Name: Ocena terapii komórkami macierzystymi w obustronnym modelu uszkodzenia ścięgna rzepki u szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj metodę oceny terapii komórkami macierzystymi w obustronnym modelu uszkodzenia ścięgna rzepki u szczurów. Model minimalizuje zmienność międzyosobniczą i pozwala na etyczne zmniejszenie liczby zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Su, PhD, za jej statystyczną analizę danych. Autorzy dziękują również dr McClure, DVM, PhD DACLAM, za jej porady dotyczące znieczulenia i protokołów leczenia bólu stosowanych w badaniu. Projekt ten był wspierany przez granty z Biura Wiceprezydenta ds. Badań Zachodniego Uniwersytetu Nauk o Zdrowiu (12678v) oraz funduszy USDA Section 1433 (2090).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Zachodniego Uniwersytetu Nauk o Zdrowiu.
1. Izolacja i ekspansja MSCs z macierzy pępowiny koni
<ol>
	<li>Pozyskać łożysko od dorosłej klaczy (ciężarnej) po zaobserwowanym źrebięciu i aseptycznie odizolować pępowinę od łożyska. Przechowywać pępowinę w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z 1% penicyliną-streptomycyną (P/S) w temperaturze 4 °C podczas transferu do czasu przetworzenia.</li>
	<li>Umyj pępowinę dwukrotnie PBS o temperaturze pokojowej z 1% P/S w probówce o pojemności 50 ml. Pokrój pępowinę na fragmenty o długości 2 cali na płytce 150 mm i umyj w temperaturze pokojowej PBS z 1% P/S w probówce o pojemności 50 ml dwa lub trzy razy, aż większość krwi zostanie wypłukana.</li>
	<li>Przetnij pępowinę wzdłuż, aby odsłonić naczynia. Usuń naczynia, w tym 2 tętnice, żyłę i łodygę omocznikową z pępowiny za pomocą kleszczy i nożyczek. Zbierz macierz pępowinową (galaretka Whartona), która jest galaretowatą matrycą otaczającą naczynia, na płytkę o średnicy 150 mm, zeskrobując skalpelem, i zmiel galaretkę na drobne kawałki.</li>
	<li>Umieść galaretkę Whartona z 2-3 fragmentów pępowiny (około 12-15 g) w 50-mililitrowej probówce z 15 ml 0,1% (w/v) roztworu kolagenazy typu IA w PBS. Inkubować w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając przez 3-4 godziny, aż do rozpuszczenia.</li>
	<li>Odwirować strawioną tkankę w stężeniu 300 x g przez 15 minut i odessać supernatant. Zawiesić strawioną tkankę w 15 ml PBS o temperaturze pokojowej z 1% P/S, wymieszać pipetując, odwirować przy 150 x g przez 5 minut i odessać supernatant (przemywać). Powtórz pranie jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Zawiesić umyte komórki w 15 ml PBS o temperaturze pokojowej z 1% P/S, wymieszać pipetując, przecedzić za pomocą sitka do komórek o wielkości 100 μm, odwirować przy 150 x g przez 5 minut i odessać supernatant.</li>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną (CM), mieszając zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco Eagle's Medium o niskiej zawartości glukozy z surowicą płodową bydlęcą (FBS) i 1% P/S. Wysterylizuj pożywkę przez filtrację.</li>
	<li>Ponownie zawiesić odcedzone komórki w 10 ml CM wstępnie ogrzanego do 37 °C, wymieszać pipetując, przenieść do kolby do hodowli tkankowej o średnicy 25cm2 i inkubować w 5% CO2 przy wilgotności 90% i temperaturze 37,0 °C. Zmieniaj CM co 3 dni, aż kultura osiągnie 70–80% zbieżności, kiedy kultura będzie pasażowana.</li>
	<li>Aby przejść przez kulturę, należy odessać CM z kolby, przemyć dwukrotnie 5 ml PBS o temperaturze pokojowej i odłączyć 3 ml 0,25% trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Zneutralizować trypsynę/EDTA za pomocą 6 ml CM wstępnie podgrzanego do 37,0 °C, wymieszać pipetując, przenieść do probówki o pojemności 15 ml, odwirować przy 150 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Zawiesić oderwane komórki w 1 ml CM, wymieszać pipetując. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Ponownie wysiać do kolby do hodowli tkankowej o średnicy 25cm2 w ilości 5 000 komórek/cm2 i inkubować w 5% CO2 przy wilgotności 90% i temperaturze 37,0 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie sferoid z UCM-MSC hodowanych na foliach chitozanowych
<ol>
	<li>Aby przygotować 100 ml 1% (w/v) roztworu chitozanu, dodaj 1 g chitozanu do 99 ml wody destylowanej (dH2O) i dobrze wymieszaj z mieszadłem magnetycznym.</li>
	<li>Dodać 670 μl lodowatego kwasu octowego i kontynuować mieszanie, aż chitozan się rozpuści i stanie się lepki. Trwa to zwykle 3–4 godziny.</li>
	<li>Dodać 500 μl roztworu chitozanu do każdego dołka 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i zawirować płytkę, aby równomiernie rozprowadzić roztwór chitozanu i pokryć całą dolną powierzchnię.</li>
	<li>Płytkę pokrytą roztworem chitozanu suszyć pod komorą z przepływem laminarnym bez pokrywy przez noc przez 24 godziny. Po wyschnięciu zostanie uformowana cienka folia i przyklejona do płyty.</li>
	<li>Zneutralizować film chitozanowy, dodając 1 ml 0,5 N roztworu wodorotlenku sodu (NaOH) do każdego dołka i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Odessać NaOH z każdej studzienki i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 1 ml dH2O. Umyj każdą studzienkę 1 ml 70% etanolu (EtOH) raz.</li>
	<li>Aby wysterylizować film chitozanowy, dodaj 1 ml 70% EtOH do każdej studzienki i inkubuj przez noc w komorze laminarnej. Odessać pozostały EtOH z każdej studzienki w następnym dniu. Umyj każdą studzienkę trzykrotnie 1 ml sterylnego PBS. Sterylizuj folię chitozanową światłem ultrafioletowym w komorze laminarnej przez noc bez pokrywy.</li>
	<li>Aby utworzyć sferoidy UCM-MSC, należy wysiać ekspandowane i pasażowane komórki do każdej studzienki w ilości 5 000 komórek/cm2 i inkubować w 5% CO2 przy wilgotności 90% i temperaturze 37,0 °C. 
