Name: Prosty i tani test do pomiaru ambulacji w mysich modelach dystrofii mięśniowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Poznaj metodę pomiaru ambulacji w mysich modelach dystrofii mięśniowej przy użyciu niskokosztowego systemu nagrywania. Ta nieinwazyjna technika pozwala ocenić skuteczność terapii i postęp osłabienia mięśni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health [R01 AR048179 i R01 HL126204 dla R.C.W, T32 AR059033 i F32 AR069469 dla E.M.G] oraz Muscular Dystrophy Association USA [274143 i 416364 dla R.C.W.].

Opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles. Myszy typu dzikiego (C57BL/6J) oraz myszy mdx (tło C57Bl/10ScSn) zostały zakupione z komercyjnego źródła. Myszy mdx:utrophin-Tg były darem od Jamesa Ervasti, za zgodą Kay Davies, i były utrzymywane na tle mdx. Testy chodu przeprowadzono na samcach myszy w wieku 6 miesięcy. Myszy były utrzymywane w Terasaki Life Sciences Vivarium zgodnie z wytycznymi ustanowionymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles (zatwierdzenie nr 20-029-43), a zgodę na te badania przyznał UCLA Animal Welfare Assurance (zatwierdzenie nr A3196-01).
1. Przygotowanie komory
<ol>
	<li>Przeprowadź zbieranie danych w cichym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze o stałej porze dnia9. Testy należy przeprowadzić w sposób zaślepiony pod kątem genotypu i zastosowanej terapii badanej myszy.</li>
	<li>Dostosuj dowolny system komory otwartego pola do tej analizy. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano niedrogą i łatwo transportowalną komorę rejestracyjną wykonaną z dużego kosza na śmieci. Areną otwartego pola jest taca ustawiona na klatce lub podobnej podwyższonej platformie.</li>
	<li>Umieść kamerę na siatce nad komorą, aby rejestrować obraz całej areny.</li>
	<li>Przed każdą próbą oczyść komorę rejestracyjną środkiem dezynfekującym.</li>
</ol>
2. Protokół przedwysiłkowy i gromadzenie danych
<ol>
	<li>Opcjonalnie, bezpośrednio przed rejestracją aktywności, poddaj każdą mysz protokołowi aktywacji mięśni. 
	UWAGA: Krok ten jest opcjonalny, ale zalecany w eksperymentach z udziałem myszy mdx.
	<ol>
		<li>Pozwól myszy chwycić uchwyt cyfrowego miernika siły i delikatnie pociągnij do tyłu, aż zwierzę puści uchwyt. Powtórz tę procedurę pięć razy w ramach jednej próby.</li>
		<li>Zarejestruj maksymalne napięcie (N) dla każdej próby. 
		UWAGA: Poza pełnieniem funkcji wyzwania wysiłkowego dla testu ambulacyjnego, siła wywarta przez zwierzę podczas tego testu siły chwytu może służyć jako dodatkowy funkcjonalny miernik wyniku2,10.</li>
		<li>Wykonaj łącznie pięć prób dla każdej myszy, z 1 min przerwą między kolejnymi próbami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bezpośrednio po teście siły chwytu lub innym protokole wysiłkowym, umieść mysz w komorze aktywności.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie wideo ruchów myszy w arenie komory. Pozwól myszy swobodnie eksplorować otoczenie przez 6 min.</li>
	<li>Zatrzymaj nagrywanie po 6 min i przenieś mysz z powrotem do klatki domowej.</li>
</ol>
3. Analiza wideo
<ol>
	<li>Opcjonalnie przygotuj wideo do analizy poprzez zmniejszenie częstotliwości odświeżania klatek. Aby zmniejszyć częstotliwość klatek na potrzeby analizy śledzenia, zastosuj poniższy protokół w programie do edycji wideo (np. iMovie lub podobnym programie), aby zredukować liczbę klatek wideo dwukrotnie. 
	UWAGA: W zależności od długości i częstotliwości klatek wideo, przed analizą może być przydatne zmniejszenie częstotliwości odświeżania. W niniejszym badaniu wideo nagrywano przy 30 frames/s (nagranie trwało 6 min, co daje łącznie około 10 80 klatek).
	<ol>
		<li>Załaduj wideo do programu.</li>
		<li>W menu „Speed” wybierz opcję „Speed: Fast” i ustaw prędkość na 2x.</li>
		<li>Wyeksportuj zredukowane wideo w formacie pliku .mp4 do analizy śledzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz wideo do analizy w programie komputerowym. Wykonaj kalibrację nagrania wideo za pomocą narzędzia linii. Narysuj linię wzdłuż jednej krawędzi komory. Kliknij prawym przyciskiem myszy na linii i wybierz „Calibrate measure…”. Wprowadź rzeczywisty wymiar boku komory w centymetrach.</li>
	<li>Aby rozpocząć półautomatyczne śledzenie pozycji myszy, kliknij kursor „move”. 
	Zaczynając od pierwszej klatki w wideo, kliknij prawym przyciskiem myszy w punkt, który ma być śledzony; punkt śledzenia jest oznaczony niebieskim kółkiem. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu pozycję każdego zwierzęcia śledzono, wyznaczając podstawę ogona.</li>
	<li>Przesuń klatkę, klikając prawą strzałkę na klawiaturze; punkt śledzenia powinien automatycznie przesuwać się zgodnie z pozycją podstawy ogona.
	<ol>
		<li>Jeśli pozycja śledzenia nie pokrywa się z punktem zainteresowania w danej klatce, ręcznie dopasuj niebieskie kółko do podstawy ogona. 
		UWAGA: W zależności od jakości wideo i prędkości myszy, śledzenie może wymagać różnego stopnia interwencji użytkownika w celu utrzymania zgodności z punktem zainteresowania. Ścieżka myszy powinna przesuwać się w miarę trwania nagrania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu śledzenia całego wideo zapisz film oraz nałożoną na niego ścieżkę. Wyeksportuj dane pozycyjne ścieżki, wybierając opcję „Export to Spreadsheet”.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz dane pozycyjne w programie arkusza kalkulacyjnego. Oprogramowanie do analizy ruchu raportuje współrzędne X,Y pozycji myszy w każdej klatce obrazu.</li>
	<li>Aby obliczyć dystans przebyty w jednej klatce, należy zastosować następujące równanie (gdzie pozycja w pierwszej klatce to x1,y1 a druga ramka to x2,y2): 
	<img alt="Wzór na odległość, wyrażenie matematyczne służące do obliczania odległości w geometrii analitycznej." src="/files/ftp_upload/56772/56772eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> 
	UWAGA: Skumulowany dystans w czasie można obliczyć, sumując odległości pokonane pomiędzy kolejnymi klatkami.</li>
</ol>

