Name: Nowatorski test gojenia ran in vitro do oceny migracji komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj nowatorską metodę oceny migracji komórek nabłonka oskrzelowego przy użyciu wstawek silikonowych i zautomatyzowanej analizy obrazu. Technika ta dostarcza szybkich, powtarzalnych danych ilościowych o gojeniu ran in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez fundusze Uniwersytetu Sapienza w Rzymie i Włoskiej Fundacji Badań nad Mukowiscydozą (Projekt FFC#11/2014 przyjęty przez delegacje FFC ze Sieny, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny i Pawii). Część tych prac była również wspierana przez FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020. 
Jesteśmy wdzięczni dr Loretcie Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genua, Włochy) za dostarczenie komórek nabłonka oskrzeli.

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Wysiać 2,5x106 komórek w 10 mL Minimum Essential Medium (MEM) uzupełnionego o 2 mM glutaminy (MEMg), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), antybiotyki (0,1 mg/mL penicyliny i streptomycyny) oraz puromycynę (0,5 µg/mL do selekcji i utrzymania linii komórkowej) do kolby T75. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 dni. Przed rozpoczęciem eksperymentu sprawdzić konfluencję komórek pod mikroskopem odwróconym. 
	UWAGA: Komórki użyte w eksperymencie to unieśmiertelnione ludzkie komórki nabłonka oskrzeli transdukowane wektorem lentiwirusowym nadającym oporność na puromycynę. Stabilnie ekspresjonują one funkcjonalny CFTR14,15.</li>
	<li>Gdy konfluencja komórek osiągnie 90-100%, odessać medium z kolby i wylać je do butelki na odpady w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Przemyć komórki 6 mL roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym bez jonów wapnia i magnezu (CMF-PBS). Delikatnie potrząsnąć kolbą ręcznie i odlać CMF-PBS. 
	UWAGA: Należy uważać, aby nie dotknąć monowarstwy komórek pipetą.</li>
	<li>Dodać 10 mL CMF-PBS i inkubować kolbę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 10 min.</li>
	<li>Odessać CMF-PBS i go wylać. Następnie dodać do kolby 2 mL trypsyny/EDTA.</li>
	<li>Delikatnie potrząsnąć kolbą, aby roztwór całkowicie pokrył komórki, i inkubować kolbę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 10 min, aż komórki zostaną widocznie oderwane pod mikroskopem. 
	UWAGA: Po czasie inkubacji komórki powinny stać się okrągłe i nie być przytwierdzone do plastikowej powierzchni. Jeśli komórki nie są dobrze oderwane, może być konieczne ręczne wytrząśnięcie.</li>
	<li>Dodać 10 mL MEMg z 10% FBS w celu inaktywacji trypsyny i zebrać komórki, przemywając dno kolby. Przenieść zawiesinę do stożkowatej probówki 50 mL.</li>
	<li>Wirować probówkę przez 5 min przy 80 x g.</li>
	<li>Odessać nadsącz i resuspendować komórki w 6 mL MEMg z 10% FBS. Pipetować wielokrotnie, aby rozbić wszelkie aglomeraty.</li>
	<li>Pobrać 10 µL zawiesiny komórkowej mikropipetą i wstrzyknąć tę objętość pod szkiełko nakrywkowe uprzednio umieszczone nad komorą Burkera lub Neubauera.</li>
	<li>Policzyć liczbę komórek.</li>
</ol>
2. Wysiew komórek do insertów hodowlanych
<ol>
	<li>Do każdego dołka płytki 12-dołkowej przenieś wkład kulturkowy za pomocą sterylnej pęsety (Rysunek 1). Użyj pęsety, aby docisnąć krawędzie wkładów w celu ich utrwalenia na powierzchni płytki. 
	UWAGA: Wkłady posiadają klejącą stronę dolną, która umożliwia adhezję.</li>
</ol>
<img alt="Urządzenie mikrofluidyczne w płytce 12-dołkowej, schemat eksperymentu z hodowlą komórek, powiększony szczegół kanału." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56825/56825fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie silikonowych insertów hodowlanych, prawidłowo umieszczonych w dołkach płytki 12-dołkowej. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56825/56825fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="2">
	<li>Odpowiednio rozcieńczyć zawiesinę komórek w MEMg z dodatkiem 10% FBS. Napełnić każdą komorę wkładki 70 µL zawiesiny komórek (około 3,5x104 komórek/komorę). 
	UWAGA: Gęstość komórek nanoszonych do każdej komory zależy od rodzaju komórek. Zaleca się zastosowanie takiej gęstości komórek, która doprowadzi do pełnej konfluencji w ciągu 24 h.</li>
