Name: Odkrycie epitopu diagnostycznego specyficznego dla wirusa Zika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji peptydów specyficznych dla wirusa Zika przy użyciu mikromacierzy peptydowej. Technika ta umożliwia wykrywanie przeciwciał IgM i IgG w surowicy, dostarczając klinicystom osi czasu infekcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Obecne wsparcie jest dostarczane przez dotację na uzupełnienie administracyjne SBIR (Small Business Innovation Research) od NIDCRR44 DE024456. Grant NIDCR HIV, który wyewoluował z grantu NIDCR U01 DE017855 na opracowanie potwierdzającej diagnostyki przyłóżkowej dla HIV. Serdecznie dziękujemy Silke Weisenburger (PEPperPRINT Heidelberg, Niemcy) za jej pomoc techniczną i życzliwe wsparcie. Dziękujemy również NYU Langone Medical Center za system obrazowania LI-COR Odyssey.

Te dane są częścią trwającego badania naukowego prowadzonego w New York University College of Dentistry i zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board of the New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Próbki kliniczne użyte w tym badaniu były próbkami pozbawionymi elementów pozwalających na identyfikację, używanymi wcześniej do diagnozy i za zgodą Wadsworth Center of New York State Department of Health, Albany, NY.
1. Instalowanie szkiełka mikromacierzowego peptydowego o wysokiej gęstości ZIKV w określonej tacy inkubacyjnej
<ol>
	<li>Szkiełko należy chwytać za krawędzie w rękawicach bezpudrowych. Wymiary szkiełka to 75,4 mm na 25,0 mm i 1 mm grubości. Umieść szkiełko w tacce inkubacyjnej powierzchnią mikromacierzy skierowaną do góry.</li>
	<li>Umieść błyszczącą stronę uszczelki skierowaną w dół na zadrukowaną powierzchnię mikromatrycy. Aby zapewnić dobrą pozycję, załóż na siebie otwory na uszczelki i płyty podstawy.</li>
	<li>Umieść górną część tacki na uszczelce, aby utworzyć komorę mikromacierzy.</li>
	<li>Zamocuj suwak w tacy, dokręcając równo skrzydełkowe jedna po drugiej ręcznie w naprzemienny sposób, zaczynając od lewego górnego rogu, a następnie od prawego dolnego rogu. Umieść pokrywę tacki inkubacyjnej.</li>
</ol>
2. Wykrywanie interakcji w tle: barwienie mikromacierzy przeciwciałami drugorzędowymi
UWAGA: Użyj pipety, aby umieścić roztwory (standardowe i blokujące, rozcieńczone przeciwciała wtórne) w rogu komory mikromatrycy.
<ol>
	<li>Inkubować mikromacierz ze standardowym buforem (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 0,05% Tween 20, pH 7,4, przefiltrowana filtrem 0,45 μm) (całkowita objętość 2,000 μl/mikromacierz) przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min.</li>
	<li>Usunąć bufor wzorcowy, zasysając pipetą z rogu komory mikromacierzy. Wypełnij puste uchwyty na szkiełka pustymi szkiełkami, aby zapobiec pęknięciu szkiełka do mikromacierzy.</li>
	<li>Zablokuj mikromacierz buforem blokującym (całkowita objętość 2 000 μl/mikromacierz) na 60 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej przy 140 obr./min.</li>
	<li>Usunąć bufor blokujący, zasysając pipetą z rogu komory mikromacierzy.</li>
	<li>Inkubować mikromacierz z przeciwciałem drugorzędowym, anty-ludzkim IgM sprzężonym z fluorochromem, rozcieńczonym w stosunku 1: 5 000 (całkowita objętość 2 000 μl / mikromacierz) w buforze barwiącym (10% bufor blokujący w buforze standardowym) przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności na wytrząsarce orbitalnej przy 140 obr./min.</li>
	<li>Usunąć przeciwciało wtórne, odsysając pipetą z rogu komory mikromacierzy.</li>
	<li>Przemyj mikromacierz 3 razy, 1 minutę na mycie standardowym buforem (całkowita objętość 2 000 μl/mikromacierz przy RT na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min. Po każdym myciu należy wyjąć bufor wzorcowy, odsysając pipetą z rogu komory mikromacierzy.</li>
	<li>Zanurz szkiełko 2x w świeżo przygotowanym buforze do zanurzania (1 mM Tris, pH 7,4), (całkowita objętość 200 ml).</li>
	<li>Ostrożnie osuszyć mikromacierz przez około 1 minutę, bardzo ostrożnie odsysając nadmiar płynu od góry do dołu szkiełka, nie dotykając powierzchni szkiełka. Przeanalizuj szkiełko w czytniku skanera mikromacierzowego.</li>
</ol>
3. Ekspozycja mikromacierzy na surowicę gospodarza
