Prosty i tani test do pomiaru ambulacji w mysich modelach dystrofii mięśniowej
29 grudnia 2017
Ten protokół opisuje elastyczny, tani system do pomiaru ruchu myszy w teście aktywności w otwartym polu. Pokazujemy, że 6-minutowy test ambulacyjny oparty na tym systemie wykrywa spadek dobrowolnego ruchu u myszy mdx i dokładnie rozróżnia poprawę w ratowaniu tych zwierząt specyficznym dla mięśni
.Ogólnym celem tego testu jest pomiar dobrowolnego poruszania się w mysich modelach dystrofii mięśniowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie dystrofii mięśniowej dotyczące progresji osłabienia mięśni w mysich modelach dystrofii mięśniowej oraz skuteczności potencjalnych terapii. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona nieinwazyjny i powtarzalny pomiar aktywności zwierząt, który można łatwo dostosować do wielu różnych warunków badawczych.
W cichym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze o stałej porze dnia umieść kamerę na drucianej siatce nad komorą aktywności, aby umożliwić nagrywanie na całej arenie i wyczyść komorę środkiem dezynfekującym. Bezpośrednio przed rejestracją aktywności pozwól myszy chwycić drążek cyfrowego miernika siły i delikatnie pociągnij do tyłu, aż drążek zostanie zwolniony. Zapisz napięcie szczytowe w niutonach dla każdej próby.
Z jedną minutą odpoczynku między próbami. Natychmiast po teście siły chwytu umieść mysz w komorze i rozpocznij nagrywanie wideo, pozwalając myszy na swobodną eksplorację. Po sześciu minutach zatrzymaj nagrywanie i umieść mysz z powrotem w klatce domowej.
Aby śledzić analizę danych wideo, najpierw otwórz nagranie w odpowiednim oprogramowaniu do edycji wideo i ustaw prędkość na dwa razy. Wyeksportuj zdziesiątkowane wideo w formacie pliku mp4 w celu analizy śledzenia i otwórz wideo w odpowiednim programie do analizy wideo. Aby ustawić kalibrację nagrania wideo, użyj narzędzia linii, aby narysować linię wzdłuż jednej strony komory.
Kliknij prawym przyciskiem myszy na linię, wybierz kalibruj miarę i wprowadź rzeczywisty rozmiar boku komory w centymetrach. Aby rozpocząć półautomatyczne śledzenie pozycji myszy, kliknij kursor ruchu. Zaczynając od początkowej klatki filmu, kliknij prawym przyciskiem myszy punkt, który chcesz śledzić.
Punkt śledzenia zostanie oznaczony niebieskim kółkiem. Użyj strzałki w prawo na klawiaturze, aby przesunąć ramkę. Punkt śledzenia powinien poruszać się automatycznie w zależności od położenia podstawy ogona.
Jeśli pozycja śledzenia nie jest wyrównana z punktem zainteresowania w danej klatce, ręcznie wyrównaj niebieskie kółko do pozycji śledzenia. Gdy cały film zostanie śledzony, zapisz wideo i nakładkę śledzenia, a następnie wybierz opcję eksportuj do arkusza kalkulacyjnego, aby wyeksportować dane pozycyjne śledzenia. Zgodnie z wynikami przedstawionymi w podobnych testach, myszy z dystrofiną zerową mdx, którym bezpośrednio przed testem poddano próbę wykonania protokołu ćwiczeń, wykazują znacznie mniej dobrowolnych ruchów w sześciominutowym teście na otwartym polu niż zwierzęta typu dzikiego.