	<li>Pod mikroskopem sprawdzić, czy komórki nie wyciekają z komór wkładki, a następnie inkubować płytkę 12-dołkową przez 24 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
</ol>
3. Test pseudo-gojenia ran
<ol>
	<li>Po inkubacji należy zwizualizować komórki pod mikroskopem odwróconym, aby zweryfikować, czy utworzyły się konfluentne monowarstwy komórek.</li>
	<li>Resuspendować związki testowe (np. AMP) w 1 mL MEMg. 
	UWAGA: Przygotować świeże rozcieńczenia AMP z roztworu zapasowego przechowywanego w -20 °C.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć wkłady za pomocą sterylnej pęsety. Należy uważać, aby nie przerwać monowarstw komórek. Przenieść wkłady na papier chłonny. 
	UWAGA: Aby ponownie wykorzystać te same wkłady, należy je wysterylizować w 70% etanolu przez co najmniej 3 h. Zaleca się ich późniejszą utylizację.</li>
	<li>Aby usunąć nieprzylegające komórki, dodać 1 mL MEMg na dołek za pomocą mikropipety. Zamknąć płytkę i delikatnie nią potrząsać. 
	UWAGA: Nie dodawać pożywki bezpośrednio na monowarstwy komórek, aby uniknąć ich uszkodzenia.</li>
	<li>Odssać pożywkę i zastąpić ją 1 mL MEMg na dołek. Zamknąć płytkę i zwizualizować wolne od komórek przerwy (powstałe w wyniku usunięcia wkładów) pod mikroskopem odwróconym przy powiększeniu 4X, wyposażonym w kamerę wideo. Pozyskać obrazy w czasie zero (T0) i zapisać je w formacie .jpg.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z dołków, przemyć je 1 mL PBS, a następnie odrzucić roztwór.</li>
	<li>Dodać do dołków związki testowe (przygotowane w punkcie 3.2). W przypadku nieleczonych próbek kontrolnych dodać 1 mL MEMg. Inkubować płytkę w 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>Po 15, 20 i 24 h traktowania obserwować migrację komórek pod mikroskopem przy powiększeniu 4X i pozyskać obrazy. 
	UWAGA: Na tym etapie należy starać się rejestrować obrazy w tych samych obszarach, co dla T0. Wybór odstępów czasowych, w których rejestrowane są obrazy, zależy od prędkości migracji komórek.</li>
	<li>Aby zbadać wpływ niektórych selektywnych inhibitorów, tzn. AG1478, na migrację komórek, należy odessać pożywkę z każdego przedziału wkładu przed ich usunięciem.
	<ol>
		<li>Przemyć każdy przedział świeżym MEMg i napełnić go 70 µL MEMg uzupełnionego o AG1478.</li>
		<li>Po 30 min inkubacji w 37 °C i 5% CO2 postępować zgodnie z opisem od punktu 3.3. 
		UWAGA: Podczas etapu płukania i wstępnego traktowania monowarstw komórek specyficznymi inhibitorami należy uważać, aby nie usunąć wkładów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu wybierz obrazy najbardziej reprezentatywnych próbek z poszczególnych grup eksperymentalnych i utwórz plik zip zawierający pojedyncze obrazy dla punktów czasowych T0, T15, T20 i T24 h. 
	UWAGA: Pojedyncze obrazy są pobierane w wybranych odstępach czasu dla wszystkich próbek. Każdy eksperyment należy przeprowadzić w trzech powtórzeniach, a cały proces powtórzyć co najmniej trzy razy. Na koniec, dla wszystkich grup eksperymentalnych, analizuje się minimum 3 obrazy („a”, „b”, „c”, itp., pochodzące z każdego niezależnego eksperymentu) dla każdego punktu czasowego.</li>
	<li>Prześlij plik zip do oprogramowania do analizy obrazu, które automatycznie prześle pocztą elektroniczną plik z podsumowaniem w arkuszu kalkulacyjnym, zawierający dane eksperymentalne dotyczące obszarów pokrytych komórkami oraz obszarów zadrapania (wyrażone w procentach) w wybranych punktach czasowych. 
	UWAGA: Rozpoznawanie krawędzi czoła migracji oraz obszaru luki opiera się w dużej mierze na metodzie detekcji krawędzi (mającej na celu identyfikację punktów, w których jasność obrazu gwałtownie się zmienia).</li>
	<li>Zapisz i zgromadź dane. Znormalizuj wszystkie dane względem wartości średniej w czasie zero. Oblicz średnią wartość znormalizowanych danych dla wszystkich powtórzeń w każdym punkcie czasowym oraz względny błąd standardowy (SEM). Wykorzystując dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA), przeprowadź analizę statystyczną za pomocą odpowiedniego oprogramowania statystycznego. Różnice między grupami traktowanymi peptydami a grupami kontrolnymi w różnych odstępach czasu uznaje się za istotne statystycznie dla p&lt;0.05.</li>
	<li>Przedstaw uzyskane dane na wykresie w formie histogramu, który obrazuje procent obszaru pokrytego komórkami dla wszystkich grup próbek w funkcji wybranych odstępów czasu.</li>
</ol>