<ol><li>Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. <a target="_blank" href="http://www.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/MDX/DMD_M.2.1_002.pdf">Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system.</a> TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).</li>
<li>Tatem, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+locomotor+measurements+using+an+open+field+activity+monitoring+system+for+skeletal+muscle+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases.</a> J Vis Exp. (91), e51785(2014).</li>
<li>Kobayashi, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcolemma-localized+nNOS+is+required+to+maintain+activity+after+mild+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sarcolemma-localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise.</a> Nature. 456 (7221), 511-515 (2008).</li>
<li>Belanto, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+binding+distinguishes+dystrophin+from+utrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microtubule binding distinguishes dystrophin from utrophin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5723-5728 (2014).</li>
<li>McDonald, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+6-minute+walk+test+in+Duchenne%2FBecker+muscular+dystrophy%3A+longitudinal+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: longitudinal observations.</a> Muscle Nerve. 42 (6), 966-974 (2010).</li>
<li>Mazzone, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Star+Ambulatory+Assessment%2C+6-minute+walk+test+and+timed+items+in+ambulant+boys+with+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuromuscul Disord. 20 (11), 712-716 (2010).</li>
<li>Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endpoint+measures+in+the+mdx+mouse+relevant+for+muscular+dystrophy+pre-clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies.</a> Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).</li>
<li>Acosta, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+six-minute+walk+test+to+characterize+golden+retriever+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Use of the six-minute walk test to characterize golden retriever muscular dystrophy.</a> Neuromuscul Disord. 26 (12), 865-872 (2016).</li>
<li>Sousa, N., Almeida, O. F., Wotjak, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hitchhiker%27s+guide+to+behavioral+analysis+in+laboratory+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">A hitchhiker's guide to behavioral analysis in laboratory rodents.</a> Genes Brain Behav. 5, Suppl 2. 5-24 (2006).</li>
<li>Gibbs, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+sarcospan+are+well+tolerated+and+act+as+a+sarcolemmal+stabilizer+to+address+skeletal+muscle+and+pulmonary+dysfunction+in+DMD%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">High levels of sarcospan are well tolerated and act as a sarcolemmal stabilizer to address skeletal muscle and pulmonary dysfunction in DMD.</a> Hum Mol Genet. 25 (24), 5395-5406 (2016).</li>
<li>Gillis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+evaluation+of+the+functional+recovery+obtained+by+the+overexpression+of+utrophin+in+skeletal+muscles+of+the+mdx+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Multivariate evaluation of the functional recovery obtained by the overexpression of utrophin in skeletal muscles of the mdx mouse.</a> Neuromuscul Disord. 12, Suppl 1. S90-S94 (2002).</li>
<li>Tinsley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+full-length+utrophin+prevents+muscular+dystrophy+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice.</a> Nat Med. 4 (12), 1441-1444 (1998).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suite+of+clinically+relevant+functional+assays+to+address+therapeutic+efficacy+and+disease+mechanism+in+the+dystrophic+mdx+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the dystrophic mdx mouse.</a> J Appl Physiol. 122 (3), 593-602 (2017).</li>
<li>Bolivar, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasession+and+intersession+habituation+in+mice%3A+from+inbred+strain+variability+to+linkage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Intrasession and intersession habituation in mice: from inbred strain variability to linkage analysis.</a> Neurobiol Learn Mem. 92 (2), 206-214 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test otwartego pola zapewnia skuteczny i nieinwazyjny sposób testowania funkcji motorycznych w mysich modelach chorób mięśni, a odmiany tego testu mogą służyć jako cenna miara punktu końcowego w badaniach przedklinicznych. Jednym z głównych ograniczeń związanych z tego typu testami są wysokie koszty i ograniczona dostępność systemów monitorowania aktywności. W tym badaniu demonstrujemy tani system do analizy aktywności w terenie otwartym, który może generować wyniki podobne do istniejącego komercyjnego oprogramowania i s...

