Name: Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: Poznaj metodę FISH do badania kohezji ramienia chromosomów w oocytach Drosophila. Technika umożliwia ocenę stanu kohezji w prometafazie I i metafazie I, pomagając zrozumieć mechanizmy segregacji chromosomów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez GM59354 grantu NIH przyznanego Sharon E. Bickel. Dziękujemy Huy Q. Nguyenowi za pomoc w opracowaniu protokołu generowania fluorescencyjnych sond ramienia, Ann Lavanway za pomoc w mikroskopii konfokalnej oraz J. Emiliano Reedowi za pomoc techniczną. Dziękujemy również wielu kolegom ze społeczności Drosophila za pomocne dyskusje i rady.

<ol><li>Peters, J. M., Nishiyama, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3536341/">Sister chromatid cohesion.</a> CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).</li>
<li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+in+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li>
<li>Buonomo, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disjunction+of+homologous+chromosomes+in+meiosis+I+depends+on+proteolytic+cleavage+of+the+meiotic+cohesin+Rec8+by+separin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin.</a> Cell. 103 (3), 387-398 (2000).</li>
<li>Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sister-chromatid+cohesion+protein+ORD+is+required+for+chiasma+maintenance+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes.</a> Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).</li>
<li>Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMC1beta-deficient+female+mice+provide+evidence+that+cohesins+are+a+missing+link+in+age-related+nondisjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction.</a> Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).</li>
<li>Freeman, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+National+Down+Syndrome+Project%3A+design+and+implementation%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health+Rep%22%5BJournal%5D)">The National Down Syndrome Project: design and implementation.</a> Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).</li>
<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li>
<li>Angell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-meiotic-division+nondisjunction+in+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes.</a> Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).</li>
<li>Tsutsumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decrease+of+meiotic+cohesins+in+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes.</a> PLoS One. 9 (5), e96710(2014).</li>
<li>Liu, L., Keefe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+cohesin+is+associated+with+age-dependent+misaligned+chromosomes+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes.</a> Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).</li>
<li>Subramanian, V. V., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+predisposes+oocytes+to+meiotic+nondisjunction+when+the+cohesin+subunit+SMC1+is+reduced%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced.</a> PLoS Genet. 4 (11), e1000263(2008).</li>
<li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+weakened+centromere+cohesion+is+a+leading+cause+of+age-related+aneuploidy+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes.</a> Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).</li>
<li>Lister, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+meiotic+segregation+errors+in+mammalian+oocytes+are+preceded+by+depletion+of+cohesin+and+Sgo2%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2.</a> Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).</li>
<li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+cohesion+decreases+in+human+eggs+with+advanced+maternal+age%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age.</a> Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).</li>
<li>Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+dyad+separation+in+meiosis+II+is+the+major+segregation+error+with+maternal+age+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes.</a> Development. 141 (1), 199-208 (2014).</li>
<li>Subramanian, V. V., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2666492/">Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised.</a> Genetics. 181, 1207-1218 (2009).</li>
<li>Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+system+for+increased+meiotic+nondisjunction+in+older+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes.</a> Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).</li>
<li>Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rejuvenation+of+Meiotic+Cohesion+in+Oocytes+during+Prophase+I+Is+Required+for+Chiasma+Maintenance+and+Accurate+Chromosome+Segregation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation.</a> PLoS Genetics. 10 (9), e1004607(2014).</li>
<li>Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+in+oocytes+during+midprophase+induces+premature+loss+of+cohesion+and+chromosome+segregation+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).</li>
<li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+a+role+for+heterochromatin+in+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation.</a> Cell. 86, 135-146 (1996).</li>
<li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X08608808">Method Cell Biol</a>. 53, Academic Press. 187-233 (1998).</li>
<li>Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Securin%2C+Separase+and+Cohesins+in+female+meiosis+and+polar+body+formation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila.</a> J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).</li>
<li>Giauque, C. C., Bickel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin-Associated+Proteins+HP1a+and+Piwi+Collaborate+to+Maintain+the+Association+of+Achiasmate+Homologs+in+Drosophila+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes.</a> Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).</li>
<li>Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+progenitors+escape+the+widespread+phenomenon+of+homolog+pairing+during+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development.</a> PLoS Genet. 9 (12), e1004013(2013).</li>
<li>Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congression+of+achiasmate+chromosomes+to+the+metaphase+plate+in+Drosophila+melanogaster+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes.</a> Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).</li>
<li>Gyuricza, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+Stable+Cohesins+Regulate+Synaptonemal+Complex+Assembly+and+Chromosome+Segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation.</a> Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).</li>
<li>Radford, S. J., McKim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+Imaging+Prometaphase+and+Metaphase+of+Meiosis+I+in+Fixed+Drosophila+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Zastosowanie sond FISH do oceny stanu spójności ramienia w oocytach Drosophila prometafazy I i metafazy I jest znaczącym postępem w dziedzinie mejozy Drosophila. Historycznie rzecz biorąc, badacze Drosophila byli ograniczeni do testów genetycznych, aby wywnioskować przedwczesną utratę spójności ramienia w dojrzałych oocytach 11,18,19. Teraz, dzięki przedstawionym tutaj metodom, stan spójności ramienia ...