	UWAGA: Komórki mogą być inkubowane w warunkach niedotlenienia lub normoksji, w zależności od zainteresowania badacza.</li>
</ol>
3. Ekspresja markerów powierzchniowych analizowanych za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej
	<ol>
		<li>Płyta standardowa
		<ol>
			<li>Usuń pożywkę z każdej studzienki i umyj dwukrotnie PBS o temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Odłącz komórki z 500 μl odczynnika do dysocjacji komórek do każdego dołka 12-dołkowej płytki na 5-10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Po inkubacji dodać 1 ml buforu barwiącego (PBS zawierający 0,5% BSA) do każdej studzienki i wymieszać pipetując w celu odłączenia komórek.</li>
			<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 150 x g przez 5 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Płytka chitozanowa
		<ol>
			<li>Zebrać wszystkie sferoidy, odsysając podłoże za pomocą pipety z końcówką o pojemności 1 000 μl. Przenieś zebrane podłoże do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Po zebraniu pożywki dobrze umyć, dodając 1 ml PBS i przenieść umyty PBS do tej samej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
			<li>Odwirować sferoidy o masie 150 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.</li>
			<li>Dodać 500 μl odczynnika do dysocjacji komórek (np. akutazy) i inkubować przez 5–10 minut w temperaturze pokojowej. Mieszać pipetując za pomocą końcówki o pojemności 1 ml, aż sferoidy rozdzielą się i przestaną być widoczne.</li>
			<li>Dodać 1 ml buforu barwiącego do zawiesiny jednokomórkowej i odwirować przy 150 x g przez 5 minut.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki myjące
	<ol>
		<li>Usunąć supernatant z probówki stożkowej i ponownie zawiesić komórki w 3 ml zimnego buforu barwiącego. Utrzymuj komórki na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu od tego kroku.</li>
		<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut (mycie).</li>
		<li>Umyć dwukrotnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie komórek
	<ol>
		<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.</li>
		<li>Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Ponownie zawiesić 1 x 106 komórek w 50 μl buforu blokującego (PBS zawierający 10% surowicy końskiej) i inkubować przez 30 minut na lodzie.</li>
		<li>Dodać 10 μl przeciwciał sprzężonych z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (CD44, CD90, CD105, CD34, główny kompleks zgodności tkankowej (MHC) klasy II lub kontrolę izotypu dla każdego przeciwciała) i 40 μl buforu barwiącego, a następnie inkubować chroniony przed światłem przez 1 godzinę na lodzie.</li>
		<li>Dodać 3 ml zimnego buforu barwiącego i wymieszać, odwirować przy 300 x g przez 5 minut i odessać supernatant (przemywać).</li>
		<li>Powtórz pranie dwa razy.</li>
		<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml buforu barwiącego</li>
		<li>Dodać 5 μl 7-AAD (barwnik żywotności) i inkubować przez 30 minut na lodzie</li>
		<li>Analizuj barwione próbki komórek za pomocą cytometru przepływowego. Wyklucz zanieczyszczenia na podstawie ich mniejszych SSC i FSC i zidentyfikuj żywotne komórki z niższym wychwytem 7-AAD. Wykreśl FL1 i FL2 odpowiednio na osiach y i x. Użyj kontrolki izotypu, aby utworzyć bramkę powyżej linii ukośnej. Zmierz procent dodatnio zabarwionych komórek w obszarze. Policz co najmniej 20 000 zdarzeń na próbkę (rysunek uzupełniający 1).</li>
		<li>Zmierz procent komórek wybarwionych przeciwciałami poprzez bramkowanie żywotnych komórek i autofluorescencję oraz odejmij procent komórek wybarwionych kontrolą izotypu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Model obustronnego uszkodzenia ścięgna rzepki u szczura
<ol>
	<li>Wybierz szczury Sprague-Dawley (dorosły samiec w wieku 4–5 miesięcy, masa ciała 350–375 g). Zwróć uwagę na stosunkowo duży rozmiar szczurów użytych w tym modelu.</li>
	<li>Znieczulić i nałożyć sztuczny lubrykant do oczu szczura z 8% sewofluranem w 2 l/min 100% tlenu dostarczanego przez maskę, aż do ustąpienia odruchu szczypania w komorze indukcyjnej.</li>
	<li>Należy podać domięśniowe wstrzyknięcie meloksykamu (1 mg/kg) jako środek przeciwbólowy zapobiegawczy.</li>
	<li>Umieść szczura między dwiema butelkami z wodą o pojemności 0,5 l wypełnionymi ciepłą wodą i przykrytymi szmatką, aby utrzymać temperaturę i pozycję ciała, jednocześnie zapobiegając urazom skóry. Przyklej każdy koniec do stołu. Aby zmniejszyć ryzyko hipotermii, przykryj ciało folią bąbelkową (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Utrzymuj znieczulenie z ciągłym przepływem 5% sewofluranu w 1 l 100% mieszaniny tlenu przez stożek nosowy, ze zwierzęciem w pozycji grzbietowej na poduszce grzewczej wodnej.</li>
	<li>Aby uniknąć urazów skóry, nie przycinaj miejsc operowanych. Zamiast tego nałóż krem do depilacji na obie kolana. Użyj depresora do języka, aby usunąć krem i włosy.</li>
	<li>Wyszoruj miejsce operowane peelingiem z diglukonianu chlorheksydyny i spłucz 70% etanolem 3 razy.</li>
	<li>Naciąć skórę sterylnym ostrzem skalpela #15 w kierunku proksymalnym do dystalnego, po stronie czaszkowo-przyśrodkowej kolana. Rozpocznij nacięcie około 1 cm proksymalnie do poziomu rzepki i przedłuż je około 5 mm dystalnie do guzka piszczelowego.</li>
	<li>Odbij skórę, aby odsłonić ścięgno rzepki, uwalniając leżącą pod spodem tkankę podskórną za pomocą ostrza skalpela #15.</li>
	<li>Za pomocą ostrza skalpela #15 wytnij środkową trzecią część każdego ścięgna rzepki (1 mm) od dystalnej części rzepki do guzowatości piszczelowej.
	<ol>
