Test mobilizacji Ca^{2 +} oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

Ogólnym celem tego testu komórkowego jest zidentyfikowanie i scharakteryzowanie cząsteczek zdolnych do stymulowania lub hamowania wewnątrzkomórkowej mobilizacji wapnia za pośrednictwem receptora sprzężonego z białkiem G. Metoda ta może być cennym testem do odkrywania leków z receptorem sprzężonym z białkiem G, ponieważ może być stosowana do badań przesiewowych w poszukiwaniu cząsteczek, które modyfikują wewnątrzkomórkowe ciała wapniowe za pośrednictwem receptora. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na identyfikację cząsteczek o właściwościach agonistycznych lub antagonistycznych w ramach tego samego testu.

Test ten może pomóc w odkryciu nowych kandydatów na leki, które działają na receptory sprzężone z białkiem G, obiecując cele terapeutyczne, które odgrywają rolę w wielu chorobach człowieka. W dniu pasażowania komórek pokryj każdą studzienkę 96-dołkowej płytki z czarnego polistyrenu o przezroczystym dnie 100 mikrolitrami 0,1% roztworu żelatyny i inkubuj płytki przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Podczas krzepnięcia żelatyny użyj roztworu trypsyny EDTA, aby podnieść interesujące komórki z dna kolby hodowlanej, ponownie zawieszając komórki w świeżej pożywce wzrostowej w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów po odłączeniu.

Po zliczeniu zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w świeżej pożywce wzrostowej do stężenia od jednego razy 10 do piątego żywotnego komórek na mililitr. Gdy płytki będą gotowe, wyrzuć nadmiar roztworu żelatyny i wysusz płytki na tkance laboratoryjnej. Następnie umyj studzienki 200 mikrolitrami PBS i zastąp płukanie 200 mikrolitrami komórek na studzienkę do nocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnego ranka postukaj w talerz, aby wyrzucić pożywkę wzrostową z dołków i osusz talerz do góry nogami na ręczniku papierowym. Następnie oznacz komórki w każdym dołku 100 mikrolitrami roztworu barwnika na studzienkę i inkubuj płytkę przez 45 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji komórek dodaj 75 mikrolitrów CXCL12 na studzienkę do płytki chemokinowej i 50 mikrolitrów interesującego związku do każdej studzienki płytki złożonej.

Następnie włącz chłodnicę czytnika płytek fluorescencyjnych, a następnie sam czytnik płytek. Po odczekaniu kilku minut na zainicjowanie systemu otwórz oprogramowanie czytnika tabliczek. Aby skonfigurować protokół testu, w zakładce ustawień wybierz tryb odczytu oraz odpowiednie długości fal wzbudzenia i emisji dla barwnika obciążeniowego.

Wybierz zakładkę mieszania z płynem transferowym, aby automatycznie mieszać związki w płytce mieszanej. W zakładce płynu transferowego ustaw 20 mikrolitrów każdego dołka z płytki złożonej, która ma zostać przeniesiona na płytkę pomiarową i umieść końcówki pipet na głębokości 20 mikrolitrów poniżej powierzchni cieczy. Ustaw prędkość zasysania na 50 mikrolitrów na sekundę, a prędkość dozowania na 25 mikrolitrów na sekundę i kliknij odczyt z płynem transferowym.

W pierwszym interwale wybierz 60 odczytów z interwałem odczytu wynoszącym jedną sekundę z 10 odczytami, które należy zarejestrować przed dozowaniem związków do płytki pomiarowej i 50 odczytów do zakończenia po. Ustaw drugi interwał z interwałem odczytu wynoszącym 30 sekund i 18 odczytów. Wybierz trzy mycia końcówkami do protokołu, ustawiając każdy krok prania tak, aby zawierał odpowiedni płyn do prania, jeden cykl prania, dużą prędkość pompy i pięć ruchów na pranie.

