Name: Nowatorski system bez podajnika do masowej produkcji mysich komórek NK in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Poznaj nowatorski system bez podajnika do masowej produkcji mysich komórek NK z wysoką czystością. Ta metoda umożliwia badania nad odpornością wrodzoną i immunoterapią przeciwnowotworową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Research Grants Council of Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) oraz Innovation and Technology Fund of Hong Kong (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), Direct Grant for Research-CUHK (2016.035) oraz Hong Kong Scholar Program.
H.-Y.L. projektował i nadzorował wszystkie eksperymenty oraz przyczynił się do przygotowania manuskryptu. P.M.-K.T. Przeprowadzał eksperymenty, analizował dane i brał udział w przygotowaniu manuskryptu. P.C.-T. T., J.Y.-F.C., J.S.-C., H., Q.-M.W. i G.-Y.L. Pobierał próbki zwierzęce i brał udział w eksperymentach na zwierzętach. J.S., X.-R.H. i K.-F.T. przyczynił się do przygotowania manuskryptu.

Protokół uzyskiwania i różnicowania komórek NK pochodzących ze szpiku kostnego (BM-NK) jest oparty na wcześniej opublikowanych metodach20,21,22. Wszystkie procedury na myszach zostały zatwierdzone przez Eksperymentalny Komitet ds. Etyki Zwierząt (AEEC) na Chińskim Uniwersytecie w Hongkongu.
1. Przygotowanie pożywki warunkowej OP9
<ol>
	<li>Hodowla mysiej linii komórkowej zrębu OP9 w alfa-MEM zawierającej 20% FBS, 100 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny, w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze powietrza/CO2 (95%:5%).
	<ol>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru, a następnie zasiaj 2 x 106 komórek OP9 do każdej kolby hodowlanejo długości 75 cm 2 z 15 ml pożywki. Kultura przez 48 godzin.</li>
		<li>Gdy kultura osiągnie 80% zbieżności, przemyć kolbę 10 ml PBS i dodać 20 ml zwykłej pożywki alfa-MEM (bez FBS i antybiotyków) na kolbę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać pożywkę kondycjonującą OP9 z kolby hodowlanej po 24 godzinach, oczyścić resztki komórek za pomocą filtra polieterosulfonowego (PES) o wielkości 0,25 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C (zużyć w ciągu 2 tygodni).</li>
</ol>
2. Izolacja komórek szpiku kostnego myszy
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji 12-tygodniową mysz C57BL/6J z przedawkowaniem pentobarbitonu (100 mg/kg, wstrzyknięcie dootrzewnowe). Potwierdź śmierć przez brak oddechu, a następnie zbierz kości udowe nożem chirurgicznym, nacinając połączenia między kośćmi i usuń pozostałe mięśnie ostrzem, delikatnie drapiąc.</li>
	<li>Umieść kości w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej schłodzony sterylny alfa-MEM, a następnie wykonaj następujące czynności w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Wyrzuć pożywkę alfa-MEM i płucz kości 70% etanolem przez 30 sekund.</li>
	<li>Umyj kości dwukrotnie lodowatym sterylnym PBS, aby usunąć pozostały etanol.</li>
	<li>Przenieś kości w moździerzu zawierającym 5 ml lodowatego PBS i delikatnie rozdrobnij kości tłuczkiem (nie sproszkowaj ich).</li>
	<li>Delikatnie potrząśnij kośćmi, obracając tłuczkiem, aby uwolnić komórki szpiku kostnego do PBS. Zebrać PBS zawierające komórki szpiku kostnego do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Powtórz krok 2.6 cztery razy, aż fragmenty kości staną się jednolicie białe.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 465 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 18 ml sterylnej wody destylowanej i odstawić na 30 sekund w celu usunięcia czerwonych krwinek.</li>
	<li>Dodaj 2 ml lodowatego 10X PBS, aby zatrzymać reakcję, a następnie przefiltruj mieszaninę przez sitko do komórek o wielkości 70 μm, aby usunąć lizowane czerwone krwinki.</li>
	<li>Odwirować probówkę o masie 465 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 20 ml lodowatego PBS.</li>
	<li>Umyj komórki, powtarzając krok 2.11 po raz drugi.</li>
	<li>Przenieś osad komórkowy na sterylną szalkę Petriego o średnicy 100 mm z 10 ml pożywki warunkowej OP9 z kroku 1.2 uzupełnionej 20% FBS i mieszaniną 0,5 ng/ml mysiej IL-7, 30 ng/ml mysiego SCF i 100 U/ml mysiego flt3L.</li>
	<li>Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 godziny. Przenieść nieprzyłączone komórki do nowego pojemnika hodowlanego o gęstości 5 x 105 żywotnych komórek/ml (policzyć komórki za pomocą hemocytometru z wykluczeniem trypan-błękit) z tą samą formułą pożywki, co w kroku 2.13, i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>W 4 dniu zmień warunki hodowli na warunkową pożywkę OP9 uzupełnioną 20% FBS i 2,000 U/ml mysiej IL-2.</li>
	<li>Odświeżać pożywkę hodowlaną co 3 dni; dojrzałe komórki NK można uzyskać do 7 dnia i zakwalifikować jak w sekcji 4.</li>
</ol>
3. Wyciszanie genów za pośrednictwem siRNA w różnicujących się komórkach NK
<ol>
	<li>Wymieszaj siRNA lub kontrolę nonsensowną (NC) ze środkiem transfekcyjnym zgodnie z instrukcją produktu.</li>
	<li>Wykonaj krok 3.1 w dowolnym momencie od dnia 0.</li>
	<li>Dodaj 50 nM mieszaniny siRNA lub NC do komórek z kroku 2.14.</li>
	<li>Powtórzyć krok 3.1 dla każdego odświeżenia pożywki (np. dzień 0, 4 i 7) aż do punktu końcowego doświadczenia.</li>
</ol>
4. Analiza różnicowania komórek NK za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>W odpowiednim momencie zebrać zawiesinę różnicujących się komórek i przemyć lodowatym PBS.</li>
	<li>Zamocuj komórki za pomocą bufora do utrwalania komórek zgodnie z instrukcją produktu.</li>
	<li>Przemyć utrwalone komórki lodowatym PBS, a następnie ponownie zawiesić 1 x 106 komórek w 100 μl buforu barwiącego cytometrii przepływowej zawierającego anty-mysie przeciwciała anty-mysie NKp46 i PE sprzężone z PE przeciwko mysim CD244 w stosunku rozcieńczenia 1:100.</li>
	<li>Próbkę barwić w ciemności w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Ponownie zawiesić barwione próbki za pomocą 300 μl PBS, a następnie uzyskać dane FACS i przeanalizować za pomocą Cytobank platform20 (http://cytobank.org/).</li>
</ol>