		<li>Dopasuj drut Kirschnera o średnicy 0,99 mm do ścięgna jako szablon, aby ujednolicić rozmiar wady w każdej kończynie (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Wykonaj 2 nacięcia o pełnej grubości z każdej strony drutu Kirschnera za pomocą ostrza skalpela #15, aby odizolować środkową część ścięgna (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Wytnij środkową część proksymalnie i dystalnie za pomocą cienkich nożyczek do tęczówki (<silna klasa="xfig">Ryc. 4).</li>
		<li>Przed zamknięciem powięzi kolana należy wprowadzić skrzep (zawiesinę komórek mieszanych i ACP) dla odpowiednich grup poddanych działaniu substancji, jak opisano w ppkt 5.5. Zamknij powięź wzorem krzyżowym i skórę wzorem śródskórnym za pomocą szwów poliglaktynowych 910 5-0 (<silna klasa = "xfig">Ryc. 5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz procedurę na przeciwległym kolanie. 
	UWAGA: Jedna wada jest losowo przypisywana do leczenia (komórki macierzyste kondycjonowane chitozanem lub hodowane na standardowych płytkach). Wada kontralateralna pozostaje pusta, aby służyć jako kontrola wewnętrzna.</li>
	<li>Po zabiegu chirurgicznym należy podawać 4 tabletki enrofloksacyny (2 mg/tabletkę, doustnie, raz na dobę) i tabletkę meloksykamu (2 mg/tabletkę, doustnie, raz na dobę) przez 7 dni. Dawki te zostały zalecone przez lekarza weterynarii zwierząt laboratoryjnych i zatwierdzone w protokole IACUC.</li>
</ol>
5. Dostawa MSCs w obrębie wady ścięgna rzepki
<ol>
	<li>Znieczulenie zdrowego szczura, który nie jest używany do tworzenia ubytków ścięgna rzepki, należy znieczulić 8% sewofluranem w 2 l/min 100 % tlenu dostarczanym przez maskę, aż do ustąpienia odruchu szczypania w komorze indukcyjnej.</li>
	<li>Pobrać 5 ml krwi przez nakłucie serca od znieczulonego szczura Sprague-Dawley (dorosły samiec w wieku 4-5 miesięcy, masa ciała 350-375 g) w strzykawce o pojemności 5 ml z igłą 20 G zawierającą 1 ml kwasu cytrynianu i dekstrozy (5: 1 v / v).</li>
	<li>Poddaj szczura eutanazji po punkcji serca i pobraniu krwi, poprzez dosercowe wstrzyknięcie pentobarbitalu (100 mg / kg), w tym samym znieczuleniu.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 350 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść supernatant i przechowywać podwielokrotności (po 120 μl każdy) w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Bezpośrednio przed implantacją in vivo rozmrozić powyższą podwielokrotność i zmieszać 20 μl z 0,5 x 106 MSCs (z 1,9 lub 3.1.2.1) odłączonymi od standardowych płytek za pomocą trypsyny/EDTA lub zebrać z płytek chitozanu przez płukanie (PBS/pożywką).</li>
	<li>Dodać 6 μl 10% chlorku wapnia (CaCl2) do pozostałych 100 μl rozmrożonego osocza w studzience z 96-dołkową płytką, aby aktywować osocze i wywołać tworzenie się skrzepu (aktywowane kondycjonowane osocze: ACP).</li>
	<li>Wymieszaj zawiesinę komórkową (20 μl) i ACP (100 μl), aby utworzyć skrzep (<silna klasa="xfig">Rysunek 6). Umieść skrzep w ubytku ścięgna rzepki utworzonego przed zamknięciem powięzi kolana (patrz krok 4.10.3).</li>
</ol>
6. Wynik funkcjonalny
<ol>
	<li>Monitoruj szczury dwa razy dziennie pod kątem oznak bólu, w oparciu o skalę grymasu szczura (RGS)37,38 i obrzęk w miejscach implantacji. 
	UWAGA: Opracowano system punktacji (0-6) do oceny funkcji ambulatoryjnych w oparciu o 3 czynności, w tym stanie kończyn tylnych z podpartymi kończynami przednimi (0-3), stanie kończyn tylnych bez pomocy (0-2) oraz zdolność do wspinania się po 17-centymetrowej ścianie klatki z tworzywa sztucznego (0-1) (Tabela 1).</li>
	<li>Oceń szczury pod kątem dwóch czynności stania na tylnych kończynach rano i wieczorem w każdym punkcie czasowym, aby obliczyć średni wynik.</li>
	<li>Oceń szczury pod kątem zdolności do skutecznego wspinania się po 17-centymetrowej plastikowej ścianie klatki, przy czym obie tylne kończyny sięgają szczytu.</li>
</ol>
7. Ogólny wygląd i histopatologia ścięgna rzepki
<ol>
	<li>Szczury należy poddać eutanazji po 7 dniach (w celu oceny stanu zapalnego) lub 28 dniach (w celu oceny gojenia się tkanek) przez dosercowe wstrzyknięcie pentobarbitalu (100 mg / kg) w znieczuleniu z 8% sewofluranem i 2 litrami 100% tlenu podawanego przez maskę.</li>
	<li>Zbierz jednostki guzowatości rzepki, ścięgna i kości piszczelowej za pomocą skalpela i nożyczek po eutanazji. Usuń tkanki miękkie i więzadła wokół kolana, z wyjątkiem ścięgna rzepki.</li>
	<li>Zbadaj każdą próbkę pod kątem ogólnego wyglądu i pogrubienia ścięgna (<silna klasa="xfig">Rysunek 7).</li>
	<li>Zorientuj próbkę, umieszczając węzeł chirurgiczny z 5,0 polidioksanonu na bliższej i bocznej stronie ścięgna. Każdą próbkę umieścić w 10% obojętnym roztworze formaliny z buforem i uzyskać przekroje poprzeczne (5 μm) od środkowej części każdego ścięgna.</li>
	<li>Wybarwić skrawki za pomocą hematoksyliny i eozyny oraz barwienia trichromowego Massona zgodnie ze standardowymi protokołami.</li>
	<li>Zbadaj sekcję, aby wykryć obecność krwiaka w obrębie wady, a także zmian patologicznych, takich jak stan zapalny.</li>
	<li>Oceń wynik histologiczny skrawków przy użyciu wcześniej opublikowanego systemu punktacji, opartego na stopniu kolagenu, stopniu angiogenezy i tworzeniu chrząstki (Tabela 2)39.</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Komórki koni zostały wybrane do tego projektu, ponieważ ostatecznie zamierzamy przetestować potencjalne podejścia w leczeniu naturalnych tendinopatii u koni. Rzeczywiście, urazy ścięgien u koni są atrakcyjne jako naturalne modele tendinopatii u człowieka ze względu na biologiczne podobieństwo między powierzchownym zginaczem palców konia a ścięgnem Achillesa u ludzi41. Markery powierzchniowe komórek CD44, CD90, CD105, CD34 i MHC II zostały wybrane do immunofenotypowania komórek, zgodnie z kryteriam...

