Name: Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji krążących komórek nowotworowych w płucach myszy w modelu in vivo. Technika ta umożliwia obserwację wczesnych etapów kolonizacji płuc podczas przerzutów nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Dr. Ming-Min Chang i Pani Ya-Hsin Cheng za ich wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez tajwańskie Ministerstwo Nauki i Technologii (MOST-103-2325-B-006 -009, MOST- 104-2325-B-006-001, MOST-105-2325-B-006-001 i MOST-106-2320-B-006-068-MY3) oraz Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej (MOHW106-TDU-B-211-144004). Jesteśmy również wdzięczni za wsparcie ze strony Głównego Laboratorium Badawczego College of Medicine, National Cheng Kung University, dla ich wielofotonowego mikroskopu konfokalnego.

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi naszego instytutu (Przewodnik po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych, NCKU Medical College).
1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych i potraw
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem protokołów eksperymentalnych należy zaopatrzyć się w sterylne szwy chirurgiczne, strzykawki 1 ml z igłą 26G/0,5 cm (do wstrzykiwania żyły ogonowej), strzykawki 3 ml z igłą 24G/3 cm (do perfuzji płuc), zmodyfikowane podłoże Eagle Media firmy Dulbecco (DMEM), roztwór trypsyna-EDTA (5 g/L trypsyny i 0,53 mM), płodowa surowica bydlęca (FBS), 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PHO4 i 1,8 mM KH2PO4) oraz 6 cm szalki hodowlane.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i odzyskiwanie komórek nowotworowych w zawiesinie
<ol>
	<li>Przygotuj sterylne zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Modified Eagle (DMEM) zawierające 10% lub 20% FBS i świeżo dodaj 2 mM L-glutaminy, 1x PBS i 0,05% Trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Hodować komórki w DMEM uzupełnione 10% FBS w temperaturze 37 °C i hodować je do momentu uzyskania 70-80% konfluencji w naczyniu hodowlanym.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną (DMEM) z naczyń, a następnie dwukrotnie przemyć 2 ml sterylnego 1x PBS.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA do naczyń, aby dokładnie pokryć wszystkie komórki. Natychmiast usuń 800 μl roztworu i pozostaw tylko 200 μl w naczyniach. Inkubować szalki w temperaturze 37 °C przez 30 s do 1 minuty (w zależności od typu komórek) i poczekać, aż większość komórek znajdzie się w stanie zawieszenia.</li>
	<li>Dodaj 1 ml świeżego DMEM zawierającego 10% FBS bezpośrednio do szalek, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną trypsyny i energicznie pipetuj zawiesinę komórek w górę iw dół za pomocą pipety 1000 μl, aby przygotować zawiesinę pojedynczej komórki.</li>
	<li>Przenieś komórki z naczynia do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wiruj w temperaturze pokojowej o sile 162 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki nowotworowe w 1,5 ml DMEM zawierającym 20% FBS i obracać komórki w zawiesinie w temperaturze 37 °C od końca do końca przez 2 godziny 
	UWAGA: Jeśli podłoże zmieni kolor na żółty podczas odzyskiwania, wymień stare podłoże na świeże zawierające 20% FBS.</li>
</ol>
3. Barwienie fluorescencyjne i analiza komórek nowotworowych w zawiesinie estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE)
<ol>