Właściwa segregacja chromosomów podczas mitozy i mejozy wymaga, aby spójność chromatydy siostrzanej była ustanowiona, utrzymywana i uwalniana w skoordynowany sposób1,2. Kohezja powstaje w fazie S i jest pośredniczona przez kompleks kohezyny, który tworzy fizyczne wiązania, które utrzymują razem chromatydy siostrzane. W mejozie kohezja dystalna do skrzyżowania pełni również funkcję utrzymywania razem rekombinowanych homologów, a to fizyczne powiązanie pomaga zapewnić prawidłową orientację biwalentnego wrzeciona metafazy I (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1) 3, 4,5. Uwolnienie kohezji ramienia w anafazie I umożliwia segregację homologów na przeciwległe bieguny wrzeciona. Jeśli jednak spójność ramienia zostanie przedwcześnie utracona, rekombinowane homologi stracą swoje fizyczne połączenie i losowo się segregują, co może skutkować gametami aneuploidalnymi (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).
U ludzkich oocytów główną przyczyną poronień i wad wrodzonych są błędy w segregacji chromosomów, takie jak zespół Downa6, a ich częstość wzrasta wykładniczo wraz z wiekiem matki7. Kohezja chromatydy siostrzanej ustala się w oocytach płodu, a rekombinacja mejotyczna kończy się przed urodzeniem. Oocyty następnie zatrzymują się w połowie profazy I aż do owulacji, a podczas tego zatrzymania ciągła fizyczna asocjacja rekombinowanych homologów opiera się na kohezji chromatyd siostrzanych. Dlatego dokładna segregacja podczas mejozy i normalne wyniki ciąży wymagają, aby spójność pozostała nienaruszona przez okres do pięciu dekad.
Przedwczesna utrata spójności podczas długotrwałego zatrzymania mejotycznego ludzkich oocytów została zaproponowana jako przyczynienie się do efektu wieku matki i wiele linii dowodowych potwierdza tę hipotezę8,9. Jednak biorąc pod uwagę wyzwania związane z badaniem spójności mejotycznej w ludzkich oocytach, znaczna część naszego zrozumienia tego zjawiska opiera się na wykorzystaniu organizmów modelowych5,10,11,12,13,14,15.
oocyty Drosophila melanogaster oferują liczne korzyści w badaniu kohezji mejotycznej i segregacji chromosomów. Prosty test genetyczny pozwala odzyskać potomstwo z gamet aneuploidalnych i zmierzyć wierność segregacji chromosomu X na dużą skalę11,16,17. Co więcej, można również ustalić, czy błędy segregacji chromosomów powstają, ponieważ rekombinowane homologi nieprawidłowo segregują się podczas mejozy I, fenotypu, który jest zgodny z przedwczesną utratą spójności ramienia11,18,19. Bezpośrednia obserwacja stanu kohezji mejotycznej w oocytach Drosophila jest również możliwa za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Chociaż fluorescencyjne oligonukleotydy, które hybrydyzują się z powtarzalnymi sekwencjami satelitarnymi, są używane od ponad dekady do monitorowania spójności pericentromerowej w dojrzałych oocytach Drosophila4,20, analiza spójności ramienia była znacznie trudniejsza. Wizualizacja stanu kohezji ramion wymaga sondy, która obejmuje duży obszar sekwencji pojedynczej kopii i jest wystarczająco jasna, aby skutkować widocznymi sygnałami dla poszczególnych chromatyd siostrzanych, gdy kohezja ramienia jest nieobecna. Ponadto warunki wiązania oocytów i wielkość znakowanego DNA muszą ułatwiać penetrację21 do dużego dojrzałego oocytu Drosophila (o szerokości 200 μm i długości 500 μm). Ostatnio z powodzeniem wykorzystano sondę ramienia do wizualizacji chromatyd oocytów Drosophila podczas anafazy I, ale autorzy stwierdzili, że nie mogą wykryć sygnału w oocytach zatrzymanych w prometafazie lub metafazie I22. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół generowania sond FISH ramienia chromosomu X i warunków przygotowania oocytów, które pozwoliły nam stwierdzić przedwczesną utratę kohezji chromatyd siostrzanych w oocytach prometafazy I i metafazy I. Techniki te, które umożliwiły nam zidentyfikowanie produktów genów, które są niezbędne do utrzymania spójności mejotycznej, pozwolą innym na przeprowadzenie testów na defekty kohezji chromatyd siostrzanych w dojrzałych oocytach Drosophila o różnych genotypach.