<ol><li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+integrating+immunity%27s+roles+in+cancer+suppression+and+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li>
<li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li>
<li>Rusakiewicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+infiltrates+are+prognostic+factors+in+localized+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).</li>
<li>Mamessier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+cancer+cells+enhance+self+tolerance+by+promoting+evasion+from+NK+cell+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity.</a> J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).</li>
<li>Stern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-emptive+immunotherapy+with+purified+natural+killer+cells+after+haploidentical+SCT%3A+a+prospective+phase+II+study+in+two+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers.</a> Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+adoptive+transfer+and+in+vivo+expansion+of+human+haploidentical+NK+cells+in+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer.</a> Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).</li>
<li>Rubnitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKAML%3A+a+pilot+study+to+determine+the+safety+and+feasibility+of+haploidentical+natural+killer+cell+transplantation+in+childhood+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia.</a> J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).</li>
<li>Curti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transfer+of+alloreactive+haploidentical+KIR+ligand-mismatched+natural+killer+cells+after+infusion+in+elderly+high+risk+acute+myeloid+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients.</a> Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).</li>
<li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+acute+myeloid+leukemia+by+haploidentical+natural+killer+cells+is+improved+using+IL-2+diphtheria+toxin+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein.</a> Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).</li>
<li>Stringaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-induced+phenotypic+and+functional+defects+in+natural+killer+cells+predict+failure+to+achieve+remission+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).</li>
<li>Rouce, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF-%CE%B2%2FSMAD+pathway+is+an+important+mechanism+for+NK+cell+immune+evasion+in+childhood+B-acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).</li>
<li>Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+tumor+suppression+and+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression.</a> Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18662538">TGFbeta in cancer.</a> Cell. 134 (2), 215-230 (2008).</li>
<li>Ikushima, H., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+signalling%3A+a+complex+web+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).</li>
<li>Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+TGF%CE%B2+in+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The roles of TGFβ in the tumour microenvironment.</a> Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).</li>
<li>Rook, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transforming+growth+factor+beta+on+the+functions+of+natural+killer+cells%3A+depressed+cytolytic+activity+and+blunting+of+interferon+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness.</a> J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).</li>
<li>Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+NK+cell+functions+by+TGF-beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1.</a> J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).</li>
<li>Trotta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+utilizes+SMAD3+to+inhibit+CD16-mediated+IFN-%CE%B3+production+and+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells.</a> J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).</li>
<li>Shull, M. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1436033">Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease.</a> Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).</li>
<li>Chen, T. J., Kotecha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytobank%3A+providing+an+analytics+platform+for+community+cytometry+data+analysis+and+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).</li>
<li>Williams, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+NK1.1%2B%2C+Ly49%2B+NK+cells+from+flt3%2B+multipotent+marrow+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells.</a> J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).</li>
<li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+earliest+natural+killer+cell-committed+progenitor+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow.</a> Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).</li>
<li>Tang, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad3+promotes+cancer+progression+by+inhibiting+E4BP4-mediated+NK+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development.</a> Nat Commun. 6 (8), 14677(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy opisano nowatorską metodę wytwarzania mysich komórek NK pochodzących ze szpiku kostnego in vitro. Podajnik komórek w pierwotnym systemie21,22 został z powodzeniem zastąpiony przez warunkową pożywkę komórek OP9, co znacznie zwiększyło stabilność układu różnicowania. Ponadto system może wytwarzać dużą ilość i czystość dojrzałych komórek NK do testów in vitro i in vivo, co może ułatwić badania mechanistyczne, a także bad...