Wiarygodne i powtarzalne pomiary funkcji mięśni są kluczowe dla oceny skuteczności potencjalnych terapii DMD. DMD jest zaburzeniem genetycznym spowodowanym mutacjami w genie dystrofiny, prowadzącymi do postępującego osłabienia mięśni, utraty ruchu i ostatecznie niewydolności krążeniowo-oddechowej. Najczęściej stosowanym zwierzęcym modelem DMD jest mysz mdx z dystrofiną zerową. Zestaw testów funkcjonalnych pojawił się jako rutynowe testy do oceny postępu choroby u myszy mdx, a także w podobnych modelach zwierzęcych innych dystrofii i miopatii. Powszechnie stosowane testy in vivo obejmują pomiary siły chwytu kończyn przednich, czasu zwisania drutu, maksimum rotarod, czasu do wyczerpania podczas biegania na bieżni oraz śledzenie aktywności motorycznej. W tej dziedzinie podjęto znaczne wysiłki w celu standaryzacji tych testów, mając na celu zmniejszenie zmienności między badaniami przedklinicznymi i zwiększenie potencjału translacyjnego terapii testowanych na myszach1,2.
Jedną z ważnych kategorii badań przedklinicznych jest pomiar dobrowolnego ruchu, parametru, który jest często zmieniany w mysich modelach dystrofii mięśniowej. Jest to zwykle testowane za pomocą testów opartych na monitorowaniu aktywności w otwartym terenie i może oceniać ruchy poziome (chodzenie) lub pionowe (wychowawcze) w ciągu minut lub godzin2,3,4. Wiele badań wykazało, że dobrowolny ruch jest zmieniony u myszy mdx, szczególnie po ćwiczeniach, a pomiary te okazały się wrażliwe na leczenie farmakologiczne i postęp choroby. Jednym z głównych ograniczeń w wykonywaniu tych testów jest potrzeba specjalistycznego, drogiego sprzętu. W tym miejscu przedstawiono tanią metodę, która śledzi ruch myszy przy użyciu łatwo dostępnych zasobów.
Dystans 6-minutowego spaceru jest wskaźnikiem powszechnie używanym jako narzędzie oceny klinicznej u osób z dystrofią mięśniową Duchenne'a5,6. Modyfikacje tej miary zostały wykorzystane do oceny wyników w modelach zwierzęcych Duchenne'a, w tym myszy mdx7 i psy z dystrofią mięśniową golden retriever (GRMD)8. W tym badaniu rejestrujemy dobrowolne ruchy w otwartym polu w ciągu 6 minut bezpośrednio po łagodnym wyzwaniu ćwiczeń. Odległość ambulacji została następnie obliczona przy użyciu bezpłatnego oprogramowania typu open source do pomiaru ruchu poziomego w czasie.
Główną zaletą tej metody jest to, że zwierzęta mogą być testowane w różnych warunkach bez potrzeby specjalistycznego sprzętu czy drogiego komercyjnego oprogramowania do analizy. Jednym z ważnych aspektów tej analizy jest to, że można ją przeprowadzić w podstawowych warunkach laboratoryjnych bez konieczności przenoszenia lub przenoszenia myszy z wiwarium do specjalistycznej placówki podstawowej. Opisany tutaj protokół śledzenia wideo dobrze nadaje się do oceny poruszania się w stosunkowo krótkich okresach czasu i może wykryć różnice w aktywności między myszami typu dzikiego i mdx, a także ujawnić poprawę funkcjonalną w ratunkowym modelu DMD.

