Name: Ustanowienie pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich pochodzącego od pacjenta (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek nowotworowych z tkanki mięsaka tkanek miękkich pochodzącej od pacjenta. Technika ta umożliwia badanie patofizjologii i odpowiedzi na terapię w modelu preklinicznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Gráinne Tierney za pomoc redakcyjną.

Komórki STS są izolowane z guza chirurgicznie wyciętego od pacjentów z STS. Protokół został zatwierdzony przez Lokalną Komisję Etyczną i jest wykonywany zgodnie z wytycznymi Dobrej Praktyki Klinicznej oraz Deklaracją Helsińską. Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu. Próbki chirurgiczne są analizowane przez doświadczonego patologa mięsaka i przetwarzane w ciągu 3 godzin od operacji.
1. Pobieranie i przetwarzanie próbek nowotworów:
<ol>
	<li>Zbierz próbki guza z pomocą patologa mięsaka w sterylnym pojemniku na mocz o pojemności 100 ml z 50 ml pożywki DMEM o niskiej zawartości glukozy, uszczelnionej folią parafinową.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 3 godziny po wycięciu guza.</li>
	<li>Wykonaj wszystkie poniższe czynności pod sterylnym kapturem do hodowli tkankowych.
	<ol>
		<li>Wysterylizuj kaptur 70% etanolem i załóż sterylne rękawice.</li>
		<li>Sterylizuj stalową pęsetę inox 70% etanolem (użyj sterylnej gazy).</li>
		<li>Usuń film parafinowy z pojemnika na mocz i wyrzuć.</li>
		<li>Umyj zewnętrzną część pojemnika na mocz 70% etanolem.</li>
		<li>Otwórz kwadratową szalkę Petriego.</li>
		<li>Otwórz pojemnik na mocz i przenieś próbki guza na kwadratową szalkę Petriego za pomocą wysterylizowanej stalowej pęsety inox.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dwukrotnie przemyj próbki guza PBS.</li>
	<li>Otwórz sterylny skalpel chirurgiczny.
	<ol>
		<li>Drobno rozdrobnij próbki guza na 1 - 2 mm3 kawałki.</li>
		<li>Zebrać jedną czwartą całej próbki do probówki o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Dodać 1 ml odczynnika trizol (zakupionego) do probówki i natychmiast zamrozić w temperaturze -80 °C (próbka zostanie wykorzystana w dalszej analizie do oceny ekspresji genu STS).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz resztę drobno rozdrobnionego materiału nowotworowego do probówki o pojemności 15 ml.
	<ol>
		<li>Dodać 4 ml roztworu kolagenazy typu I (kolagenaza typu I rozpuszcza się w PBS w stężeniu 4 μg/ml).</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór kolagenazy typu I 4 ml pożywki DMEM o wysokiej hodowli (końcowe stężenie kolagenazy typu I wynosi 2 μg/ml).</li>
		<li>Zamknij probówkę o pojemności 15 ml i uszczelnij folią parafinową.</li>
		<li>Umieścić probówkę o pojemności 15 ml w wytrząsarce na kółkach w inkubatorze w temperaturze 37 °C w warunkach mieszania przez 15 minut, aby aktywować trawienie.</li>
		<li>Po 15 minutach przechowuj probówkę w wytrząsarce w warunkach mieszania w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnego dnia umieść probówkę o pojemności 15 ml pod sterylnym kapturem.</li>
	<li>Delikatnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sterylny filtr 100 μm przymocowany do górnej części probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Umyj filtr pożywką o wysokiej hodowli DMEM uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% glutaminą i 1% penicyliną/streptomycyną.</li>
	<li>Wyrzucić sterylny filtr 100 μm, zamknąć probówkę o pojemności 50 ml i odwirować przy 225 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić supernatant przez odwrócenie probówki.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 - 2 ml pożywki DMEM o wysokiej hodowli uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% glutaminą i 1% penicyliną/streptomycyną. 
	nuta: Objętość zależy od ilości przetworzonej próbki guza.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą komory Neubauera.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:2 w błękitu trypanowym i użyć 10 μl rozcieńczenia do zliczenia komórek.</li>