Postęp raka jest w dużej mierze zależny od mikrośrodowiska guza1,2, w tym immunocyty pochodzące od gospodarza, np. komórki NK. Kilka badań wykazało, że wewnątrznowotworowe komórki NK są ujemnie skorelowane z progresją nowotworu3,4. Ponadto badania kliniczne wykazały, że terapia adoptywna komórkami NK jest możliwą strategią leczenia raka5,6,7,8,9. Immunoterapia nowotworów oparta na komórkach NK została niedawno zasugerowana jako opcja terapeutyczna dla guzów litych, ale istnieją wyzwania związane z wydzielaniem cytokin immunosupresyjnych i obniżeniem poziomu ligandów aktywujących w mikrośrodowisku guzów litych10,11. Sugeruje się, że transformujący czynnik wzrostu-β (TGF-β) odgrywa rolę supresyjną w kancerogenezie, ale paradoksalnie komórki nowotworowe wytwarzają również TGF-β1, aby wspierać rozwój nowotworu12,13,14,15. Sygnalizacja TGF-β może hamować aktywność cytolityczną komórek NK poprzez regulację w dół reakcji interferonu i produkcję interferonu gamma za pośrednictwem CD16 (IFN-γ) in vitro16,17,18.
Chociaż zakłócenie sygnalizacji TGF-β w mikrośrodowisku guza może być możliwym sposobem eliminacji nowotworów, całkowite zablokowanie sygnalizacji TGF-β spowoduje choroby autoimmunologiczne ze względu na jego funkcję przeciwzapalną, o czym świadczy rozwój niepożądanych skutków ubocznych, w tym ogólnoustrojowych stanów zapalnych, wad układu krążenia i autoimmunizacji w modelach mysich19. W związku z tym zrozumienie mechanizmu działania immunosupresji za pośrednictwem TGF-β doprowadzi do zidentyfikowania dostępnego celu terapeutycznego w leczeniu raka.
Aby wyjaśnić zdarzenia molekularne niezbędne do rozwoju komórek NK, Williams i in. stworzyli system in vitro do różnicowania krwiotwórczych komórek macierzystych szpiku kostnego myszy w komórki NK20. System ten w znacznym stopniu ułatwia mechanistyczne badania rozwoju komórek NK, w tym identyfikację nowych komórek progenitorowych komórek NK21. Jednak progenitorzy szpiku kostnego powinni być hodowani w systemie ze wspierającymi komórkami zrębu OP9 jako warstwą zasilającą20,21, a ta heterogeniczna populacja komórek w znacznym stopniu ogranicza dalsze stosowanie narzędzi zaburzających geny (np. wyciszania genów za pośrednictwem siRNA) specjalnie stosowanych do różnicujących się komórek NK.
Tutaj opisujemy system bez feederów, który został opracowany przez dalszą modyfikację systemu in vitro Williams et al20. W naszym systemie komórki zasilające zręb OP9 nie są wymagane, a zamiast tego stosuje się warunkowe podłoże OP9 bez wpływu na różnicowanie komórek NK in vitro, co niedawno doprowadziło nas do odkrycia, że TGF-β jest w stanie promować progresję raka poprzez hamowanie rozwoju komórek NK zależnych od E4bp4 w mikrośrodowisku guza22. Ten nowatorski system z powodzeniem zapewnia niewymagającą tła metodę wyjaśniania molekularnego mechanizmu rozwoju komórek NK w określonych warunkach (np. wysoki TGF-β1, wyciszanie genów za pośrednictwem siRNA itp.) in vitro.