Użyj funkcji pipetora pauzy, aby uwzględnić przerwę w pipetowaniu wynoszącą 300 sekund i użyj ustawienia mieszania z płynem transferowym, aby umożliwić automatyczne mieszanie roztworu CXCL12 na płytce chemokiny. W kolejnej zakładce płynu transferowego ustaw 25 mikrolitrów z każdej studzienki płytki chemokiny, która ma zostać przeniesiona na płytkę pomiarową i umieść końcówki 20 mikrolitrów poniżej powierzchni cieczy. Ustaw prędkość zasysania na 50 mikrolitrów na sekundę, a prędkość dozowania na 25 mikrolitrów na sekundę.

Użyj przycisku odczytu z płynem transferowym, aby ustawić pierwszy interwał tak, aby zawierał 145 odczytów z interwałem odczytu wynoszącym jedną sekundę. Ustaw drugi interwał na czas interwału odczytu wynoszący sześć sekund i 20 odczytów. Wybierz trzy dodatkowe cykle końcówek prających.

Następnie kliknij ustaw temperaturę stage i ustaw temperaturę urządzenia na 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji z użyciem barwnika należy wyrzucić bufor z płytki pomiarowej i wysuszyć płytkę na tkance laboratoryjnej. Przemyć komórki 150 mikrolitrami buforu do oznaczania na studzienkę, zastępując bufor 80 mikrolitrami buforu testowego po dwóch minutach.

Umieść płytkę pomiarową w pozycji do odczytu, płytkę złożoną w drugiej pozycji źródła, płytkę chemokinową w źródle w trzeciej pozycji, a pudełko czarnych końcówek w źródle w jednej pozycji. Zamknij urządzenie i kliknij test sygnału protokołu, aby określić względne jednostki światła tła i wariancję fluorescencji na płycie. Wybierz sygnał testowy w wyskakującym okienku.

Jeśli uzyskane zostaną wartości tła od 8 000 do 10 000 względnych jednostek światła, wybierz opcję Aktualizuj i kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać główny protokół. Następnie naciśnij bieg, aby rozpocząć test. Na tym wykresie można zaobserwować zależny od dawki wzrost fluorescencji korelujący z zależnym od dawki wzrostem uwalniania wapnia.

Rosnące poziomy fluorescencji indukowanej przez CXCL12 pozwalają na wygenerowanie krzywej odpowiedzi na dawkę w oparciu o różnicę między minimalną i maksymalną odpowiedzią powyżej linii podstawowej między pierwszym pomiarem po dodaniu chemokiny a końcowym pomiarem w protokole. CXCL12 nie wywołał żadnej fluorescencyjnej odpowiedzi związanej z wapniem, nawet przy wysokim stężeniu, gdy użyto komórek pozbawionych odpowiedniego funkcjonalnego receptora chemokiny CXCR4, co wykazało swoistość receptorową pomiaru wywołanego CXCL12. Kluczowym zastosowaniem tego testu opartego na komórkach jest identyfikacja małych cząsteczek, które po wstępnej inkubacji w zależności od dawki hamują indukowaną przez CXCL12 mobilizację wapnia w komórkach w porównaniu z kontrolnymi związkami nieaktywnymi, które nie hamują odpowiedzi.

Aby określić siłę hamującą małych cząsteczek, można wygenerować krzywą odpowiedzi na dawkę dla cząsteczek hamujących za pomocą regresji nieliniowej. Test ten może być wykorzystany do badania innych receptorów sprzężonych z białkiem G bez dalszej optymalizacji lub z minimalną optymalizacją, a także w tym eksperymencie, w którym zaobserwowano zależny od dawki wzrost fluorescencji, gdy inny receptor chemokiny, CCR5, był stymulowany swoim naturalnym agonistą chemokiny CCL5. Po opanowaniu, technika ta może być wykorzystana do badania wielu innych receptorów sprzężonych z białkiem G, które sygnalizują poprzez mobilizację wewnątrzkomórkowych jonów wapnia po aktywacji receptora.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób ten test komórkowy może być używany do identyfikacji agonistów i antagonistów receptora chemokiny CXCL4.