		<li>Policz co najmniej dwa razy i oblicz średnią z kontrprób, aby poznać całkowitą średnią liczbę zebranych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płytki komórkowe w standardowej hodowli jednowarstwowej o gęstości 80 000 komórek/cm2, 
	nuta: W eksperymentach zawsze uwzględniaj elementy sterujące. Wykonaj co najmniej 3 powtórzenia techniczne dla każdego warunku. Wykonać co najmniej 2 kontrpróby biologiczne. W przypadku farmakologii przedklinicznej, analiz ekspresji genów i ekspresji białek eksperymenty należy przeprowadzać z małą liczbą pasaży hodowlanych w ciągu 30 - 45 dni od wysiewu komórek, aby uniknąć utraty fenotypów komórek rakowych.</li>
	<li>Przygotowanie próbki cytologicznej.
	<ol>
		<li>Zbierz 100 000 komórek w 200 μl pożywki o wysokiej hodowli DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% glutaminą i 1% penicyliną/streptomycyną.</li>
		<li>Odpipetować roztwór (pipeta 200 μl) do jednorazowego lejka wyposażonego w filtr i zamontowanego za pomocą szkiełka podstawowego.</li>
		<li>Otwórz cytowirówkę i włóż próbki.</li>
		<li>Uruchomić cytowirówkę przy 18,6 x g przez 20 minut.</li>
		<li>Wyrzuć lejek wyposażony w filtr.</li>
		<li>Utrwalić szkiełka w acetonie na 10 minut, a następnie chloroformem na 5 minut.</li>
		<li>Przechowywać szkiełka w temperaturze -20 °C. 
		nuta: Rozmrozić i uwodnić próbki przed barwieniem i przeprowadzić barwienie zgodnie z instrukcjami producenta. Proszę przygotować co najmniej 3 repliki techniczne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowle komórkowe STS:
<ol>
	<li>Zmieniaj pożywkę raz w tygodniu (pożywki o wysokiej hodowli DMEM uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% glutaminą i 1% penicyliną/streptomycyną).
	<ol>
		<li>Wyrzucić pożywkę hodowlaną za pomocą pipety o pojemności 200 - 1 000 μl.</li>
		<li>Dodaj nową świeżą pożywkę za pomocą pipety o pojemności 200 - 1 000 μl.</li>
		<li>Pasaż komórkowy:
		<ol>
			<li>Odłącz komórki, gdy zbieg wynosi około 90%: 
			nuta: Amplifikacja hodowli komórek STS powinna być wykonywana raz w tygodniu w zależności od warunków hodowli.</li>
			<li>Wyrzuć pożywkę, przemyj PBS i dodaj 2-3 ml trypsyny 1x w PBS 
			nuta: Objętość użytej trypsyny zależy od ilości uzyskanych hodowanych komórek.</li>
			<li>Inkubować komórki przez 3 - 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
			<li>Pobrać oderwane komórki z płytki za pomocą pipety o pojemności 200 - 1 000 μl.</li>
			<li>Odłączone komórki należy pipetować do probówki o pojemności 15 ml i dodać 4 ml pożywki o wysokiej zawartości DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% glutaminą i 1% penicyliną/streptomycyną, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.</li>
			<li>Wirować przy 225 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Odrzucić supernatant.</li>
			<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy, dodając 1 ml pożywki o wysokiej hodowli DMEM uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% glutaminy i 1% penicyliny/streptomycyny.</li>
			<li>Wysiewać komórki na nowej płytce hodowlanej lub kolbie o końcowej objętości zgodnie z instrukcjami producenta. 
			nuta: Nie dziel komórek więcej niż 1:3.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Dalsze analizy:
Uwaga: Za pomocą tego modelu można przeprowadzić wiele różnych eksperymentów (patrz poniżej). W związku z tym kluczowe znaczenie ma podjęcie decyzji na etapie projektowania badania, które analizy zostaną przeprowadzone, aby można było przygotować odpowiednią liczbę próbek i powtórzeń.
<ol>
	<li>Testy proliferacji, takie jak bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu MTT</li>
	<li>Testy apoptotyczne, takie jak końcowy deoksynukleotydylotransferaza (TdT), test znakowania końca nacięcia (TUNEL)</li>
	<li>Analiza immunohistochemiczna</li>