<ol><li>Enyedi, B., Niethammer, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25813429">Mechanisms of epithelial wound detection.</a> Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).</li>
<li>Kujath, P., Kujath, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complicated+skin%2C+skin+structure+and+soft+tissue+infections+-+are+we+threatened+by+multi-resistant+pathogens%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens?</a> Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).</li>
<li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).</li>
<li>Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lung+infections+in+cystic+fibrosis+patients%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Infect+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update.</a> Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).</li>
<li>Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+and+wound+healing%3A+biological+and+therapeutic+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations.</a> Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).</li>
<li>Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+role+of+stem+cells+in+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing.</a> Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).</li>
<li>Hu, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+and+regenerative+repair+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering and regenerative repair in wound healing.</a> Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).</li>
<li>Ramot, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+PPARgamma-mediated+signalling+in+skin+biology+and+pathology%3A+new+targets+and+opportunities+for+clinical+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology.</a> Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).</li>
<li>Lai, Y., Gallo, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPed+up+immunity%3A+how+antimicrobial+peptides+have+multiple+roles+in+immune+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense.</a> Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).</li>
<li>Zasloff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+of+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides of multicellular organisms.</a> Nature. 415, 389-395 (2002).</li>
<li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).</li>
<li>Di Grazia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+frog+skin-derived+antimicrobial+peptide+esculentin-1a%281-21%29NH2+promotes+the+migration+of+human+HaCaT+keratinocytes+in+an+EGF+receptor-dependent+manner%3A+a+novel+promoter+of+human+skin+wound+healing%3F%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing?</a> PLoS One. 10, e0128663(2015).</li>
<li>Di Grazia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-Amino+acids+incorporation+in+the+frog+skin-derived+peptide+esculentin-1a%281-21%29NH2+is+beneficial+for+its+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions.</a> Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).</li>
<li>Cappiello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esculentin-1a-derived+peptides+promote+clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+internalized+in+bronchial+cells+of+cystic+fibrosis+patients+and+lung+cell+migration%3A+biochemical+properties+and+a+plausible+mode+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).</li>
<li>Bebok, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+cAMP+agonists+to+activate+rescued+deltaF508+CFTR+in+CFBE41o-+airway+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers.</a> J Physiol. 569, 601-615 (2005).</li>
<li>Trinh, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+defective+cystic+fibrosis+airway+epithelial+wound+repair+after+CFTR+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue.</a> Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).</li>
<li>Gan, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+tyrosine+kinase+inhibitor+AG1478+increases+the+formation+of+inactive+untethered+EGFR+dimers.+Implications+for+combination+therapy+with+monoclonal+antibody+806%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806.</a> J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).</li>
<li>Tokumaru, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+keratinocyte+migration+via+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+by+the+antimicrobial+peptide+LL-37%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37.</a> J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).</li>
<li>Tjabringa, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+peptide+LL-37+activates+innate+immunity+at+the+airway+epithelial+surface+by+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor.</a> J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).</li>
<li>Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporins+A+and+B+stimulate+migration+of+HaCaT+keratinocytes+and+kill+intracellular+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Migracja komórek jest niezbędnym procesem w wielu zdarzeniach fizjologicznych i patologicznych, w tym w gojeniu się ran, rozwoju embrionalnym i przerzutach raka. Podstawowa procedura badania migracji komórek in vitro obejmuje: (i) stworzenie monowarstwy komórki, (ii) wytworzenie pseudo-rany w zlewającej się warstwie komórek, (iii) przechwytywanie obrazów w różnych odstępach czasu, aż do osiągnięcia zamknięcia rany, oraz (iv) analizę sekwencji obrazu w celu ilościowego określenia prędkości migracji wybranych komó...