UWAGA: Wykonaj ten krok w warunkach bezpieczeństwa laboratoryjnego, poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) ze względu na potencjalnie zakaźny charakter próbek surowicy. Praca w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II (BSC).
<ol>
	<li>Dezaktywować próbkę surowicy w temperaturze 56 °C przez 30 minut i odwirować w temperaturze 16 000 rcf przez 5 minut w temperaturze 4 °C13. 
	UWAGA: Za pomocą pipety nanieść roztwory (barwnik, bufor standardowy i rozcieńczoną surowicę) w rogu komory mikromacierzy.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbkę surowicy w buforze barwiącym, zaczynając od rozcieńczenia 1:1 000 (całkowita objętość 2 000 μl/mikromacierz). Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Inkubować mikromacierz z buforem barwiącym (całkowita objętość 2 000 μl/mikromacierz) przez 15 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min.</li>
	<li>Usunąć bufor barwiący, zasysając pipetą z rogu komory mikromacierzy.</li>
	<li>Inkubować mikromacierz z rozcieńczoną próbką surowicy przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min.</li>
	<li>Usunąć rozcieńczoną próbkę surowicy, zasysając pipetą z rogu komory mikromacierzy.</li>
	<li>Przemyj mikromacierz 3 razy, 1 minutę na mycie standardowym buforem (całkowita objętość 2 000 μl/mikromacierz przy RT na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min. Po każdym myciu należy wyjąć bufor wzorcowy, odsysając pipetą z rogu komory mikromacierzy.</li>
</ol>
4. Barwienie przeciwciałami drugorzędowymi i znakowanymi przeciwciałami kontrolnymi
UWAGA: Użyj pipety, aby umieścić roztwory (standardowe, rozcieńczone przeciwciała wtórne i znakowane) w rogu komory mikromacierzy.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze barwiącym. 
	UWAGA: Użyć przeciwciała sprzężonego z fluorochromem anty-ludzkiego IgM lub przeciwciała sprzężonego z fluorochromem anty-ludzkiej IgG w rozcieńczeniu 1:5,000 (całkowita objętość 2,000 μl / mikromacierz) w buforze barwiącym.</li>
	<li>Zmieszać przeciwciało ze znakiem kontrolnym (monoklonalny anty-HA sprzężony z fluorochromem) w rozcieńczeniu 1:1 000 (całkowita objętość 2 000 μl/mikromacierz) w buforze barwiącym z przeciwciałem drugorzędowym uprzednio rozcieńczonym w buforze barwiącym.</li>
	<li>Inkubować z mikromacierzą przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min.</li>
	<li>Usunąć mieszaninę rozcieńczonych przeciwciał drugorzędowych i znakowanych, odsysając pipetą z rogu komory mikromacierzy.</li>
	<li>Przemyć 3x standardowym buforem (całkowita objętość 2 000 μL/mikromacierz). Każde mycie trwa 1 minutę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min. Po każdym myciu należy wyjąć bufor wzorcowy, odsysając pipetą z rogu komory mikromacierzy.</li>
</ol>
5. Skanowanie mikromacierzy
<ol>
	<li>Zanurz szkiełko 2x w świeżo przygotowanym buforze do zanurzania (1 mM Tris, pH 7,4) (całkowita objętość 200 ml).</li>
	<li>Ostrożnie wysuszyć mikromacierz, około 1 minuty, bardzo ostrożnie zasysając od góry do dołu szkiełka, nie dotykając powierzchni szkiełka.</li>
	<li>Zeskanuj mikromacierz zgodnie z instrukcjami skanera. Umieść szkiełko na skanerze zadrukowaną powierzchnią skierowaną do góry.</li>
	<li>Utwórz nowy projekt i wybierz obszar skanowania. Ustaw parametry skanera jako: Rozdzielczość: 21 μm, Intensywność dla kanałów 700 i 800 nm: 7.0, Jakość skanowania: średnia i Przesunięcie: 0.8.</li>
	<li>Uzyskaj i zapisz zeskanowany obraz RAW jako 16-bitowy format pliku TIFF w skali szarości.</li>
</ol>
6. Analiza mikromacierzy przy użyciu specjalnego oprogramowania
<ol>
	<li>Otwórz obraz RAW (obraz TIFF). Otwórz plik siatki tablicy.</li>
	<li>Wyrównaj siatkę tablicy do skanowanego obrazu za pomocą strzałek myszy lub klawiatury komputera.</li>
	<li>Wybierz "Quantify Selection" w określonym oprogramowaniu, które tworzy plik odczytu zawierający intensywność sygnału dla każdego punktu, wartość tła i odpowiednią sekwencję peptydów. 
	UWAGA: Ten plik wyjściowy można również zaimportować do programu arkusza kalkulacyjnego w celu dodatkowej analizy i tworzenia wykresów.</li>
</ol>
7. Pamięć masowa mikromacierzy
<ol>
	<li>Przechowywać mikromacierz szczelnie zgrzaną w ciemności w temperaturze 4 °C w atmosferze beztlenowego azotu lub argonu.</li>
</ol>