	<li>Analiza ekspresji genów</li>
	<li>Analiza Western blot</li>
	<li>Test ELISA</li>
	<li>Analiza sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)</li>
	<li>Model ksenoprzeszczepu in vivo</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.3322/caac.21387/full">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).</li>
<li>Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+treatment+of+soft-tissue+sarcoma+gold+standard+and+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).</li>
<li>Fletcher, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+classification+of+soft+tissue+tumours+-+an+update+based+on+the+new+2013+WHO+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">The evolving classification of soft tissue tumours - an update based on the new 2013 WHO classification.</a> Histopathology. 64 (1), 2-11 (2014).</li>
<li>De Vita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+classification%2C+treatment+options%2C+and+new+perspectives+in+the+management+of+adipocytic+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Onco+Targets+Ther%22%5BJournal%5D)">Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas.</a> Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).</li>
<li>Recine, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+role+of+trabectedin+in+the+treatment+of+intractable+soft+tissue+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Onco+Targets+Ther%22%5BJournal%5D)">Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas.</a> Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).</li>
<li>Ducimetière, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+sarcoma+histotypes+and+molecular+subtypes+in+a+prospective+epidemiological+study+with+central+pathology+review+and+molecular+testing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing.</a> PLoS One. 6 (8), 20294(2011).</li>
<li>Nussbaum, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lanonc/article/PIIS1470-2045(16)30050-X/abstract">Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database.</a> Lancet Oncol. 17 (7), 966-975 (2016).</li>
<li>The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+tissue+and+visceral+sarcomas%3A+ESMO+clinical+practice+guidelines+for+diagnosis%2C+treatment+and+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 25, Suppl 3 102-112 (2014).</li>
<li>Paul, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cancer+Cell+in+Vitro%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The Cancer Cell in Vitro: A Review.</a> Cancer Research. 22, 431-440 (1962).</li>
<li>Morton, C. L., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+tumor+xenografts+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice.</a> Nat Protoc. 2 (2), 247-250 (2007).</li>
<li>Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+human+prostate+tissue+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development.</a> Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).</li>
<li>Vannucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroma+as+an+Active+Player+in+the+Development+of+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Microenviron. 8 (3), 159-166 (2015).</li>
<li>De Vita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+Eribulin+in+a+Primary+Culture+of+Well-Differentiated%2FDedifferentiated+Adipocytic+Sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma.</a> Molecules. 3 (12), 1662(2016).</li>
<li>Failli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+culturing+human+colorectal+tumor+cells%3A+establishment+of+a+cell+culture+model+by+the+comparison+of+different+methodological+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Tumori%22%5BJournal%5D)">The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches.</a> Tumori. 95 (3), 343-347 (2009).</li>
<li>Steinstraesser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+primary+human+sarcoma+model+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice.</a> Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).</li>