	<li>Po odzyskaniu komórek w zawiesinie, należy policzyć odpowiednią liczbę żywotnych komórek za pomocą błękitu trypanowego w komorze liczącej Neubauera w celu miareczkowania dawek barwienia fluorescencyjnego i wstrzyknięcia żyły ogonowej.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 162 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty i ponownie zawiesić granulowane komórki w 1 ml wysterylizowanego 1x PBS, a następnie odwirować w temperaturze pokojowej przy 162 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Zawiesić granulowane komórki w 500 μl 1X PBS zawierającego 10% FBS i 0, 5, 10, 20 lub 40 μM CFSE w celu miareczkowania dawki i inkubować zawiesinę komórek w temperaturze 37 oC przez 10 minut w ciemności.</li>
	<li>Odwiruj komórki w temperaturze 162 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty i ponownie zawieś granulowane komórki za pomocą 4 ml DMEM zawierającego 1% FBS. Powtórz ten krok prania jeszcze trzy razy. Ponownie zawiesić granulowane komórki za pomocą 4 ml samego DMEM w celu końcowego przepłukania.</li>
	<li>Poddaj komórki znakowane CFSE analizie sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu ilościowego określenia intensywności fluorescencji pojedynczej komórki lub wstrzyknięcia żyły ogonowej. 
	UWAGA: Trzymaj komórki na lodzie przed wykonaniem analizy FACS lub wstrzyknięć do żył ogonowych.</li>
</ol>
4. Test kolonizacji płuc
<ol>
	<li>Przygotuj komórki oznaczone 20 μM CFSE (patrz kroki od 3.1 do 3.4). 
	UWAGA: Zdecyduj o dawce roboczej CFSE do znakowania komórek nowotworowych, na podstawie wyników miareczkowania z analizy FACS (patrz Krok 3.3).</li>
	<li>Rozgrzej ogony 4-6 tygodniowych samców myszy C57BL/6 (6 myszy) lampą halogenkową przez 5-10 minut na zasadzie mysz po myszy, aby rozszerzyć żyły ogona myszy.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj i odessaj komórki nowotworowe znakowane CFSE za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (26Gx1/2), unikając pęcherzyków w zawiesinie komórek (przy końcowej gęstości komórek 5 x 106 komórek/ml).</li>
	<li>Ostrożnie wstrzyknąć 1 x106 komórek nowotworowych znakowanych CFSE w 200 μl DMEM do żyły ogonowej myszy, która powinna być umieszczona w ograniczniku dla myszy. 
	UWAGA: Podczas wstrzyknięcia, jeśli igła jest umieszczona bezpośrednio w świetle żyły ogonowej, komórki nowotworowe powinny być łatwo dostarczone do krążenia bez konieczności mocnego naciskania na strzykawkę. Jeśli trudno jest przepchnąć komórki nowotworowe, najprawdopodobniej zostały one wstrzyknięte poza żyłę ogonową, do przestrzeni podskórnej.</li>
	<li>Podziel myszy, które otrzymały dożylnie komórki nowotworowe znakowane CFSE, na dwie grupy: jedna grupa przejdzie perfuzję płuc, a następnie mikroskopię konfokalną i kwantyfikację ImageJ w teście kolonizacji płuc, a druga zostanie pozostawiona sama na 4-5 tygodni w długoterminowym teście kolonizacji płuc.</li>
	<li>Po 20, 38 lub 45 godzinach i z 1x 106 komórkami nowotworowymi wstrzykniętymi dożylnie podczas miareczkowania zależnego od czasu i dawki, znieczulij myszy z guzem za pomocą 50-75 mg / kg zoletil 50, który jest dobrze akceptowanym i właściwym środkiem znieczulającym<klasa sup = "xref">23. 