Uraz ścięgna jest jedną z najczęstszych przyczyn znacznego bólu i zaniku mięśni u różnych gatunków1. W medycynie weterynaryjnej urazy ścięgien i więzadeł są szczególnie interesujące u koni, ponieważ 82% wszystkich urazów u koni wyścigowych dotyczy układu mięśniowo-szkieletowego, a 46% z nich dotyczy ścięgien i więzadeł2,3. Tworzenie się tkanki bliznowatej wpływa na właściwości biomechaniczne wyleczonych ścięgien i wyjaśnia ostrożne rokowanie dotyczące powrotu do użytku sportowego po urazach ścięgien zginaczy; Ponowna kontuzja występuje w ciągu 2 lat u 67% koni leczonych zachowawczo4. Medycyna regeneracyjna dostarcza nowatorskich alternatyw dla schorzenia, które stanowi wyzwanie dla tradycyjnych metod leczenia. Terapia autologicznymi komórkami macierzystymi przyniosła zachęcające wyniki5,6 ale jest ograniczona przez zachorowalność związaną z pobraniem tkanek, opóźnione podawanie z powodu przetwarzania/przeprogramowania komórek oraz wpływ stanu zdrowia pacjenta (np. wieku) na właściwości komórek macierzystych7,8. Ograniczenia te stanowią uzasadnienie dla badań nad allogenicznymi komórkami macierzystymi jako gotową alternatywą. Komórki pochodzące z przydatków płodowych są atrakcyjnymi kandydatami, ponieważ omijają obawy etyczne i ryzyko powstania potworniaka związane z embrionalnymi komórkami macierzystymi. Wśród przydatków płodu macierz pępowiny (UCM), zwana również galaretką Whartona, jest obfita i łatwa do zebrania.
Niezależnie od źródła komórek, poprawa macierzystej jest niezbędna do stworzenia banku komórek dla allogenicznej medycyny regeneracyjnej. Z funkcjonalnego punktu widzenia, stem można zdefiniować jako potencjał do samoodnawiania się i różnicowania wieloliniowego9. Dowody na pochodzenie opierają się na testach proliferacji i różnicowania, wraz z ekspresją markerów genowych Oct4, Sox2 i Nanog9. Jedna ze strategii mających na celu zwiększenie macierzystej łodygi opiera się na wykorzystaniu biomateriałów, które służą jako wypełniacze pustych przestrzeni i nośniki, zwiększając proliferację i różnicowanie UCM-MSC. Takie podejście eliminuje obawy związane z manipulacją czynnikami transkrypcyjnymi w celu przeprogramowania dojrzałych komórek w indukowane komórki pluripotencjalne. Wśród biomateriałów uważanych za potencjalne nośniki komórek macierzystych, chitozan jest atrakcyjny ze względu na swoją biokompatybilność i degradowalność10. Ten naturalny aminopolisacharyd powstaje w wyniku alkalicznej deacetylacji chityny, drugiego najobficiej występującego naturalnego polisacharydu, otrzymywanego głównie jako produkt uboczny skorupiaków10. Wcześniej badaliśmy interakcje między MSCs a rusztowaniami chitozanowymi i obserwowaliśmy powstawanie sferoidów11,12,13,14,15,16. Informowaliśmy również o wyższości chondrogenezy chondrogenezy w matrycach chitozanu12,13,14,15,16,17,18. Niedawno dwa niezależne badania opisały powstawanie sferoid przez MSCs pochodzące z tkanki tłuszczowej i tkanki łożyska, hodowane na folii chitozanowej 19,20. To tworzenie sferoid nie tylko zwiększyło zdolność macierzystą, ale także poprawiło retencję komórek macierzystych po implantacji in vivo20.
Rozpowszechnienie i chorobowość tendinopatii u różnych gatunków skłoniły do opracowania eksperymentalnych modeli do badania patofizjologii tendinopatii i testowania nowych terapii, takich jak zastrzyki z komórek macierzystych. U koni zapalenie ścięgien wywołane kolagenazą jest powszechnym modelem wykazującym skuteczność przy użyciu MSCs w naprawie ścięgien21. Znaczenie tego podejścia jest ograniczone, ponieważ zastrzyki powodują ostre zmiany zapalne, podczas gdy tendinopatie kliniczne zwykle wynikają z przewlekłego przeciążenia22,23. Ponadto, chemiczna indukcja choroby ścięgien indukuje reakcję gojenia i nie replikuje upośledzonego procesu gojenia obecnego w przypadkach klinicznych22,23. Wycięcie odcinka ścięgna zginacza powierzchownego palca zostało opisane jako chirurgiczny model zapalenia ścięgien u koni24. Niedawno zastosowano podejście minimalnie inwazyjne w celu ograniczenia urazowego uszkodzenia centralnego rdzenia powierzchownego ścięgna zginacza cyfrowego 25. Modele chirurgiczne nie symulują mechanizmu zmęczenia, który może prowadzić do naturalnej choroby ścięgien i zwykle nie są odtwarzalne w zakresie tworzonych uszkodzeń25. Niezależnie od modelu, zachorowalność i koszty związane z modelami chorób ścięgien koni są dodatkowymi ograniczeniami, które uzasadniają zainteresowanie modelami gryzoni jako pierwszym krokiem do oceny in vivo nowych terapii.