<ol><li>Kelser, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+dengue%27s+cousin%5BTitle%5D)+AND+%22Zika.+Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Meet dengue's cousin.</a> Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).</li>
<li>Musso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Zika+virus+in+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Detection of Zika virus in saliva.</a> J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).</li>
<li>Siqueira, W. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.oralhealthgroup.com/features/oral-clinical-manifestations-patients-infected-zika-virus/">Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus.</a> Oral Health. , (2016).</li>
<li>Duarte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Bras+Ginecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women.</a> Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).</li>
<li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li>
<li>Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+diagnostic+peptides+for+lyme+disease+through+epitope+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).</li>
<li>Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Peptide+library+screening+to+detect+a+previously+unknown+linear+diagnostic+epitope%3A+proof+of+principle+by+use+of+lyme+disease+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).</li>
<li>t Hoen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+screening+without+repetitious+selection+rounds%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Phage display screening without repetitious selection rounds.</a> Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).</li>
<li>Townend, J. E., Tavassoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+Production+of+Cyclic+Peptide+Libraries+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli.</a> ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).</li>
<li>Turchetto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+expression+of+animal+venom+toxins+in+Escherichia+coli+to+generate+a+large+library+of+oxidized+disulphide-reticulated+peptides+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 6(2017).</li>
<li>Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Peptide+Discovery%3A+Prioritization+of+Pathogen+Diagnostic+Markers+Using+Multiple+Features%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features.</a> Plos One. 7 (12), e50748(2012).</li>
<li>Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+three+immunodominant+motifs+with+atypical+isotype+profile+scattered+over+the+Onchocerca+volvulus+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome.</a> PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330(2017).</li>
<li>Basile, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+ELISA+kit+%28YF+MAC-HD%29+to+detect+IgM+to+yellow+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus.</a> J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).</li>
<li>Madden, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK153387/">The BLAST Sequence Analysis Tool.</a> The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).</li>
<li>Services, U. S. D. oH. aH. <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL)</a>. , 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).</li>
<li>Pellois, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individually+addressable+parallel+peptide+synthesis+on+microchips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips.</a> Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).</li>
<li>Stafford, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22261726">Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect".</a> Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).</li>
<li>Gardner, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+for+anti-CMV+biologics+identifies+a+broadly+neutralizing+epitope+of+an+essential+envelope+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li>
<li>Nixon, C. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28468980">Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1.</a> Clin Vaccine Immunol. , (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zaprojektowaliśmy protokół wykorzystujący mikromacierz peptydową o dużej gęstości zawierającą całą sekwencję białka wirusa Zika (szczep Polinezji Francuskiej). Mikromacierz została wyprodukowana poprzez wydrukowanie 3 423 różnych, nakładających się na siebie peptydów liniowych. Każdy peptyd składał się z 15 aminokwasów i różnił się tylko jedną resztą od najbliższego sąsiada w sekwencji (tj. 14 reszt nakładało się na siebie). Chociaż można drukować krótsze nakładki, mapowanie epitopów jest bardziej precyzyjne w p...

