Name: Pilokarpinowy model padaczki skroniowej i monitorowanie EEG z wykorzystaniem systemu radiotelemetrycznego u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Poznaj metodę indukcji statusu epilepticus za pomocą pilokarpiny i monitorowania napadów u myszy z wykorzystaniem systemu radiotelemetrycznego. Model ten umożliwia badanie mechanizmów padaczki przewlekłej z wysoką przeżywalnością zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez grant Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez rząd koreański (NRF-2014R1A1A3049456) oraz grant z Koreańskiego Projektu Badawczo-Rozwojowego Technologii Medycznych za pośrednictwem Koreańskiego Instytutu Rozwoju Przemysłu Zdrowia (KHIDI), finansowany przez Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej, Republika Korei (HI15C2854).

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Katolickiego Uniwersytetu Korei i zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (Publikacje NIH nr 80-23).
1. Indukcja SE
<ol>
	<li>Kup 8-tygodniowego samca myszy C57BL/6NHsd i zważ każdą mysz. Następnie użyj markera, aby oznaczyć ogony wszystkich myszy, aby ułatwić ich identyfikację podczas indukcji SE.</li>
	<li>Obliczyć ilość bromku metylu skopolaminy (skopolaminy; 2 mg/kg), hemisulfanu terbutaliny (terbutaliny; 2 mg/kg) i chlorowodorku pilokarpiny (pilokarpiny; 280 mg/kg) na podstawie masy ciała myszy i dodać sól fizjologiczną (0,9% NaCl, 10 ml/kg) w celu uzyskania roztworów. 
	nuta: Na przykład, jeśli waga myszy wynosi 25 g, stosuje się następujące ilości: skopolamina i terbutalina: 2 mg/kg * (25 g/1,000 g) = 0,05 mg, sól fizjologiczna: 10 ml/kg * (25 g/1,000 g) = 0,25 ml, pilokarpina: 280 mg/kg * (25 g/1,000 g) = 7 mg, sól fizjologiczna: 10 ml/kg * (25 g/1,000 g) = 0,25 ml.</li>
	<li>Mieszaninę skopolaminy i terbutaliny należy umieścić w strzykawce o pojemności 1 ml z igłą 30 G. Wstrzyknąć roztwór dootrzewnowo każdej myszy, a następnie umieścić myszy z powrotem w klatkach. Po 30 minutach od podania skopolaminy i terbutaliny wstrzyknąć roztwór pilokarpiny każdej myszy (i.p.; strzykawka 1 ml; igła 30 G). Natychmiast po wstrzyknięciu pilokarpiny umieścić myszy w inkubatorze (28-30°C) w celu obserwacji.</li>
	<li>Uważnie monitoruj zachowanie myszy, aż do momentu wywołania SE. Jeśli zostaną wykryte napady limbiczno-ruchowe, które odpowiadają etapowi 3 lub wyższemu zgodnie ze skalą Racine'a, rejestruj czas i monitoruj myszy, aby określić, czy napady występują częściej. Gdy ciągłe napady motoryczne trwają dłużej niż 2 minuty, umieść mysz w nowej klatce w temperaturze pokojowej i monitoruj przez 3 godziny, aby ustalić, czy ich napady konwulsyjne trwają nadal i czy wywołane jest SE. Poddaj eutanazji myszy, które nie dostały się do SE po około 2 godzinach od wstrzyknięcia pilokarpiny. 
	nuta: Skala Racine'a; etap 1, ruchy ust i twarzy; etap 2, głową; etap 3, klonus kończyny przedniej; etap 4, odchów z klonusem kończyn przednich; Etap 5, podnoszenie i upadek z klonusem kończyn przednich16. Jeśli mysz nie zostanie przeniesiona do klatki w temperaturze pokojowej natychmiast po indukcji SE, mysz może umrzeć z powodu hipertermii.</li>
	<li>Ostre napady behawioralne należy zakończyć po 3 godzinach od wystąpienia SE poprzez wstrzyknięcie roztworu diazepamu (i.p.; 10 mg/kg; strzykawka 1 ml; igła 30 G). Przygotować roztwór diazepamu, rozcieńczając 5 mg/ml diazepamu w 10% uwodornionym oleju rycynowym polioksylowym 35, dodając sól fizjologiczną (i.p.; 10 ml/kg; 1 ml strzykawka; igła 30 G). 
	Uwaga: 10% polioksylo-35 uwodorniony roztwór oleju rycynowego: 1 ml uwodornionego roztworu oleju rycynowego polioksylo-35 + 9 ml soli fizjologicznej. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Na przykład, jeśli masa ciała myszy wynosi 25 g, wstrzyknij 250 μl roztworu diazepamu: 50 μl 5 mg/ml diazepamu + 200 μl 10% polioksylo-35 uwodornionego roztworu oleju rycynowego = 250 μl 1 mg/ml diazepamu.</li>
	<li>W przypadku myszy pozorowanych należy wykonać wstrzyknięcie dożylnie mieszaniny bromku metylu skopolaminy i półsiarczanu terbutaliny (i.p.; oba 2 mg/kg, 10 mL/kg; strzykawka 1 ml; igła 30 G). 30 minut później wstrzyknąć sól fizjologiczną dootrzewnowo (i.p.; 10 ml / kg; 1 ml strzykawka; igła 30 G). 