Jedną z głównych zalet modeli eksperymentalnych na gryzoniach jest koszt i możliwość kontrolowania zmienności międzyosobniczej. Gryzonie można standaryzować pod względem różnych czynników fizjologicznych ze względu na ich szybkie tempo wzrostu i stosunkowo krótką żywotność, co ogranicza źródła zmienności, a tym samym zmniejsza liczbę zwierząt potrzebnych do wykrycia różnic. Strategie wywoływania chorób ścięgien u gryzoni opierały się na indukcji chemicznej, ale także na chirurgicznym tworzeniu częściowych wad ścięgien21. Modele chirurgiczne mogą symulować naturalne tendinopatie lepiej niż modele chemiczne, ale mogą prowadzić do większej zachorowalności i katastrofalnej niewydolności uszkodzonego ścięgna. Pod tym względem szczury wydają się lepszymi kandydatami na te modele niż myszy, ponieważ ich rozmiar pozwala na tworzenie większych defektów, ułatwiając w ten sposób ocenę gojenia się tkanek. Szczury Sprague-Dawley zostały wykorzystane w eksperymentalnych badaniach tendinopatii w czterech głównych grupach ścięgien: stożek rotatorów, zginacz, ścięgno Achillesa i ścięgna rzepki26. Wśród nich szczególnie atrakcyjne są modele obejmujące ścięgno rzepki ze względu na większy rozmiar tego ścięgna i łatwość dostępu do niego27. Ścięgno rzepki przyczepia mięsień czworogłowy uda do guzowatości piszczelowej. W tym mechanizmie prostownika rzepka jest kością trzeszczkową, która kieruje działaniem mięśnia czworogłowego uda i wyznacza proksymalny zakres ścięgna rzepki. Obecność kotwic kostnych w bliższym i dalszym zasięgu ścięgna rzepki ułatwia badania biomechaniczne. Modele obejmujące ścięgno rzepki zazwyczaj opierają się na jednostronnych wadach chirurgicznych, z nienaruszonym ścięgnem przeciwległym służącym jako kontrola28,29. Najczęstszy model ubytku ścięgna rzepki polega na wycięciu środkowej części (1 mm szerokości) ścięgna rzepki od dystalnego wierzchołka rzepki do przyczepu guzowatości piszczelowej, podczas gdy przeciwległe ścięgno rzepki pozostawia się nienaruszone. Miary wyników obejmowały histologię, nieniszczące badania biomechaniczne lub testy biomechaniczne do awarii, obrazowanie ultrasonograficzne, obrazowanie fluorescencyjne ex vivo, obserwację ogólną i testy funkcjonalne28,30,31. Modele jednostronne nie pozwalają na porównanie proponowanego leczenia z zachowawczym leczeniem podobnego urazu u tego samego zwierzęcia. Podobnie, porównanie między kilkoma zabiegami wymaga oddzielnych zwierząt. Model dwustronny wyeliminowałby różnice między osobnikami i zmniejszyłby liczbę zwierząt wymaganych do badania32. Jednak obustronne urazy mogą zwiększać zachorowalność, a obustronna kulawizna może utrudniać ocenę leczenia. Kilka badań pokrótce donosi o zastosowaniu obustronnych wad ścięgna rzepki u szczurów, ale koncentrują się na efektach leczenia, a nie na leczeniu okołooperacyjnym i zachorowalności modelu33,34.
Długoterminowym celem tego badania jest opracowanie strategii poprawy zdolności macierzystej i przeżywalności in vivo UCM-MSC przeznaczonych do przeszczepu allogenicznego. Aby osiągnąć ten cel, niedawno informowaliśmy o poprawie macierzystej UCM-MSCs poprzez tworzenie sferoid na folii chitozanu i inkubację w środowisku niedotlenionym35. Te właściwości in vitro były związane z poprawą właściwości biomechanicznych ubytków ścięgna rzepki leczonych kondycjonowanymi UCM-MSC. Opierając się na tych wynikach, model obustronnego ubytku ścięgna rzepki u szczura wydaje się odpowiedni do testowania potencjalnych metod leczenia urazów ścięgien36. Celem opisywanego tutaj badania jest dostarczenie szczegółowych protokołów izolacji i charakterystyki UCM-MSC, przygotowania biologicznego systemu dostarczania komórek macierzystych, tworzenia i leczenia obustronnych ubytków ścięgna rzepki oraz rekonwalescencji pooperacyjnej i oceny gojenia się tkanek w obrębie ubytków.