Diagnoza wirusa Zika (ZIKV) na podstawie objawów klinicznych jest trudna, ponieważ wirus ten dzieli wektory, rozmieszczenie geograficzne i objawy z infekcją wirusem denga i Chikungunya1. Biorąc pod uwagę ryzyko niekorzystnych wyników ciąży u kobiet zakażonych ZIKV w czasie ciąży, ważne jest, aby rozróżnić te 3 wirusy. Chociaż obecne molekularne testy diagnostyczne są specyficzne, są one przydatne tylko we krwi lub ślinie w stosunkowo krótkim okresie ostrej infekcji2,3. Testy serologiczne są niezbędne do diagnozy poza tym początkowym okresem infekcji4.
Opracowanie testu serologicznego specyficznego dla ZIKV jest wyzwaniem z dwóch powodów: po pierwsze, antygeny Zika, na które reaguje ludzki układ odpornościowy, nie są obecnie znane; a po drugie, konserwatywne sekwencje aminokwasów flawiwirusów indukują reaktywność krzyżową przeciwciał. Naszym celem było odkrycie unikalnych peptydów specyficznych dla ZIKV do wykorzystania w diagnostyce. Opracowano różne podejścia do badań przesiewowych bibliotek peptydów obejmujących całe białka, w tym fagi, bakterie i powierzchnię drożdży5,6,7,8,9,10. Nasza strategia polegała na użyciu mikromacierzy peptydowej o dużej gęstości, która umożliwia szybkie i niedrogie, wysokoprzepustowe badania serologiczne 11,12, a następnie zidentyfikowane peptydy mogą być wykorzystane do ulepszenia obecnych testów serologicznych do wykrywania zakażenia ZIKV.
Ten protokół umożliwia wykrywanie peptydów diagnostycznych specyficznych dla wirusa Zika za pomocą mikromacierzy peptydowej o dużej gęstości (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Mikromacierz peptydowa o dużej gęstości została wyprodukowana przy użyciu technologii laserowego druku peptydowego. Cała sekwencja białka ZIKV składająca się z 3 423 reszt aminokwasowych opartych na szczepie Polinezji Francuskiej (GenBank: KJ776791.2), została wydrukowana na standardowym szkiełku podstawowym w blokach 15 reszt liniowych z nałożeniem 14 reszt aminokwasowych w dwóch egzemplarzach, co daje łącznie 6 846 plamek peptydowych. Oprócz peptydów z całą sekwencją białka Zika, mikromacierz wykorzystuje peptydy hemaglutyniny (HA) grypy do kontroli wewnętrznej.
Pozytywna próbka surowicy Zika uzyskana z Wadsworth Center (Albany, NY) została użyta do identyfikacji specyficznych peptydów reaktywnych immunoglobuliną M (IgM) i immunoglobuliną G (IgG). Po inkubacji z próbką przez noc, mikromacierz wybarwiono drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym z fluorochromem (anty-ludzka IgM lub anty-ludzka IgG) i przeanalizowano na skanerze mikromacierzy. Kwantyfikacja intensywności plamki i adnotacja peptydów została przeprowadzona za pomocą specjalnego oprogramowania dostarczonego przez tę samą firmę, która wyprodukowała mikromacierz.

