Biochemia

Dializa jest powszechną techniką stosowaną w biochemii do rozdzielania cząsteczek na podstawie dyfuzji. W tej procedurze półprzepuszczalna membrana umożliwia ruch niektórych cząsteczek w zależności od wielkości. Metodę tę można zastosować do usuwania buforu, znanego jako odsalanie, czyli wymiany cząsteczek buforu lub jonów z roztworu białkowego. Ten film omawia zasady dializy wraz z ogólną procedurą. Omówiono kilka zastosowań dializy, w tym usuwanie odczynników gradientowych po ultrawirowaniu,...

Kinetyka enzymów opisuje katalityczne działanie enzymów, które są biomolekułami ułatwiającymi reakcje chemiczne niezbędne dla organizmów żywych. Enzymy działają na cząsteczki, zwane substratami, tworząc produkty. Parametry kinetyczne enzymów są określane za pomocą testów, które bezpośrednio lub pośrednio mierzą zmiany stężenia substratu lub produktu w czasie. W tym filmie omówione zostaną podstawowe zasady kinetyki enzymów (w tym równania szybkości) i modele kinetyczne. Omówiono również...

Jonizacja z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI) to źródło jonów ze spektrometrii mas, idealne do analizy biomolekuł. Zamiast związków jonizujących w stanie gazowym, próbki są zatapiane w matrycy, w którą uderza się laserem. Matryca pochłania większość energii; Część tej energii jest następnie przekazywana do próbki, która w rezultacie ulega jonizacji. Próbki jonów można następnie zidentyfikować za pomocą analizatora czasu przelotu (TOF). Ten film omawia zasady MALDI-TOF, w tym wybór...

W tandemowej spektrometrii mas biomolekuła będąca przedmiotem zainteresowania jest izolowana z próbki biologicznej, a następnie fragmentowana na wiele podjednostek, aby pomóc wyjaśnić jej skład i sekwencję. Osiąga się to dzięki szeregowym spektrometrom masowym. Pierwszy spektrometr jonizuje próbkę i filtruje jony o określonym stosunku masy do ładunku. Przefiltrowane jony są następnie fragmentowane i przekazywane do drugiego spektrometru mas, gdzie fragmenty są analizowane. Ten film przedstawia...

Krystalizacja białek, uzyskanie stałej sieci biomolekuł, wyjaśnia strukturę białek i umożliwia badanie funkcji białek. Krystalizacja polega na suszeniu oczyszczonego białka pod wpływem kombinacji wielu czynników, w tym pH, temperatury, siły jonowej i stężenia białka. Po uzyskaniu kryształów strukturę białka można wyjaśnić za pomocą dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego i obliczeń modelu gęstości elektronów. Ten film przedstawia krystalizację białek i pokazuje ogólną procedurę. Procedura...

W biochemii metody oczyszczania oparte na chromatografii są stosowane do izolowania związków ze złożonej mieszaniny. Dwie takie metody powszechnie stosowane przez biochemików to chromatografia wykluczająca wielkość i chromatografia powinowactwa. W chromatografii wykluczającej wielkość kolumna wypełniona porowatymi kulkami oddziela składniki mieszaniny na podstawie wielkości. Z drugiej strony, chromatografia powinowactwa pozwala na bardziej szczegółowe oddzielenie biomolekuł za pomocą kolumny...

Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa (2DGE) to technika, która pozwala na rozdzielenie tysięcy biomolekuł z mieszaniny. Technika ta obejmuje dwie odrębne metody separacji, które zostały ze sobą połączone: ogniskowanie izoelektryczne (IEF) i elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE). To fizycznie oddziela związki w dwóch osiach żelu według ich punktów izoelektrycznych (właściwość elektrochemiczna) i ich mas cząsteczkowych. Procedura przedstawiona w tym filmie...

Znakowanie metaboliczne służy do badania przemian biochemicznych i modyfikacji zachodzących w komórce. Osiąga się to za pomocą analogów chemicznych, które naśladują strukturę naturalnych biomolekuł. Komórki wykorzystują analogi w swoich endogennych procesach biochemicznych, wytwarzając związki, które są znakowane. Etykieta pozwala na włączenie znaczników detekcji i powinowactwa, które można następnie wykorzystać do wyjaśnienia szlaków metabolicznych przy użyciu innych biochemicznych technik...