<table><tbody><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midi Zestaw przygotowawczy</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>Prep BAC klon DNA</td></tr><tr><td>GenomePlex Kompletny zestaw do amplifikacji całego genomu (WGA) Sigma</td><td></td><td>WGA2</td><td>Amplify BAC klon DNA</td></tr><tr><td>ARES Alexa Fluor 647 Zestaw do znakowania DNA</td><td>Invitrogen</td><td>A21676</td><td>Etykieta BAC klon DNA</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania DNA PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Usuń niesprzężony barwnik po oznakowaniu DNA klonu BAC</td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Chemicals & Roztwory</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uwaga: Wszystkie roztwory są przygotowywane przy użyciu sterylnej ultraczystej wody i powinny być sterylizowane w autoklawie lub filtrze.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td>Przygotuj 10% bulionu Zamroź podwielokrotności</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>C75-500</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4', 6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td><silny>Toksyczny: </silny> nosić odpowiednią ochronę. Przygotuj 100&micro; g/ml zapasu w 100% etanolu, przechowywać w porcjach w temperaturze -20 °C. Przygotować 1 &mikro; g/ml roztworu w 2X SSCT przed użyciem.</td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu</td><td>Sigma</td><td>D-8906</td><td></td></tr><tr><td>Drierite</td><td>Drierite Company</td><td>23001</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td>Przygotuj 10 mM zapasu</td></tr><tr><td>dTTP (10 &mikro; mol, 100 i mikro; l)</td> <td>Boehringer Mannheim</td><td>1277049</td><td>Przygotuj 1 mM zapasu</td></tr><tr><td>EDTA (disodowy kwas etylenodiaminotetraoctowy) Fisher</td> <td>Scientific</td><td>S311-500</td><td>Przygotuj 250 mM zapasu</td></tr><tr><td>100% etanolu (klasa molekularna, 200 dowodów)</td> <td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Tris (Ultra Pure)</td> <td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (Kwas etylenobis(oksyetylenonitro)tetraoctowy)</td><td>Sigma</td><td>E-3889</td><td></td></tr><tr><td>16% formaldehyd</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18505</td><td>< Silny>Toksyczny: </silny> nosić odpowiednią ochronę</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Invitrogen</td><td>AM9342</td><td><silny>Toksyczny: </silny>nosić odpowiednią ochronę</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Roche</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>737-151</td><td></td></tr><tr><td>Heptan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H350-4</td><td><silny>Toksyczny: </mocny> nosić odpowiednią ochronę.</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Millipore</td><td>HX0603-4</td><td><silny>Toksyczny: < / silny> nosić odpowiednią ochronę.</td></tr><tr><td>Hydroksyloamina</td><td>Sigma</td><td>438227</td><td>Przygotuj 3 M zapas</td></tr><tr><td>4,9 M Chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>104-20</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 &Yuml; 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 &Yuml; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna (0,1 mg / ml)</td> <td>Sigma</td><td>P8920-100</td><td></td></tr><tr><td>Octan potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP364-500</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S209-500</td><td>Przygotuj 3M zapas</td></tr><tr><td>Kakodylan sodu</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>1131</td><td><silny>Toksyczny: nosić odpowiednią ochronę. Przygotuj 400mM zapasu</td></tr><tr><td>cytrynianu sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Chlorek sodu</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Thermo Scientific</td><td>28320</td><td>Surfact-Amps</td></tr><tr><td>10% Triton X-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>28314</td><td>Surfact-Amps</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uwaga: Wszystkie roztwory są przygotowywane przy użyciu sterylnej ultraczystej wody i powinny być sterylizowane w autoklawie lub przez sterylizację filtra.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> TE <td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8,0</td></tr><tr><td>20X SSC (Soline Sodium Citrate)</td><td></td><td></td><td>3 M NaCl, 300 mM Cytrynian sodu</td></tr><tr><td>2X roztwór <wiążący</td><td></td><td></td> kakodylan 2X <td>Silny>Toksyczny: </silny> nosić odpowiednią ochronę. 200 mM kakodylan sodu, 200 mM sacharozy, 80 mM octan sodu, 20 mM EGTA</td></tr><tr><td>1.1X Bufor</td><td></td><td></td> <td>hybrydyzacyjny3,3X SSC, 55% formamid, 11% siarczan dekstranu</td></tr><tr><td>Fix roztwór</td><td></td><td></td> <td><silny>Toksyczny: </silny>nosić odpowiednią ochronę. 4% formaldehyd, 1X roztwór wiążący kakodylan</td></tr><tr><td>PBSBTx</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 0,5% BSA, 0,1% Trition X-100</td></tr><tr><td>PBSTx</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 1% Trition X-100</td></tr><tr><td>Bufor ekstrakcyjny (PBSTx + Rnaza)</td><td></td><td></td><td>1X PBS, 1% Trition X-100, 100 & Mikro; g / mL RNaza</td></tr><tr><td>2X SSCT</td><td></td><td></td><td>2X SSC, 0,1% Tween 20</td></tr><tr><td>2X SSCT + 20% formamid</td><td></td><td></td> <td>< silny>Toksyczny: < / silny> nosić odpowiednią ochronę. 