<table><tbody><tr><td>Kamera wideo</td><td>Apple Inc.</td><td>ME553LL/A</td><td>Do nagrywania wideo z jazdy, iPhone 5S Plus (lub odpowiednik)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Kinovea (wersja 0.8.15)</td><td>Kinovea Association</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy wideo o otwartym kodzie źródłowym. Bezpłatne pobieranie, kompatybilne z komputerem PC (wersja 0.8.15, www.kinovea.org)</td></tr><tr><td>iMovie (wersja 10.0.6)</td><td>Apple Inc.</td><td></td><td>Każde podobne oprogramowanie może być użyte do zmniejszenia liczby klatek na sekundę wideo (opcjonalnie)</td></tr><tr><td>Okrągły kosz na śmieci o pojemności 32 galonów (komora na otwartym polu)</td><td>Rubbermaid</td><td>#</td><td>1778013 Każdy system komór otwartego pola można dostosować do nagrywania. W tym badaniu wykorzystano komorę rejestracyjną zbudowaną z tacy umieszczonej na platformie, na dnie dużego kosza na śmieci.</td></tr><tr><td>Avant Biała plastikowa taca 15 "szer. x 10" gł. x 1,45 "wys. (otwarta komora polowa)</td><td>US Acrylic, LLC</td><td></td><td>Każdy system komór otwartego pola można dostosować do nagrywania. W tym badaniu wykorzystano komorę rejestracyjną zbudowaną z tacy umieszczonej na platformie, na dnie dużego kosza na śmieci.</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td>Samiec 6-miesięcznych myszy</td></tr><tr><td>C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#001801</td><td>Samiec 6-miesięcznych myszy</td></tr><tr><td>mdx: utropin-Tg (fiona)</td><td>Prezent od od Jamesa Ervastiego, za zgodą Kay Davies</td><td></td><td>Męskie myszy 6-miesięczne</td></tr></tbody></table>

prosty i tani test do pomiaru ambulacji w mysich modelach dystrofii mięśniowej

A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy

Mierzenie funkcjonalnych wyników w leczeniu dystrofii mięśniowej jest istotnym aspektem badań przedklinicznych. Ocena dobrowolnego poruszania się w modelach mysich jest nieinwazyjnym i powtarzalnym testem aktywności, który jest bezpośrednio analogiczny do pomiarów poruszania się pacjenta, takich jak test 6-minutowego marszu i powiązane wyniki mobilności. Wiele popularnych metod testowania prędkości i odległości poruszania się myszy opiera się na teście na otwartym polu, w którym mierzy się swobodny ruch zwierzęcia na arenie w czasie. Jedną z głównych wad tego podejścia jest to, że komercyjne oprogramowanie i sprzęt do śledzenia ruchu w wysokiej rozdzielczości jest drogi i może wymagać przeniesienia myszy do wyspecjalizowanych ośrodków w celu przetestowania. W tym miejscu opisujemy tani, oparty na wideo system pomiaru ruchu myszy, który wykorzystuje bezpłatne oprogramowanie o otwartym kodzie źródłowym. Korzystając z tego protokołu, wykazaliśmy, że dobrowolne poruszanie się w mysim modelu dystrofiny mdx z dystrofiną zerową dla dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD) jest zmniejszone w stosunku do aktywności myszy typu dzikiego. U myszy mdx wykazujących ekspresję transgenu utrofiny te deficyty aktywności nie są obserwowane, a całkowita przebyta odległość jest nie do odróżnienia od myszy typu dzikiego. Metoda ta jest skuteczna w mierzeniu zmian w dobrowolnym chodzeniu związanym z patologią dystroficzną i zapewnia wszechstronną platformę, którą można łatwo dostosować do różnych warunków badawczych.