<table><tbody><tr><td>PBS 10x</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td>Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IA</td><td>Worthington</td><td>LS004197</td><td>Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>DMEM o niskiej zawartości glukozy</td><td></td><td>SH30021. FS</td><td>Konsumpcyjny</td></tr><tr><td>hyklon</td><td>płodowej surowicy bydlęcej</td><td>SH30910.03</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna 100x</td><td>Hyclon</td><td>SV30010</td><td>Topliwy</td></tr><tr><td>Trypsyna 0,25%</td> <td>Hyklonu</td><td>SH30042.01</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td>Topliwy</td></tr><tr><td>niebieski hyklon</td><td>trypanowy</td><td>SV30084.01</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>Chitozan</td><td>Sigma</td><td>C3646</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>Hyklon</td><td>albuminy surowicy bydlęcej</td><td>SH30574.01</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>Rurka polistyrenowa z okrągłym dnem</td><td>Corning</td><td>149591A</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>Mysz anty-koń CD44 (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA1082F</td><td>Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Mysz anty-szczura CD90 (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA47FT</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>Mysz przeciw koniom MHC-II (FITC)AbD</td> <td>Serotec</td><td>MCA1085F</td><td>Konsumpcyjna</td></tr><tr><td>mysz IgG1 (FITC) - Kontrola izotypu</td><td>AbD serotec</td><td>MCA928F</td><td>Materiałowy</td></tr><tr><td>monoklonalny mysz [SN6] do CD105 (FITC)</td><td>abcam</td><td>ab11415</td><td>Zużywalna</td></tr><tr><td>mysz IgG1 (FITC) - Kontrola izotypu</td><td>abcam</td><td>ab91356</td><td>Konsumpcyjna</td></tr><tr><td>mysz anty-ludzka CD34 (FITC)</td><td>BD</td><td>BDB560942</td><td>Eksploatacyjna</td></tr><tr><td>mysz IdG1 kappa (FITC)</td><td>BD</td><td>BDB555748</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD</td><td>BDB559925</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>BD Cytometr przepływowy Accuri C6</td><td>BD</td><td></td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Vacutainer 5 mL</td><td>Med Vet International</td><td>RED5.0</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>Kwas-cytrynian-dekstroza</td><td>Sigma</td><td>C3821</td><td>Materiał</td></tr> eksploatacyjny <tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>Sewofluran</td><td>JD Medical</td><td>60307-320-25</td> Materiały <td>eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Szczury</td><td>Charles</td><td>River Kod szczepu: 400</td><td>Zwierzę doświadczalne</td></tr><tr><td>Zestaw chirurgiczny dla szczurów</td><td>Aparat Harvard</td><td>728942</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne #15</td><td>MEDLINE</td><td>MDS15115</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>Baptril firmy Rat MD (2 mg / tabletkę), Rimadyl (2 mg / tabletka)</td> <td>Bio Serv</td><td>F06801</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>Polyglactin 910, 5-0</td><td>Ethicon</td><td>J436G</td><td>Materiał eksploatacyjny</td></tr><tr><td>Eosin alchol shandon</td><td>Thermo naukowy</td><td>6766007</td><td>Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>Thermo naukowe</td><td>143907</td><td>Materiały eksploatacyjne</td></tr></tbody></table>