<table><tbody><tr><td>Linia komórkowa OP9</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; CRL-2749&trade; </td><td></td></tr><tr><td>MEM &alpha;, bez nukleozydów</td><td>Gibco</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia IL-7</td><td>PEPROTECH</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz Flt3-Ligand</td><td>PEPROTECH</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia IL-2</td><td>PEPROTECH</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamina RNAiMAX Odczynnik do transfekcji</td><td>Invitrogen</td><td>1377815</td><td></td></tr><tr><td>IC Fixation Buffer&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-8222-49</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do barwienia cytometrii przepływowej&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>PE-sprzężone anty-mysie CD244</td><td>eBioscience</td><td>12-2441-83</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-sprzężone anty-mysie NKp46</td><td>Bioss</td><td>bs-2417R-cy3</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola nonsensu (NC)</td><td>Ribobio</td><td>siN05815122147</td><td></td></tr><tr><td>siRNA przeciwko mysiemu E4BP4 mRNA</td><td>Ribobio</td><td>N/A</td><td>5&prime;-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& pierwszy;</td></tr></tbody></table>

nowatorski system bez podajnika do masowej produkcji mysich komórek nk in vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Komórki NK należą do wrodzonego układu odpornościowego i stanowią pierwszą linię obrony immunologicznej przeciwnowotworowej; jednak są one tłumione w mikrośrodowisku guza, a mechanizm leżący u ich podstaw jest nadal w dużej mierze nieznany. Brak spójnego i wiarygodnego źródła komórek NK ogranicza postęp badań nad odpornością komórek NK. W tym miejscu przedstawiamy system in vitro, który może zapewnić wysoką jakość i ilość mysich komórek NK pochodzących ze szpiku kostnego w warunkach wolnych od karmienia. Co ważniejsze, wykazaliśmy również, że wyciszanie genów za pośrednictwem siRNA skutecznie hamuje dojrzewanie komórek NK zależne od E4bp4 za pomocą tego systemu. W związku z tym ten nowatorski system różnicowania komórek NK in vitro jest rozwiązaniem biomateriałowym do badań nad odpornością.

Reprezentatywne wyniki uzyskano po zastosowaniu opisanego protokołu. Komórki z całkowitej zawiesiny szpiku kostnego hodowano w systemie różnicowania bez komórek pokarmowych przez 11 dni; do 7. dnia zaobserwowano znaczny wzrost tempa proliferacji w porównaniu z całkowitą liczbą komórek w dniu 0 (Rysunek 1A). W 6. dniu w systemie stwierdzono obecność dojrzałych komórek NK o wysokim stosunku jądra do cytoplazmy oraz morfologii cytoplazmy bogatej...

Tutaj prezentujemy protokół masowej produkcji mysich komórek NK wyciszających geny za pomocą systemu różnicowania bez karmienia do mechanistycznych badań in vitro i in vivo.