<li>Raouf, A., Sun, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+methods+to+culture+primary+human+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells.</a> Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).</li>
<li>Daigeler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+in+vitro+effects+of+doxorubicin+on+gene+expression+in+primary+human+liposarcoma+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures.</a> BMC Cancer. 29, 313(2008).</li>
<li>Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+publicly+available+sarcoma+cell+lines+for+use+in+proteomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies.</a> Expert Rev Proteomics. 13 (2), 227-240 (2016).</li>
<li>Liverani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+approaches+to+establish+and+characterize+primary+cultures%3A+an+ex+vivo.+3D+system+and+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model.</a> Biol Open. 15 (2), 309(2017).</li>
<li>De Vita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myxofibrosarcoma+primary+cultures%3A+molecular+and+pharmacological+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Adv+Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile.</a> Ther Adv Med Oncol. 9 (12), 755-767 (2017).</li>
<li>Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcoma+in+2016%3A+Evolving+biological+understanding+and+treatment+of+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas.</a> Nat Rev Clin Oncol. 14 (2), 78-80 (2017).</li>
<li>Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cell+culture+of+primary+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Selective cell culture of primary breast carcinoma.</a> Cancer Res. 55 (12), 2516-2519 (1995).</li>
<li>Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+primary+culture+of+human+ovarian+cancer+cells+to+chemotherapy%3A+In+vitro+individualized+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy.</a> J Cancer Res Ther. 12 (2), 1050-1055 (2016).</li>
<li>Ravi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+Tumorigenesis+of+a+Murine+Sarcoma+Cell+Line+in+the+Absence+of+DICER1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1.</a> Cancer Cell. 21 (6), 848-855 (2012).</li>
<li>Zhong, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+vegf+gene+knockdown+on+growth+of+the+murine+sarcoma+cell+line+MS-K%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K.</a> Cells. 16 (6), 625-638 (2011).</li>
<li>Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+Inhibits+Cell+Proliferation+and+Reduces+the+Motile+Potential+of+Murine+LM8+Osteosarcoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells.</a> Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).</li>
<li>Sugiyasu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radio-sensitization+of+the+murine+osteosarcoma+cell+line+LM8+with+parthenolide%2C+a+naturalinhibitor+of+NF-%CE%BAB%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB.</a> Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).</li>
<li>Daigeler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+in+vitro+effects+of+doxorubicin+on+gene+expression+in+primary+human+liposarcoma+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures.</a> BMC Cancer. 29 (8), 313(2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Potrzebne są dobrze zdefiniowane modele przedkliniczne, aby wyjaśnić podłoże molekularne nowotworów, przewidzieć złe rokowania i opracować nowe strategie terapeutyczne dla pacjentów z rakiem. Jest to szczególnie ważne w przypadku rzadkich nowotworów, takich jak STS, których wysoka heterogeniczność pod względem morfologii, agresywnego potencjału i zachowania klinicznego rzuca wyzwanie naszemu zrozumieniu biologii STSi postępowania z pacjentem. Co więcej, kilka dostępnych komercyjnych linii komórkow...