	nuta: Jeśli masa ciała myszy wynosi 25 g, wstrzyknij 250 μl soli fizjologicznej zamiast pilokarpiny.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu diazepamu (i.p.; strzykawka 1 ml; igła 30 G) należy podać 1 ml 5% dekstrozy na pojedynczą mysz (i.p.; strzykawka 1 ml; igła 26 G). 
	Uwaga: 1 ml 5% dekstrozy do wstrzykiwań zapewnia źródło energii i nawodnienie, które mogą zwiększyć wskaźnik przeżycia.</li>
	<li>Podczas pielęgnacji w inkubatorze (28-30 °C) należy zetrzeć nadmierną ilość wydzieliny, takiej jak ślina, łzy i kał.</li>
	<li>W 1. dniu po indukcji SE zważyć myszy i trzymać je w inkubatorze (28-30 °C) przez jeden dodatkowy dzień. W 2 dniu, po indukcji SE, zważ myszy i umieść je z powrotem w klatce domowej. Zapewnij im wilgotną karmę, aby ułatwić im regenerację. 
	nuta: W tym eksperymencie śmiertelność dla C57BL / 6NHsd po zakończeniu SE wynosiła średnio 8,57% (3 z 35 badanych myszy).</li>
	<li>Zmierzyć dzienną masę ciała zwierząt do 7 dni po pilokarpinie i wstrzyknąć myszom 5% dekstrozy (i.p.; strzykawka 1 ml; igła 26 G), gdy masa ciała nie wzrosła. Przerwij monitorowanie masy ciała, gdy myszy zaczną odzyskiwać masę ciała i bez trudu spożywać wilgotną karmę po 2 dniach od wstrzyknięcia pilokarpiny. 
	nuta: Jeśli masa ciała myszy nie wzrosła do 7 dni po SE, wyklucz mysz z eksperymentu i poddaj ją eutanazji dwutlenkiem węgla. W zależności od tła myszy czasami może dojść do śmierci; jednak w przypadku C57BL / 6NHsd mniej niż 1% myszy zmarło w tych eksperymentach. Przy przeżyciu dłuższym niż 7 dni po indukcji SE myszy rzadko umierają w okresie utajonym.</li>
</ol>
2. Chirurgia implantacji do monitorowania wideo-EEG
<ol>
	<li>Przygotowanie 12-tygodniowych myszy (4 tygodnie po indukcji SE) do wykonania implantacji telemetrycznej w celu monitorowania EEG. 
	nuta: Czas implantacji może być modyfikowany w zależności od celów eksperymentalnych i szczepów myszy.</li>
	<li>Przed zabiegiem należy znieczulić mysz mieszaniną (4:0,5) roztworu ketaminy (50 mg/ml) i ksylazyny (23,3 mg/ml) rozpuszczonego w soli fizjologicznej w dawce 2,5 μl/g masy ciała (i.p.; strzykawka 1 ml; igła 26 G). Monitoruj częstość oddechów i wysiłek oddechowy myszy w regularnych odstępach czasu (maksymalnie 15 minut) i oceniaj głębokość znieczulenia za pomocą odruchu wycofania pedału.</li>
	<li>Umieść mysz w stereotaktycznej ramce z nausznikami i płytką zgryzową, a następnie nałóż maść weterynaryjną na oba oczy, aby uniknąć ślepoty.</li>
	<li>Aby utrzymać sterylne warunki podczas zabiegu, należy ogolić miejsca operowane za pomocą żyletki. Uważaj, aby zapobiec zanieczyszczeniu sierści pola operacyjnego. Po goleniu zdezynfekuj skórę 70% roztworem etanolu i jodu. 
	nuta: Zabieg chirurgiczny powinien być wykonywany w sposób aseptyczny, w sterylnych rękawiczkach i maskach, przy użyciu wysterylizowanego sprzętu i technik aseptycznych.</li>
	<li>Po potwierdzeniu głębokości znieczulenia wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry, aby odsłonić czaszkę. Wykonaj dwa otwory zadziorów wiertłem przymocowanym do aparatu stereotaktycznego na współrzędnych od Bregmy w osi przednio-tylnej (AP): +0,1 mm, osi przyśrodkowo-bocznej (ML): +0,1 mm (odniesienie) i AP: −0,2 mm, ML: +0,22 mm (lewa kora ciemieniowa)13.
	<ol>
		<li>Przetrzyj skórę bawełnianymi zamianami nasączonymi PBS, a następnie 70% roztworem etanolu i jodu. Wykonaj podłużne nacięcie nożyczkami na środku głowy, aby odsłonić Lambda (punkt, w którym styka się szew strzałkowy i lambdoidalny), Bregma (punkt przecięcia szwu koronalnego przez szew strzałkowy) i miejsce docelowe.</li>
		<li>Zidentyfikuj anatomiczne punkty orientacyjne, takie jak Lambda i Bregma. Ustaw wiertło w Bregma i zanotuj współrzędne X, Y dla tego punktu.</li>
		<li>Skorzystaj z atlasu mózgu, książek lub opublikowanych odniesień, aby określić odpowiednie współrzędne regionów mózgu do zapisu EEG. Następnie oblicz współrzędne (odniesienie i zapis) przy użyciu współrzędnych Bregma zmierzonych w kroku 2.5.2.</li>
