Poznaj metodę eksplantacji i dysocjacji komórek z dorsal root ganglia myszy w celu badania neuroplastyczności oraz odpowiedzi neuronów na infekcje wirusowe i czynniki środowiskowe.

Dorosłe myszy DRG eksplantowane i zdysocjowane modele komórkowe w celu zbadania neuroplastyczności i reakcji na zniewagi środowiskowe, w tym infekcje wirusowe (Wideo) | JoVE Journal

Dorosłe myszy DRG eksplantowane i zdysocjowane modele komórkowe w celu zbadania neuroplastyczności i reakcji na zniewagi środowiskowe, w tym infekcje wirusowe

Przeglądaj więcej filmów