ocena terapii komórkami macierzystymi w obustronnym modelu uszkodzenia ścięgna rzepki u szczurów

Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

Medycyna regeneracyjna dostarcza nowatorskich alternatyw dla schorzeń, które stanowią wyzwanie dla tradycyjnych metod leczenia. Rozpowszechnienie i zachorowalność na tendinopatię u różnych gatunków, w połączeniu z ograniczonymi właściwościami leczniczymi tej tkanki, skłoniły do poszukiwania terapii komórkowych i przyspieszyły rozwój modeli eksperymentalnych w celu zbadania ich skuteczności. Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z macierzy pępowinowej (UCM-MSC) są atrakcyjnymi kandydatami, ponieważ są liczne, łatwe do pobrania, omijają obawy etyczne i ryzyko powstania potworniaka, a jednocześnie bardziej przypominają prymitywne embrionalne komórki macierzyste niż dorosłe MSC pochodzące z tkanki. Duże zainteresowanie skupiło się na chitozanie jako strategii poprawy właściwości MSCs poprzez tworzenie sferoidów. W artykule szczegółowo opisano techniki izolowania UCM-MSC, przygotowania sferoid na błonie chitozanu oraz analizy wpływu tworzenia się sferoidów na ekspresję markerów powierzchniowych. W związku z tym opisano stworzenie obustronnego modelu uszkodzenia ścięgna rzepki u szczurów w celu implantacji in vivo sferoidów UCM-MSC utworzonych na błonie chitozanu. W badaniu nie zaobserwowano żadnych powikłań związanych z zachorowalnością, skutkami narastania stresu lub zakażeniem tkanek. Całkowity wynik funkcjonalny operowanych szczurów po 7 dniach był niższy niż u normalnych szczurów, ale powrócił do normy w ciągu 28 dni po operacji. Wyniki histologiczne gojenia tkanek potwierdziły obecność skrzepu w leczonych defektach ocenianych po 7 dniach, brak reakcji ciała obcego i postępujące gojenie po 28 dniach. Ten obustronny model ubytku ścięgna rzepki kontroluje zmienność międzyosobniczą poprzez stworzenie wewnętrznej kontroli u każdego szczura, był związany z akceptowalną chorobowością i pozwolił na wykrycie różnic między nieleczonymi ścięgnami a leczeniem.

W niniejszym badaniu wyniki przedstawiono jako średnia ± SD (odchylenie standardowe). Komórki wyizolowano z pępowin 6 klaczy, a odsetek wyizolowanych linii komórkowych wykazujących każdy marker powierzchniowy w warunkach standardowych lub kondycjonowania chitozanem porównano za pomocą testu Friedmana, jako nieparametrycznej analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami. Do stworzenia modelu defektu ścięgna wykorzystano 8 szczurów do oceny 7 dni po operacji oraz 12 szczurów do oceny po 28 dni...

Ten artykuł opisuje przygotowanie i ocenę sferoidów mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z macierzy pępowiny z obustronnym modelem ubytku ścięgna rzepki u szczura. Model ten był związany z akceptowalną chorobowością i stwierdzono, że wykrywa różnice między nieleczonymi i leczonymi ścięgnami oraz między dwoma testowanymi terapiami.

Ocena terapii komórkami macierzystymi w obustronnym modelu uszkodzenia ścięgna rzepki u szczurów

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

Ogólnym celem tego obustronnego modelu szczurzego jest optymalizacja wykorzystania zwierząt i ocena kandydatów do leczenia wad ścięgien. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na wszelkie kluczowe pytania w dziedzinie ortopedii. Takich jak ocena terapii komórkowej na tendinopatię.Główną zaletą tego modelu jest to, że kontroluje on zmienność międzyosobniczą, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt potrzebnych do wykrycia różnic między zabiegami. Wizualna demonstracja modelu ma kluczowe znaczenie, ponieważ tworzenie obustronnych standaryzowanych wad ścięgna rzepki u szczurów jest trudne do nauczenia. Model wymaga dobrej znajomości anatomii lokalnej, silnych podstawowych umiejętności chirurgicznych i precyzji podczas pracy na małych strukturach.Na początek umyj pobraną pępowinę konia dwukrotnie w 50-mililitrowej probówce przy użyciu PBS o temperaturze pokojowej zawierającej antybiotyki. Następnie przenieś tkankę na 150-milimetrową płytkę i pokrój ją na fragmenty o długości dwóch cali. Następnie przenieś fragmenty do 50-mililitrowej probówki i przemyj je PBS zawierającym antybiotyki w celu usunięcia krwi.Zrób to dwa lub trzy razy w temperaturze pokojowej. Następnie przetnij rozdrobnione c

evaluation-stem-cell-therapies-bilateral-patellar-tendon-injury-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano eksperymentalną technikę leczenia ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika. Implantacja allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w ubytki chrzęstno-kostne stanowi obiecujący kierunek rozwoju w dziedzinie inżynierii tkankowej. Przygotowanie skrzepów fibrynowo-komórkowych in vitro oferuje zestandaryzowaną metodę implantacji.