		<li>Powoli opuść wiertło, aby zrobić otwór na zadziory, uważając, aby nie włożyć wiertła zbyt głęboko w miejscu, w którym czaszka staje się cieńsza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włóż podskórnie korpus jednokanałowego bezprzewodowego nadajnika EEG za kark szyi i umieść elastyczne przewody w pobliżu czaszki.</li>
	<li>Umieść ze stali nierdzewnej (o długości 2 mm) w każdym otworze na zadziory za pomocą pęsety i dokręć ją śrubokrętem, obracając ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Upewnij się, że śruba nie jest włożona zbyt głęboko, regulując stopień obrotu, aby zapobiec uszkodzeniu opony twardej lub tkanek mózgu. </li>
	<li>Zdejmij warstwę izolacyjną 2 mm z końcówki przewodów i rozciągnij drut na tyle długo, aby zaokrąglić wałek, aby zapewnić dobre połączenie między drutem a śrubą. Podłącz przewód odniesienia do przedniej, a przewód nagrywający do w korze ciemieniowej. Następnie nałóż cement dentystyczny, aby zabezpieczyć cały zespół na miejscu bez odsłaniania metalowych części.</li>
	<li>Po sprawdzeniu, czy cement dentystyczny całkowicie wyschł za pomocą oględzin, zszyj skórę i nałóż miejscowo maść mupirocyny. Umieść mysz w inkubatorze w temperaturze 30 °C do czasu wyzdrowienia po operacji (około 30 min). Następnie umieść mysz z powrotem w klatce domowej, aż rozpocznie się ciągłe monitorowanie wideo EEG. 
	nuta: Po zabiegu chirurgicznym każdej myszy wstrzykuje się (i.p.; strzykawka 1 ml; igła 30 g) z 5 mg/kg gentamycyny (antybiotyki) i 5 mg/kg ketoprofenu (leki przeciwbólowe). Zwierzęta powinny być monitorowane do czasu, aż osiągną pełną zdolność poruszania się. Myszy z implantacją nadajnika mają okres rekonwalescencji wynoszący około 1 tygodnia.</li>
</ol>
3. Monitorowanie i analiza wideo i EEG
<ol>
	<li>Umieść mysz w indywidualnej klatce i umieść klatkę na płytkach odbiornika bezprzewodowego, na których zainstalowana jest klatka Faradaya, aby uniknąć przerw w przesyłaniu sygnałów elektrycznych z jakichkolwiek źródeł, w tym komputera, linii prądu przemiennego i sąsiednich odbiorników. 
	nuta: Zapoznaj się z instrukcją dostarczoną przez producenta. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć martwych punktów.</li>
	<li>Rejestruj aktywność elektryczną za pomocą bezprzewodowego systemu telemetrii wideo-EEG.
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie do nagrywania wideo-EEG. Kliknij "Sprzęt" i wybierz "Edytuj konfigurację". Dopasuj odbiornik i nadajnik wszczepione w każdą mysz. Kliknij "Konfiguracja kanału" i potwierdź, że wszystkie kanały są aktywne. Kliknij "Konfiguracja wideo", aby zsynchronizować wideo z danymi EEG (rozdzielczość 40 x 480 i liczba klatek na sekundę 30,00). 
		nuta: Zainstaluj kamerę IP o wysokiej czułości, jeśli ważne jest uzyskanie dobrej jakości obrazu, który może zidentyfikować subtelne zmiany w zachowaniu myszy w nocy.</li>
		<li>Kliknij "Ustawienia" i "Ustawienia P3", aby wprowadzić informacje o poszczególnych zwierzętach, dopasowaną kamerę i ustawienia wykresu.</li>
		<li>Kliknij "Akwizycja" i "Częstotliwość próbkowania A/D", aby ustawić częstotliwości próbkowania. Kliknij "Nazwa zestawu danych", aby oznaczyć każdy eksperyment. 
		nuta: Częstotliwość próbkowania EEG musi być wyższa niż 500 Hz. Ze względu na duży rozmiar danych wideo i EEG zaleca się, aby przetwarzane były tylko 24 godziny danych na sesję, zamiast używać ciągłego 2-tygodniowego nagrania jako jednego pliku. Dane mogą być zapisywane oddzielnie w odstępach 8 h lub 12 h w przypadku braku pamięci RAM.</li>
		<li>Aktywuj nadajnik za pomocą paska magnetycznego i kliknij "Rozpocznij akwizycję", aby odebrać zapis wideo-EEG. Stale monitoruj mysz za pomocą systemu wideo-EEG przez co najmniej 2 tygodnie. 
		nuta: W przypadku myszy C57BL/6 SRS ma tendencję do występowania w klastrach, które trwają około 5,2 dnia, a czas trwania okresu wolnego od napadów wynosi około 6,7 dnia17.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ częstotliwość i czas trwania napadów poprzez ręczną kontrolę za pomocą oprogramowania analitycznego.
	<ol>
		<li>Zaznacz obszar z pokazanym SRS i wyeksportuj dane do analizy statystycznej. Uważaj, aby wykluczyć artefakty EEG, które mogą być generowane przez drapanie głowy lub żucie; Można je usunąć, sprawdzając dane wideo. 
