Dializa jest powszechną techniką stosowaną w biochemii do rozdzielania cząsteczek na podstawie dyfuzji. W tej procedurze półprzepuszczalna membrana umożliwia ruch niektórych cząsteczek w zależności od wielkości. Metodę tę można zastosować do usuwania buforu, znanego jako odsalanie, czyli wymiany cząsteczek buforu lub jonów z roztworu białkowego.
Ten film omawia zasady dializy wraz z ogólną procedurą. Omówiono kilka zastosowań dializy, w tym usuwanie odczynników gradientowych po ultrawirowaniu, usuwanie detergentu po ekstrakcji białka błonowego oraz odtwarzanie białek poprzez zmianę środowiska roztworu.
Dializa jest powszechną techniką stosowaną w biochemii do rozdzielania cząsteczek na podstawie dyfuzji. W tej procedurze półprzepuszczalna membrana umożliwia ruch niektórych cząsteczek w zależności od wielkości. Metodę tę można zastosować do usuwania buforu, znanego jako odsalanie, czyli wymiany cząsteczek buforu lub jonów z roztworu białkowego.
Ten film omawia zasady dializy wraz z ogólną procedurą. Omówiono kilka zastosowań dializy, w tym usuwanie odczynników gradientowych po ultrawirowaniu, usuwanie detergentu po ekstrakcji białka błonowego oraz odtwarzanie białek poprzez zmianę środowiska roztworu.
Próbki biochemiczne zazwyczaj mają wysokie stężenia buforowe, które mogą zakłócać dalsze przetwarzanie i analizę. Dializa jest powszechną, niedrogą techniką stosowaną do rozdzielania cząsteczek na podstawie dyfuzji. Metoda wykorzystuje półprzepuszczalną membranę, która umożliwia ruch niektórych elementów w zależności od rozmiaru. W tym filmie przedstawimy koncepcje dializy, ogólnej procedury i niektóre z jej zastosowań w biochemii.
Najważniejszym aspektem dializy jest półprzepuszczalna membrana, która ma pory, które narzucają odcięcie masy cząsteczkowej, przepuszczając cząsteczki poniżej określonej wielkości. Na przykład membrana 10k na ogół zatrzymuje cząsteczki większe niż 10 kilodaltonów. Jednak granica masy cząsteczkowej nie jest dyskretną ani precyzyjną granicą. Membrana zazwyczaj zawiera szeroki zakres rozmiarów porów, więc niewielka część cząsteczek w pobliżu punktu odcięcia może zostać utracona.
Ponieważ granica masy cząsteczkowej jest definiowana za pomocą białek globularnych, liniowe cząsteczki o podobnej masie, takie jak DNA lub RNA, mogą się prześlizgnąć. Membrany są zwykle wybierane od połowy do jednej trzeciej masy cząsteczkowej pożądanej cząsteczki.
Aby wykonać procedurę, próbkę umieszcza się w membranie, która z kolei jest dodawana do dużej objętości roztworu, zwanego dializatem. Z biegiem czasu mniejsze cząsteczki będą swobodnie dyfundować przez błonę między próbką a dializatem, podczas gdy większe biomolekuły są zatrzymywane w środku. Dializa jest procesem powolnym. Często pozwala się mu działać przez noc, a nawet przez wiele dni.
Jeśli dializatem jest czysta woda, ogólne stężenie buforu zmniejszy się, w procesie znanym jako odsalanie. Jeśli roztwór zawiera inne małe cząstki, niektóre z nich przemieszczą się do próbki, prowadząc do wymiany buforu. Ponieważ dializa jest procesem równowagi, dialilat może być wielokrotnie odświeżany, aby jeszcze bardziej wyprzeć małe cząsteczki. Po zakończeniu procesu próbka jest ponownie pobierana do dalszego przetwarzania.
Teraz, gdy znasz już podstawy dializy, przyjrzyjmy się ogólnej procedurze.