Powszechnie wiadomo, że gojenie się ran u zwierząt jest podstawowym procesem przywracania integralności i normalnej funkcji warstw tkanek po urazie1. Pomimo tego, że powierzchnie nabłonkowe narażone na działanie środowiska zewnętrznego (np. skóra, drogi oddechowe i pokarmowe) tworzą barierę ochronną przed urazami fizycznymi i chemicznymi, łatwo może dojść do powstania ran, zwłaszcza po zabiegach chirurgicznych lub infekcjach bakteryjnych2. Na przykład kolonizacja tkanki płucnej przez oportunistyczny patogen bakteryjny Pseudomonas aeruginosa, zwłaszcza u osób cierpiących na mukowiscydozę (CF), prowadzi do uszkodzenia nabłonka dróg oddechowych, a w konsekwencji do niewydolności oddechowej3,4. Gojenie się ran to złożony mechanizm naprawy gospodarza mający na celu przywrócenie normalnej architektury uszkodzonej tkanki5. Charakteryzuje się początkowym stanem zapalnym, po którym następuje okres regeneracji obejmujący nabłonkowanie, angiogenezę i przebudowę tkanek z produkcją kolagenu i różnicowaniem komórek6,7,8. Aby zapewnić integralność nabłonka i kontrolować proliferację drobnoustrojów, wszystkie żywe organizmy wytwarzają cząsteczki obronne, w tym peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP)9,10. Proces gojenia się ran jest bardzo trudny do symulacji in vitro ze względu na brak resztek komórkowych i złożone interakcje między różnymi typami komórek. Jednak zdolność peptydu do przyspieszania zamykania pseudorany poprzez stymulowanie migracji komórek nabłonka in vitro wskazuje na jego zdolność do gojenia uszkodzonego nabłonka. Rzeczywiście, migracja komórek jest zdarzeniem ograniczającym szybkość gojenia się ran, a badanie czynników, które mogą wpływać na migrację komórek, pomoże ukierunkować terapie w celu poprawy gojenia się ran.
Tutaj dostępny jest wysoce powtarzalny test eksperymentalny oparty na specjalnych wkładkach do hodowli silikonowych do oceny migracji komórek in vitro. Polega ona na utworzeniu szczeliny o wielkości 500 μm (pseudo-nawiniętej) na zlewającej się monowarstwie komórek. Komórki na skraju sztucznego "zranionego" pola zaczną migrować do obszaru wolnego od komórek, tworząc nowe kontakty komórka-komórka. Wkładka hodowlana stanowi nowe narzędzie do eksperymentów z szybkim gojeniem się ran. Zapewnione są dwa zbiorniki oddzielone ścianką o grubości 500 μm, które można odpowiednio umieścić w 3-centymetrowej płytce talerzowej lub w studzience płytki 12-dołkowej. Wypełnienie każdej komory wkładki zawiesiną komórek pozwala komórkom rosnąć w każdym wyznaczonym obszarze aż do zbiegu, podczas gdy usunięcie wkładki spowoduje powstanie czystej, wolnej od komórek szczeliny około 500 μm (tej samej szerokości co ściana separacyjna). Odpowiednią pożywkę do hodowli komórkowych uzupełnioną badanym związkiem można następnie dodać do płytki/dołka naczynia. Następnie zamknięcie szczeliny można uwidocznić w różnych odstępach czasu pod mikroskopem odwróconym, najlepiej wyposażonym w kamerę wideo do akwizycji obrazu. Wreszcie, pomiar zmian w obszarze pokrytym komórką za pomocą internetowego automatycznego programu do analizy obrazu pozwoli na ilościowe określenie szybkości zamykania się ran i migracji komórek. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta jest krokiem naprzód w stosunku do klasycznego testu, w którym rysa jest wykonywana ręcznie poprzez nacinanie monowarstw zbiegających się komórek za pomocą sterylnej igły lub końcówki pipety11. Rzeczywiście, ostatnia procedura może zniszczyć plastikowe dno talerza/studzienki naczynia i powłokę powierzchniową, tworząc zmarszczki. Ponadto obszar "zraniony" nie ma dobrze zdefiniowanej szerokości na całej długości szczeliny, ponieważ zależy to w dużym stopniu od nacisku wywieranego przez badaczy na igłę/końcówkę. Co więcej, przemieszczone komórki mogą tworzyć skupiska żywych i martwych komórek na krawędziach zadrapania; Co więcej, rozprzestrzenianie się żywych komórek w "zranionym" obszarze może zakłócać prędkość migracji komórek, generując niepowtarzalne wyniki<klasa SUP="xref">12.
Ponadto, dzięki platformie do analizy obrazów scratch, użytkownicy mogą szybko otrzymać (w ciągu kilku minut) dane ilościowe na temat migracji wybranych komórek bez konieczności nabywania dodatkowego oprogramowania. Platforma ta jest w stanie analizować obrazy z mikroskopii kontrastu fazowego o małym (~5X), średnim (~10X) i dużym (~20X) powiększeniu. Po przesłaniu pliku zip z obrazami (w formacie *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff) analiza jest automatycznie przeprowadzana w celu wygenerowania pliku podsumowującego, który pokazuje procent zarówno obszarów pokrytych komórkami, jak i obszarów zarysowań, a także szybkość migracji komórek, w różnych odstępach czasu.
W tej pracy, przy użyciu pochodnej AMP ze skóry żaby, tj. Esc(1-21) i jego diastereomeru Esc(1-21)-1c13, oraz linii komórkowej oskrzeli wyrażającej funkcjonalny transbłonowy regulator przewodnictwa CF (CFTR)14,15, podano przykład migracji komórek wywołanej peptydem w porównaniu z próbkami nietraktowanymi (kontrolnymi). Należy pamiętać, że nabłonek dróg oddechowych i CFTR odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu funkcji płuc i gojeniu ran16. Ponadto, za pomocą selektywnych inhibitorów (np. AG1478)17 receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), przedstawiono dowody na to, że migracja komórek oskrzeli indukowana przez wyżej wymienione peptydy wiąże się z aktywacją EGFR12,18.
Podsumowując, celem tej procedury jest pokazanie, w jaki sposób użycie takich silikonowych wkładek do hodowli stanowi szybki i łatwo dostępny test do dokładnego określenia migracji przylegających komórek (np. komórek nabłonka oskrzeli) i mechanizmów molekularnych kontrolujących takie zdarzenia.