	UWAGA: Użyj maści weterynaryjnej na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Przeciąć podłużnie skórę i tkanki podskórne od brzucha do klatki piersiowej nożyczkami chirurgicznymi. Otwórz jamę opłucnową nożyczkami chirurgicznymi i kleszczami, aby całkowicie odsłonić serce i płuca. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie odciąć naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Zawiązać żyłę główną górną (SVC) i żyłę główną dolną (IVC) sterylnymi szwami chirurgicznymi, aby zapobiec cofaniu się roztworu perfuzyjnego podczas perfuzji płuc.</li>
	<li>Przeciąć ścianę lewej komory nożyczkami chirurgicznymi, aby otworzyć szczelinę (około 2-4 mm) w celu odprowadzenia roztworu perfuzyjnego z płuc.</li>
	<li>Wstrzyknąć 1x PBS do prawej komory za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i usunąć odsączony roztwór ze stałym ssaniem podczas perfuzji płuc, aż płuca zmienią kolor z czerwonawego na całkowicie blady.</li>
</ol>
5. Konfokalne obrazowanie mikroskopowe i analiza komórek nowotworowych skolonizowanych przez płuca
<ol>
	<li>Usuń blade płuca z jamy opłucnej i oddziel pięć płatów, odcinając tchawicę i więzadła tkanki łącznej za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy24.</li>
	<li>Przygotuj uchwyt na płuca przypominający nosze, jak pokazano w Rysunek 3B, owijając nylonowy szew wokół dwóch metalowych prętów, aby uzyskać siatkową teksturę z przestrzenią między dwoma prętami do umieszczenia płatów płuc. Umieść uchwyt na płuca w naczyniu o średnicy 6 cm. 
	UWAGA: Uchwyt płuc będzie używany do stabilizacji płatów płuc pod soczewką obiektywu mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Umieść i przymocuj płaty płuc do siateczkowatej tekstury uchwytu płuca. Przykryj i zwilż płaty płuc 1x PBS.</li>
	<li>Poddaj 6-centymetrową naczynie hodowlane, w której znajdują się płaty płuc na uchwycie płuc, mikroskopii konfokalnej w celu uchwycenia obrazów fluorescencyjnych rejestrujących komórki nowotworowe kolonizujące płuca.</li>
	<li>Do obrazowania należy używać soczewek obiektywowych (5X, MPLN, NA: 0,1, WD: 20, Air).</li>
	<li>Obróć koło filtra do NIBA (wzbudzenie/emisja; 470-495 nm/510-550 nm) i użyj lasera 488 nm do wzbudzenia CFSE, aby wyraźnie uwidocznić obrazy punktów fluorescencyjnych w płatach płuc.</li>
	<li>Obróć koło filtrów na R690 (dla lasera MaiTai HP DeepSee), aby skanować z prędkością skanowania 2,0 μs/piksel i zoptymalizować poziomy HV, wzmocnienia i przesunięcia.</li>
	<li>Rejestruj obrazy fluorescencyjne (512 x 512 pikseli) za pomocą oprogramowania mikroskopowego z prędkością skanowania 10 μs/piksel.</li>
	<li>Określ ilościowo i analizuj statystycznie obrazy mikroskopowe za pomocą oprogramowania ImageJ i GraphPad, jak opisano wcześniej21.</li>
</ol>
6. Długoterminowe testy kolonizacji płuc
UWAGA: Powtórz kroki od 4.1 do 4.5.
<ol>
	<li>Poświęć myszy po inokulacji komórek nowotworowych przez 4-5 tygodni i napraw ich płuca za pomocą Bouin's Fluid25 przez 1 do 2 dni.</li>
	<li>Określ ilościowo i przeanalizuj statystycznie guzki guza z płuc myszy za pomocą software21.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wraz z długoterminowymi testami kolonizacji płuc, krótkoterminowa metodologia, którą zastosowaliśmy tutaj do oceny kolonizacji płuc in vivo przez CTC w odległych narządach, wyraźnie ujawniła i zróżnicowała specyficzną rolę polyFN zgromadzonego na CTC w kolonizacji płuc, co następnie doprowadziło do procesów wynaczynienia i przerzutów 18,19,20,21. Chociaż znakowanie komórek za pomocą dł...

