Tyłomózgowie myszy jako model do badania neurogenezy embrionalnej

Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie analizy całego narządu i analizy histologicznej zarodka tyłomózgowia myszy podczas rozwoju. Metoda ta pozwala na badanie zmian w neurogenezie w tyłomózgowiu organizmu modelowego ssaków. Rozwijające się tyłomózgowie myszy jest doskonałym modelem do badania aktywności progenezy neuronalnej ze względu na swoją płaską architekturę, która ułatwia obserwację wzorców neurogenezy w całym narządzie.

Rozpocznij tę procedurę od eutanazji ciężarnej samicy myszy w czasie przy użyciu etycznie zatwierdzonej procedury na wymaganym etapie ciąży. Ostrymi nożyczkami rozetnij jamę otrzewnej i ostrożnie wytnij macicę. Umieść wyciętą macicę zawierającą zarodki w 60-milimetrowym plastikowym naczyniu zawierającym 20 mililitrów lodowatego PBS.

Wykonaj całą dalszą sekcję za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich numer pięć rozerwij ścianę mięśni macicy, aby odsłonić zarodki. Uwolnij każdy zarodek, przecinając pępowinę i usuwając woreczek żółtkowy.

Po przeniesieniu każdego zarodka do czystego plastikowego naczynia z lodowatym PBS, użyj kleszczy zegarmistrzowskich nr 55, aby odciąć głowę. Opcjonalnie należy zachować niewielki fragment tkanki do izolacji genomowego DNA i późniejszego genotypowania. Za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich nr 55 wytnij tkankę zawierającą tyłomózgowie równolegle do i bezpośrednio poniżej nabłonka nerwowego tyłomózgowia, aby oddzielić go od tkanki twarzy i przodomózgowia.

Ustaw tkankę tyłomózgowia i głowy ogona, grzbietową stroną do góry i zidentyfikuj czwartą komorę, która jest pokryta cienką warstwą tkanki znaną jako płyta dachowa. Ostrożnie przebij płytę dachową za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich nr 55 i oderwij nadmiar tkanki kleszczami, przesuwając się rostralnie wzdłuż linii środkowej nad śródmózgowiem, a następnie doogonowo nad tylnym tyłomózgowiem i rdzeniem kręgowym. Tylna część mózgu powinna być teraz wyeksponowana w przygotowaniu do otwartej książki.

Aby przygotować tyłomózgowie do całościowego znakowania immunologicznego, użyj kleszczy zegarmistrzowskich numer 55, aby ostrożnie usunąć pozostałą głowę mezenchymy i wszelkie opony mózgowe przyczepione do skórnej strony tyłomózgowia. Usuń tkankę śródmózgowia i rdzenia kręgowego, aby pozostawić tylko tkankę tylnomózgowia. Aby przygotować tyłomózgowie do wibratomu i kriosekcji, użyj kleszczy zegarmistrzowskich nr 55, aby usunąć tkankę śródmózgowia i rdzenia kręgowego.

Przenieś tyłomózgowie z plastikowego naczynia do dwumililitrowych probówek z okrągłym dnem za pomocą pipety Pasteura. Po zaessaniu całego PBS, unieruchom tyłomózgowie na dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając w świeżo rozmrożonym formaldehydzie o sile 4% na objętość rozpuszczonym w PBS. Na koniec trzykrotnie opłucz tyłomózgowie PBS.

W razie potrzeby należy ponownie nawodnić tyłomózgowie w seryjnie zmniejszających się urojeniach metanolu w PBS w temperaturze pokojowej przez pięć minut przy każdym stężeniu. Następnie przenieś się do tyłomózgowia do PBS. Przepuszczalność tyłomózgowia przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w PBS zawierającym PBT z delikatnym mieszaniem.

Następnie inkubuj tyłomózgowie przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w PBT zawierającym 10% inaktywowanej termicznie koziej surowicy. Następnie inkubuj tyłomózgowie przez noc, tak jak poprzednio, w PBT zawierającym 1% inaktywowaną ciepło surowicy i pierwszorzędowe przeciwciała. Następnego dnia umyj tyłomózgowie w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą PBT przez godzinę każdy.

Po umyciu inkubować tyłomózgowie przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w PBT zawierającym odpowiednie przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem skierowane przeciwko zastosowanym przeciwciałom pierwszorzędowym. Od tego momentu trzymaj tyłomózgowie w ciemności, aby chronić fluorofory przed fotowybielaniem. Po umyciu, jak poprzednio, PBT, należy utrwalić tyłomózgowie w 4% formaldehydzie w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby zapewnić długotrwałe zachowanie wiązania przeciwciał.

W międzyczasie przykryj szklane szkiełko mikroskopowe dwiema warstwami czarnej taśmy izolacyjnej i wytnij mały kwadrat z warstwowej taśmy, aby utworzyć kieszeń wystarczająco dużą, aby pomieścić tylną część mózgu. Po dwukrotnym krótkim przepłukaniu tyłomózgowia w PBS, przenieś go do kieszeni za pomocą pipety Pasteura. Usuń nadmiar płynu i dodaj odpowiedni odczynnik zapobiegający blaknięciu do kieszeni.