		nuta: SRS definiuje się jako nagły początek powtarzającej się aktywności napadowej (≥ 3 Hz), która utrzymuje się przez ponad 10 s. Zachowaniom konwulsyjnym często może towarzyszyć wybuch aktywności skokowej. Napady niekonwulsyjne mogą również wykazywać elektrograficzne działania impulsowe bez zachowań konwulsyjnych. Zakończenie napadu definiuje się jako występujące, gdy skoki wystrzeliwania powracają do aktywności wyjściowej.</li>
		<li>W celu analizy częstości napadów należy podzielić całkowitą liczbę przypadków SRS wykrytych w ciągu 2 tygodni przez łączną liczbę dni rejestracji dla każdego zwierzęcia.</li>
		<li>W celu analizy czasu trwania napadu należy zmierzyć czas od początku do końca aktywności napadowej padaczkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu zapisu wideo EEG, utrwal mózg 4% paraformaldehydem za pomocą perfuzji przezsercowej. Aby znieczulić mysz, wstrzyknąć roztwór (4:0,5) ketaminy (50 mg/ml) i ksylazyny (23,3 mg/ml) rozpuszczony w soli fizjologicznej w dawce 10 μl/g masy ciała (i.p.; strzykawka 1 ml; igła 26 G). Gdy potwierdzi się, że mysz jest głęboko znieczulona, wykonaj perfuzję przezsercową.</li>
	<li>Przed odizolowaniem mózgu myszy wyjmij nadajnik z myszy w celu ponownego użycia po oczyszczeniu.
	<ol>
		<li>Usuń cement dentystyczny wokół przewodów za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Namocz końcówkę przewodów cementem dentystycznym w 100% acetonie, aż cement dentystyczny się rozpuści.</li>
		<li>Usuń zanieczyszczenia tkankowe wokół nadajnika, spłukując go wodą destylowaną.</li>
		<li>Opłucz nadajnik 70% etanolem przez 3 godziny i wysusz go na powietrzu do przechowywania. Bezpośrednio przed następnym użyciem przepłucz i przetwornik 70% etanolem, a następnie wodą destylowaną i umieść je w soli fizjologicznej. 
		nuta: Należy zachować ostrożność, aby nie przeciąć elastycznych przewodów podczas obcinania głowy myszy, ponieważ jeśli elastyczne przewody są zbyt krótkie, hałas podczas następnej implantacji i nagrywania wideo EEG może się nasilić.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chang, B. S., Lowenstein, D. H. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra022308">Epilepsy.</a> N Engl J Med. 349 (13), 1257-1266 (2003).</li>
<li>Scharfman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiology+of+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurol+Neurosci+Rep%22%5BJournal%5D)">The neurobiology of epilepsy.</a> Curr Neurol Neurosci Rep. 7 (4), 348-354 (2007).</li>
<li>Rakhade, S. N., Jensen, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptogenesis+in+the+immature+brain%3A+emerging+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms.</a> Nat Rev Neurol. 5 (7), 380-391 (2009).</li>
<li>Cavalheiro, E. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF02229072">The pilocarpine model of epilepsy.</a> Ital J Neurol Sci. 16 (1-2), 33-37 (1995).</li>
<li>Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pilocarpine+model+of+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy.</a> J Neurosci Methods. 172 (2), 143-157 (2008).</li>
<li>Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindling+and+status+epilepticus+models+of+epilepsy%3A+rewiring+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain.</a> Prog Neurobiol. 73 (1), 1-60 (2004).</li>
<li>Levesque, M., Avoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kainic+acid+model+of+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">The kainic acid model of temporal lobe epilepsy.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 37 (10), 2887-2899 (2013).</li>
<li>Sharma, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesial+temporal+lobe+epilepsy%3A+pathogenesis%2C+induced+rodent+models+and+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mesial temporal lobe epilepsy: pathogenesis, induced rodent models and lesions.</a> Toxicol Pathol. 35 (7), 984-999 (2007).</li>
<li>Hellier, J. L., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoconvulsant+model+of+chronic+spontaneous+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chemoconvulsant model of chronic spontaneous seizures.</a> Curr Protoc Neurosci. 9, Chapter 9 Unit 9 19(2005).</li>