<table><tbody><tr><td>Minimalna ilość niezbędnego podłoża (MEM)&nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB2071L</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180DH&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina i streptomycyna</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA 1X w PBS</td><td>Euroclone</td><td>ECB3052D</td><td>Przed użyciem ogrzać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>DPBS bez wapnia i magnezu (CMF-PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DPBS z wapniem i magnezem (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Culture-Insert 2 dołki</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>80209</td><td></td></tr><tr><td>Analiza obrazu Wimasis</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>30002</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie PRISM&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>w wersji 6.0</td><td></td></tr></tbody></table>

nowatorski test gojenia ran in vitro do oceny migracji komórek

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Celem tej pracy jest pokazanie nowej metody oceny zdolności niektórych cząsteczek immunomodulujących, takich jak peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP), do stymulowania migracji komórek. Co ważne, migracja komórek jest zdarzeniem ograniczającym szybkość procesu gojenia się ran w celu przywrócenia integralności i normalnego funkcjonowania warstw tkanek po urazie. Przewagą tej metody nad klasycznym testem, który opiera się na ręcznym zarysowaniu monowarstwy komórki, jest zastosowanie specjalnych silikonowych wkładek hodowlanych zapewniających dwie komory w celu wytworzenia bezkomórkowego pseudo-nawiniętego pola o dobrze zdefiniowanej szerokości (500 μm). Ponadto, dzięki zautomatyzowanej platformie analizy obrazu, możliwe jest szybkie uzyskanie danych ilościowych na temat szybkości zamykania się ran i migracji komórek. Dokładniej rzecz ujmując, pokazany zostanie wpływ dwóch AMP ze skóry żaby na migrację komórek nabłonka oskrzeli. Co więcej, wstępne potraktowanie tych komórek specyficznymi inhibitorami dostarczy informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw takich zdarzeń.

Niniejszy protokół został wykorzystany do określenia wpływu Esc(1-21) oraz Esc(1-21)-1c na gojenie ran w kontekście aktywności migracyjnej komórek nabłonka oskrzeli wykazujących ekspresję funkcjonalnego CFTR. W tym badaniu w dołkach płytki 12-dołkowej umieszczono wkłady hodowlane, a do każdej komory zasiano 35 000 komórek w pożywce MEMg uzupełnionej o 10% FBS. Komórki osiągnęły pełną konfluencję w ciągu 24 h. Następnie utworzono przerwę o szerokości 500 μm, a każdy dołek wypełniono pożywk...

Tutaj prezentujemy protokół do oceny wpływu peptydów na migrację komórek nabłonka oskrzeli. Metoda ta pozwala na szybkie i wysoce powtarzalne uzyskanie danych ilościowych na temat szybkości migracji komórek i zamykania ran.

