Odkrycie epitopu diagnostycznego specyficznego dla wirusa Zika
12 grudnia 2017
W tym protokole opisujemy technikę wykrywania peptydów diagnostycznych specyficznych dla wirusa Zika za pomocą mikromacierzy peptydowej o dużej gęstości. Protokół ten można łatwo dostosować do innych pojawiających się chorób zakaźnych.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest zidentyfikowanie peptydów specyficznych dla wirusa Zika do wykorzystania w teście diagnostycznym do wykrywania przeciwciał wirusa Zika. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ wirus znika z krwi w ciągu około 10 dni, a przeciwciała utrzymują się przez lata. Metoda ta pozwala nam zidentyfikować antygeny i epitopy przy użyciu mikromacierzy całego proteomu Zika w celu identyfikacji peptydów, które wychwytują przeciwciała IgM lub IgG w próbce surowicy od zakażonej osoby.
Główną zaletą w wykrywaniu zarówno wczesnych przeciwciał, IgM, jak i późniejszych przeciwciał, IgG, jest dostarczenie klinicystom harmonogramu infekcji. Jest to szczególnie ważne u kobiet w ciąży. Chociaż protokół ten zapewnia wgląd w przyczynę zakażenia wirusem Zika, można go zastosować do innych patogenów, przy użyciu mikromacierzy specyficznej dla tego patogenu, jeśli znana jest jego sekwencja białka.
Szkiełko należy chwytać za krawędzie w rękawicach bezpudrowych. Wymiary szkiełka to 75,4 milimetra na 25,0 milimetra i grubość 1 milimetra. Umieść szkiełko w tacce inkubacyjnej powierzchnią mikromacierzy skierowaną do góry.
Napełnij puste uchwyty na szkiełka pustymi szkiełkami, aby zapobiec pęknięciu szkiełka mikromacierzy. Umieść błyszczącą stronę uszczelki skierowaną w dół na zadrukowaną powierzchnię mikromatrycy. Aby zapewnić dobrą pozycję, załóż na siebie otwory na uszczelki i płyty podstawy.
Umieść górną część tacki na uszczelce, aby utworzyć komorę mikromacierzy. Zabezpiecz suwak w tacy, dokręcając równo radełkowane jedna po drugiej ręcznie w naprzemienny sposób. Zacznij od lewego górnego rogu i przejdź do prawego dolnego rogu.
Umieść pokrywkę na tacce inkubacyjnej. Ostrożne obchodzenie się z mikromacierzą jest niezbędne, aby uniknąć zarysowania jej powierzchni. Roztwory są dodawane, a następnie usuwane z rogu komory mikromacierzy.
Suszenie mikromacierzy jest również ważne dla zapewnienia dobrego obrazu skanowania. Inkubować mikromacierz z 2 000 mikrolitrów standardowego buforu na mikromacierz przez 15 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min. Usunąć bufor wzorcowy, zasysając pipetą z rogu komory mikromacierzy, a następnie zablokować mikromacierz buforem blokującym na 60 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min.
Usunąć bufor blokujący, odsysając pipetą z rogu komory mikromacierzy. Dodać przeciwciało drugorzędowe sprzężone z anty-ludzkim IgM fluorochromem rozcieńczone w stosunku 1:5 000 w buforze barwiącym do mikromacierzy. Następnie inkubować mikromacierz przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min.
Za pomocą pipety usunąć przeciwciało wtórne, odsysając je z rogu komory mikromacierzy. Myć mikromacierz przez jedną minutę 2000 mikrolitrami ze standardowym buforem na mikromacierz w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min. Usuń standardowy bufor przy użyciu zademonstrowanej techniki i powtórz pranie dwa razy.
Następnie zanurz szkiełko dwukrotnie w 200 mililitrach świeżo przygotowanego buforu do zanurzania. Ostrożnie wysuszyć mikromacierz przez około jedną minutę, bardzo ostrożnie odsysając nadmiar płynu od góry do dołu szkiełka, nie dotykając powierzchni szkiełka. Przeanalizuj slajd w czytniku skanera mikromacierzowego, jak pokazano w dalszej części tego filmu.
Dezaktywuj próbkę surowicy w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 16 000 RCF przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Próbkę należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu użycia.
Następnie inkubować mikromacierz z buforem barwiącym przez 15 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min. Usunąć bufor barwiący, zasysając pipetą z rogu komory mikromacierzy. Rozcieńczyć próbkę surowicy i bufor barwiący, zaczynając od rozcieńczenia 1:1 000.
Rozcieńczoną próbkę inkubować z mikromacierzą przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min. Usunąć rozcieńczoną próbkę surowicy przy użyciu zademonstrowanej techniki. Następnie umyj mikromacierz trzy razy, tak jak poprzednio.
Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze barwiącym. Stosować przeciwciało anty-ludzkie IgM sprzężone fluorochromem lub przeciwciało anty-ludzkie IgG sprzężone fluorochromem w rozcieńczeniu 1:5 000 w buforze barwiącym. Następnie zmieszać przeciwciało znakowane kontrolnie w rozcieńczeniu 1:1000 w buforze barwiącym z rozcieńczonym przeciwciałem drugorzędowym.
Inkubować z mikromacierzą przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności i na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min. Usunąć mieszaninę rozcieńczonych przeciwciał wtórnych i znakowanych, odsysając pipetą z rogu komory mikromatrycy. Następnie umyj mikromacierz trzykrotnie buforem standardowym.
Każde mycie trwa jedną minutę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min. Na koniec wyjmij bufor myjący z komory mikromacierzy, tak jak poprzednio. Aby wykonać skanowanie mikromacierzy, zanurz szkiełko dwukrotnie w 200 mililitrach świeżo przygotowanego buforu do zanurzania.
Suszyć mikromacierz przez około minutę, bardzo ostrożnie zasysając od góry do dołu szkiełka, nie dotykając powierzchni szkiełka. Zeskanuj mikromacierz zgodnie z instrukcjami skanera. Umieść szkiełko na skanerze zadrukowaną powierzchnią skierowaną do góry.
Utwórz nowy projekt i wybierz obszar skanowania. Ustaw parametry skanera z rozdzielczością 21 mikronów, intensywnością 7,0 dla kanałów 700 i 800 nanometrów, jakością skanowania medium i przesunięciem 0,8. Uzyskaj i zapisz obraz rysowania skanów jako 16-bitowy format pliku TIF w skali szarości.
Aby przeanalizować dane, otwórz obraz RAW. Następnie otwórz plik siatki tablicy. Wyrównaj siatkę tablicy do skanowanego obrazu za pomocą strzałek myszy lub klawiatury komputera.
Wybierz wybór ilościowy w określonym oprogramowaniu, które tworzy plik odczytu zawierający intensywność sygnału dla każdego punktu, wartość tła i odpowiednią sekwencję peptydów. Na koniec przechowuj zamkniętą mikromacierz w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza pod beztlenowym azotem lub argonem. Pokazano tutaj surowy obraz fluorescencyjny barwienia mikromacierzy anty-ludzką IgG po inkubacji ze specyficzną próbką surowicy wirusa Zika rozcieńczoną w stosunku 1:250.
Peptydy kontrolne HA otaczają mikromacierz. Peptydy, które silnie reagują na IgG, są pokazane w panelu powiększenia. Podobnie, pokazano tutaj surowy obraz fluorescencyjny barwienia mikromacierzy anty-ludzkimi IgM po inkubacji ze specyficzną próbką surowicy wirusa Zika rozcieńczoną w stosunku 1:250.
Ponownie, peptydy kontrolne HA otaczają mikromacierz. Peptydy, które silnie reagują na IgM, są pokazane w panelu powiększenia. Pokazano tutaj reprezentatywną sekwencję konsensusu epitopów wirusa Zika reagującą z IgM w peptydach próbki surowicy gospodarza.
Peptydy z sekwencji konsensusu epitopów są podświetlone na czerwono, a peptyd o największej intensywności fluorescencji jest zaznaczony pogrubioną czcionką. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przetwarzać mikromacierz peptydową o dużej gęstości. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 24 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ostrożnym obchodzeniu się z mikromacierzą, aby uniknąć zarysowania jej powierzchni. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak ELISA lub test wiązania powierzchniowego rezonansu plazmonowego, aby określić, czy zidentyfikowane peptydy wiążą się specyficznie z przeciwciałami wirusa Zika, a nie z innymi przeciwciałami Flavivirus. Po opracowaniu technika ta utoruje drogę naukowcom w dziedzinie diagnostyki do odkrycia peptydów diagnostycznych na podstawie próbek surowicy i śliny.
Nie zapominaj, że praca z czynnikami zakaźnymi, takimi jak wirus Zika, może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak inaktywacja termiczna próbki surowicy i praca w obiektach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę identyfikacji peptydów specyficznych dla wirusa Zika z wykorzystaniem wysokogęstościowej mikromacierzy peptydowej. Metoda ta może zostać dostosowana do badania innych pojawiających się chorób zakaźnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Choroby zakaźne
- Testy diagnostyczne
- Mikromacierze peptydowe
Wstęp
- Przeciwciała przeciwko wirusowi Zika utrzymują się dłużej niż sam wirus.
- Przeciwciała IgM wskazują na wczesną fazę infekcji, natomiast przeciwciała IgG świadczą o jej późniejszych etapach.
- Zrozumienie chronologii zakażenia jest kluczowe, szczególnie w przypadku kobiet w ciąży.