2X SSC, 0,1% Tween 20, 20% formamid</td></tr><tr><td>2X SSCT + 40% formamid</td><td></td><td></td> <td><silny>Toksyczny: < / silny> nosić odpowiednią ochronę. 2X SSC, 0,1% Tween 20, 40% formamid</td></tr><tr><td>2X SSCT + 50% formamid</td><td></td><td></td><td><silny>Toksyczny: </silny> nosić odpowiednią ochronę. 2X SSC, 0,1% Tween 20, 50% formamid</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AluI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0137S</td><td></td></tr><tr><td>HaeIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0108S</td><td></td></tr><tr><td>MseI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0525S</td><td></td></tr><tr><td>MspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106S</td><td></td></tr><tr><td>RsaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0167S</td><td></td></tr><tr><td>BfuCI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0636S</td><td></td></tr><tr><td>100X BSA</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>W zestawie enzymy NEB</td></tr><tr><td>10X bufor NEB #2</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>Bufor trawienia enzymów restrykcyjnych. W zestawie z enzymami NEB</td></tr><tr><td>Końcowa deoksynukleotydylotransferaza (TdT) 400 U/&mikro; l</td> Bufor TdT <td>Roche / Sigma 3333566001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roche</td><td>/ Sigma</td><td></td><td>W zestawie z enzymem TdT</td></tr><tr><td>Chlorek kobaltu</td><td>Roche / Sigma</td><td></td> <td>Toxic: nosić odpowiednią ochronę. W zestawie enzym TdT</td></tr><tr><td>RNaza A (10 mg / ml)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Cytology Tools itp.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Dumont</td><td></td><td>#5 INOX, Biologia</td></tr><tr><td>9" Jednorazowe szklane pipety Pasteura</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td>Autoklaw do sterylizacji</td></tr><tr><td>Naczynie</td><td></td><td></td> preparacyjne z płytkiego szkła <td>Wykonane na zamówienie</td></tr><tr><td>Naczynie do głębokiej studni (3 dołki)</td><td>Pyrex</td><td>7223-34</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Fisherfinest Premium</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-104</td><td>Służy do przykrywania naczyń ze studni głębinowych</td></tr><tr><td>Szkiełka z matowego szkła, 25 x 75 mm</td><td>VWR Scientific</td><td>48312-002</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka podstawowe, 3 x 1 cal, grubość 1 mm</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3051</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, 10 x 10 mm, nr 1.5</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3405</td><td></td></tr><tr><td>Igła wolframowa</td><td></td><td></td><td>domowej roboty</td></tr><tr><td>Prolong GOLD Nośniki</td><td>montażowe Sondy molekularne</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Sprężone powietrze w puszce</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000, spektrofotometr</td><td>Termo-naukowy</td><td></td><td>spektrofotometr mikroobjętościowy</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrofuge stołowy w temperaturze pokojowej</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrofuge stołowe w 4 & stopniach; C</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bloki grzewcze</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji lub inkubator z rotatorem</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nutatory</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>konfegalne skanowanie laserowe A1RSi</td><td>Nikon</td><td></td><td>40X olej Plan Fluor DIC (NA 1.3)</td></tr> <tr><td><silny>Nazwa< / silny></td><td><silny>Firma< / silny></td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Materiały eksploatacyjne itp.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL probówki stożkowe</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówki stożkowe 15 ml</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówki do mikrofuge 1,5 ml</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 i mikro; l rurki do mikrofuge</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 i mikro; l Probówki PCR</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy pojemnik ze szczelnie dopasowaną pokrywką</td><td>Różne</td><td></td><td>Do przechowywania Drierite</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Różne</td><td></td><td>chusteczki jednorazowe</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Różne</td><td></td><td>folie parafinowe</td></tr> <tr><td>< silny>Nazwa< / silny></td><td><silny>Firma< / silny></td><td><silny>Numer katalogowy</silny></td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Inne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC oczyszczone oligonukleotydy znakowane 5'</td><td>Zintegrowane technologie DNA Sondy</td><td></td><td>znakowane Cy3, które rozpoznają powtórzenie satelitarne 359 pz chromosomu X</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu 3D Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>wersja 6.3</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (fish) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy i drosophila