Nowatorski test gojenia ran in vitro do oceny migracji komórek

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Celem tej procedury jest pokazanie, w jaki sposób można ocenić zdolność niektórych cząsteczek immunomodulujących, takich jak antymikropeptydy, do stymulowania migracji komórek, co jest zdarzeniem ograniczającym szybkość procesu gojenia się ran. Ogólnie rzecz biorąc, podstawowa procedura badania migracji komórek in vitro obejmuje tworzenie monowarstwy komórek, wytwarzanie pseudoran, przechwytywanie obrazów w różnych odstępach czasu, aż do osiągnięcia zamknięcia rany oraz analizę sekwencji obrazu w celu ilościowego określenia migracji komórek. Teraz przewaga tej metody nad klasycznym testem, który opiera się na ręcznie wykonanym zadrapaniu, wynika z zastosowania specjalnych silikonowych wkładek hodowlanych do wytworzenia pola pseudo-nawiniętego, które jest całkowicie wolne od komórek i ma bardzo dobrze zdefiniowaną szerokość, 500 mikrometrów.Ponadto, dzięki internetowemu, zautomatyzowanemu programowi do analizy obrazu, możliwe jest szybkie otrzymanie w ciągu kilku minut danych ilościowych dotyczących szybkości zamykania ran i migracji komórek. Ogólnie rzecz biorąc, jest to niezawodna technika eksperymentalna, którą można zastosować do każdego rodzaju przylegających komórek o bardzo wysokiej odtwarzalności danych. W tym miejscu przedstawiono na przykład wpływ antymikropeptydu ze skóry żaby na migrację komórek nabłonka oskrzeli oraz sposób, w jaki wstępne traktowanie tych komórek specyficznymi inhibitorami może dostarczyć informacji na temat mechanizmu molekularnego leżącego u podstaw takich zdarzeń.Dokładniej rzecz ujmując, pokazane, w jaki sposób indukowana peptydem migracja komórek polega na aktywacji receptora naskórkowego czynnika wzrostu. Aby rozpocząć eksperyment, należy wyjąć kolbę zawierającą komórki z inkubatora do hodowli komórkowych i sprawdzić obwód na odwróconym mikroskopie wyposażonym w automatyczny system akwizycji obrazu. Jeśli zostanie osiągnięte 90% całkowitego zlania, przenieś się do kaptura bezpieczeństwa biologicznego i ostrożnie zassaj pożywkę hodowlaną za pomocą 10-mililitrowej plastikowej pipety w sterylnych warunkach i delikatnie wyrzuć pożywkę do butelki na odpady.Umyj komórki sześciomililitrowym PBS bez wapnia i magnezu, czyli CMF. Delikatnie obrócić kolbę ręcznie i wyrzucić CMF. Następnie dodaj inne 10-mililitrowe CMF, aby dalej usunąć resztki komórek i nieprzyłączone komórki.W tym momencie zamknij kolbę i umieść ją z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 10 minut. Wyjmij kolbę, wyrzuć CMF i delikatnie dodaj dwa mililitry trypsyny-EDTA, aby oderwać komórki od plastikowej powierzchni. Delikatnie kołysać kolbą ręcznie, pozwalając, aby roztwór całkowicie pokrył komórki, a następnie inkubować kolbę przez dodatkowe 10 minut.Następnie wyjąć kolbę z inkubatora i sprawdzić, czy proces dodawania trypsyny został zakończony. W takim przypadku komórki będą w zawieszeniu i będą wyglądały na zaokrąglone pod mikroskopem. Aby dezaktywować trypsynę, dodaj 10 mililitrów pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie surowicą bydlęcą i ostrożnie umyj kolbę.Zebrać zawiesinę komórkową, przenieść tę objętość do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i odwirować próbkę. Po odwirowaniu sprawdź tworzenie się osadu, odessaj supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w sześciomililitrowej pożywce hodowlanej uzupełnionej surowicą. Kilkakrotnie pipetować zawiesinę komórek w górę i w dół, aby rozbić wszelkie tworzące się grudki.Ten proces może potrwać kilka minut. Następnie wyjąć 10 mikrolitrów za pomocą końcówki do mikropipet i wstrzyknąć objętość pod szkło nakrywkowe komory Burkera lub Neubauera i policzyć liczbę komórek. W każdym dołku 12-dołkowej płytki umieść wkładkę hodowlaną za pomocą sterylnej pęsety.Każda wkładka składa się z dwóch przegródek oddzielonych ścianką o grubości 500 mikrometrów, a spód jest lepki, aby umożliwić przyczepność. Jednak za pomocą pęsety należy nieco docisnąć krawędzie płytki, aby przymocować je do powierzchni płytki. Wypełnij każdą komorę wkładu 70 mikrolitrami zawiesiny komórek zawierającej około 3,5 na 10 do czwartej komórki na