Przerzuty są główną przyczyną zgonów z powodu raka1,2. Komórki nowotworowe pochodzące z tkanek pierwotnych wchodzą do krążenia w zawiesinie i przeżywają różne wyzwania hematogenne, np. anoikis, ataki immunologiczne i uszkodzenia spowodowane stresem ścinającym spowodowanym ciśnieniem krwi lub ograniczeniami geometrycznymi, zanim będą w stanie skolonizować odległe narządy, co jest kluczowym krokiem decydującym o powodzeniu przerzutów3,4,5,6. W związku z tym obecnie podjęto energiczne wysiłki w celu scharakteryzowania krążących komórek nowotworowych (CTC) i skorelowania tych cech z nowotworem złośliwym, przerzutami i wskaźnikami przeżycia pacjentów z rakiem7,8,9. Ponieważ proces przerzutów nowotworowych wyraźnie przedstawia zdarzenie in vivo, modele zwierzęce są jedynym podejściem, które ujmuje pełny ogólnoustrojowy proces przerzutów10,11,12.
CTC stają się przerzutowymi tkankami nowotworowymi w wyniku wielu zdarzeń komórkowych, w tym kolonizacji odległych narządów1,2. Jednak najczęściej stosowane testy przerzutów13,14,15 nie zapewniają sposobu na obserwację kolonizacji CTC odległych narządów. Dlatego pilnie potrzebny jest projekt testu in vivo do wizualizacji kolonizacji CTC. Chociaż zaprojektowano kilka krótkoterminowych testów kolonizacji płuc in vivo i ex vivo, problemy i wady pozostają. Na przykład, podczas gdy komórki nowotworowe z nadekspresją białka zielonej fluorescencji (GFP) zostały użyte w tych testach22,23, stabilna transfekcja i klonowanie komórek nowotworowych o wystarczającej intensywności fluorescencji GFP pod mikroskopem wymaga czasu. Podobnie, chociaż przejściowe barwienie komórek nowotworowych za pomocą długoterminowego znacznika komórek CFSE zostało zastosowane w celu zastąpienia komórek nowotworowych wykazujących ekspresję GFP, nadal trudno jest ocenić, czy komórki nowotworowe znakowane CFSE są przyczepione, czy tylko obecne w unaczynieniu wyciętych odległych narządów16,17.
Stwierdzono, że Polimeryczna fibronektyna (polyFN) złożona na powierzchni CTC w decydujący sposób przyczynia się do ostatecznego powstania przerzutowych tkanek nowotworowych18,19,20,21,22. Tutaj przeprowadziliśmy krótkoterminowe testy kolonizacji płuc, w których zawieszone komórki raka płuc Lewisa (LLC) stabilnie eksprymujące FN-shRNA (shFN) lub scramble-shRNA (shScr) i wstępnie znakowane CFSE zostały dożylnie zaszczepione myszom C57BL / 6. Po 2-3 dniach płuca myszy zostały najpierw perfundowane solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu całkowitego usunięcia nieprzyłączonych CTC w obrębie układu krwionośnego, a następnie poddane mikroskopii konfokalnej i kwantyfikacji LLC kolonizujących płuca. Wyraźnie wykazaliśmy, że liczba kolonizujących płuca shFN LLC i guzków nowotworowych została znacznie zmniejszona w porównaniu z shScr LLC, co znacznie potwierdza rolę składania poliFN na CTC w ułatwianiu kolonizacji i wzrostu CTC w płucach. Nasze badanie uzasadnia dalsze badania nad rolą poliFN w przerzutach raka.