<table><tbody><tr><td>PEPperCHIP Custom Peptide Microarray</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.001.001</td><td>Niestandardowy mikarak peptydowy: nasza mikromacierz zawiera całą sekwencję białka wirusa Zika</td></tr><tr><td>Taca inkubacyjna PEPperCHIP 3/1</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.004.001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia PEPperCHIP (680 nm) (anty-HA, etykietowanie DyLight)</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.037.002</td><td></td></tr><tr><td>Analizator PepSLide</td><td>PEPperPRINT</td><td>PSA.004.001</td><td>14-dniowa bezpłatna licencja dla systemu Windows</td></tr><tr><td>Bufor blokujący</td><td>Rockland</td><td>MB-070</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzki IgM (łańcuch mu) DyLight 800</td><td>Rockland</td><td>609-145-007</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzki IgG Fc DyLight 680</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10138</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania LI-COR Odyssey</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td></td><td>Cyfrowa wytrząsarka do mikromiareczkowania IKA MTS 2/4</td> Adobe Illustrator Adobe Deltagraph Redrocks <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

odkrycie epitopu diagnostycznego specyficznego dla wirusa zika

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Mikromacierze peptydowe o dużej gęstości pozwalają na badanie przesiewowe ponad sześciu tysięcy peptydów na jednym standardowym szkiełku mikroskopowym. Metoda ta może być stosowana do odkrywania leków, identyfikacji celów terapeutycznych i opracowywania diagnostyki. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania specyficznych peptydów diagnostycznych wirusa Zika (ZIKV) przy użyciu mikromacierzy peptydowej o dużej gęstości. Ludzka próbka surowicy zwalidowana pod kątem zakażenia ZIKV była inkubowana z mikromacierzą peptydową o dużej gęstości zawierającą całe białko ZIKV przetłumaczone na 3,423 unikalnych 15 liniowych reszt aminokwasowych (aa) z zakładką reszt 14-aa wydrukowanymi w dwóch egzemplarzach. Barwiąc różnymi przeciwciałami drugorzędowymi w tej samej macierzy, wykryliśmy peptydy, które wiążą się z przeciwciałami immunoglobuliny M (IgM) i immunoglobuliny G (IgG) obecnymi w surowicy. Peptydy te zostały wybrane do dalszych eksperymentów walidacyjnych. W tym protokole opisujemy strategię zastosowaną do projektowania, przetwarzania i analizowania mikromacierzy peptydowej o dużej gęstości.

Wyniki uzyskane przy użyciu opisanego protokołu przedstawiono na Rysunku 2 oraz Rysunku 3. Nie odnotowano interakcji tła podczas wstępnego barwienia macierzy mikroarray przeciwciałami wtórnymi anty-ludzkimi IgM (dane nie pokazano). Barwienie koniugatem anty-ludzkim IgM doprowadziło do powstania kilku obszarów o intensywności fluorescencji zielonej powyżej tła, co wskazuje na wiązanie tych peptydów z IgM w próbce ...

W tym protokole opisujemy technikę wykrywania peptydów diagnostycznych specyficznych dla wirusa Zika za pomocą mikromacierzy peptydowej o dużej gęstości. Protokół ten można łatwo dostosować do innych pojawiających się chorób zakaźnych.