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) jest procedurą biochemiczną stosowaną do wyjaśnienia wiązania między białkami a kwasami nukleinowymi. W tym teście miesza się znakowany radioaktywnie kwas nukleinowy i badane białko. Wiązanie określa się za pomocą elektroforezy żelowej, która rozdziela składniki na podstawie masy, ładunku i konformacji. Ten film przedstawia koncepcje EMSA i ogólną procedurę, w tym przygotowanie żelu i białka, wiązanie, elektroforezę i wykrywanie.

Pomiar stężenia jest podstawowym etapem wielu testów biochemicznych. Fotometryczne oznaczanie białek wykorzystuje fakt, że im więcej próbki zawiera substancji pochłaniających światło, tym mniej światła będzie przez nią przechodzić. Ponieważ zależność między stężeniem a absorpcją jest liniowa, zjawisko to można wykorzystać do pomiaru stężenia w próbkach, w których jest ono nieznane. Ten film opisuje podstawy fotometrycznego oznaczania białek i przedstawia test Bradforda oraz metodę Lowry'ego.

Ultrawirowanie w gradiencie gęstości jest powszechną techniką stosowaną do izolowania i oczyszczania biomolekuł i struktur komórkowych. Technika ta wykorzystuje fakt, że w zawiesinie cząstki, które są gęstsze niż rozpuszczalnik, osadzają się, podczas gdy te, które są mniej gęste, unoszą się na wodzie. Do przyspieszenia tego procesu stosuje się ultrawirówkę o dużej prędkości w celu oddzielenia biomolekuł w gradiencie gęstości, który można ustalić poprzez nakładanie warstw cieczy o malejącej...

Testy koimmunoprecypitacyjne (CoIP) i pull-down są ściśle powiązanymi metodami identyfikacji stabilnych interakcji białko-białko. Metody te są związane z immunoprecypitacją, metodą oddzielania białka docelowego związanego z przeciwciałem od białek niezwiązanych. W CoIP białko związane z przeciwciałem jest samo związane z innym białkiem, które nie wiąże się z przeciwciałem, po czym następuje proces separacji, który zachowuje kompleks białko-białko. Różnica w testach pull-down polega na tym, że...

Rekonstytucja to proces przywracania wyizolowanej biomolekuły do jej pierwotnej formy lub funkcji. Jest to szczególnie przydatne do badania białek błonowych, które umożliwiają ważne funkcje komórkowe i wpływają na zachowanie pobliskich lipidów. Aby zbadać funkcję oczyszczonych białek błonowych in situ, należy je odtworzyć poprzez integrację ze sztuczną błoną lipidową. W tym filmie przedstawiono koncepcje rekonstytucji białek błonowych i powiązane procedury, takie jak izolacja białek za pomocą...

Rezonansowy transfer energii Förstera (FRET) jest zjawiskiem wykorzystywanym do badania oddziaływań biochemicznych bliskiego zasięgu. W FRET cząsteczka fotoluminescencyjna donorowa może nieradiacyjnie przenosić energię do cząsteczki akceptora, jeśli ich odpowiednie widma emisji i absorbancji nakładają się na siebie. Ilość przenoszonej energii - a co za tym idzie całkowita emisja próbki - zależy od bliskości pary akceptor-donor cząsteczek fotoluminescencyjnych. Analiza FRET jest łączona z innymi...

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) jest podstawowym zjawiskiem optycznym stojącym za bioczujnikami bezznacznikowymi do oceny powinowactwa molekularnego, kinetyki, swoistości i stężenia biomolekuł. W SPR oddziaływania biomolekularne zachodzą na biosensorze wykonanym z cienkiej warstwy metalu na pryzmacie. Interakcje biomolekuł w czasie rzeczywistym można monitorować, mierząc zmiany światła odbitego od spodu metalu. Ten film opisuje podstawowe pojęcia SPR i sposób jego wykorzystania do...