<table><tbody><tr><td><silny>Materiał</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej&nbsp;( BSA)</td><td>Cyrusbioscience (Tajpej, Tajwan)</td><td>101-9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Płyn Bouina</td><td>MCC (korporacja chemii medycznej)/POISON</td><td>456-A-1GL</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik proliferacyjny CFSE</td><td>ebiosciences</td><td>65-0850-85</td><td>Pełna nazwa: Karboksyfluoresceina succinimidylowa ester</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbecco Eagle Media (DMEM)&nbsp;</td><td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td><td>12100-061</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Cyrusbioscience (Tajpej, Tajwan)</td><td>101-6381-92-6</td><td>Do przygotowanego roztworu trypsyny-EDTA( Stężenie końcowe: 0,53mM )&nbsp;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Rak płuc Lewisa (LLC)</td><td>ATCC, Manassas, VA, USA,</td><td>CRL-1642</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina, USP&nbsp;</td><td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td><td>21051-024</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Cyrusbioscience (Taipei, Tajwan)</td><td>101-7447-40-7</td><td>Do przygotowania 1X PBS ( Stężenie końcowe: 2,7mM )</td></tr> <tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)</td><td>Cyrusbioscience (Taipei, Tajwan)</td><td>101-7778-77-0</td><td>Do przygotowanego 1X PBS ( Stężenie końcowe: 1,8mM )</td></tr><tr><td>Sód chlorek (NaCl)</td><td>Cyrusbioscience (Tajpej, Tajwan)</td><td>101-7647-14-5</td><td>Do przygotowanego 1X PBS ( Stężenie końcowe: 137mM )</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)</td><td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td><td>101-10039-32-4</td><td>Do przygotowanego 1X PBS ( Stężenie końcowe: 10mM )</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6146</td><td>0,5 g wymieszać ze 100 ml 1X PBS</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4799</td><td>Do przygotowanego roztworu trypsyna-EDTA ( Stężenie końcowe: 5g/L )</td></tr><tr><td>Zoletil 50</td><td>Virbac</td><td></td><td>Do rozcieńczenia 1X PBS&nbsp;</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compact Wirówka stołowa 2420</td><td>KUBOTA Co.</td><td>2420</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane (6cm)</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td><td></td><td></td>705001</tr><tr><td>Jednorazowa strzykawka (z igłą)</td><td>Perfect Medical Industry Co.</td><td></td><td>24G/3 cm;3 ml & 26G/0,5 cm;1 ml</td></tr><tr><td>Mikser end over end</td><td>C.T.I YOUNG CHENN</td><td>TS-20</td><td>Do odzyskiwania zawieszonych komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>FACSCalibur (FACS)</td><td>BD biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Dimeda</td><td>10.102.14</td><td></td></tr><tr><td>Forma Direct Heat Inkubator CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>HEPA CLASS 100</td><td></td></tr><tr><td>Ogranicznik myszy (Ogranicznik cylindryczny 15-30 g)</td><td>Stoelting</td><td>51338</td><td></td></tr><tr><td>Wielofotonowy mikroskop konfokalny BX61WI</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>Komora licząca Neubauer</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Dimeda</td><td>08.370.11</td><td></td></tr><tr><td>Szwy chirurgiczne&nbsp;</td><td>UNIK SZWY CHIRURGICZNE MFG. CO.</td><td>NR 0034</td><td>pleciony jedwab; niewchłanialny (25YD; U.S.P. 4/0)</td></tr><tr><td>1,5 ml probówka do mikrowirówek</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td><td></td><td></td>615001</tr><tr><td>15 ml rurki Greiner Greiner</td><td>bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Przerzuty są główną przyczyną zgonów z powodu raka. Rola krążących komórek nowotworowych (CTC) w promowaniu przerzutów nowotworowych, w których kolonizacja płuc przez CTC krytycznie przyczynia się do wczesnych procesów przerzutowych do płuc, była intensywnie badana. W związku z tym modele zwierzęce są jedynym podejściem, które pozwala uchwycić pełny ogólnoustrojowy proces przerzutów. Biorąc pod uwagę, że w poprzednich projektach eksperymentalnych występują problemy dotyczące badania udziału CTC w wynaczynieniu naczyń krwionośnych, ustaliliśmy test kolonizacji płuc in vivo, w którym długotrwały znacznik komórek fluorescencyjnych, ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny (CFSE), został użyty do znakowania zawieszonych komórek nowotworowych, a perfuzję płuc przeprowadzono w celu usunięcia niespecyficznie uwięzionych CTC przed usunięciem płuc, obrazowanie konfokalne i kwantyfikacja. Stwierdzono, że polimeryczna fibronektyna (polyFN) złożona na powierzchni CTC pośredniczy w kolonizacji płuc w ostatecznym ustaleniu przerzutowych tkanek nowotworowych. Tutaj, aby w szczególności przetestować wymóg składania poliFN na CTC do kolonizacji i wynaczynienia płuc, przeprowadziliśmy krótkoterminowe testy kolonizacji płuc, w których zawieszone komórki raka płuc Lewisa (LLC) stabilnie eksprymujące FN-shRNA (shFN) lub scramble-shRNA (shScr) i wstępnie znakowane 20 μM CFSE zostały dożylnie zaszczepione myszom C57BL / 6. Z powodzeniem wykazaliśmy, że zdolności komórek shFN LLC do kolonizacji płuc myszy były znacznie zmniejszone w porównaniu z komórkami shScr LLC. Dlatego ta krótkoterminowa metodologia może być szeroko stosowana w celu specyficznego wykazania zdolności CTC w krążeniu do kolonizacji płuc.