Nowatorski system bez podajnika do masowej produkcji mysich komórek NK in vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Ogólnym celem tego nowatorskiego, niewymagającego karmienia systemu jest zapewnienie metody masowej produkcji komórek NK o wysokiej czystości do testów in vitro i in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w immunologii wrodzonej, w tym rozwój komórek NK i odporność na raka. Główną zaletą tej techniki jest to, że ten nowatorski system bez zasilacza może znacznie zwiększyć czystość wytwarzanych komórek NK.To znacznie ułatwia następujące testy in vitro i in vivo. Wskazanie tej techniki rozciąga się na odporność NK, ponieważ masowa produkcja mysich komórek NK może być wytwarzana ze szpiku kostnego pacjentów z rakiem w celu analizy i modyfikacji do osobistej immunoterapii. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ zużyte podłoże powinno zostać pobrane z komórki OP9 poddawanej wzrostowi w fazie obciążenia.Demonstracja tej metody na twarzy ma kluczowe znaczenie, ponieważ instrukcje dotyczące szpiku kostnego są trudne do nauczenia, ponieważ kości muszą być sterylne etanolem przez optymalny czas, aby zachować żywotność. Aby rozpocząć tę procedurę, należy pobrać komórki OP9 z kolby hodowlanej. Dodaj FBS, aby zatrzymać trawienie trypsyny.Zbierz komórki OP9 i odwiruj pod kątem 465-krotności grawitacji przez pięć minut. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy. Za pomocą hemocytometru policz komórki.Następnie wysiewaj dwie razy od 10 do sześciu komórek w 15 mililitrach pożywki alfa-mem w kolbie hodowlanej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych i inkubuj przez 48 godzin. Gdy komórki zlewają się w 80%, umyj je 10 milimetrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i dodaj do komórek 20 mililitrów zwykłej pożywki alfa-mem bez antybiotyków i płodowej surowicy bydlęcej. Inkubować przez 24 godziny.Następnego dnia zbierz pożywkę kondycjonowaną OP9, usuwając resztki komórek za pomocą filtra i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wstrzyknij przedawkowanie 100 miligramów na kilogram pentobarbitonu dootrzewnowego, aby poddać eutanazji 12-tygodniową mysz. Po potwierdzeniu braku oddechu wyciąć kości udowe nożem chirurgicznym.Usuń pozostałe mięśnie, delikatnie drapiąc ostrzem. Przenieś kości do 50-mililitrowej probówki wirówkowej wypełnionej schłodzoną, sterylną pożywką alfa-mem i przechowuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Następnie wydal pożywkę alpha-mem i myj kości 70% etanolem przez 30 sekund.Ponownie dwukrotnie umyj kości lodowato zimnym, sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, aby usunąć pozostały etanol. Po umyciu przenieś kości do moździerza zawierającego pięć mililitrów lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i rozdrobnij kości tłuczkiem. Delikatnie zakręć tłuczkiem, aby uwolnić komórki szpiku kostnego do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.Przenieś buforowaną fosforanem sól fizjologiczną zawierającą komórki szpiku kostnego do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie odwiruj probówkę pod ciśnieniem 465-krotności grawitacji przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu odrzucić supernatant.Ekstrahuj, aż kość zmieni kolor na biały, aby uzyskać maksymalną wydajność. Następnie ponownie zawiesić granulkę z 18 mililitrami sterylnej wody destylowanej i odczekać 30 sekund, aby usunąć czerwone krwinki. Następnie dodaj dwa mililitry 10X lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby zatrzymać reakcję.Użyj sitka do komórek o średnicy 70 mikrometrów, aby usunąć zlizowane krwinki czerwone. Następnie odwiruj probówki pod ciśnieniem 465 razy większym od grawitacji przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 mililitrach lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.Odwiruj