Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przerzutów nowotworowych dotyczące roli kolonizacji płuc w osiąganiu przerzutów raka. Główną zaletą tej techniki jest to, że wczesne wynaczynione komórki rakowe można uwidocznić w płucach podczas przerzutów raka. Procedurę zademonstruje Cheng-Han Yang, doktorant z mojego laboratorium.

Gdy hodowla komórek nowotworowych osiągnie 70 do 80 procent zbieżności, umyj kulturę dwa razy w dwóch mililitrach sterylnego PBS na mycie i dodaj jeden mililitr 0,5% trypsyny-EDTA do naczynia hodowlanego. Natychmiast usunąć 800 mikrolitrów supernatantu i umieścić naczynie hodowlane w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 do 60 sekund, aż większość komórek oderwie się od płytki. Dodaj jeden mililitr świeżej pożywki, uzupełnionej 10% FBS, aby zatrzymać reakcję i użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby energicznie wymieszać roztwór komórek.

Przenieś powstałą zawiesinę jednokomórkową do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i zbierz komórki przez odwirowanie. Następnie ponownie zawiesić osad komórek nowotworowych w 1,5 mililitra pożywki uzupełnionej 20% FBS, a koniec nad końcem obracać komórki przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji należy policzyć żywe komórki przez wykluczenie błękitu trypanowego i zebrać je przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze sterylnego PBS do drugiego odwirowania i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach PBS uzupełnionych 10% FBS i 20 mikromililitrami CFSE. Po dziesięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności odwiruj komórki i ponownie zawiesić osad w czterech mililitrach pożywki uzupełnionej jednym procentem FBS do kolejnego odwirowania. Po ostatnim myciu ponownie zawiesić komórki na pięć razy dziesięć do szóstych komórek nowotworowych na mililitr świeżej pożywki bez stężenia FBS i umieścić komórki na lodzie.

Następnie ogrzej ogon cztero- do sześciotygodniowego samca myszy C570 Black Six przez pięć do dziesięciu minut, aby rozszerzyć żyły ogonowe i użyj jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 26 i pół grubości, aby dokładnie wymieszać komórki, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Ostrożnie załadować strzykawkę 200 mikrolitrami komórek i umieścić mysz w ograniczniku. Następnie wstrzyknij całą objętość komórek do światła rozszerzonej żyły ogonowej.

W odpowiednim momencie po wstrzyknięciu należy wykonać podłużne nacięcie skóry i tkanki podskórnej od brzucha do klatki piersiowej i otworzyć jamę opłucnej, aby odsłonić serce i płuca. Za pomocą sterylnych szwów chirurgicznych podwiązaj żyłę główną górną i dolną, aby zapobiec cofaniu się roztworu obfitości i użyj nożyczek, aby zrobić dwu- do czteromilimetrową szczelinę w lewej komorze, aby ułatwić odpływ perfuzatu z płuc. Następnie użyj trzymililitrowej strzykawki, aby wstrzyknąć PBS do prawej komory i użyj ciągłego ssania, aby usunąć odsączony roztwór, aż płuca zmienią kolor z czerwonawego na całkowicie blady.

Zadbaj o prawidłowe zabezpieczenie żyły głównej górnej i dolnej, aby perfuzja płuc zakończyła się sukcesem. Po pobraniu płuc umieść płaty w specjalnie wykonanym uchwycie na płuca w sześciocentymetrowym naczyniu i przymocuj płuca do siateczkowej tekstury uchwytu. Przykryj i zwilż płaty PBS, a następnie umieść naczynie hodowlane na stoliku do obrazowania mikroskopu konfokalnego.

Wybierz obiektyw 5x i obróć koło filtrów w kierunku NIBA. Za pomocą lasera o długości fali 488 nanometrów wzbudz CFSE, aby umożliwić wyraźną wizualizację fluorescencyjnych komórek nowotworowych oznaczonych na niebiesko w płatach płuc. Obróć koło filtra do R690, aby skanować z prędkością dwóch mikrosekund na piksel i zoptymalizować wzmocnienie wysokiego napięcia i poziomy przesunięcia.

Następnie uchwyć pięć 12 na pięć 12-pikselowych obrazów fluorescencyjnych, korzystając z szybkości skanowania 10 mikrosekund na piksel. Stosując metodę barwienia, jak właśnie wykazano, komórki nowotworowe są skutecznie znakowane CFSE w sposób zależny od dawki. Przy intensywności fluorescencji znakowania, prawie osiągając plateau w sześć razy 10 do piątej komórek raka płuc Lewisa na mililitr przy stężeniu 20 mikromolów.

Perfuzja płuc przed pobraniem, jak właśnie wykazano, oczyszcza naczynia krwionośne płuc z niespecyficznie posiekanych krążących komórek nowotworowych przed analizą obrazową. Fluorescencyjna mikroskopia konfokalna ujawnia obecność kolonizujących komórek nowotworowych znakowanych CFSE w pobranych i perfundowanych płatach płuc. Użycie odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu w celu konwersji obrazów fluorescencyjnych na czarno-białe, ułatwia ilościowe określenie kolonizacji płuc.

Dożylne podanie fibronektyny eksprymującej lub pomieszanej fibronektyny wyrażającej komórki raka płuc Lewisa wykazuje znacznie mniejszą liczbę komórek wyrażających fibronektynę w tkance płucnej pobranej 38 i 45 godzin po wstrzyknięciu, co podkreśla rolę fibronektyny w kolonizacji płata płuc i rozwoju guza. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dokładnym przeprowadzeniu perfuzji płuc, aby nieprzyłączone komórki mogły zostać zmyte. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się przerzutami nowotworowymi do zbadania kolonizacji płuc poprzez krążenie komórek nowotworowych w mysim modelu o zerowym gramie.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak fluorescencyjnie znakować zawiesiny komórek nowotworowych, dożylnie zaszczepiać komórki nowotworowe perfundować płuca myszy i używać konfokalnej mikroskopii kwiatowej do obrazowania przerzutów komórek nowotworowych.