Wykazano, że warianty testu otwartej przestrzeni (open field assay) stanowią skuteczną metodę badania progresji choroby w modelach dystrofii mięśniowej. W niniejszej pracy prezentujemy wszechstronną metodę śledzenia wideo do analizy dwuwymiarowego ruchu myszy z wykorzystaniem łatwo dostępnego sprzętu rejestrującego oraz oprogramowania open source (Rysunek 1A-B). Zgodnie z wynikami zgłaszanymi w podobnych testach, wykazujemy, ...

Ten protokół opisuje elastyczny, tani system do pomiaru ruchu myszy w teście aktywności w otwartym polu. Pokazujemy, że 6-minutowy test ambulacyjny oparty na tym systemie wykrywa spadek dobrowolnego ruchu u myszy mdx i dokładnie rozróżnia poprawę w ratowaniu tych zwierząt specyficznym dla mięśni.

Prosty i tani test do pomiaru ambulacji w mysich modelach dystrofii mięśniowej

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation ...

Ogólnym celem tego testu jest pomiar dobrowolnej lokomocji w mysich modelach dystrofii mięśniowej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie dystrofii mięśniowej dotyczące postępu osłabienia mięśni w mysich modelach dystrofii mięśniowej oraz skuteczności potencjalnych terapii. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona nieinwazyjny i powtarzalny pomiar aktywności zwierząt, który można łatwo dostosować do wielu różnych warunków badawczych.W cichym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze, o stałej porze dnia, umieść kamerę na drucianej siatce nad komorą aktywności, aby umożliwić rejestrację całej areny, a następnie zdezynfekuj komorę. Bezpośrednio przed rozpoczęciem rejestracji aktywności pozwól myszy chwycić pręt cyfrowego miernika siły i delikatnie odciągnij zwierzę, aż pręt zostanie zwolniony. Zapisz wartość szczytowego naciągu w Newtons dla każdej próby.Z zachowaniem jednej minuty przerwy między próbami. Bezpośrednio po badaniu siły chwytu umieść mysz w komorze i rozpocznij nagrywanie wideo, pozwalając zwierzęciu na swobodną eksplorację. Po sześciu minutach przerwij nagrywanie i przenieś mysz z powrotem do klatki domowej.W celu przeprowadzenia analizy śledzenia danych wideo, najpierw otwórz nagranie w odpowiednim oprogramowaniu do edycji wideo i ustaw prędkość na dwukrotność prędkości oryginalnej. Wyeksportuj zredukowane wideo w formacie pliku mp4 do analizy śledzenia, a następnie otwórz ten plik w odpowiednim programie do analizy wideo. Aby przeprowadzić kalibrację nagrania wideo, użyj narzędzia linii, aby narysować linię wzdłuż jednej z krawędzi komory.Kliknij prawym przyciskiem myszy na linii, wybierz kalibruj pomiar i wprowadź rzeczywisty wymiar boku komory w centymetrach. Aby rozpocząć półautomatyczne śledzenie pozycji myszy, kliknij kursor przesuwania. Zaczynając od pierwszej klatki wideo, kliknij prawym przyciskiem myszy w punkt, który ma być śledzony.Punkt śledzenia zostanie oznaczony niebieskim okręgiem. Aby przejść do następnej klatki, należy użyć prawej strzałki na klawiaturze. Punkt śledzenia powinien przemieszczać się automatycznie w zależności od położenia nasady ogona.Jeśli pozycja śledzenia nie jest wyrównana z punktem zainteresowania w danej klatce, należy ręcznie dopasować niebieski okrąg do pozycji śledzenia. Po prześledzeniu całego filmu należy zapisać wideo oraz nakładkę śledzenia, a następnie wybrać opcję eksportu do arkusza kalkulacyjnego, aby wyeksportować dane pozycyjne śledzenia. Zgodnie z wynikami raportowanymi w podobnych testach, myszy