- Metodę tę można dostosować do innych patogenów o znanych sekwencjach białkowych.
Cel badania
- Identyfikacja peptydów specyficznych dla wirusa Zika do zastosowań diagnostycznych.
- Zwiększenie czułości wykrywania przeciwciał przeciwko wirusowi Zika w próbkach surowicy.
- Umożliwienie klinicystom określenia ram czasowych infekcji.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie mikromacierzy zawierającej cały proteom wirusa Zika.
- Identyfikacja peptydów wiążących przeciwciała IgM i IgG.
- Analiza próbek surowicy pobranych od osób zakażonych.
- Adaptacja protokołu dla innych patogenów.
Główne wyniki
- Skuteczna identyfikacja peptydów swoistych dla wirusa Zika.
- Wykazanie możliwości adaptacji metody do innych chorób zakaźnych.
- Opracowanie ram czasowych infekcji wirusem Zika na podstawie detekcji przeciwciał.
Wnioski
- Niniejszy protokół jest skuteczny w diagnostyce zakażeń wirusem Zika.
- Pozwala on na uzyskanie wiedzy na temat odpowiedzi immunologicznej na wirusa Zika.
- Metodę tę można zastosować do innych patogenów, co zwiększa możliwości diagnostyczne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Identyfikacja epitopów specyficznych dla patogenu jest kluczowa dla opracowania diagnostyki serologicznej o rozszerzonym oknie detekcji, wykraczającym poza okres wiremii. Podejście to umożliwia rozróżnienie etapów infekcji poprzez profilowanie IgM/IgG, co wspiera podejmowanie decyzji klinicznych w grupach populacji szczególnie narażonych. Metoda ta stanowi skalowalną platformę do odkrywania epitopów, którą można zastosować w przypadku pojawiających się zagrożeń zakaźnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie epitopów liniowych w całym proteomie wirusa.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez systematyczną identyfikację peptydów reaktywnych wobec IgM i IgG.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację celów diagnostycznych wykazujących trwałą odpowiedź przeciwciał.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje zwalidowane peptydy kandydackie do dalszego opracowywania testów diagnostycznych.
- Powtarzalność: Wykorzystuje dublowanie wydruków oraz standaryzowane przemywanie w celu zapewnienia spójnej detekcji sygnału.
- Skalowalność: Umożliwia przesiewanie ponad 3 000 peptydów na jednym szkiełku do wysokoprzepustowego mapowania epitopów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Identyfikuje epitopy rozpoznawane w ludzkim surowicy, zapewniając kliniczną istotność odkrytych celów.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkrywania z walidacją, dostarczając peptydów odpowiednich do potwierdzenia metodą ELISA lub SPR.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o specyficzność epitopu i kinetykę izotypów przeciwciał.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od identyfikacji celu po opracowanie testu – umożliwiając projektowanie diagnostyki opartej na epitopach.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez przesiewowe badanie całego proteomu w celu identyfikacji regionów reaktywnych dla przeciwciał.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych odczytów fluorescencji służących do selekcji i priorytetyzacji trafień.
- Analityka: Generuje dane o intensywności sygnału, umożliwiając porównanie wiązania IgM i IgG w obrębie peptydów.
- Badania translacyjne: Łączy z walidacją przedkliniczną poprzez potwierdzone interakcje peptyd-przeciwciało.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do szybkiego mapowania epitopów przeciwko nowym patogenom.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez bezpośrednie mapowanie epitopów z próbek klinicznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji wymian buforów i kontroli środowiskowej.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez skupienie rozwoju na istotnych klinicznie epitopach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów diagnostycznych z uwzględnieniem ryzyka na podstawie trwałości przeciwciał.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze mikrotablic, detekcji fluorescencji oraz w korzystaniu z oprogramowania do analizy danych.
- Zależne od skanera mikrotablic, wytrząsarki orbitalnej oraz aparatury do dozowania cieczy.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie protokołów przetwarzania surowicy, inkubacji i płukania.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy zastosowaniu do patogenów o innej wielkości proteomu lub innej kinetyce przeciwciał.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak wrażliwość przy obchodzeniu się z laminkami oraz kontrola warunków środowiskowych w celu zapewnienia stabilności fluorescencji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:21
Installing the ZIKV High-density Peptide Microarray Slide in a Specific Incubation Tray
2:38
Background Interation Detection: Staining the Microarray with Secondary Antibodies
4:59
Exposure of the Microarray to Host Serum
6:08
Staining with Secondary Antibodies and Labeled Control Antibodies
7:12
Microarray Scanning, Anaysis, and Storage
9:10
Results: Peptide Microarray Scanned Images and Representative Zika Virus Epitope Consensus Sequence Reacting with IgM on the Host Serum Sample
10:11
Conclusion