komorę.Co ważne, stężenie komórek zaaplikowanych do każdego przedziału zależy od rodzaju komórek. Zaleca się stosowanie gęstości komórek, która prowadzi do całkowitego zbiegania się w ciągu 24 godzin. Pod mikroskopem przy czterokrotnym powiększeniu sprawdź, czy komórki nie wyciekają z komór wkładki, a następnie inkubuj płytkę przez 24 godziny.Po inkubacji delikatnie wyjmij wkładki sterylną pęsetą, nie rozbijając monowarstw komórek, a następnie przenieś wkładkę na papier chłonny. Umyj komórki, dodając jeden mililitr pożywki na studzienkę. Należy uważać, aby nie dodawać pożywki bezpośrednio na monowarstwy komórek, aby uniknąć ich rozerwania.Zamknij płytkę i delikatnie kołysz nią ręcznie. Odessać pożywkę i zastąpić ją jednym mililitrem świeżej pożywki na studzienkę. Wizualizuj wolne od komórek przerwy pod mikroskopem i uzyskuj obrazy w czasie zero.Wycofaj pożywkę ze studzienek i dodaj PBS uzupełniony wapniem i magnezem. Potrząśnij płytką, usuń PBS, a na koniec dodaj badane związki do studzienek. W przypadku niepoddanych działaniu substancji próbek kontrolnych stosuje się pożywkę o długości jednego milimetra.Inkubuj płytkę. Dla każdej próbki obserwuj migrację komórek pod mikroskopem w czterokrotnym powiększeniu i uzyskuj obrazy po 15, 20 i 24 godzinach inkubacji. Na tym etapie spróbuj uchwycić obrazy w tych samych obszarach, co dla czasu zerowego.Wybór interwałów czasowych, w których przechwytywane są obrazy, zależy od szybkości migracji wybranych komórek. Po zakończeniu eksperymentu wybierz obrazy dla każdej próbki w różnych odstępach czasu i utwórz plik zip. Ważne jest, aby mieć co najmniej trzy powtórzenia dla każdej próbki w każdym przedziale czasowym.Otwórz program do automatycznej analizy obrazu Wimasis i prześlij plik zip w najmniejszym powiększeniu. Program automatycznie dostarczy pocztą elektroniczną plik podsumowujący zawierający dane eksperymentalne obszaru pokrytego komórką i obszarów zadrapań jako procent każdej pojedynczej próbki, na przykład próbek 1a i 2a, w wybranych punktach czasowych. Obliczyć średnią wartość wszystkich próbek w czasie zero.Znormalizuj wszystkie dane w odniesieniu do wartości średniej w czasie zero. Obliczyć średnią wartość wszystkich próbek w każdym punkcie czasowym i względny błąd standardowy. Korzystając z dwukierunkowego testu ANOVA, przeprowadź analizę statystyczną.Uzyskane dane można wykreślić na wykresie w postaci histogramu pokazującego procent obszaru pokrytego komórką w różnych punktach czasowych dla różnych grup próbek. Histogramy te pokazują zamknięcie rany uzyskane po 15, 20 i 24 godzinach leczenia komórek oskrzeli różnymi stężeniami antymikropeptydu eskulentyny 1-21-1c lub eskulentyny 1-21 w porównaniu z kontrolą. Jak wskazują histogramy i niektóre reprezentatywne mikrofotografie, eskulentyna 1-21-1c jest bardziej skuteczna w promowaniu reepitelializacji pseudoran w komórkach oskrzeli indukowanej prawie całkowitym zamknięciem pola rany w ciągu około 20 godzin na jednym mikromolu, podczas gdy wyższe stężenie jest potrzebne dla eskulentyny 1-21, czyli 10 mikromolowych.Aby zbadać rolę niektórych receptorów, takich jak receptor naskórkowego czynnika wzrostu, w migracji komórek, należy wstępnie potraktować monowarstwy komórek specyficznym inhibitorem, na przykład związkiem AG1478. W tym celu przed wyjęciem wkładki należy zassać pożywkę w każdej komorze, umyć ją raz i dodać 70 mikrolitrów pożywki uzupełnionej pięcioma mikromolowymi AG1478. Inkubować płytkę przez 30 minut.Następnie wyjmij wkładkę pęsetą i postępuj zgodnie z wcześniejszym opisem. Są to ostateczne dane pokazujące, że indukowana peptydem migracja komórek wiąże się z aktywacją receptora naskórkowego czynnika wzrostu. Rzeczywiście, po wstępnym traktowaniu inhibitorem AG1478 procent obszaru pokrytego komórkami jest znacznie zmniejszony we wszystkich odstępach czasu w porównaniu z wynikami uzyskanymi, gdy komórki nie są wstępnie inkubowane z AG1478 przed dodaniem peptydu.Podsumowując, opisana metoda ma duży potencjał, aby w krótkim czasie i z dużą dokładnością znacznie poprawić wiedzę na temat cech migracyjnych różnych typów komórek, a także na temat wyboru najbardziej obiecujących promotorów i/lub inhibitorów gojenia się ran.