<li>Pitkanen, A., Lukasiuk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+basis+of+epileptogenesis+in+symptomatic+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Behav%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular basis of epileptogenesis in symptomatic epilepsy.</a> Epilepsy Behav. 14, Suppl 1 16-25 (2009).</li>
<li>Mathern, G. W., Adelson, P. D., Cahan, L. D., Leite, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+neuron+damage+in+human+epilepsy%3A+Meyer%27s+hypothesis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Hippocampal neuron damage in human epilepsy: Meyer's hypothesis revisited.</a> Prog Brain Res. 135, 237-251 (2002).</li>
<li>Turski, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbic+seizures+produced+by+pilocarpine+in+rats%3A+behavioural%2C+electroencephalographic+and+neuropathological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: behavioural, electroencephalographic and neuropathological study.</a> Behav Brain Res. 9 (3), 315-335 (1983).</li>
<li>Brulet, R., Zhu, J., Aktar, M., Hsieh, J., Cho, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+with+conditional+NeuroD1+knockout+display+reduced+aberrant+hippocampal+neurogenesis+but+no+change+in+epileptic+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mice with conditional NeuroD1 knockout display reduced aberrant hippocampal neurogenesis but no change in epileptic seizures.</a> Exp Neurol. 293, 190-198 (2017).</li>
<li>Cho, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+hippocampal+neurogenesis+contributes+to+epilepsy+and+associated+cognitive+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline.</a> Nat Commun. 6, 6606(2015).</li>
<li>Cavalheiro, E. A., Santos, N. F., Priel, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pilocarpine+model+of+epilepsy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">The pilocarpine model of epilepsy in mice.</a> Epilepsia. 37 (10), 1015-1019 (1996).</li>
<li>Racine, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+seizure+activity+by+electrical+stimulation.+II.+Motor+seizure%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr+Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure.</a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).</li>
<li>Hester, M. S., Danzer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+abnormal+adult-generated+hippocampal+granule+cells+predicts+seizure+frequency+and+severity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Accumulation of abnormal adult-generated hippocampal granule cells predicts seizure frequency and severity.</a> J Neurosci. 33 (21), 8926-8936 (2013).</li>
<li>Shibley, H., Smith, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilocarpine-induced+status+epilepticus+results+in+mossy+fiber+sprouting+and+spontaneous+seizures+in+C57BL%2F6+and+CD-1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Research%22%5BJournal%5D)">Pilocarpine-induced status epilepticus results in mossy fiber sprouting and spontaneous seizures in C57BL/6 and CD-1 mice.</a> Epilepsy Research. 49 (2), 109-120 (2002).</li>
<li>Borges, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+and+glial+pathological+changes+during+epileptogenesis+in+the+mouse+pilocarpine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal and glial pathological changes during epileptogenesis in the mouse pilocarpine model.</a> Exp Neurol. 182 (1), 21-34 (2003).</li>
<li>Pavlova, M. K., Shea, S. A., Bromfield, E. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14751206">Day/night patterns of focal seizures.</a> Epilepsy Behav. 5 (1), 44-49 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W pracy opisano eksperymentalne procedury indukcji SE i oceny napadów przewlekłych.
Na udaną indukcję SE może mieć wpływ kilka czynników. Dokładne monitorowanie behawioralne zgodnie ze skalą Racine'a ma kluczowe znaczenie dla rozwoju SRS. głową, klonus kończyn przednich, podnoszenie i opadanie są behawioralnymi cechami charakterystycznymi ostrych napadów rozwijających się w fazę SE 4,16. Po wykryciu pierwszego napadu ruchowego długość ...