Następnie powoli przykryj tyłomózgowie szklanym szkiełkiem nakrywkowym, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem nakrywkowym. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe i przymocuj je do szkiełka cienką warstwą lakieru do paznokci. Przechowuj szkiełko w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności do momentu uzyskania obrazu.

Osadź tyłomózgowie w stopionej agarozie w ilości 3% wagowej na objętość przygotowanej w wodzie destylowanej. Cut przenosi sekcje tyłomózgowia na grubość 70 mikronów za pomocą wibratomu. Przenieś każdy świeżo ścięty fragment pędzlem do jednego dołka 24-dołkowej płytki zawierającej lodowaty PBS.

Po oznaczeniu sekcji pływających zgodnie z opisem w protokole tekstowym, umyj je krótko w PBS. Ostrożnie przenieś pływające sekcje na szklane szkiełko mikroskopowe za pomocą pędzla. Zetrzyj nadmiar PBS wokół sekcji za pomocą bibuły lub chusteczki higienicznej.

Nie sekcje zawierające 80% glicerolu w PBS. I powoli przykryj je szklanym szkiełkiem nakrywkowym, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza. Przechowuj szkiełko w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności do momentu uzyskania obrazu.

Inkubuj tyłomózgowie w 30% wagowej sacharozy w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby chronić tyłomózgowie przed zamrożeniem. Zanurz tyłomózgowie w optycznym związku o temperaturze skrawania lub OCT. Następnie szybko je zamroź, przenosząc formy zawierające tylne deszcze na izopentan schłodzony do temperatury od 40 do 50 stopni Celsjusza na suchym lodzie.

Następnie przytnij transfery tylnego odcinka mózgu do grubości 10 mikronów za pomocą kriostatu. Przenieś sekcje tyłomózgowia na elektrostatycznie adhezyjne szkiełka mikroskopowe. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby wysuszyć sekcje do szkiełek.

Następnie umyj skrawki kriogeniczne PBS, aby rozpuścić OCT. Zaznacz hydrofobową barierę wokół sekcji kriogenicznych za pomocą pisaka PAP. Zobrazuj próbki za pomocą epifluorescencyjnego lub konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w soczewki odpowiednie do szkiełek montowanych w pożywkach wodnych, a także filtry optyczne odpowiednie dla fluoroforów stosowanych do znakowania immunologicznego.

Aby zobrazować całe tyłomózgowie lub część tyłomózgowia, użyj soczewki o 10-krotnym powiększeniu. Aby uwidocznić obszary tyłomózgowia w celu oceny ilościowej, użyj 40-krotnego powiększenia. Aby zobrazować poszczególne komórki, użyj soczewki o 63-krotnym powiększeniu.

Pokazano tutaj reprezentatywne wyniki z całych znakowanych immunologicznie tyłomózgowia w celu obserwacji dzielących się nerwowych komórek progenitorowych w strefie komorowej. Obrazy te uzyskano przy użyciu markera mitotycznego histonu fosfo H3 na kolejnych etapach rozwoju. Przekroje wibratomu poprzecznego znakowano po godzinnym impulsie EdU, aby uwidocznić komórki progenitorowe neuronów tyłomózgowia poddawane międzykinetycznej migracji jądrowej, a także mitotyczne fosfohistony H3-dodatnie na powierzchni komory.

Ogólny odsetek samoodnawiających się nerwowych komórek progenitorowych można określić, obliczając procent podwójnie dodatnich komórek Ki67 BrdU w kolorze żółtym wśród wszystkich komórek BrdU dodatnich w kolorze czerwonym i żółtym w poprzecznych skriogenicznych tyłomózgowiach z zarodków jeden dzień po podaniu BrdU. Sekcje wibratomu tyłomózgowia mogą być również znakowane immunologicznie przeciwciałem dla pośredniego białka filamentu Nestin, znanego również jako RC-2, w celu wizualizacji końcówek i wypukłości nerwowych komórek progenitorowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować preparat do montażu płaskiego lub poprzeczne odcinki tkanek tyłomózgowia.

Po opanowaniu można wyciąć do 10 tyłomózgowia w mniej niż godzinę. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby użyć lodowatego PBS, jeśli po raz pierwszy zapoznasz się z mikropreparacją tyłomózgowia, ponieważ ułatwia to oddzielenie od opon mózgowych, a także zapewnia zachowanie tkanek. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak cytometria przepływowa, na zawiesinach pojedynczych komórek tyłomózgowia, aby oddzielić progenitory nerwowe od innych typów komórek.

Opracowanie tej techniki utorowało drogę naukowcom zajmującym się neurobiologią rozwojową do zbadania mechanizmów neurogenezy ssaków poprzez wykorzystanie tyłomózgowia jako alternatywy dla konwencjonalnie stosowanych modeli rdzenia kręgowego i przodomózgowia. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat neurogenezy tyłomózgowia ssaków, ale może być również zastosowana do innych rozwijających się kręgowców, biorąc pod uwagę stopień podobieństwa strukturalnego i molekularnego między gatunkami. Technika ta może pomóc w odkryciu nowych mechanizmów kontrolujących neurogenezę i pomóc w ustaleniu, czy te zidentyfikowane w innym miejscu osi są rekapitulowane w tej części mózgu kręgowców.