komórki jeszcze raz. Następnie przenieś osad komórkowy na sterylną szalkę Petriego o pojemności 100 mililitrów, zawierającą 10 mililitrów pożywki warunkowej OP9, uzupełnionej dodatkowymi odczynnikami. Przenieś szalkę Petriego do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na dwie godziny.Usuń wszystkie nieprzyłączone komórki i nasiona w nowym naczyniu hodowlanym zawierającym pożywkę warunkową OP9 i umieść w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut. Czwartego dnia zastąp pożywkę hodowlaną pożywką warunkową OP9, uzupełnioną 20% płodową surowicą bydlęcą i 2 000 jednostek na mililitr mysiej interleukiny 2. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co trzy dni aż do siódmego dnia, aby uzyskać dojrzałe komórki NK .Postępuj zgodnie z instrukcją produktu, aby wstępnie wymieszać małe interferujące RNA lub bezsensowną kontrolę z odczynnikiem do transfekcji o zero, czwartym i siódmym dniu od zmiany pożywki aż do eksperymentalnego punktu końcowego. Dodaj 50 nanomoli małego interferującego RNA lub bezsensownej mieszaniny do nieprzyłączonych komórek podczas odświeżania pożywki. Zbierz różnicujące się komórki w odpowiednim punkcie czasowym.Odwiruj komórki pod 465-krotnością grawitacji przez pięć minut. Odrzucić supernatant i przemyć osad komórkowy lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami. Po umyciu utrwalonych komórek lodowato zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach buforu barwiącego cytometrię przepływową zawierającego przeciwciała sprzężone z SY3.Następnie ponownie zawiesić próbki w 300 mikrolitrach soli fizjologicznej buforowanej fosforanami w celu analizy faksowej. Reprezentatywna krzywa wzrostu pokazująca tempo proliferacji komórek szpiku kostnego ulegających różnicowaniu w komórki NK w systemie bezżywiowym. Wykres pokazuje znaczny wzrost tempa proliferacji komórek do siódmego dnia.Reprezentatywny obraz w jasnym polu przedstawiający zróżnicowane komórki NK w nowatorskim systemie bez zasilania. Dojrzałe komórki NK wykazywały wysoki stosunek jądra do cytoplazmy z ziarnistą morfologią cytoplazmatyczną. Reprezentatywny wykres słupkowy przedstawiający wpływ małego interferującego RNA na komórki szpiku kostnego ulegające różnicowaniu w komórki NK w szóstym dniu.Wykres pokazuje znaczne obniżenie poziomów mRNA E4bp4 i małych interferujących komórek NK traktowanych RNA w porównaniu z grupą kontrolną. Reprezentatywne dane cytometryczne przepływowe wykazujące wpływ wyciszonego E4bp4 na różnicowanie komórek NK pochodzących ze szpiku kostnego w sposób zależny od TGF beta-1 Smad3. Dane pokazują, że knockdown mRNA E4bp4 znacznie zmniejsza produkcję dojrzałych komórek NK w szóstym dniu w porównaniu z kontrolą nonsensowną.Wykazano, że zmniejszona produkcja komórek NK za pośrednictwem małego interferującego RNA może być uratowana przez tłumienie TGF beta-1 Smad3 za pomocą jednego mikromolowego inhibitora SIS3 Smad3 w porównaniu z małą interferującą grupą transfekowaną RNA. Po opanowaniu to badanie można wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Postępowanie zgodnie z tą procedurą pozwala na przeprowadzenie modyfikacji genetycznych, takich jak blokada genów i nadmierna ekspresja, w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak mechanizmy regulacji aktywności komórek NK oraz ich rozwój.Pierwszy pomysł na tę metodę przyszedł mi do głowy, gdy rozbudowywałem komórki NK w starym systemie. Obecność komórek płodu zmniejszyła obciążenie i wydajność siRNA w stosunku do genu zainteresowania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak produkować masywne, wysokiej jakości komórki NK z tego lokalnego systemu in vitro.Nie zapominaj, że praca z odczynnikami do ekstrakcji RNA może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy zachować środki ostrożności podczas wykonywania tej procedury.