Mięsaki tkanek miękkich (STS) obejmują spektrum heterogennych zmian pochodzenia mezenchymalnego, stanowiących 1% wszystkich guzów litych1,2, a nowa klasyfikacja Światowej Organizacji Zdrowia rozpoznaje obecność ponad 50 różnych podtypów3. Wśród nich najczęstszymi histotypami są mięsak adipocytów lub tłuszczakomięsak i mięśniakomięsak gładkokomórkowy, stanowiące odpowiednio 15% i 11% wszystkich dorosłych STS4,5. Chociaż STS może rozwijać się w różnych częściach ciała, najczęstszymi miejscami są kończyny i miejsce zaotrzewnowe, występujące odpowiednio w 60% i 20% przypadków6.
Podstawą terapii chorób miejscowych jest szeroka resekcja chirurgiczna, podczas gdy korzyści z chemioterapii adjuwantowej i neoadjuwantowej są nadal niejasne i są brane pod uwagę tylko w wybranych przypadkach7. W przypadku przerzutów chemioterapia jest standardem opieki, ale daje ograniczone wyniki8. Lepsze zrozumienie biologii molekularnej STS pomogłoby udoskonalić obecną diagnostykę różnicową, zoptymalizować dostępne metody leczenia i zidentyfikować nowe cele terapii.
W tym kontekście, badania nad rakiem prowadzone są od wielu lat przy użyciu unieśmiertelnionych linii komórkowych9. Te eksperymentalne modele są zwykle hodowane w standardowych jednowarstwowych podłożach lub wszczepiane gryzoniom z niedoborem odporności w celu stworzenia modeli ksenoprzeszczepów in vivo10. Unieśmiertelnione linie komórkowe stanowią łatwy w obsłudze i łatwy do przechowywania materiał, na którym można przeprowadzić dużą liczbę eksperymentów badawczych. W rzeczywistości są one najtańszym i najczęściej używanym narzędziem w badaniach przedklinicznych11.
Jednak modele raka oparte na linii komórkowej mają również pewne ograniczenia, np. przedłużona hodowla w systemie jednowarstwowym wraz z rosnącą liczbą pasaży indukuje dryf fenotypowy i genetyczny, co sprawia, że komórki są mniej skłonne do rekapitulacji kluczowych cech nowotworu. Co więcej, hodowle linii komórkowych nie są w stanie odtworzyć interakcji między komórkami i przesłuchów cząsteczek sygnałowych, które naśladują biologiczne zachowanie nowotworów i charakteryzują mikrośrodowisko guza. Zagadnienia te stanowią podstawę luki istniejącej między wynikami przedklinicznymi i klinicznymi12.
Biorąc pod uwagę powyższe, wzrosło zainteresowanie kulturami pierwotnymi pochodzącymi od pacjentów13. Rzeczywiście, wycięcie złośliwej i normalnej tkanki zmniejsza ryzyko utraty fenotypu i heterogeniczności komórek rakowych, oferując w ten sposób materiał wyjściowy, który jest bardziej reprezentatywny dla mikrośrodowiska guza. Co więcej, wykorzystanie świeżych próbek guzów pobranych od pacjentów poddawanych resekcji chirurgicznej umożliwia nam badanie pojedynczych guzów i porównywanie różnych zmian z tej samej części ciała pacjenta14. Z powyższych powodów hodowle komórkowe pochodzące z tkanek stanowią cenny materiał do badania patofizjologii i farmakologii nowotworów15,16,17, szczególnie w STS, w których dostępne na rynku linie komórkowe mięsaka są ograniczone18. W ten sposób zoptymalizowaliśmy metodę tworzenia pierwotnej hodowli komórek STS pochodzącej od pacjenta, zaczynając od chirurgicznie wyciętej tkanki nowotworowej13,19,20. Nasza metoda polega na dezagregacji próbki guza na małe fragmenty tkanki, a następnie nocnej dysocjacji tkanki enzymatycznej w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Następnego dnia trawienie enzymatyczne zostaje zatrzymane przez dodanie świeżej pożywki hodowlanej, a uzyskana zawiesina jest filtrowana w celu usunięcia fragmentów tkanek, agregatów komórkowych i nadmiaru materiału matrycowego lub zanieczyszczeń. Na koniec frakcja wyizolowanych komórek nowotworowych jest cytowirowana na szkiełkach podstawowych, utrwalana i przechowywana do dalszej analizy mającej na celu potwierdzenie założenia pierwotnej hodowli STS poprzez cytomorfologiczną, immunohistochemiczną i molekularną ocenę cytogenetyczną (np. Analiza FISH amplifikacji MDM2 stanowi standardową diagnostykę różnicową dla dobrze zróżnicowanego tłuszczakomięsaka i niezróżnicowanego tłuszczakomięsaka)4. Pozostałe komórki są wysiewane do standardowej hodowli jednowarstwowej w celu profilowania ekspresji genów i badań farmakologicznych. Wszystkie eksperymenty są wykonywane przy użyciu kultur pierwotnych o niskim pasażu, aby uniknąć selekcji określonych subklonów raka, i analizowane przez doświadczonego patologa mięsaka. W ten sposób stworzyliśmy w pełni ludzki model STS ex-vivo13,19,20. Ten wysoce wszechstronny, łatwy w obsłudze model może stanowić użyteczne narzędzie w różnych typach badań przedklinicznych, np. w celu identyfikacji nowych markerów molekularnych do diagnozowania i prognozowania lub w celu głębszego zrozumienia aktywności i mechanizmów działania standardowych i nowych leków stosowanych w leczeniu STS.