mdx z brakiem dystrofiny, poddane protokołowi ćwiczeń bezpośrednio przed badaniem, wykazują znacznie mniejszą aktywność ruchową w sześciominutowym teście otwartego pola niż zwierzęta typu dzikiego.Rzeczywiście, po lekkim wysiłku w teście siły chwytu, myszy mdx zazwyczaj pozostawały w bezruchu przez pierwsze kilka minut protokołu ambulacji, wykazując niewielki wzrost aktywności w czwartej i piątej minucie. Jednak w przypadku porównania zwierząt typu dzikiego i myszy mdx bez obciążenia wysiłkowego nie stwierdzono różnic w przebytej odległości. Myszy mdx transgeniczne pod kątem ekspresji utrofiny są nieodróżnialne od zwierząt typu dzikiego, bez istotnych różnic w całkowitej przebytej odległości ani w żadnym z obserwowanych skumulowanych punktów czasowych.Aby określić wpływ zmniejszenia częstotliwości próbkowania, zmierzono całkowity dystans przebyty w ciągu jednej minuty nagrania w pełnej liczbie klatek na sekundę, a następnie porównano go z pomiarami dystansu uzyskanymi z wersji zestawu danych o obniżonej częstotliwości próbkowania. Zmniejszenie liczby klatek na sekundę o połowę spowodowało spadek zmierzonego dystansu o 5% w stosunku do pierwotnie obliczonej wartości. Po tym punkcie dokładność pomiaru dystansu gwałtownie spada, choć nawet silnie zdyskontowane zestawy danych nadal ściśle przybliżają ścieżkę zwierzęcia. Podkreśla to znaczenie uwzględnienia liczby klatek na sekundę oraz przetwarzania sygnałów przy ocenie aktywności zwierząt i wykazuje, że w danych wideo o obniżonej częstotliwości próbkowania można zachować wysoką rozdzielczość przestrzenną.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu rejestracji i analizy ambulacji myszy w warunkach otwartego pola. Po opanowaniu tej metody, analiza może zostać przeprowadzona w ciągu 15 do 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Ten niedrogi i nieinwazyjny test pozwala badaczom na ocenę aktywności motorycznej w modelach mysich dystrofii mięśniowej i może służyć jako informacyjny pierwszy krok do dalszych pomiarów funkcjonalnych.

a-simple-low-cost-assay-for-measuring-ambulation-mouse-models

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Pomiary funkcji mięśni przyczyniają się do oceny potencjalnych metod leczenia patologii mięśni, jak również do określenia mechanizmów leżących u podstaw fizjologii tej tkanki.   Zademonstrujemy przygotowanie mięśni prostownika długiego palca i przepony do testów funkcjonalnych. Pokazane zostaną protokoły skurczów izometrycznych i ekscentrycznych, a także różnice w wynikach między mięśniami dystroficznymi, reprezentującymi stan patologiczny, a mięśniami typu dzikiego.

Izometryczna i ekscentryczna ocena generowania sił mięśni szkieletowych wyizolowanych z mysich modeli dystrofii mięśniowych

W chorobie Parkinsona i ogólnie w zaburzeniach ruchowych, czułe i wiarygodne testy behawioralne są niezbędne do testowania nowych potencjalnych terapii. W tym miejscu opisujemy łatwą do opanowania baterię testów sensomotorycznych dla myszy, które są wrażliwe na różne stopnie uszkodzenia układu nigrostriatal i przydatne w badaniach przedklinicznych.

Ocena funkcji sensomotorycznych w mysich modelach choroby Parkinsona

Poziomy aktywności w otwartym polu są używane do oceny poziomu aktywności lokomotywy i zachowania. Protokół ten zapewnia dobrze zaprojektowany, ustandaryzowany protokół do stosowania w badaniach przedklinicznych dotyczących zaburzeń nerwowo-mięśniowych.

