Ustanowienie pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich pochodzącego od pacjenta

Ogólnym celem tego ludzkiego modelu przedklinicznego wyprowadzonego z chirurgicznie wyciętej tkanki nowotworowej jest uzyskanie pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich pochodzącego od pacjenta. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące patofizjologii mięsaka tkanek miękkich i stanowi ważne narzędzie przedkliniczne do przewidywania odpowiedzi na leczenie. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to w pełni ludzki model przedkliniczny.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię mięsaków tkanek miękkich, ponieważ ten model przedkliniczny może być testowany z konwencjonalnymi innowacyjnymi lekami w celu zbadania ich aktywności i mechanizmu działania. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w mięsaka tkanek miękkich, może być również stosowana do badania interakcji komórek rakowych z komórkami tkanek miękkich. Osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, będą miały trudności z powodu niejednorodności tkanek nowotworowych i izolowania komórek nowotworowych.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ początkowe etapy selekcji komórek mięsaka tkanek miękkich i CD wymagają pewnego doświadczenia, zanim będzie można osiągnąć biegłość. Próbki guza należy przyjmować w sterylnym pojemniku na mocz o pojemności 100 mililitrów z 50 mililitrami pożywki DMEM o niskiej zawartości glukozy, uszczelnionej filmem parafinowym. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez maksymalnie trzy godziny po wycięciu guza.

Wysterylizuj kaptur do hodowli tkankowych 70% etanolem i sterylizuj stalową pęsetę INOX 70% etanolem. Usuń film parafinowy z pojemnika na mocz i wyrzuć. Oczyść zewnętrzną część pojemnika na mocz 70% etanolem.

Otwórz kwadratową szalkę Petriego, a następnie otwórz pojemnik na mocz i użyj wysterylizowanej stalowej pęsety INOX, aby przenieść próbki guza do naczynia. Dodaj PBS i dwukrotnie umyj próbkę guza. Po umyciu drobno rozdrobnij próbkę guza na kawałki o wielkości od jednego do dwóch milimetrów.

Przenieś jedną czwartą całej próbki do dwumililitrowej probówki. Następnie dodaj jeden mililitr odczynnika TRIzol do probówki i natychmiast zamroź w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Zbierz resztę drobno rozdrobnionego materiału nowotworowego do 15-mililitrowej probówki i dodaj cztery mililitry roztworu kolagenazy typu pierwszego.

Następnie rozcieńczyć roztwór kolagenazy typu pierwszego czterema mililitrami pożywki hodowlanej, zamknąć probówkę i uszczelnić folią parafinową. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza na toczącym się wytrząsarce przez 15 minut, aby aktywować trawienie. Po 15 minutach umieść probówkę z wytrząsarką w temperaturze pokojowej i pozostaw na noc.

Następnego dnia delikatnie przefiltruj zawiesinę komórkową przez sterylny filtr o średnicy 100 mikronów do 50-mililitrowej probówki. Następnie umyć filtr pożywką hodowlaną i odwirować filtrat w ilości 225 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant przez odwrócenie probówki i ponownie zawiesić komórki jednym do dwóch mililitrów pożywki hodowlanej.

Po zliczeniu komórek i obliczeniu liczby komórek, umieść komórki w standardowej kulturze jednowarstwowej o gęstości 80 000 komórek na centymetr kwadratowy. Aby przygotować próbkę cytologiczną, zacznij od zebrania 100 000 komórek w 200 mikrolitrach pożywki hodowlanej. Odpipetować roztwór do jednorazowego lejka wyposażonego w filtr i wyposażonego w szklane szkiełko.

Otwórz cytowirówkę i włóż próbki. Po cytowirowaniu należy wyrzucić lejek wyposażony w filtr. Następnie utrwal szkiełko w acetonie na 10 minut, a następnie chloroformem na pięć minut.

Przejdź przez komórki STS, gdy zbieg wynosi około 90%Po umyciu arkusza komórek PBS, dodaj dwa do trzech mililitrów 1X Trypsyny w PBS i inkubuj przez trzy do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji użyj pipety o pojemności od 200 do 1 000 mikrolitrów, aby zebrać oderwane komórki i przenieść do probówki o pojemności 15 mililitrów. Dodaj cztery mililitry pożywki, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.

Następnie odwirować w temperaturze 225 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy, dodając jeden mililitr pożywki i zasiać komórki na nowej płytce hodowlanej lub kolbie. Komórki nowotworowe wyizolowano z tłuszczakomięsaka usuniętego chirurgicznie od 54-letniego pacjenta.

Przeprowadzono fluorescencyjną hybrydyzację in situ w celu wykrycia amplifikacji MDM2 w próbce tkanki pacjenta. Analiza cytologiczna amplifikacji MDM2 w izolowanych komórkach nowotworowych potwierdza ustanowienie hodowli pierwotnej pochodzącej od pacjenta. Zmiany morfologiczne w stosunku do zasady zostały wywołane, gdy hodowle traktowano ifosfamidem, epirubicyną, ifosfamidem i epirubicyną, trabektedyną i erybuliną.

Dla każdego eksperymentu dotyczącego żywotności przeprowadzono trzy niezależne powtórzenia. Wyniki potwierdziły wrażliwość kultur na chemioterapię. Najbardziej aktywnym leczeniem było skojarzone stosowanie ifosfamidu i epirubicyny, leku pierwszego rzutu stosowanego w zaawansowanym lub przerzutowym ALT-DDLPS.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 15-16 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dokładnym rozdrobnieniu próbki guza. Po tej procedurze można przeprowadzić różne dalsze analizy, w tym profilowanie ekspresji genów, analizę immunohistochemiczną lub test cytotoksyczności, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące biologii mięsaka tkanek miękkich.

Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mięsakami tkanek miękkich do badania historii naturalnej tych słabo zbadanych nowotworów złośliwych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustalić pierwotną hodowlę mięsaka tkanek miękkich pochodzącego od pacjenta. Nie zapominaj, że praca z próbkami biologicznymi i lekami może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i praca z wyciągiem.