Leczenie ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika poprzez implantację allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w skrzepach fibrynowych

Ten protokół opisuje znakowanie radioaktywne mezenchymalnych komórek macierzystych koni i ich implantację do urazów ścięgien u konia w celu określenia przeżycia komórek i dystrybucji tkanek za pomocą scyntygrafii gamma.

In vivo (in vivo) Obrazowanie i śledzenie mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego znakowanych technetem-99m w tendinopatii koni

Modele zwierzęce są ważnymi narzędziami do oceny przeszczepów wytwarzanych metodą inżynierii tkankowej. W pracy przedstawiono protokół przygotowania elektroprzędzonego biodegradowalnego przeszczepu polimerowego do zastosowania w inżynierii tkankowej więzadła krzyżowego przedniego, a także protokół chirurgiczny implantacji w modelu szczurzym.

Atymiczny model szczura do oceny zmodyfikowanych przeszczepów więzadła krzyżowego przedniego

Opisujemy protokół in vivo do pomiaru zgięcia grzbietowego stopy po stymulacji nerwu strzałkowego i skurczu przedniego przedziału podudniowego kończyny tylnej szczura. Takie pomiary są niezastąpionym narzędziem translacyjnym do oceny patologii mięśni szkieletowych i podejść inżynierii tkankowej do naprawy i regeneracji mięśni.

Zastosowania testów funkcjonalnych in vivo kości piszczelowej szczura przedniego do oceny naprawy mięśni szkieletowych za pomocą inżynierii tkankowej

Ten protokół opisuje proces oceny gojenia ścięgien u szczurów, którym wstrzyknięto allogeniczne osocze bogatopłytkowe (PRP) lub roztwór soli fizjologicznej po usunięciu części ścięgna Achillesa. Postęp gojenia ścięgien jest oceniany w kilku punktach czasowych za pomocą różnych rodzajów analiz.

Wpływ allogenicznego osocza bogatopłytkowego (PRP) na proces gojenia przeciętych ścięgien Achillesa szczurów: opis metodologiczny

Trójwymiarowy jednoosiowy system bioreaktora do stymulacji mechanicznej jest idealnym bioreaktorem do specyficznego dla tenogenicznego różnicowania komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien i tworzenia neościęgien.

Zastosowanie trójwymiarowego, jednoosiowego bioreaktora do stymulacji mechanicznej w celu indukowania różnicowania tenogennego komórek macierzystych pochodzących ze ścięgien

Ten protokół ustanawia model pełnogrubych wad chrząstki (FTCD) poprzez wiercenie otworów w rowku bloczkowym kości udowej szczurów i mierzenie późniejszego zachowania bólowego i zmian histopatologicznych.

Opracowanie i ocena szczurzego modelu ubytków chrząstki pełnej grubości

To badanie szczegółowo opisuje procedury ustalania przewlekłego uszkodzenia stożka rotatorów u królika (RC). W szczególności uraz powstaje w jednostce mięśniowo-ścięgnistej / mięśniowo-ścięgnistej podłopatkowej (SSC), aby naśladować ludzką anatomię i patofizjologię RC, w tym ciężkie zwyrodnienie tłuszczowe mięśni (FD). Protokół ten może być stosowany do badania urazów RC i oceny terapii regeneracyjnych.

Opracowanie modelu przewlekłego uszkodzenia stożka rotatorów u królika do badania zwłóknienia i zwyrodnienia mięśniowego

Tutaj prezentujemy system modeli assembloid, który naśladuje przesłuch komórkowy ścięgien między tkanką rdzenia ścięgna nośnego a zewnętrznym przedziałem zawierającym populacje komórek aktywowane przez chorobę i uraz. Jako ważny przypadek użycia pokazujemy, w jaki sposób system może zostać wykorzystany do badania istotnej z chorobą aktywacji zewnętrznych komórek śródbłonka.

Inżynieria asembloidów ścięgien do badania przesłuchów komórkowych w chorobach i naprawach

Myszowy model transplantacji in utero jest wszechstronnym narzędziem, które może być wykorzystywane do badania potencjalnych zastosowań klinicznych transplantacji komórek macierzystych oraz terapii genowej u płodu. W niniejszym protokole przedstawiamy ogólne podejście do wykonania tej...

Model mysi transplantacji in utero

Poznaj metodę oceny terapii komórkami macierzystymi w obustronnym modelu uszkodzenia ścięgna rzepki u szczurów. Model minimalizuje zmienność międzyosobniczą i pozwala na etyczne zmniejszenie liczby zwierząt.

Ocena terapii komórkami macierzystymi w obustronnym modelu uszkodzenia ścięgna rzepki u szczurów

Przeglądaj więcej filmów