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

U ludzi błędy segregacji chromosomów w oocytach są odpowiedzialne za większość poronień i wad wrodzonych. Co więcej, wraz z wiekiem ryzyko poczęcia płodu aneuploidalnego dramatycznie wzrasta, a zjawisko to jest znane jako efekt wieku matki. Jednym z warunków dokładnej segregacji chromosomów podczas podziałów mejotycznych jest utrzymanie spójności chromatyd siostrzanych podczas wydłużonego okresu profazy, którego doświadczają oocyty. Dowody cytologiczne zarówno u ludzi, jak i organizmów modelowych sugerują, że spójność mejolityczna pogarsza się podczas procesu starzenia. Ponadto błędy segregacji w ludzkich oocytach są najbardziej rozpowszechnione podczas mejozy I, co jest zgodne z przedwczesną utratą spójności ramienia. Wykorzystanie organizmów modelowych ma kluczowe znaczenie dla rozwikłania mechanizmów, które leżą u podstaw zależnej od wieku utraty spójności. Drosophila melanogaster oferuje kilka zalet w badaniu regulacji spójności mejotycznej w oocytach. Jednak do niedawna dostępne były tylko testy genetyczne do oznaczania utraty spójności ramienia w oocytach o różnych genotypach lub w różnych warunkach eksperymentalnych. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół stosowania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do bezpośredniej wizualizacji defektów w kohezji ramienia w oocytach Drosophila zatrzymanych w prometafazie I i metafazie I. Generując sondę FISH, która hybrydyzuje z dystalnym ramieniem chromosomu X i zbierając konfokalne stosy Z, badacz może zwizualizować liczbę pojedynczych sygnałów FISH w trzech wymiarach i określić, czy siostrzane ramiona chromatydy są rozdzielone. Opisana procedura umożliwia ilościowe określenie wad kohezji ramienia w setkach oocytów Drosophila. W związku z tym metoda ta stanowi ważne narzędzie do badania mechanizmów, które przyczyniają się do utrzymania spójności, a także czynników, które prowadzą do jej zaniku w procesie starzenia.