a-novel-feeder-free-system-for-mass-production-murine-natural-killer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszej pracy opisujemy metodę wydajnej ekspansji i oczyszczania dużych ilości ludzkich komórek NK oraz oceny ich funkcji.

Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK z krwi obwodowej

Ten film demonstruje technikę ekspansji komórek NK (natural killer) bezpośrednio z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) za pomocą linii komórkowej zasilającej. PBMC są hodowane wspólnie z genetycznie zmodyfikowanymi komórkami odżywiającymi limfoblastoidy eksprymujące interleukinę-21 związaną z błoną (mIL-21), a hodowla jest uzupełniana cytokinami interleukiną-2 (IL-2) i interleukiną-15 (IL-15). Razem ten koktajl ligandów prowadzi do przedłużonej ekspansji komórek NK o wysokiej...

Ekspansja ex vivo komórek NK z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Ten protokół opisuje rozwój, ekspansję i obrazowanie in vivo komórek NK pochodzących z hESC i iPSC.

Rozwój, ekspansja i monitorowanie in vivo ludzkich komórek NK z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)

W tym badaniu prezentujemy system hodowli in vitro, który może efektywnie generować pDC poprzez kokulturę pospolitych komórek progenitorowych limfoidalnych z komórkami zasilającymi AC-6 w obecności ligandu Flt3.

In vitro Generowanie mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych przy użyciu systemu AC-6 Feeder

Tutaj prezentujemy dostosowany protokół, który może być użyty do wygenerowania dużej liczby mysich niezmiennych limfocytów T NK z mysiej śledziony. W protokole przedstawiono podejście, dzięki któremu komórki iNKT śledziony mogą być wzbogacane, izolowane i namnażane in vitro przy użyciu ograniczonej liczby zwierząt i odczynników.

Zoptymalizowana metoda izolowania i namnażania niezmiennych limfocytów T NK ze śledziony myszy

Opisujemy szybki i solidny protokół wzbogacania niezmiennych komórek T natural killer (iNKT) ze śledziony myszy i rozszerzania ich in vitro do odpowiedniej liczby dla badań in vitro i in vivo.

Oczyszczanie i namnażanie mysich niezmiennych limfocytów T NK do badań in vitro i in vivo

Tutaj prezentujemy metodę rozszerzania naturalnego killera krwi obwodowej (PBNK), komórek NK z tkanek wątroby oraz chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-komórek NK pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) lub krwi pępowinowej (CB). Protokół ten demonstruje ekspansję komórek NK i CAR-NK przy użyciu ogniw zasilających 221-mIL-21 oprócz zoptymalizowanej czystości ekspandowanych komórek NK.

Metoda ekspansji komórek NK i CAR-NK przy użyciu linii komórkowej B zmodyfikowanej przez błonę IL-21

Obecny protokół pokazuje, jak odróżnić komórki CD3−/CD45+CD56+ o łagodnej cytotoksyczności od ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale (hEPSC) zarówno w warunkach hodowli 3D, jak i 2D. Pozwala to na rutynową walidację fenotypową bez niszczenia złożonego mikrośrodowiska.

Generowanie komórek NK z ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z komórek NK (NK-EVs) mają obiecujący potencjał jako bioterapia przeciwnowotworowa. To oparte na metodologii badanie przedstawia skalowalny proces bioprodukcji w pętli zamkniętej, zaprojektowany do ciągłej produkcji i izolowania dużych ilości NK-EV o wysokiej czystości. Testy kontrolne w trakcie procesu są przeprowadzane w całym procesie bioprodukcji, aby zapewnić, że pojazdy elektryczne spełniają standardy jakości dotyczące wprowadzania produktu do...

Skalowalny proces bioprodukcji do produkcji i izolacji bioterapeutyków przeciwnowotworowych na bazie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek NK

Protokół ten opisuje skalowalną metodę rozszerzania produktów Adoptive Cell Therapies (ACT), mianowicie komórek Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T oraz komórek zabójczych indukowanych cytokinami (CIK), wykorzystujących urządzenia Gas-permeable Rapid Expansion (G-Rex), wykazując efektywny i solidny wzrost w klinicznie istotnych warunkach.

Efektywna i szybka generacja komórek zabójczych indukowanych przez CAR-T i cytokiny w urządzeniach skalowalnych GMP

Poznaj nowatorski system bez podajnika do masowej produkcji mysich komórek NK z wysoką czystością. Ta metoda umożliwia badania nad odpornością wrodzoną i immunoterapią przeciwnowotworową.

Nowatorski system bez podajnika do masowej produkcji mysich komórek NK in vitro

Przeglądaj więcej filmów