TLE to jedna z najczęściej nabytych padaczek1. Osoby z padaczką doświadczają nawracających napadów w wyniku nieprawidłowej aktywności neuronalnej w mózgu2,3. Biorąc pod uwagę, że TLE jest często nieuleczalna, kluczowe jest zrozumienie podstawowych mechanizmów leżących u podstaw rozwoju padaczki.
Modele zwierzęce, które mogą podsumować kluczowe cechy ludzkiego TLE, mogą zaoferować lepsze zrozumienie patofizjologii TLE, pozwalając nam łatwo monitorować i manipulować krytycznymi czynnikami w epileptogenezie. Wśród nich szeroko stosowano SE wywołane przez chemoconvulsants4,5. W przeciwieństwie do innych modeli padaczki, takich jak stymulacja elektryczna, która nie wykazuje stwardnienia hipokampa i solidnego SRS6,7,8, ogólnoustrojowe wstrzyknięcie chemoconvulsantów może naśladować kliniczną patogenezę ludzkiego TLE, tj. początkowe uszkodzenie mózgu, okres utajony i przewlekłe stadium padaczkowe objawiające się SRS5,9,10. Dlatego też technika ta może być wykorzystana w różnych badaniach wyjaśniających mechanizmy ostrego uszkodzenia mózgu, epileptogenezy czy tłumienia napadów. Co więcej, zmiany histopatologiczne wywołane przez chemoconvulsanty są podobne do tych obserwowanych u ludzkich TLE, co stanowi dodatkowe uzasadnienie dla stosowania modeli gryzoni TLE10,11,12. Warto zauważyć, że uszkodzenia strukturalne obejmujące hipokamp były konsekwentnie odtwarzane zarówno w modelach SE wywołanych kwasem kainowym, jak i pilokarpiną. Jednak w porównaniu z wstrzykiwaniem kwasu kainowego, model pilokarpiny może wytwarzać bardziej wytrzymałe SRS u myszy, co może przynieść znaczne korzyści w badaniu przewlekłej padaczki, biorąc pod uwagę szeroką dostępność transgenicznych linii myszy5,13,14,15. Co więcej, progresja napadów po wstrzyknięciu pilokarpiny jest na ogół szybsza niż w modelu kwasu kainowego, co dostarcza dodatkowych dowodów na skuteczne stosowanie modelu padaczki z pilokarpiną.
Tutaj demonstrujemy metodę wywoływania SE poprzez wstrzyknięcie domięśniowe pilokarpiny oraz poprzez monitorowanie wideo i EEG w przewlekłej padaczce.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6</td><td>Envigo</td><td>C57BL/6NHsd</td><td></td></tr><tr><td>Azotan metylu skopolaminy</td><td>Sigma</td><td>S2250</td><td>Zrób 10X zapas</td></tr><tr><td>Sól półsiarczanu terbutaliny</td><td>Sigma</td><td>T2528</td><td>Zrób 10X zapas</td></tr><tr><td>Chlorowodorek pilokarpiny</td><td>Sigma</td><td>P6503</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy</td><td>Yuhan corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna chlorowodorek</td><td>Bayer Korea</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diazepam</td><td>SAMJIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olej rycynowy (Kolliphor EL)</td><td>Sigma</td><td>C5135</td><td>Polioksyl 35 uwodorniony olej rycynowy</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Daihan pharm. Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% dekstroza</td><td>Daihan pharm. Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór jodu (Powidyna)</td><td>Maść weterynaryjna Firson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Terramycyna)</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blue Nylon</td><td>AILEE</td><td>NB617</td><td></td></tr><tr><td>Mupirocyna (Bearoban)</td><td>Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Samchundang Pharm. Co., Ltd</td><td></td><td>5 mg / kg</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Huons, Ltd. </td><td></td><td>5 mg/kg</td></tr><tr><td>1 ml strzykawka</td><td>Sung shim medial Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>26 igły</td><td>Sung shim medial Co., Ltd.</td><td></td><td>Igła 26 G * 13 mm (1/2 "),</td></tr> <tr><td>30 mm</td><td>Sung shim medial Co., Ltd.</td><td></td><td>30 G * 13 mm (1/2 ")</td></tr> <tr><td>Żyletka</td><td>Dorco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Saeshin precision Co., Ltd.</td><td></td><td>207A, 35K (prędkość)</td></tr><tr><td>Telemetryczny system wideo/EEG</td><td>Data sciences International. Inc.</td><td>Wersja 5.20-SP6</td><td></td></tr><tr><td>Wszczepialny nadajnik</td><td>Data sciences International. Inc.</td><td>ETA-F10</td><td></td></tr><tr><td>Śruba</td><td>Sungho Steel</td><td></td><td>M1.4, stal nierdzewna o długości 2 mm</td></tr><tr><td>Vertex dental material&nbsp;</td><td>Dentimex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Duksan czyste chemikalia Co., Ltd.</td><td></td><td>CAS 67-64-1</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td> <td>milipory</td><td>1.04005.1000</td><td>4 %&nbsp;</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>30% roztwór w 0,01 M PBS</td></tr><tr><td>octan fioletu kresylowego</td><td>Sigma</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>EMD Millipore Co.</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>ksylen</td><td>Duksan czyste chemikalia Co., Ltd.</td><td>UN1307</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy lodowaty</td><td>Junsei chemiczny</td><td>31010-0350</td><td></td></tr><tr><td>FSC33 Przezroczysty&nbsp;</td>Związek OCT <td>Leica biosystems</td><td></td><td>do zamrażania tkanek</td></tr><tr><td>Montaż DPX do histologii</td><td>Sigma</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Solco biomedical</td><td>02-2445</td><td></td></tr><tr><td>Ramka stereotaktyczna</td><td>David Kopf Instruments</td><td>E51070012</td><td></td></tr></tbody></table>