Rysunek 5 przedstawia obrazy uzyskane za pomocą sondy ramienia, która hybrydyzuje z regionem cytologicznym 6E-7B chromosomu X. Sonda ta generuje sygnał, który kolokalizuje z sygnałem DAPI, jest łatwo odróżnialny od tła i był z powodzeniem stosowany do ilościowego określania defektów kohezji ramion w różnych genotypach19. Ilościowa ocena defektów kohezji została ograniczona do stadiów prometafazy I i metafazy I; z analizy wyklu...

Ten manuskrypt przedstawia szczegółową metodę generowania sond ramienia chromosomu X i przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu zbadania stanu kohezji chromatydy siostrzanej w oocytach Drosophila zatrzymanych w prometafazie i metafazie I. Protokół ten jest odpowiedni do określenia, czy spójność ramienia mejotycznego jest nienaruszona, czy zakłócona w różnych genotypach.

Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie sond FISH i wizualizacja stanu kohezji ramienia mejotycznego w oocytach drosophila podczas pierwszej i pierwszej prometafazy. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na określenie stanu spójności ramienia w oocytach prometafazy i metafazy pierwszej zatrzymanych w sosophila. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mejozy drosophila, takie jak: jakie warunki prowadzą do przedwczesnej utraty spójności ramienia?Technika ta ma potencjał, aby poszerzyć naszą wiedzę na temat efektu wieku matki u ludzi, który występuje, przynajmniej częściowo, ponieważ spójność mejotyczna pogarsza się wraz z wiekiem oocytów. Rozpocznij ten protokół od wygenerowania sondy ramienia dla FISH, a także preparacji i utrwalenia oocytów, jak opisano w protokole tekstowym. Aby oddzielić oocyty w późnym stadium, najpierw dodaj jeden mililitr PBSBTX do płytkiego naczynia preparacyjnego.Następnie użyj P-200 z końcówką pokrytą BSA, aby przenieść nieruchome jajniki do płytkiego naczynia. Pipetować jajniki w górę i w dół za pomocą końcówki pipety pokrytej BSA, aby usunąć dojrzałe oocyty ze mniej dojrzałych oocytów. Gdy oocyty w późnym st

using-fluorescence-situ-hybridization-fish-to-monitor-state-arm

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Przedstawiamy protokoły pobierania, przygotowania i obrazowania dojrzałych oocytów Drosophila. Metody te pozwalają na wizualizację zachowania chromosomów oraz składania i funkcji wrzeciona podczas mejozy.

Techniki obrazowania prometafazy i metafazy mejozy I w utrwalonych oocytach Drosophila

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Ten protokół hybrydyzacji fluorescencji in situ jest zoptymalizowany do ilościowego określenia liczby cząsteczek RNA w pączkujących drożdżach podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy.

Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie

Aby w sposób powtarzalny zliczyć liczbę mRNA w poszczególnych oocytach, zoptymalizowano jednocząsteczkową fluorescencję RNA in situ (RNA-FISH) dla komórek nieprzylegających. Oocyty zebrano, zhybrydyzowano z sondami specyficznymi dla transkryptu i oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania do kwantyfikacji obrazu.

Zastosowanie jednocząsteczkowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (SM-FISH) do ilościowego oznaczania i lokalizacji mRNA w mysich oocytach

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

Ten protokół opisuje kroki wymagane do przeprowadzenia hybrydyzacji łańcucha reakcji fluorescencyjnej in situ (HCR-FISH) w narządach wzrokowych larw Drosophila melanogaster. Szczegółowo opisano procedury projektowania sond, hybrydyzacji, amplifikacji oraz montażu tkanki, aby ułatwić wizualizację rozwijającego się narządu wzrokowego.

Reakcja łańcuchowa hybrydyzacji FISH w rozwijającym się Drosophila płacie wzrokowym

Poznaj metodę FISH do badania kohezji ramienia chromosomów w oocytach Drosophila. Technika umożliwia ocenę stanu kohezji w prometafazie I i metafazie I, pomagając zrozumieć mechanizmy segregacji chromosomów.

Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila

Przeglądaj więcej filmów