Rzeczywiście, po łagodnym wysiłku związanym z wyzwaniem siły chwytu, myszy mdx zazwyczaj pozostawały nieruchome przez pierwsze kilka minut protokołu ambulacji, z niewielkim wzrostem ruchu o cztery do pięciu minut. Porównując zwierzęta typu dzikiego i mdx bez wyzwania związanego z ćwiczeniami, nie wykrywa się jednak żadnych różnic w przebytej odległości. Myszy Mdx transgeniczne pod względem ekspresji utrofiny są nie do odróżnienia od zwierząt typu dzikiego, bez znaczących różnic w całkowitej przebytej odległości lub w którymkolwiek z obserwowanych punktów czasowych kommulacji.
Aby określić efekt zmniejszenia częstotliwości próbkowania, zmierzono całkowitą odległość przebytą od jednej minuty pełnoklatkowego wideo i porównano ją z pomiarami odległości uzyskanymi z wersji zestawu danych próbkowanych w dół. Zmniejszenie liczby klatek na sekundę o połowę zmniejszyło zmierzoną odległość o 5% pierwotnie obliczonej odległości. Dokładność zmierzonej odległości gwałtownie spada po tym punkcie, chociaż nawet silnie zdziesiątkowane zestawy danych nadal bardzo przybliżają ścieżkę zwierzęcia, podkreślając znaczenie uwzględnienia liczby klatek na sekundę i przetwarzania sygnału w ocenie aktywności zwierząt oraz pokazując, że wysoka rozdzielczość przestrzenna może zostać zachowana w próbkowanych w dół danych wideo.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rejestrować i analizować ruch myszy w otwartym terenie. Po opanowaniu analiza ta może zostać zakończona w ciągu 15 do 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Ten tani i nieinwazyjny test pozwala naukowcom badać aktywność motoryczną w mysich modelach dystrofii mięśniowej i może służyć jako pouczający pierwszy krok do dalszych pomiarów funkcjonalnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje elastyczny, niskokosztowy system pomiaru aktywności ruchowej myszy w teście otwartego pola. Metoda ta zapewnia nieinwazyjny i powtarzalny pomiar aktywności zwierząt, który może być dostosowany do różnych warunków badawczych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Badania nad dystrofią mięśniową
- Analiza behawioralna
Wstęp
- Test ten mierzy dobrowolną ambulację w mysich modelach dystrofii mięśniowej.
- Odpowiada on na kluczowe pytania dotyczące progresji osłabienia mięśni.
- Technika ta została zaprojektowana w celu oceny skuteczności potencjalnych terapii.
- Rejestracja odbywa się w kontrolowanym środowisku, aby zapewnić spójność wyników.
Cel badania
- W celu pomiaru ruchów dobrowolnych u myszy mdx.
- W celu oceny wpływu interwencji specyficznych dla mięśni.
- W celu uzyskania informacji na temat progresji dystrofii mięśniowej.
Zastosowane metody
- Użycie kamery umieszczonej nad komorą aktywności do rejestracji.
- Czyszczenie komory środkiem dezynfekcyjnym przed próbami.
- Umożliwienie myszy uchwycenia się drążka w celu pomiaru szczytowego napięcia.
- Rejestracja aktywności podczas 6-minutowego testu ambulacyjnego.
Główne wyniki
- System wykrywa spadki w dobrowolnej aktywności ruchowej u myszy mdx.
- Dokładnie odróżnia on poprawę wynikającą ze specyficznego dla mięśni ratunku fenotypu.
- Wyniki są powtarzalne w różnych próbach.
- Metoda ta jest możliwa do dostosowania do różnych warunków badawczych.
Wnioski
- Ten test jest skuteczny w badaniu dystrofii mięśniowej u myszy.
- Dostarcza on cennych danych na temat skuteczności potencjalnych metod leczenia.
- Podejście to jest elastyczne i może być wykorzystywane w różnych środowiskach badawczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Pomiar dobrowolnego chodzenia w modelach mysich dostarcza translacyjnych danych dotyczących funkcji motorycznych w dystrofii mięśniowej, będąc bezpośrednim odpowiednikiem punktów końcowych stosowanych w klinice, takich jak 6-minutowy testy chodzenia. Ten niskokosztowy test oparty na analizie wideo umożliwia powtarzalną, nieinwazyjną ocenę progresji choroby oraz odpowiedzi na terapię w badaniach przedklinicznych. Dzięki wykrywaniu deficytów aktywności u myszy mdx z brakiem dystrofiny oraz ich niwelowaniu poprzez ekspresję utrofiny, metoda ta wspiera walidację celów terapeutycznych i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków w chorobach nerwowo-mięśniowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju BioPharma
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez kwantyfikację dobrowolnej ambulacji jako funkcjonalnego wskaźnika siły mięśni w modelach dystroficznych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną redukcję ryzyka dzięki powtarzalnej korelacji genotypowo-fenotypowej u myszy mdx w porównaniu z kohortami typu dzikiego oraz kohortami po ratunku fenotypu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez odróżnianie skutecznych interwencji (np. transgen utrofiny), które normalizują poziom aktywności do poziomu typu dzikiego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszego przesiewu związków z wykorzystaniem znormalizowanych wskaźników ambulacji w otwartym polu.
- Powtarzalność: Dostarcza ilościowe wyniki w zakresie dystansu i czasu, umożliwiając standaryzację analizy pomiędzy różnymi laboratoriami.
- Skalowalność: Wykorzystuje bezpłatne oprogramowanie open-source oraz dostępny sprzęt, co pozwala na ponowne wykorzystanie platformy w różnych warunkach badawczych bez konieczności posiadania specjalistycznego wyposażenia.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje istotne dla pacjentów deficyty w chodzeniu, zapewniając ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Pozwala ustalić, czy obserwowane efekty wynikają z ratunku specyficznego dla mięśni, czy z nieswoistych zmian aktywności.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Informuje kryteria go/no-go poprzez korelację powrotu zdolności do chodzenia z zaangażowaniem celu i modulacją szlaku.
Integracja potoku i przepływu pracy
Test ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, stanowiąc funkcjonalny pomost między mechanizmami molekularnymi a efektami fenotypowymi w modelach dystrofii mięśniowej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez powiązanie interwencji genetycznych lub farmakologicznych z mierzalnymi zmianami w ruchach dobrowolnych.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki powtarzalnemu śledzeniu opartemu na wideo, które generuje mierzalne punkty końcowe ambulacji do oceny związków.
- Analityka: Generuje strumienie danych pozycyjnych i czasowych, które pozwalają zespołom porównywać aktywność lokomotoryczną w zależności od genotypów, zastosowanych terapii i punktów czasowych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez odzwierciedlenie klinicznych ocen ambulacji, co ułatwia dopasowanie biomarkerów i modelowanie predykcyjne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania niskokosztowej metody testowania ambulacji, co zmniejsza zależność od specjalistycznych placówek centralnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w testach funkcji motorycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i odtwarzalność dzięki wykorzystaniu śledzenia open-source oraz kontrolowanych warunków środowiskowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez wyeliminowanie potrzeby stosowania kosztownych systemów śledzenia ruchu przy zachowaniu jakości danych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju skorygowanych o ryzyko, w oparciu o funkcjonalne przywrócenie fenotypów chodu w modelach przedklinicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga podstawowej wiedzy w zakresie rejestracji wideo oraz obsługi oprogramowania do śledzenia typu open-source (np. ręcznego dopasowania klatka po klatce).
- Zależy od standardowego sprzętu obrazującego i stałych warunków środowiskowych (oświetlenie, temperatura, pora dnia).
- Wymaga przestrzegania protokołu przez wszystkie zespoły w celu zapewnienia powtarzalności wyników w różnych ośrodkach i przez różnych operatorów.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów do różnych rozmiarów komór, szczepów myszy oraz poziomów aktywności.
- Wiąże się z kompromisem między częstotliwością klatek a dokładnością pomiaru, ponieważ undersampling zmniejsza precyzję obliczeń odległości.