pilokarpinowy model padaczki skroniowej i monitorowanie eeg z wykorzystaniem systemu radiotelemetrycznego u myszy

The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice

Padaczka skroniowa (TLE) jest częstym zaburzeniem neurologicznym w wieku dorosłym. Do badań translacyjnych nad padaczką przewlekłą często wybiera się stan padaczkowy wywołany pilokarpiną (SE) w celu podsumowania spontanicznych nawracających napadów padaczkowych (SRS). W tym artykule przedstawiono protokół indukcji SE poprzez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie pilokarpiny oraz monitorowanie przewlekłych nawracających napadów padaczkowych u żywych zwierząt za pomocą bezprzewodowego systemu telemetrii wideo i elektroencefalogramu (EEG). Wykazaliśmy znaczące zmiany w zachowaniu, które wymagają uwagi po wstrzyknięciu pilokarpiny i ich korelację z utratą neuronów w hipokampie po 7 dniach i 6 tygodniach od pilokarpiny. Opisano również eksperymentalne procedury implantacji elektrod do rejestracji wideo i EEG oraz analizę częstości i czasu trwania przewlekłych napadów nawracających. Na koniec omawiamy możliwe powody, dla których oczekiwane rezultaty nie są osiągane w każdym przypadku. Zawiera on podstawowe informacje na temat modelowania przewlekłej padaczki u myszy oraz wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów. Uważamy, że protokół ten może służyć jako punkt odniesienia dla odpowiednich modeli przewlekłej padaczki i epileptogenezy.

Skuteczne SE może indukować śmierć komórek hipokampa oraz SRS (Rysunek 1 i Rysunek 2). Przerwaliśmy behawioralne napady ostre poprzez wstrzyknięcie diazepamu 3 h po wystąpieniu SE, a myszy uśpiono 7 dni lub 6 tygodni później.
Do monitorowania wideo-EEG u myszy przeprowadzono zabieg implantacji 4 tygodnie po SE, a przypadki SRS oceniano przez 2 tygodnie w okresie od 5. d...

Ten manuskrypt opisuje metodę wywoływania stanu padaczkowego poprzez ogólnoustrojowe wstrzykiwanie pilokarpiny oraz monitorowania spontanicznych nawracających napadów u żywych zwierząt za pomocą bezprzewodowego systemu telemetrii wideo i elektroencefalogramu. Protokół ten może być wykorzystany do badania patofizjologicznych mechanizmów przewlekłej padaczki, epileptogenezy i ostrych napadów.

Pilokarpinowy model padaczki skroniowej i monitorowanie EEG z wykorzystaniem systemu radiotelemetrycznego u myszy

Temporal lobe epilepsy (TLE) is a common neurological disorder in adulthood. For translational studies of chronic epilepsy, pilocarpine-induced status ...

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie stanu padaczkowego za pomocą pilokarpiny oraz monitorowanie spontanicznych nawracających napadów za pomocą systemu radiotelemetrii u myszy. Protokół ten może być wykorzystany do badania mechanizmów patofizjologii ostrych napadów, epileptogenezy i przewlekłej padaczki. Główną zaletą tej techniki jest dostarczenie mysiego modelu padaczki przewlekłej wykazującej spontaniczne nawracające napady z wysokim wskaźnikiem przeżywalności po ostrych napadach.Procedurę zademonstruje dr Ji-Eun Kim, doktor habilitowany w moim laboratorium. Zacznij od zważenia każdego ośmiotygodniowego samca myszy. Przygotuj dwa miligramy na kilogram skopolaminy i terbutaliny, a także 280 miligramów na kilogram roztworu pilokarpiny.Następnie wstrzyknąć roztwór dootrzewnowo każdej myszy i umieścić myszy z powrotem w klatkach. 30 minut po podaniu skopolaminy i terbutaliny, wstrzyknąć roztwór pilokarpiny każdej myszy. Natychmiast po wstrzyknięciu pilokarpiny umieść myszy w inkubatorze o temperaturze od 28 do 30 stopni Celsjusza w celu obserwacji.Następnie monitoruj zachowanie myszy, aż do momentu wywołania stanu padaczkowego lub SE. Jeśli zostaną wykryte napady limbicznego r

the-pilocarpine-model-temporal-lobe-epilepsy-eeg-monitoring-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film przedstawia procedurę wywoływania stanu padaczkowego (SE) u myszy poprzez systemowe podawanie pilokarpiny w celu modelowania padaczki skroniowej.

Leczenie układowe pilokarpiny: mysi model padaczki skroniowej

Film demonstruje długoterminowe, ciągłe monitorowanie elektroencefalografii (EEG) u młodych gryzoni za pomocą bezprzewodowego systemu nadajników. Nadajnik zawiera dwie elektrody rejestrujące i jedną elektrodę odniesienia sięgającą do powierzchni mózgu. Po umieszczeniu szczeniaka w komorze rejestracyjnej, EEG może być stale monitorowane przez cały okres rozwoju szczeniaka do dorosłości.

Długotrwały ciągły monitoring elektroencefalograficzny u młodego gryzonia

Tutaj demonstrujemy użycie bezprzewodowej technologii umożliwiającej elektroencefalogram (EEG) w modelach chorób ludzkich noworodków gryzoni. Dzięki telemetrii nie ma obciążających połączeń, co pozwala na naturalne zachowania.