Przed przeprowadzeniem testu kolonizacji płuc in vivo, przedstawionego na Rysunku 1A, w celu sprawdzenia, czy polyFN na zawiesionych komórkach nowotworowych pośredniczy w kolonizacji płuc i/lub ekstrawazacji, ułatwiając przerzutowanie, w pierwszej kolejności dokonaliśmy miareczkowania różnych stężeń CFSE w zawiesinach komórek nowotworowych. CFSE jest związkiem fluorescencyjnym przenikającym przez błony komórkowe, który kowalencyjnie łączy się z wewną...

Model zwierzęcy jest potrzebny do rozszyfrowania roli krążących komórek nowotworowych (CTC) w promowaniu kolonizacji płuc podczas przerzutów raka. W tym miejscu opracowaliśmy i z powodzeniem przeprowadziliśmy test in vivo, aby przetestować wymóg składania polimerycznej fibronektyny (polyFN) na CTC w celu kolonizacji płuc.

Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przerzutów nowotworowych dotyczące roli kolonizacji płuc w osiąganiu przerzutów raka. Główną zaletą tej techniki jest to, że wczesne wynaczynione komórki rakowe można uwidocznić w płucach podczas przerzutów raka. Procedurę zademonstruje Cheng-Han Yang, doktorant z mojego laboratorium.Gdy hodowla komórek nowotworowych osiągnie 70 do 80 procent zbieżności, umyj kulturę dwa razy w dwóch mililitrach sterylnego PBS na mycie i dodaj jeden mililitr 0,5% trypsyny-EDTA do naczynia hodowlanego. Natychmiast usunąć 800 mikrolitrów supernatantu i umieścić naczynie hodowlane w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 do 60 sekund, aż większość komórek oderwie się od płytki. Dodaj jeden mililitr świeżej pożywki, uzupełnionej 10% FBS, aby zatrzymać reakcję i użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby energicznie wymieszać roztwór komórek.Przenieś powstałą zawiesinę jednokomórkową do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i zbierz komórki przez odwirowanie. Następnie ponownie zawiesić osad komórek nowotworowych w 1,5 mililitra pożywki uzupełnionej 20% FBS, a koniec nad końcem obracać komórki przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji należy policzyć żywe komórki przez wykluczenie błękitu trypanowego i zebrać je przez odwirowanie.Ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze sterylnego PBS do drugiego odwirowania i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach PBS uzupełnionych 10% FBS i 20 mikromililitrami CFSE. Po dziesięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności odwiruj komórki i ponownie zawiesić osad w czterech mililitrach pożywki uzupełnionej jednym procentem FBS do kolejnego odwirowania. Po ostatnim myciu ponownie zawiesić komórki na pięć razy dziesięć do szóstych komórek nowotworowych na mililitr świeżej pożywki bez stężenia FBS i umieścić komórki na lodzie.Następnie ogrzej ogon cztero- do sześciotygodniowego samca myszy C570 Black Six przez pięć do dziesięciu minut, aby rozszerzyć żyły ogonowe i użyj jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 26 i pół grubości, aby dokładnie wymieszać komórki, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Ostrożnie załadować strzykawkę 200 mikrolitrami komórek i umieścić mysz w ograniczniku. Następnie wstrzyknij całą objętość komórek do światła rozszerzonej żyły ogonowej.W odpowiednim momencie po wstrzyknięciu należy wykonać podłużne nacięcie skóry i tkanki podskórnej od brzucha do klatki piersiowej i otworzyć jamę opłucnej, aby odsłonić serce i płuca. Za pomocą sterylnych