<table><tbody><tr><td>DMEM Wysoki poziom glukozy</td><td>EuroClone</td><td>ECB7501L</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>EuroClone</td><td>ECS0180D</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 4% roztwór wodny, klasa EM</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>157-4-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik triazolowy</td><td>Ambion Life-Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>EuroClone</td><td>ECB3052D</td><td></td></tr></tbody></table>

ustanowienie pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich pochodzącego od pacjenta

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Mięsaki tkanek miękkich (STS) reprezentują spektrum heterogennych nowotworów złośliwych z trudną diagnozą, klasyfikacją i leczeniem. Do tej pory zidentyfikowano ponad 50 podtypów histologicznych tych rzadkich guzów litych. Tak więc, ze względu na ich niezwykłą różnorodność i niską częstość występowania, nasza wiedza na temat biologii tych nowotworów jest nadal ograniczona. Kultury pochodzące od pacjentów stanowią idealną platformę do badania patofizjologii i farmakologii STS. W ten sposób opracowaliśmy ludzki model przedkliniczny STS, zaczynając od próbek guza pobranych od pacjentów poddawanych resekcji chirurgicznej. Hodowle komórek STS pochodzące od pacjentów uzyskano z próbek chirurgicznych przez trawienie kolagenazy i wyizolowano przez filtrację. Komórki policzono, wysiano i pozostawiono na 14 dni w standardowych kulturach jednowarstwowych, a następnie przetworzono przez dalszą analizę. Przed przeprowadzeniem analiz molekularnych lub farmaceutycznych potwierdzono utworzenie kultur pierwotnych STS poprzez ocenę cech cytomorfologicznych i, jeśli były dostępne, markerów immunohistochemicznych. Metoda ta stanowi użyteczne narzędzie: 1) do badania historii naturalnej tych słabo zbadanych nowotworów złośliwych oraz 2) do testowania działania różnych leków w celu dowiedzenia się więcej o ich mechanizmach działania.

Opracowaliśmy prostą metodę prowadzącą do utworzenia hodowli pierwotnej miękkiego sarcoma tkanek miękkich pochodzącej od pacjenta i przedstawiamy tutaj przykład wyników uzyskanych dla jednego konkretnego histotypu STS13. Protokół ten został wykorzystany do utworzenia hodowli pierwotnych różnych histotypów STS, w tym dobrze zróżnicowanego liposarkoma, dedyferencjowanego liposarkoma, miksoidnego liposarkoma, pleomorficznego liposarkoma, miksofibrosarkoma, niezróżnico...

Poniższy protokół skupia się na ustanowieniu pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich (STS) pochodzącego od pacjenta. Model ten może pomóc nam lepiej zrozumieć podłoże molekularne i profil farmakologiczny tych rzadkich nowotworów złośliwych i może stanowić punkt wyjścia do dalszych badań mających na celu poprawę leczenia STS.

Ustanowienie pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich pochodzącego od pacjenta

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Ogólnym celem tego ludzkiego modelu przedklinicznego wyprowadzonego z chirurgicznie wyciętej tkanki nowotworowej jest uzyskanie pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich pochodzącego od pacjenta. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące patofizjologii mięsaka tkanek miękkich i stanowi ważne narzędzie przedkliniczne do przewidywania odpowiedzi na leczenie. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to w pełni ludzki model przedkliniczny.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię mięsaków tkanek miękkich, ponieważ ten model przedkliniczny może być testowany z konwencjonalnymi innowacyjnymi lekami w celu zbadania ich aktywności i mechanizmu działania. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w mięsaka tkanek miękkich, może być również stosowana do badania interakcji komórek rakowych z komórkami tkanek miękkich. Osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, będą miały trudności z powodu niejednorodności tkanek nowotworowych i izolowania komórek nowotworowych.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ początkowe etapy selekcji komórek mięsaka tkanek miękkich i CD wymagają pewnego doświadczenia, zanim będzie można osiągnąć biegłość.

establishment-primary-culture-patient-derived-soft-tissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten artykuł opisuje przygotowanie świeżo uzyskanej tkanki czerniaka do pierwotnych hodowli komórkowych oraz sposób usuwania zanieczyszczeń erytrocytów i fibroblastów z komórek nowotworowych. Na koniec opisujemy, w jaki sposób domniemane komórki macierzyste czerniaka CD133 + są sortowane od masy CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS).

Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka CD133+ z czerniaka

Opisano metody tworzenia ludzkich tkanek nowotworowych 3D jako systemów testowych. Technologie te opierają się na bezkomórkowym biologicznym rusztowaniu unaczynionym (BioVaSc), pierwotnych komórkach ludzkich i linii komórek nowotworowych, które mogą być hodowane zarówno w warunkach statycznych, jak i dynamicznych w bioreaktorze przepływowym.