Odkrycie epitopu diagnostycznego specyficznego dla wirusa Zika

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zidentyfikowanie peptydów specyficznych dla wirusa Zika do wykorzystania w teście diagnostycznym do wykrywania przeciwciał wirusa Zika. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ wirus znika z krwi w ciągu około 10 dni, a przeciwciała utrzymują się przez lata. Metoda ta pozwala nam zidentyfikować antygeny i epitopy przy użyciu mikromacierzy całego proteomu Zika w celu identyfikacji peptydów, które wychwytują przeciwciała IgM lub IgG w próbce surowicy od zakażonej osoby.Główną zaletą w wykrywaniu zarówno wczesnych przeciwciał, IgM, jak i późniejszych przeciwciał, IgG, jest dostarczenie klinicystom harmonogramu infekcji. Jest to szczególnie ważne u kobiet w ciąży. Chociaż protokół ten zapewnia wgląd w przyczynę zakażenia wirusem Zika, można go zastosować do innych patogenów, przy użyciu mikromacierzy specyficznej dla tego patogenu, jeśli znana jest jego sekwencja białka.Szkiełko należy chwytać za krawędzie w rękawicach bezpudrowych. Wymiary szkiełka to 75,4 milimetra na 25,0 milimetra i grubość 1 milimetra. Umieść szkiełko w tacce inkubacyjnej powierzchnią mikromacierzy skierowaną do góry.Napełnij puste uchwyty na szkiełka pustymi szkiełkami, aby zapobiec pęknięciu szkiełka mikromacierzy. Umieść błyszczącą stronę uszczelki skierowaną w dół na zadrukowaną powierzchnię mikromatrycy. Aby zapewnić dobrą pozycję, załóż na siebie otwory na uszczelki i płyty podstawy.Umieść górną część tacki na uszczelce, aby utworzyć komorę mikromacierzy. Zabezpiecz suwak w tacy, dokręcając równo radełkowane jedna po drugiej ręcznie w naprzemienny sposób. Zacznij od lewego górnego rogu i przejdź do prawego dolnego rogu.Umieść pokrywkę na tacce inkubacyjnej. Ostrożne obchodzenie się z mikromacierzą jest niezbędne, aby uniknąć zarysowania jej powierzchni. Roztwory są dodawane, a następnie usuwane z rogu komory mikromacierzy.Suszenie mikromacierzy jest również ważne dla zapewnienia dobrego obrazu skanowania. Inkubować mikromacierz z 2 000 mikrolitrów standardowego buforu na mikromacierz przez 15 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min. Usunąć bufor wzorcowy, zasysając pipetą z rogu komory mikromacierzy, a następnie zablokować mikromacierz buforem blokującym na 60 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min.Usunąć bufor blokujący, odsysając pipetą z rogu komory mikromacierzy. Dodać przeciwciało drugorzędowe sprzężone z anty-ludzkim IgM fluorochromem rozcieńczone w stosunku 1:5 000 w buforze barwiącym do mikromacierzy. Następnie inkubować mikromacierz przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min.Za pomocą pipety usunąć przeciwciało wtórne, odsysając je z rogu komory mikromacierzy. Myć mikromacierz przez jedną minutę 2000 mikrolitrami ze standardowym buforem na mikromacierz w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min. Usuń standardowy bufor przy użyciu zademonstrowanej techniki i powtórz pranie dwa razy.Następnie zanurz szkiełko dwukrotnie w 200 mililitrach świeżo przygotowanego buforu do zanurzania. Ostrożnie wysuszyć mikromacierz przez około jedną minutę, bardzo ostrożnie odsysając nadmiar płynu od góry do dołu szkiełka, nie dotykając powierzchni szkiełka. Przeanalizuj slajd w czytniku skanera mikromacierzowego, jak pokazano w dalszej części tego filmu.Dezaktywuj próbkę surowicy w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 16 000 RCF przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Próbkę należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu użycia.Następnie inkubować mikromacierz z buforem barwiącym przez 15 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min. Usunąć bufor barwiący, zasysając pipetą z rogu komory mikromacierzy. Rozcieńczyć próbkę surowicy i bufor barwiący, zaczynając od rozcieńczenia 1:1 000.Rozcieńczoną próbkę inkubować z mikromacierzą przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min. Usunąć rozcieńczoną próbkę surowicy przy użyciu zademonstrowanej techniki. Następnie umyj mikromacierz trzy razy, tak jak poprzednio.Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze barwiącym. Stosować przeciwciało anty-ludzkie IgM sprzężone fluorochromem lub przeciwciało anty-ludzkie IgG sprzężone fluorochromem w rozcieńczeniu 1:5 000 w buforze barwiącym. Następnie zmieszać przeciwciało znakowane kontrolnie w rozcieńczeniu 1:1000 w buforze barwiącym z rozcieńczonym przeciwciałem drugorzędowym.Inkubować z mikromacierzą przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności i na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min. Usunąć mieszaninę rozcieńczonych przeciwciał wtórnych i znakowanych, odsysając pipetą z rogu komory mikromatrycy. Następnie umyj mikromacierz trzykrotnie buforem standardowym.Każde mycie trwa jedną minutę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min. Na koniec wyjmij bufor myjący z komory mikromacierzy, tak jak poprzednio. Aby wykonać skanowanie mikromacierzy, zanurz szkiełko dwukrotnie w 200 mililitrach świeżo przygotowanego buforu do zanurzania.Suszyć mikromacierz przez około minutę, bardzo ostrożnie zasysając od góry do dołu szkiełka, nie dotykając powierzchni szkiełka. Zeskanuj mikromacierz zgodnie z instrukcjami skanera. Umieść szkiełko na skanerze zadrukowaną powierzchnią skierowaną do góry.Utwórz nowy projekt i wybierz obszar skanowania. Ustaw parametry skanera z rozdzielczością 21 mikronów, intensywnością 7,0 dla kanałów 700 i 800 nanometrów, jakością skanowania medium i przesunięciem 0,8. Uzyskaj i zapisz obraz rysowania skanów jako 16-bitowy format pliku TIF w skali szarości.Aby przeanalizować dane, otwórz obraz RAW. Następnie otwórz plik siatki tablicy. Wyrównaj siatkę tablicy do skanowanego obrazu za pomocą strzałek myszy lub klawiatury komputera.Wybierz wybór ilościowy w określonym oprogramowaniu, które tworzy plik odczytu zawierający intensywność sygnału dla każdego punktu, wartość tła i odpowiednią sekwencję peptydów. Na koniec przechowuj zamkniętą mikromacierz w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza pod beztlenowym azotem lub argonem. Pokazano tutaj surowy obraz fluorescencyjny barwienia mikromacierzy anty-ludzką IgG po inkubacji ze specyficzną próbką surowicy wirusa Zika rozcieńczoną w stosunku 1:250.Peptydy kontrolne HA otaczają mikromacierz. Peptydy, które silnie reagują na IgG, są pokazane w panelu powiększenia. Podobnie, pokazano tutaj surowy obraz fluorescencyjny barwienia mikromacierzy anty-ludzkimi IgM po inkubacji ze specyficzną próbką surowicy wirusa Zika rozcieńczoną w stosunku 1:250.Ponownie, peptydy kontrolne HA otaczają mikromacierz. Peptydy, które silnie reagują na IgM, są pokazane w panelu powiększenia. Pokazano tutaj reprezentatywną sekwencję konsensusu epitopów wirusa Zika reagującą z IgM w peptydach próbki surowicy gospodarza.Peptydy z sekwencji konsensusu epitopów są podświetlone na czerwono, a peptyd o największej intensywności fluorescencji jest zaznaczony pogrubioną czcionką. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przetwarzać mikromacierz peptydową o dużej gęstości. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 24 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ostrożnym obchodzeniu się z mikromacierzą, aby uniknąć zarysowania jej powierzchni. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak ELISA lub test wiązania powierzchniowego rezonansu plazmonowego, aby określić, czy zidentyfikowane peptydy wiążą się specyficznie z przeciwciałami wirusa Zika, a nie z innymi przeciwciałami Flavivirus. Po opracowaniu technika ta utoruje drogę naukowcom w dziedzinie diagnostyki do odkrycia peptydów diagnostycznych na podstawie próbek surowicy i śliny.Nie zapominaj, że praca z czynnikami zakaźnymi, takimi jak wirus Zika, może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak inaktywacja termiczna próbki surowicy i praca w obiektach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.