Przed rozpoczęciem zabiegu membrana jest wstępnie nasączona dializatem. Dzięki temu jest łatwiejszy w użyciu i usuwa wszelkie konserwanty. Po przygotowaniu próbka jest pobierana, zwykle za pomocą strzykawki, a następnie dodawana do pojemnika do dializy. Może to być goły przewód lub umieszczony w kasecie. Nadmiar powietrza jest usuwany z zestawu do dializy, aby zmaksymalizować powierzchnię próbki z membraną. Zestaw jest następnie umieszczany w dialiacie z mieszaniem, aby zmaksymalizować dyfuzję. Powinien unosić się na wodzie, aby nie hamować mieszania.
Dializat jest zmieniany w odpowiednich odstępach czasu, gdy osiągana jest równowaga między próbką a dializatem. Po ostatniej zmianie reakcję zwykle pozostawia się na noc. Po upływie odpowiedniego czasu próbka pozbawiona buforu lub wymieniona jest wyjmowana z kasety. Po pobraniu próbka może być analizowana lub dalej przetwarzana, w zależności od charakteru eksperymentu.
Teraz, gdy przyjrzeliśmy się ogólnej procedurze dializy, zobaczmy niektóre ze sposobów, w jakie ta technika jest wykorzystywana w biochemii.
Gradienty gęstości są powszechnym sposobem oddzielania złożonych próbek biologicznych. Koncepcja ta opiera się na rozkładzie na małych cząstkach, zwykle jonach sacharozy lub chlorku cezu. Po zakończeniu odczynniki te zazwyczaj muszą zostać usunięte, zanim pobrana próbka będzie mogła zostać przetworzona. Dializa umożliwia wykorzystanie oczyszczonej próbki do przyszłej analizy.
Niektóre białka znajdują się w dwuwarstwie lipidowej komórki i zwykle są badane poprzez przeplatanie ich w sferyczne pęcherzyki lipidowe znane jako liposomy. Białka i lipidy są najpierw ekstrahowane za pomocą detergentu. Dializa może być stosowana do powolnego usuwania detergentu, tworząc proteoliposomy.
Po oczyszczeniu niektóre białka są nieprawidłowo sfałdowane lub denaturowane, co prowadzi do utraty funkcjonalności. Związki, które powodują te zmiany w strukturze, mogą być usuwane za pomocą dializy, co prowadzi do reformacji funkcjonujących analitów.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat dializy. Powinieneś teraz zrozumieć tę metodę opartą na dyfuzji, prostą procedurę eksperymentalną i zastosowanie tej techniki.
Dzięki za oglądanie!
Dializa jest powszechną techniką stosowaną w biochemii do rozdzielania cząsteczek na podstawie dyfuzji. W tej procedurze półprzepuszczalna membrana umożliwia ruch niektórych cząsteczek w zależności od wielkości. Metodę tę można zastosować do usuwania buforu, znanego jako odsalanie, czyli wymiany cząsteczek buforu lub jonów z roztworu białkowego.
Ten film omawia zasady dializy wraz z ogólną procedurą. Omówiono kilka zastosowań dializy, w tym usuwanie odczynników gradientowych po ultrawirowaniu, usuwanie detergentu po ekstrakcji białka błonowego oraz odtwarzanie białek poprzez zmianę środowiska roztworu.
Próbki biochemiczne zazwyczaj mają wysokie stężenia buforowe, które mogą zakłócać dalsze przetwarzanie i analizę. Dializa jest powszechną, niedrogą techniką stosowaną do rozdzielania cząsteczek na podstawie dyfuzji. Metoda wykorzystuje półprzepuszczalną membranę, która umożliwia ruch niektórych elementów w zależności od rozmiaru. W tym filmie przedstawimy koncepcje dializy, ogólnej procedury i niektóre z jej zastosowań w biochemii.
Najważniejszym aspektem dializy jest półprzepuszczalna membrana, która ma pory, które narzucają odcięcie masy cząsteczkowej, przepuszczając cząsteczki poniżej określonej wielkości. Na przykład membrana 10k na ogół zatrzymuje cząsteczki większe niż 10 kilodaltonów. Jednak granica masy cząsteczkowej nie jest dyskretną ani precyzyjną granicą. Membrana zazwyczaj zawiera szeroki zakres rozmiarów porów, więc niewielka część cząsteczek w pobliżu punktu odcięcia może zostać utracona.