Inżynieria tkankowa ludzkiego systemu badań 3D nowotworów in vitro

Opisano protokół ekstrakcji pierwotnych komórek ludzkich z chirurgicznego guza jelita grubego i normalnych tkanek. Wyizolowane komórki są następnie hodowane na miękkich elastycznych podłożach (hydrożele poliakrylamidowe) funkcjonalizowanych przez białko macierzy zewnątrzkomórkowej i osadzonych w fluorescencyjnych mikrogranulkach. Cytometria trakcyjna jest wykonywana w celu oceny komórkowych naprężeń skurczowych.

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych jelita grubego z tkanek chirurgicznych i hodowla ich bezpośrednio na miękkich, elastycznych podłożach do cytometrii trakcyjnej

Obecność nowotworowych komórek macierzystych (CSC) w mięsakach kostnych została ostatnio powiązana z ich patogenezą. W artykule przedstawiono izolację CSCs z pierwotnych kultur komórkowych uzyskanych z ludzkich biopsji konwencjonalnego kostniakomięsaka (OS) z wykorzystaniem zdolności CSC do wzrostu w warunkach niezakaźnych.

Ustanowienie hodowli nowotworowych komórek macierzystych z ludzkiego konwencjonalnego kostniakomięsaka

Guzy skórne są często usuwane po operacji mikrograficznej Mohsa. Opisano tutaj protokół, który umożliwia personelowi pomocniczemu klinicznemu skuteczne przetwarzanie i przechowywanie próbek guzów skóry (np. raka płaskonabłonkowego, raka podstawnokomórkowego i czerniaka) do dalszych zastosowań laboratoryjnych bez zakłócania operacji klinicznych.

Utworzenie klinicznego repozytorium biologicznego

Opisujemy szczegółowy protokół izolacji komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z ludzkim mięsakiem poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, przy użyciu ludzkiego antygenu leukocytów-1 (HLA-1) jako markera ujemnego, oraz dla dalszej walidacji i charakterystyki tych komórek inicjujących HLA-1-ujemny nowotwór.

Izolacja i charakterystyka komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z mięsakiem

Udostępniamy metodę generowania, hodowli i systematycznej analizy wycinków organotypowych pochodzących z mysich guzów płuc. Opisujemy również, jak zoptymalizować grubość plastra i jak dobrać stężenia leków do leczenia plastrów guza.

Ustalenie i analiza eksplantatów plastrów guza jako warunek wstępny do badań diagnostycznych

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Szczegółowy protokół jest tutaj podany do ustalania ludzkich organoidów piersi na podstawie resekcji guza piersi pochodzących od pacjenta lub normalnej tkanki piersi. Protokół zawiera kompleksowe instrukcje krok po kroku dotyczące hodowli, zamrażania i rozmrażania organoidów piersi pochodzących od ludzkich pacjentów.

Tworzenie i hodowla organoidów piersi pochodzących od pacjentów

Organoidy nowotworowe zrewolucjonizowały badania nad rakiem i podejście do medycyny spersonalizowanej. Reprezentują one klinicznie istotny model guza, który pozwala naukowcom być o krok przed guzem w klinice. Protokół ten ustanawia organoidy nowotworowe ze świeżych próbek tkanki guza trzustki i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów pochodzących od gruczolakoraka trzustki.

Tworzenie organoidów nowotworowych i fibroblastów pochodzących z raka trzustki ze świeżych tkanek

Protokół opisuje metodę tworzenia modelu organoidowego raka jelita grubego (CRC) pochodzącego od pacjenta, współhodowanego z limfocytami naciekającymi nowotwór (TIL) w celu zbadania ich interakcji i potencjału terapeutycznego. Model ten stanowi platformę przedkliniczną do badania odpowiedzi immunologicznych w mikrośrodowisku guza oraz do przewidywania skuteczności terapii opartej na TIL w spersonalizowanym leczeniu raka jelita grubego.

Ustanowienie systemu kohodowli organoidów i limfocytów naciekających nowotwór jelita grubego pochodzących od pacjentów

Poznaj metodę izolacji komórek nowotworowych z tkanki mięsaka tkanek miękkich pochodzącej od pacjenta. Technika ta umożliwia badanie patofizjologii i odpowiedzi na terapię w modelu preklinicznym.

Ustanowienie pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich pochodzącego od pacjenta

Przeglądaj więcej filmów