zika-virus-specific-diagnostic-epitope-discovery

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wirus Zika (ZIKV), nowy patogen, jest powiązany z nieprawidłowościami rozwojowymi płodu i małogłowiem. Stworzenie skutecznego systemu hodowli komórek zakaźnych ma kluczowe znaczenie dla badań nad replikacją ZIKV, a także dla opracowywania szczepionek i leków. W niniejszej pracy zilustrowano i omówiono różne testy wirusologiczne dotyczące ZIKV.

System zakaźnych hodowli komórek wirusa Zika i profilaktyczne działanie interferonów in vitro

Tutaj autorzy prezentują prosty i skuteczny protokół definiowania liniowego epitopu antygenowego za pomocą oczyszczonego przeciwciała monoklonalnego i skanowania peptydowego poprzez hybrydyzację kropkowo-plamową. Zidentyfikowany epitop może być następnie wykorzystany w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych.

Wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów B rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne

Ten protokół opisuje odzyskiwanie zakaźnego wirusa Zika z dwuplazmidowego zakaźnego klonu cDNA.

Ratowanie i charakterystyka rekombinowanego wirusa z zakaźnego klonu wirusa Zika z Nowego Świata

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Opisano protokół oceny odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu w narządach immunouprzywilejowanych mysiego modelu Ifnar1-/- dla infekcji wirusem Zika (ZIKV). Metoda ta ma kluczowe znaczenie dla badania komórkowych mechanizmów ochrony i immunopatogenezy szczepionek ZIKV, a także jest cenna dla oceny ich skuteczności.

Ocena odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla wirusa Zika w narządach z uprawnieniami immunologicznymi zakażonych myszy Ifnar1-/-

Opisujemy metodę oceny wpływu istniejącej wcześniej odporności na wirusa dengi na infekcję wirusem Zika za pomocą ludzkiej surowicy, pierwotnych komórek ludzkich i kwantyfikacji infekcji za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa Zika w pierwotnych komórkach ludzkich

Celem protokołu jest zademonstrowanie technik używanych do badania chorób wirusowych poprzez izolację i ilościowe określenie wirusa Zika z wielu narządów u myszy po zakażeniu.

Izolacja i kwantyfikacja wirusa Zika z wielu narządów myszy

Prezentowany protokół może określić kompetencję wektorową populacji komarów Aedes aegypti dla danego wirusa, takiego jak Zika, w warunkach powstrzymywania.

Wektorowe analizy kompetencyjne komarów Aedes aegypti z wykorzystaniem wirusa Zika

W tej pracy opisujemy protokoły używane w testach opartych na replikonie i enzymach wirusowych do badań przesiewowych na obecność inhibitorów replikacji wirusa Zika w formacie wysokoprzepustowych.

Wysokoprzepustowe testy przeciwwirusowe do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów replikacji wirusa Zika

Multipleksowe fluorescencyjne testy immunologiczne stają się źródłem informacji do badań serologicznych. Ich zastosowanie jest jednak ograniczone ze względu na złożoność i czasochłonne procesy sprzężenia kulki z analizą koralików. Raport ten przedstawia półautomatyczny, powtarzalny protokół multipleksowego mikrokulkowego sprzężenia kulek, który jest porównywalny ze standardową metodą, a jednocześnie znacznie skraca czas oczekiwania na uzyskanie rezultatów.

Multipleksowy test serologiczny do wykrywania odpowiedzi przeciwciał na arbowirusy

Poznaj metodę identyfikacji peptydów specyficznych dla wirusa Zika przy użyciu mikromacierzy peptydowej. Technika ta umożliwia wykrywanie przeciwciał IgM i IgG w surowicy, dostarczając klinicystom osi czasu infekcji.

Odkrycie epitopu diagnostycznego specyficznego dla wirusa Zika

Przeglądaj więcej filmów