Długotrwałe, ciągłe monitorowanie EEG w modelach chorób człowieka u małych gryzoni przy użyciu systemu nadajników bezprzewodowych Epoch

Nieograniczająca radiotelemetria EEG jest cennym podejściem metodologicznym do rejestrowania in vivo długoterminowych elektroencefalogramów od swobodnie poruszających się gryzoni. Ten szczegółowy protokół opisuje stereotaktyczne znieczulenie zewnątrzoponowe i głębokie domózgowe umieszczenie elektrod w różnych obszarach mózgu w celu uzyskania wiarygodnych zapisów rytmiczności OUN i etapów behawioralnych związanych z OUN.

Nieskrępowana radiotelemetria EEG: zewnątrzoponowe i głębokie śródmózgowe stereotaktyczne umieszczenie elektrod EEG

Ten artykuł demonstruje skuteczność akupunktury, modeli epilepsji i analizy snu u gryzoni. Opisano procedurę akupunktury i identyfikację punktów akupunkturowych. Pilokarpina lub pentylenotetrazol (PTZ) jest stosowany w celu wywołania padaczki. Do analizy snu wykorzystuje się elektrokortykogram (ECoG), elektromiogram (EMG), temperaturę mózgu i zapisy aktywności lokomotorycznej.

Manipulacja elektrokortykogramem padaczkowym (ECoG) i snem u szczurów i myszy za pomocą akupunktury

Tutaj prezentujemy protokół do rejestrowania sygnałów biologicznych mózgu i serca u myszy za pomocą jednoczesnego wideo, elektroencefalografii (EEG) i elektrokardiografii (EKG). Opisano również metody analizy wynikowych zapisów EEG-EKG pod kątem napadów, mocy spektralnej EEG, funkcji serca i zmienności rytmu serca.

Jednoczesne monitorowanie wideo-EEG-EKG w celu identyfikacji dysfunkcji neurosercowej w mysich modelach padaczki

Tutaj prezentujemy protokół do wywołania ciężkiego TBI za pomocą modelu bocznego uszkodzenia płynem płynowym (FPI) u dorosłych, samców szczurów rasy Wistar. Demonstrujemy również zastosowanie bezprzewodowego systemu telemetrycznego do zbierania ciągłych zapisów wideo-EEG i monitorowania wyładowań padaczkowych zgodnych z epileptogenezą pourazową.

Wykorzystanie bezprzewodowego systemu wideo-EEG do monitorowania wyładowań padaczkowych po bocznym urazowym uszkodzeniu mózgu wywołanym płynem

Ten artykuł przedstawia eksperymentalne procedury oceny zaburzeń pamięci u myszy z padaczką wywołaną pilokarpiną. Protokół ten może być wykorzystany do badania patofizjologicznych mechanizmów spadku funkcji poznawczych związanego z padaczką, który jest jedną z najczęstszych chorób współistniejących w padaczce.

Ocena funkcji pamięci u myszy z padaczką indukowaną pilokarpiną

Ten raport opisuje metody generowania modelu padaczki skroniowej na podstawie elektrycznego rozpalenia transgenicznych myszy VGAT-Cre. Rozpalone myszy VGAT-Cre mogą być przydatne w określaniu, co powoduje padaczkę i w badaniach przesiewowych nowych terapii.

Przygotowanie i wszczepienie elektrod dla elektrycznie zapalających myszy VGAT-Cre w celu wygenerowania modelu padaczki skroniowej

Ciało migdałowate odgrywa kluczową rolę w padaczce skroniowej, która wywodzi się z tej struktury i z niej się rozprzestrzenia. Ten artykuł zawiera szczegółowy opis wytwarzania głębokich elektrod mózgowych z funkcjami zarówno rejestrującymi, jak i stymulującymi. Wprowadza model padaczki przyśrodkowego płata skroniowego wywodzącej się z ciała migdałowatego.

Użycie elektrody bipolarnej do stworzenia mysiego modelu padaczki skroniowej poprzez elektryczne rozppalenie ciała migdałowatego

Protokół ten został opracowany, aby stworzyć niezawodny i łatwo dostępny system do rejestrowania swobodnie poruszającego się EEG gryzoni.

Opłacalny i minimalnie inwazyjny protokół do przewlekłej wielomiejscowej elektroencefalografii u swobodnie poruszających się myszy

Poznaj metodę indukcji statusu epilepticus za pomocą pilokarpiny i monitorowania napadów u myszy z wykorzystaniem systemu radiotelemetrycznego. Model ten umożliwia badanie mechanizmów padaczki przewlekłej z wysoką przeżywalnością zwierząt.

Pilokarpinowy model padaczki skroniowej i monitorowanie EEG z wykorzystaniem systemu radiotelemetrycznego u myszy

Przeglądaj więcej filmów