szwów chirurgicznych podwiązaj żyłę główną górną i dolną, aby zapobiec cofaniu się roztworu obfitości i użyj nożyczek, aby zrobić dwu- do czteromilimetrową szczelinę w lewej komorze, aby ułatwić odpływ perfuzatu z płuc. Następnie użyj trzymililitrowej strzykawki, aby wstrzyknąć PBS do prawej komory i użyj ciągłego ssania, aby usunąć odsączony roztwór, aż płuca zmienią kolor z czerwonawego na całkowicie blady.Zadbaj o prawidłowe zabezpieczenie żyły głównej górnej i dolnej, aby perfuzja płuc zakończyła się sukcesem. Po pobraniu płuc umieść płaty w specjalnie wykonanym uchwycie na płuca w sześciocentymetrowym naczyniu i przymocuj płuca do siateczkowej tekstury uchwytu. Przykryj i zwilż płaty PBS, a następnie umieść naczynie hodowlane na stoliku do obrazowania mikroskopu konfokalnego.Wybierz obiektyw 5x i obróć koło filtrów w kierunku NIBA. Za pomocą lasera o długości fali 488 nanometrów wzbudz CFSE, aby umożliwić wyraźną wizualizację fluorescencyjnych komórek nowotworowych oznaczonych na niebiesko w płatach płuc. Obróć koło filtra do R690, aby skanować z prędkością dwóch mikrosekund na piksel i zoptymalizować wzmocnienie wysokiego napięcia i poziomy przesunięcia.Następnie uchwyć pięć 12 na pięć 12-pikselowych obrazów fluorescencyjnych, korzystając z szybkości skanowania 10 mikrosekund na piksel. Stosując metodę barwienia, jak właśnie wykazano, komórki nowotworowe są skutecznie znakowane CFSE w sposób zależny od dawki. Przy intensywności fluorescencji znakowania, prawie osiągając plateau w sześć razy 10 do piątej komórek raka płuc Lewisa na mililitr przy stężeniu 20 mikromolów.Perfuzja płuc przed pobraniem, jak właśnie wykazano, oczyszcza naczynia krwionośne płuc z niespecyficznie posiekanych krążących komórek nowotworowych przed analizą obrazową. Fluorescencyjna mikroskopia konfokalna ujawnia obecność kolonizujących komórek nowotworowych znakowanych CFSE w pobranych i perfundowanych płatach płuc. Użycie odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu w celu konwersji obrazów fluorescencyjnych na czarno-białe, ułatwia ilościowe określenie kolonizacji płuc.Dożylne podanie fibronektyny eksprymującej lub pomieszanej fibronektyny wyrażającej komórki raka płuc Lewisa wykazuje znacznie mniejszą liczbę komórek wyrażających fibronektynę w tkance płucnej pobranej 38 i 45 godzin po wstrzyknięciu, co podkreśla rolę fibronektyny w kolonizacji płata płuc i rozwoju guza. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dokładnym przeprowadzeniu perfuzji płuc, aby nieprzyłączone komórki mogły zostać zmyte. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się przerzutami nowotworowymi do zbadania kolonizacji płuc poprzez krążenie komórek nowotworowych w mysim modelu o zerowym gramie.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak fluorescencyjnie znakować zawiesiny komórek nowotworowych, dożylnie zaszczepiać komórki nowotworowe perfundować płuca myszy i używać konfokalnej mikroskopii kwiatowej do obrazowania przerzutów komórek nowotworowych.

the-establishment-lung-colonization-assay-for-circulating-tumor-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Nowy protokół opisany w niniejszym badaniu umożliwia selekcyjne wykrywanie przerzutów do płuc z rozdzielczością pojedynczych komórek u myszy poprzez połączenie perfuzji i fiksacji płuc in-situ oraz barwienia X-Gal komórek nowotworowych znakowanych genem lacZ.