Pomiary behawioralne i ruchowe z wykorzystaniem otwartego systemu monitorowania aktywności w chorobach mięśni szkieletowych

Pomiar przewodnictwa nerwowego jest użytecznym narzędziem do oceny mysich modeli neurodegeneracji, ale często jest stosowany tylko do stymulacji nerwu kulszowego w kończynach tylnych. W tym miejscu opisujemy technikę pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) in vivo w mięśniach kończyn przednich myszy unerwionych przez splot ramienny.

In vivo (in vivo) Elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych

W tym badaniu demonstrujemy wykorzystanie kinematycznej analizy chodu opartej na obrazowaniu w płaszczyźnie brzusznej do monitorowania subtelnych zmian w koordynacji ruchowej, jak również postępu neurodegeneracji wraz z wiekiem w modelach mysich (np. linie myszy z mutacją endofiliny).

Analiza chodu zależnych od wieku zaburzeń motorycznych u myszy z neurodegeneracją

Pomiar funkcji kurczliwości mięśni szkieletowych gryzoni jest użytecznym narzędziem, które może być używane do śledzenia postępu choroby, jak również skuteczności interwencji terapeutycznej. Opisujemy tutaj nieinwazyjną ocenę in vivo mięśni zginaczy grzbietowych, która może być powtarzana w czasie u tej samej myszy.

Nieinwazyjna ocena funkcji mięśni zginacza grzbietowego u myszy

Niskokosztowy protokół składający się z analizy śladu i testu wiszącego pudełka po naprężeniu ograniczającym jest przydatny do oceny zaburzeń ruchowych modelu mysiego.

Tani protokół analizy śladu i testu wiszącego pudełka dla myszy zastosował przewlekły stres związany z ograniczeniem

To innowacyjne urządzenie wykorzystuje czujniki magneto-inercyjne, aby umożliwić analizę chodu i aktywności w niekontrolowanych środowiskach. Obecnie w procesie kwalifikacji jako miernik wyniku w Europejskiej Agencji Medycznej, jednym z wniosków będzie pełnienie funkcji klinicznego punktu końcowego w badaniach klinicznych w chorobach nerwowo-mięśniowych.

Domowy monitor do analizy chodu i aktywności

Analiza śladów to tania alternatywa dla cyfrowych programów do analizy chodu dla badaczy kwantyfikujących nieprawidłowości ruchowe u myszy. Ze względu na swoją szybkość, prostotę i potencjał podłużny idealnie nadaje się do fenotypowania behawioralnego modeli mysich.

Tania analiza chodu do fenotypowania behawioralnego mysich modeli choroby nerwowo-mięśniowej

Dostarczono eksperymentalny potok do ilościowego opisu wzorca lokomotorycznego swobodnie chodzących myszy za pomocą zestawu narzędzi MouseWalker (MW), począwszy od wstępnych nagrań wideo i śledzenia, a skończywszy na analizie po kwantyfikacji. W celu wykazania użyteczności systemu MW wykorzystano model kontuzji rdzenia kręgowego u myszy.

Wykorzystanie MouseWalker do ilościowego określenia dysfunkcji lokomotorycznej w mysim modelu urazu rdzenia kręgowego

Przedstawiamy niskonakładowy, bezznacznikowy proces za pomocą DeepLabCut do ilościowego określania spontanicznego chodu i lokomocji u myszy poruszających się swobodnie. Ten protokół integruje nagranie wideo z jedną kamerą, bezznacznikowe śledzenie punktów anatomicznych i wyodrębnianie parametrów lokomocji przestrzenno-czasowych, zapewniając nieinwazyjne i dostępne narzędzie do analizy zachowań motorycznych bez specjalistycznego sprzętu.

Tani niskokosztowy proces bez markerów oparty na DeepLabCut do analizy spontanicznego chodu i lokomocji u myszy poruszających się swobodnie

Poznaj metodę pomiaru ambulacji w mysich modelach dystrofii mięśniowej przy użyciu niskokosztowego systemu nagrywania. Ta nieinwazyjna technika pozwala ocenić skuteczność terapii i postęp osłabienia mięśni.

Prosty i tani test do pomiaru ambulacji w mysich modelach dystrofii mięśniowej

Przeglądaj więcej filmów