a-novel-in-vitro-wound-healing-assay-to-evaluate-cell-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje bezkontaktowy test gojenia ran w kokulturze, aby ocenić zdolność migracyjną mysich mioblastów. Pomaga to zrozumieć komponenty wysyłania i odbierania sygnałów parakrynnych niekanonicznych interakcji sygnalizacyjnych Wnt in vitro.

Test ran w celu oceny zdolności migracyjnej mysich mioblastów w kokulturze

Opisano powszechnie stosowane, wysoce dostępne metody badania migracji komórek i inwazji in vitro. Pierwszą metodą jest test zamykania ran komórkowych, który mierzy ruchliwość komórek. Drugą metodą jest test migracji i inwazji transwell, który ocenia zdolność komórek do chemotakcji i inwazyjności.

Metody in vitro Testy migracji i inwazji komórek

Migracja komórek to zjawisko biologiczne, które bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, takich jak gojenie się ran i reakcje immunologiczne oraz procesy patofizjologiczne, takie jak rak. Test migracji macierzy kolagenu 3D jest wszechstronnym narzędziem do analizy właściwości migracyjnych różnych typów komórek w środowisku fizjologicznym 3D.

Analiza migracji komórek w obrębie trójwymiarowej matrycy kolagenowej

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia półwysokoprzepustowego testu migracji komórek na 96-dołkowej płytce do hodowli komórek. Protokół ten jest szybką, prostą i ekonomiczną metodą tworzenia spójnych ran zadrapań na monowarstwie komórki.

Urządzenie do wykonywania migracji komórek/gojenia ran w płytce 96-dołkowej

Celem tego protokołu jest ocena wpływu czynników pro- i antymigracyjnych na migrację komórek w trójwymiarowej matrycy fibryny.

Charakterystyka migracji komórek w trójwymiarowym środowisku ran in vitro

To badanie przedstawia dwie różne metody analizy inwazji i migracji komórek: test komory Boydena i test gojenia ran oparty na mikroskopie in vitro. Opisano protokoły tych dwóch eksperymentów oraz porównano ich zalety i wady.

Ocena procesu inwazji i migracji komórek: porównanie testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo i testu z komorą Boydena

Ten manuskrypt opisuje, w jaki sposób zmiany przypominające nacięcia wykonane na monowarstwach hodowanych komórek nabłonkowych wygodnie modelują gojenie się ran in vitro, umożliwiając obrazowanie za pomocą konfokalnej lub laserowej mikroskopii skaningowej, i które mogą dostarczyć wysokiej jakości danych ilościowych i jakościowych do badania zarówno zachowania komórek, jak i mechanizmów związanych z migracją.

Mikroskopowe metody oceny migracji komórek nabłonka podczas gojenia się ran in vitro

Tutaj opisujemy procedurę testowania migracji komórek in vitro za pomocą automatycznego mikroskopu optycznego. Test zarysowania jest szeroko stosowany, w którym zamknięcie rysy następuje przez określony czas. Mikroskop optyczny umożliwia niezawodne i tanie wykrywanie migracji komórek.

Zoptymalizowany test zarysowań do testowania migracji komórek in vitro za pomocą zautomatyzowanej kamery optycznej

To badanie skupia się na modelu gojenia ran in vitro (test zadrapań) jako mechanizmie określającym, jak zanieczyszczenia środowiskowe, takie jak arsen, wpływają na migrację komórek. Wyniki pokazują, że ten test in vitro dostarcza szybkich i wczesnych wskazówek dotyczących zmian w migracji komórkowej przed eksperymentami in vivo.

In vitro Test zarysowania w celu wykazania wpływu arsenu na migrację komórek skóry

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

Ten protokół przedstawia eksperyment migracji in vitro odpowiedni do analizy funkcjonalnej cząsteczek biorących udział w migracji in vivo komórek grzebienia nerwowego do bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej.

In vitro Badanie wpływu bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej na migrację komórek grzebienia nerwowego

Poznaj nowatorską metodę oceny migracji komórek nabłonka oskrzelowego przy użyciu wstawek silikonowych i zautomatyzowanej analizy obrazu. Technika ta dostarcza szybkich, powtarzalnych danych ilościowych o gojeniu ran in vitro.

Nowatorski test gojenia ran in vitro do oceny migracji komórek

Przeglądaj więcej filmów