Ulepszona wizualizacja przerzutów do płuc w rozdzielczości pojedynczych komórek u myszy poprzez połączoną perfuzję in-situ tkanki płucnej i barwienie X-Gal komórek nowotworowych znakowanych lacZ

Ten film opisuje test tworzenia kolonii, który pomaga określić zdolność komórek raka płuc do rozmnażania się w nieskończoność i tworzenia indywidualnych kolonii. Możemy przeanalizować wpływ środka przeciwnowotworowego na komórki tworzące kolonie, analizując zmiany w liczbie i/lub wielkości powstałych kolonii.

Test tworzenia kolonii: ocena skuteczności środków przeciwnowotworowych na komórkach raka płuc tworzących kolonie

Ten manuskrypt opisuje metodę ilościowego określania akumulacji komórek nowotworowych w płucach w zwierzęcym modelu przerzutów nowotworowych.

Test rekrutacji komórek nowotworowych płuc

Opisujemy powstawanie ortotopowych guzów jelita grubego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych lub organoidów do jelita ślepego myszy i późniejszą izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) z tego modelu.

Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu protokołu testu przerzutów do płuc (PuMA). Model ten pozwala naukowcom badać wzrost komórek kostniakomięsaka z przerzutami (OS) w tkance płucnej za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.

Praktyczne rozważania w badaniu przerzutowej kolonizacji płuc w kostniakomięsaku przy użyciu testu przerzutów do płuc

Charakterystyka krążących komórek nowotworowych (CTC) jest popularnym tematem w badaniach translacyjnych. Protokół ten opisuje półautomatyczny test immunofluorescencyjny (IF) do charakterystyki PD-L1 i liczenia CTC w próbkach pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC).

Półautomatyczna charakterystyka i liczenie krążących komórek nowotworowych PD-L1 od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca za pomocą immunofluorescencji

Opisane podejście łączy eksperymentalne testy przerzutów do żył ogonowych z obrazowaniem żywych zwierząt in vivo, aby umożliwić monitorowanie w czasie rzeczywistym powstawania i wzrostu przerzutów raka piersi, a także ilościowe określenie liczby i wielkości przerzutów w płucach.

Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc

Dożylne wstrzykiwanie komórek rakowych jest często stosowane w badaniach nad przerzutami, ale obciążenie guzem przerzutowym może być trudne do analizy. W tym artykule demonstrujemy model przerzutów do iniekcji żyły ogonowej i uwzględniamy nowatorskie podejście do analizy wynikającego z przerzutowego obciążenia guzem płuc.

Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Głównym wyzwaniem przy opracowywaniu nowych terapii raka płuc jest modelowanie mikrośrodowiska guza w miarę postępu choroby regionalnej w kierunku choroby przerzutowej. Tutaj opisujemy prostą metodę ustanowienia ortotopowego modelu syngeneicznego raka płuc, który pozwala na śledzenie chorób in vivo w czasie.

Minimalnie inwazyjna metoda tworzenia syngeneicznego ortotopowego modelu myszy raka płuc

Protokół ten przedstawia szczegółową metodę izolowania wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek zarówno ze zdrowej, jak i z guzowymi tkankami płuc myszy. Protokół ten może być stosowany w scRNA-seq, analizie cytometrii przepływowej oraz izolacji komórek pierwotnych.

Optymalizacja przygotowania całej tkanki płucnej z guzem myszy do cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA pojedynczego komórkowego

Poznaj metodę wizualizacji krążących komórek nowotworowych w płucach myszy w modelu in vivo. Technika ta umożliwia obserwację wczesnych etapów kolonizacji płuc podczas przerzutów nowotworowych.

Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

Przeglądaj więcej filmów