Ponieważ granica masy cząsteczkowej jest definiowana za pomocą białek globularnych, liniowe cząsteczki o podobnej masie, takie jak DNA lub RNA, mogą się prześlizgnąć. Membrany są zwykle wybierane od połowy do jednej trzeciej masy cząsteczkowej pożądanej cząsteczki.
Aby wykonać procedurę, próbkę umieszcza się w membranie, która z kolei jest dodawana do dużej objętości roztworu, zwanego dializatem. Z biegiem czasu mniejsze cząsteczki będą swobodnie dyfundować przez błonę między próbką a dializatem, podczas gdy większe biomolekuły są zatrzymywane w środku. Dializa jest procesem powolnym. Często pozwala się mu działać przez noc, a nawet przez wiele dni.
Jeśli dializatem jest czysta woda, ogólne stężenie buforu zmniejszy się, w procesie znanym jako odsalanie. Jeśli roztwór zawiera inne małe cząstki, niektóre z nich przemieszczą się do próbki, prowadząc do wymiany buforu. Ponieważ dializa jest procesem równowagi, dialilat może być wielokrotnie odświeżany, aby jeszcze bardziej wyprzeć małe cząsteczki. Po zakończeniu procesu próbka jest ponownie pobierana do dalszego przetwarzania.
Teraz, gdy znasz już podstawy dializy, przyjrzyjmy się ogólnej procedurze.
Przed rozpoczęciem zabiegu membrana jest wstępnie nasączona dializatem. Dzięki temu jest łatwiejszy w użyciu i usuwa wszelkie konserwanty. Po przygotowaniu próbka jest pobierana, zwykle za pomocą strzykawki, a następnie dodawana do pojemnika do dializy. Może to być goły przewód lub umieszczony w kasecie. Nadmiar powietrza jest usuwany z zestawu do dializy, aby zmaksymalizować powierzchnię próbki z membraną. Zestaw jest następnie umieszczany w dialiacie z mieszaniem, aby zmaksymalizować dyfuzję. Powinien unosić się na wodzie, aby nie hamować mieszania.
Dializat jest zmieniany w odpowiednich odstępach czasu, gdy osiągana jest równowaga między próbką a dializatem. Po ostatniej zmianie reakcję zwykle pozostawia się na noc. Po upływie odpowiedniego czasu próbka pozbawiona buforu lub wymieniona jest wyjmowana z kasety. Po pobraniu próbka może być analizowana lub dalej przetwarzana, w zależności od charakteru eksperymentu.
Teraz, gdy przyjrzeliśmy się ogólnej procedurze dializy, zobaczmy niektóre ze sposobów, w jakie ta technika jest wykorzystywana w biochemii.
Gradienty gęstości są powszechnym sposobem oddzielania złożonych próbek biologicznych. Koncepcja ta opiera się na rozkładzie na małych cząstkach, zwykle jonach sacharozy lub chlorku cezu. Po zakończeniu odczynniki te zazwyczaj muszą zostać usunięte, zanim pobrana próbka będzie mogła zostać przetworzona. Dializa umożliwia wykorzystanie oczyszczonej próbki do przyszłej analizy.
Niektóre białka znajdują się w dwuwarstwie lipidowej komórki i zwykle są badane poprzez przeplatanie ich w sferyczne pęcherzyki lipidowe znane jako liposomy. Białka i lipidy są najpierw ekstrahowane za pomocą detergentu. Dializa może być stosowana do powolnego usuwania detergentu, tworząc proteoliposomy.
Po oczyszczeniu niektóre białka są nieprawidłowo sfałdowane lub denaturowane, co prowadzi do utraty funkcjonalności. Związki, które powodują te zmiany w strukturze, mogą być usuwane za pomocą dializy, co prowadzi do reformacji funkcjonujących analitów.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat dializy. Powinieneś teraz zrozumieć tę metodę opartą na dyfuzji, prostą procedurę eksperymentalną i zastosowanie tej techniki.
Dzięki za oglądanie!
Videos from this collection: