Name: Uchwycenie kinetyki oddziaływania białka kanału jonowego z małymi cząsteczkami za pomocą testu interferometrii biowarstwowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Poznaj metodę interferometrii biowarstwowej do badania kinetyki oddziaływań białka kanału jonowego hEAG1 z małymi cząsteczkami lipidów. Technika ta umożliwia szybki, wysokoprzepustowy screening ligandów przy minimalnym zużyciu próbki białka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Bio-ID Center i SJTU Cross-Disciplinary Research Fund in Medicine and Engineering (YG2016QN66), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31271217) oraz Narodowy Program Badań Podstawowych Chin (2014CB910304).

UWAGA: Linia komórkowa HEK-293T wykazująca ciągłą ekspresję białka kanału hEAG1 znakowanego FLAG jest konstruowana przez transfekcję plazmidu lentiwirusowego pCDH zawierającego sekwencję DNA hEAG1 z FLAG na dystalnym końcu C do komórek HEK-293T, a następnie selekcję oporną na puromycynę, jak wcześniej opisano15.
1. Oczyszczanie powinowactwa białka kanału hEAG1 oznaczonego flagą z komórek HEK-293T
<ol>
	<li>Komórki rozmrażają stabilnie, szybko eksprymując kanały hEAG1 z ciekłego azotu do ciepłej wody (37 °C). Wysiewaj komórki (około 5 x 106 zamrożonych komórek) w naczyniu o średnicy 10 cm. Hoduj komórkę przez noc w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) uzupełnionej 8 ml 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 4 mM L-glutaminy i zmień pożywkę następnego dnia.</li>
	<li>Sprawdź fluorescencję GFP tych komórek HEK-293T za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby upewnić się, że wysoki odsetek komórek stabilnie wyraża kanały hEAG1 w systemie hodowli. Wykładniczo trypsynizuj rosnące komórki 1 ml 0,25% trypsyny przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie dodaj 2 ml płynu hodowlanego zawierającego surowicę, aby zakończyć trawienie. Przenieść 400 μl zawiesiny komórkowej do 15 cm naczynia zawierającego 15 ml kompletnej pożywki DMEM. Przygotuj w sumie cztery naczynia o średnicy 15 cm.</li>
	<li>Zbierz te komórki po 2-3 dniach hodowli, gdy komórki osiągną około 90% zbieżności.
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę wzrostową z komórek i przemyć je dwukrotnie 4 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS, pH = 7,4).</li>
		<li>Wyrzuć PBS po umyciu.</li>
		<li>Zeskrobać komórki do 2 ml 1x PBS na każde naczynie za pomocą skrobania komórek i przenieść zeskrobane komórki za pomocą pipety 1 ml do probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut w temperaturze 420 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zdekantować i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w sumie 4 ml buforu do lizy (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 1% NP-40, pH 7,0, zawierał kompletny inhibitor proteazy) przez 30 minut na lodzie i dokładnie mieszać lizat co 10 minut.</li>
		<li>Odwirować lizat komórkowy przez 10 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść supernatant do probówki o pojemności 5 ml i przechowywać go na lodzie do natychmiastowego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj żywicę affinity anti-FLAG M2.
	<ol>
		<li>Dokładnie zawiesić żywicę (dostarczaną jako 50% zawiesinę w buforze sklepowym) przez delikatne odwrócenie, aby upewnić się, że butelka żelu powinowactwa anti-FLAG M2 jest jednolitą zawiesiną kulek żelowych.</li>
		<li>Natychmiast przenieść 400 μl zawiesiny do schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Odwirowywać zawiesinę przez 30 s przy 8 000 x g w temperaturze 4 °C i ostrożnie wyrzucić supernatant w celu wypłukania buforu zapasowego.</li>
		<li>Dodaj 500 μl 1x PBS do żywicy i zawiesić granulkę za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Następnie odwirować zawiesinę przez 30 s przy 8,000 x g w temperaturze 4 °C i ostrożnie odrzucić sklarowany nad nim PBS. Powtórz ten krok mycia, aby wyczyścić zapisany bufor.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 500 μl supernatantu z ekstraktu białkowego przygotowanego w kroku 1.3.8 do osadu z żywicy, aby zawiesić osad i przenieść zawiesinę do nowej schłodzonej probówki o pojemności 5 ml. Powtórz ten krok ponownie, aby upewnić się, że nie pozostały żadne kulki żelu. Dodaj pozostały ekstrakt białkowy do mieszanki.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez noc na wytrząsarce z prędkością 8 obr./min w temperaturze 4 °C w celu wychwycenia białka fuzyjnego LGR.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę po 12 godzinach inkubacji przez 10 minut w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i przemyć osad trzykrotnie 500 μl 1x PBS. Trzymaj go na lodzie do natychmiastowego użycia.</li>
	<li>Elucja białka FLAG hEAG1 za pomocą 3x peptydu FLAG.
	<ol>
		<li>Przygotować 3X roztwór elucji FLAG. Rozpuścić peptyd 3X FLAG w 500 μL roztworu podstawowego (0,5 M Tris-HCl, 1 M NaCl, pH = 7,5) w stężeniu 8 μg/μL.</li>
		<li>Dodać 10 μl 3x roztwór elucyjny FLAG do 390 μl PBS, aby uzyskać roztwór o stężeniu końcowym 200 ng/μl.</li>
		<li>Dodać 400 μl 3x roztworu elucyjnego FLAG do kulek żelowych przygotowanych w kroku 1.8.</li>
		<li>Inkubować próbkę w wytrząsarce przy 8 obr./min przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odwirowywać żywicę przez 30 s przy 8 000 x g.</li>
		<li>Przenieść supernatant do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do natychmiastowego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test koncentracji i potwierdzenie oczyszczonej fuzji FLAG hEAG1 za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA i Western Blotting
<ol>
	<li>Określić stężenie oczyszczonego białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Użyj próbki 30 μl do analizy zachodniej, aby potwierdzić, że interesujące białko zostało oczyszczone przy użyciu przeciwciała ANTI-FLAG, jak opisano wcześniej15.</li>
</ol>
3. Znakowanie oczyszczonego białka kanałowego biotyną do testu BLI
<ol>
	<li>Przygotować 5 mg/ml roztworu podstawowego biotyny w PBS. Dla każdego badania (dwa biosensory) dodać 3-krotny molowy nadmiar biotyny do 20 μg oczyszczonego białka, aby uzyskać preferowaną N-końcową biotynylację oczyszczonego białka w PBS.</li>
	<li>Próbkę należy inkubować w ciemności na lodzie przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Przygotować bufor do rozcieńczania próbki (SD): PBS z 0,02% polisorbatem 20 i 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA, pH 7,4).</li>
	<li>Przeprowadzić ultrafiltrację, aby zmienić bufor oczyszczonego białka kanału na bufor SD. Usunąć niezwiązaną biotynę za pomocą urządzenia do ultrafiltracji z odcięciem masy cząsteczkowej 30 kDa, dodając bufor SD i odwirowując próbkę przy 12 000 x g, przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć ultrafiltrat z probówki wirówkowej urządzenia do ultrafiltracji, dodać 200 μl buforu SD do urządzenia filtrującego i odwirować próbkę przy 12 000 x g, przez 10 minut w temperaturze 4°C. Powtórzyć tę czynność co najmniej trzy razy.</li>
	<li>Aby zebrać próbkę wymienioną w buforze, odwróconą należy włożyć urządzenie filtrujące do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować je w temperaturze 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Próbkę należy przechowywać na lodzie do natychmiastowego użycia.</li>
</ol>
4. Przygotowanie roztworu2 do testu
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy2 (1 mM) w dejonizowanymH2O, sonikując przez 30 minut na lodzie, jak opisano wcześniej17. Przechowywać roztwór w szklanych fiolkach w temperaturze -20 °C i rozcieńczyć go do końcowych stężeń bezpośrednio przed eksperymentami poprzez energiczne wirowanie.</li>
</ol>
5. Test BLI
<ol>
	<li>Włącz urządzenie i sprawdź okno "stan urządzenia", aby upewnić się, że urządzenie jest w stanie "gotowym", aby wstępnie ogrzać sprzęt co najmniej przez 30 minut przed badaniem BLI.</li>
	<li>Upewnij się, że drzwiczki instrumentu są zamknięte przed otwarciem oprogramowania do akwizycji danych i wybierz "Nowy eksperyment kinetyczny" w Kreatorze eksperymentów.</li>
	<li>Zdefiniuj dołki, które mają być używane na płytce 96-dołkowej, klikając prawym przyciskiem myszy, aby wybrać bufor, obciążenie i próbkę. W przypadku studzienek na próbki jednostkę stężenia biotynylowanego białka fuzyjnego FLAG hEAG1 należy wprowadzić jako molowe (10 μg, 0,09 μM).</li>
	<li>Zdefiniuj etapy testu, w tym linię bazową, obciążenie, asocjację i dysocjację. Wybierz krok testu i kliknij dwukrotnie odpowiednią kolumnę. Dla czujników kontrolnych ustawiana jest kopia definicji testu. Ustaw prędkość obrotową na 1 000. Wybierz odpowiednio 1 minutę dla kroku planu bazowego i 5–10 minut dla ładowania, skojarzenia i dysocjacji. Przeprowadzić test w temperaturze pokojowej (około 24 °C). 
	UWAGA: Istnieją dwie główne procedury: ładowanie biotynylowanego białka kanałowego do czujników i oznaczanie interakcji ze związkami małocząsteczkowymi. Mogą być kontynuowane w sposób ciągły (linia bazowa, obciążenie, linia bazowa, asocjacja i dysocjacja). Alternatywnie można je postępować oddzielnie, aby uniknąć marnowania badanych związków, gdy pierwsza część ładująca nie powiodła się.</li>
	<li>Kliknij kolumny zawierające czujniki i kliknij "Wypełnij", aby wskazać lokalizacje czujników w zasobniku czujników.</li>
	<li>Przejrzyj wszystkie zaplanowane kroki, aby sprawdzić, czy nie ma błędów, i wróć, aby je poprawić.</li>
	<li>Ustaw lokalizację plików danych i kliknij "Przejdź", aby rozpocząć test. 
	UWAGA: Czujniki należy wstępnie zwilżyć przez co najmniej 10 minut w buforze SD, jeśli ten krok został wykonany, ustawienie "Opóźnione rozpoczęcie eksperymentu" należy pominąć. Jeśli nie, ustaw 600 s opóźnienia przed wstępnym zwilżeniem czujników.</li>
	<li>Umieść czarną 96-dołkową płytkę na dnie tacki i włóż róg A1 płytki do wycięcia w tacy, aby osadzić płytkę. Aby dołki mogły załadować czujniki, 200 μl buforu testowego na studzienkę dodać do 2 dołków w rzędzie A i 2 dołków w rzędzie B płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Przygotować kolejną czarną 96-dołkową płytkę jako płytkę do pobierania próbek i napełnić studzienki 200 μl buforu SD w rzędzie B jako kontrolny lub biotynylowany roztwór białka hEAG1 (10 μg) w wierszu A, zgodnie z przypisaniem podczas programowania w kroku 5.3. 
	UWAGA: Unikaj wprowadzania bąbelków.</li>
	<li>Otwórz drzwiczki przyrządu i włóż tackę czujnika i płytkę na próbkę odpowiednio do lewego i prawego uchwytu na płytkę. Sprawdź, czy taca czujnika i płytka próbki są prawidłowo ustawione w oparciu o kształt lewego uchwytu płytki i znacznika "A1" w prawym górnym rogu prawego uchwytu płytki. Zamknij drzwiczki i rozpocznij test.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy danych i załaduj folder zawierający dane testowe. Kliknij "Przetwarzanie", aby przejść do interfejsu menu przetwarzania i możemy zobaczyć kolorowe surowe krzywe kinetyczne</li>.
	<li>W obszarze Krok 1: "Wybór danych" kliknij "Wybór czujnika". Na "Tacy czujnika #1" kliknij studzienki czujnika tylko zwilżone buforem SD i kliknij prawym przyciskiem myszy "Zmień typ czujnika" na "Czujnik odniesienia". Na "Mapie płytki próbnej" oznacz wszystkie niespecyficzne dołki wiążące i kliknij prawym przyciskiem myszy na "Zmień typ studni" na "Studnia referencyjna".</li>
	<li>Zaznacz pole przed "Odejmowanie" kroku 2 i wskaż "Podwójne odniesienie".</li>
	<li>W kroku 3: "Wyrównaj oś Y" wybierz "Linia bazowa" jako krok wyrównania. W polu "Zakres czasu" wprowadź ostatnie 10 s tej linii bazowej (tj. Od: 0,1 Do: 59,8).</li>
	<li>W kroku 4: "Korekcja międzyetapowa" wybierz "wyrównaj do linii bazowej", aby zminimalizować przesunięcia sygnału między krokami asocjacji i dysocjacji.</li>
	<li>W kroku 5: "Proces" w większości przypadków wybierz funkcję filtrowania Savitzky-Golay i przejdź do "Przetwarzaj dane".</li>
	<li>Zapisz nieprzetworzone dane do dalszej analizy danych za pomocą innego oprogramowania w kroku 7: "Zapisz wyniki".</li>
	<li>Kliknij "Analiza | Dopasowanie krzywej".
	<ol>
		<li>W polu "Krok do analizy" wybierz "Asocjacja | Dysocjacja". W polu "Model" (Model) wybierz 1:1. 
		UWAGA: wybraliśmy model 1:1, ponieważ dobrze pasował do naszych oryginalnych danych i uniknął możliwości nadmiernego dopasowania pod model 1:2 lub 2:1 ze względu na ich dużą swobodę. Ale tutaj dostępne są inne opcje, które można odpowiednio wybrać do innej analizy dopasowania dla różnych modeli wiązania analitu.</li>
		<li>W polu "Dopasowanie" wybierz opcję Globalny (pełny). W polu "Grupuj według" wybierz "Kolor". Wybierz "Rmax Unlinked By Sensor", aby umożliwić niezależne dopasowanie maksymalnej odpowiedzi sygnału (Rmax).</li>
		<li>Kliknij "Dopasuj krzywe!", aby rozpocząć analizę regresji nieliniowej. W naszym badaniu wykorzystano równanie Hilla i pojedynczą funkcję wykładniczą.</li>
		<li>Kliknij "Eksport danych |Zapisz raport", aby zapisać wyniki dopasowania. Lub kliknij "Eksport danych | Eksportuj wyniki dopasowania", aby zapisać surowe dane do dalszego tworzenia wykresów i analizy danych za pomocą innego oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+Interactions+with+Model+Lipid+Membranes%3A+Applications+in+Drug+Discovery+and+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery.</a> Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).</li>
<li>van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Property-based+design%3A+Optimization+of+drug+absorption+and+pharmacokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics.</a> J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).</li>
<li>Papo, N., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+peptide+membrane+interaction+using+surface+plasmon+resonance%3A+Differentiation+between+pore+formation+versus+membrane+disruption+by+lytic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides.</a> Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).</li>
<li>Fechner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+does+matter%21+Label-free+detection+of+small+molecule-protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).</li>
<li>Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Bio-Layer+Interferometry+for+the+analysis+of+protein%2Fliposome+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Biomed.+Anal%22%5BJournal%5D)">Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).</li>
<li>Wartchow, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Aided+Mol.+Des%22%5BJournal%5D)">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li>
<li>Shah, N. B., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-layer+Interferometry+for+Measuring+Kinetics+of+Protein-protein+Interactions+and+Allosteric+Ligand+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects.</a> J. Vis. Exp. (84), e51383(2014).</li>
<li>Occhiodoro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+human+ether-a-go-go+potassium+channel+expressed+in+myoblasts+at+the+onset+of+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Lett%22%5BJournal%5D)">Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion.</a> Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).</li>
<li>Pardo, L. A., Stuhmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eag1%3A+An+emerging+oncological+target%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Eag1: An emerging oncological target.</a> Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).</li>
<li>Simons, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+voltage-gated+potassium+channel+gene+KCNH1+cause+Temple-Baraitser+syndrome+and+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy.</a> Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).</li>
<li>Kortum, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+KCNH1+and+ATP6V1B2+cause+Zimmermann-Laband+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome.</a> Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).</li>
<li>Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eag1+K%2B+Channel%3A+Endogenous+Regulation+and+Functions+in+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid.+Med.+Cell.+Longev%22%5BJournal%5D)">Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).</li>
<li>Han, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+EAG+channels+are+directly+modulated+by+PIP2+as+revealed+by+electrophysiological+and+optical+interference+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations.</a> Sci. Rep. 6, (2016).</li>
<li>Do, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+determining+dynamic+binding+capacity+of+resins+for+the+purification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PREP%22%5BJournal%5D)">A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins.</a> PREP. 60 (2), 147-150 (2008).</li>
<li>Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+specificities+of+inwardly+rectifying+K%2B+channels+for+phosphoinositides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides.</a> J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).</li>
<li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+drug+targets+are+there%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">How many drug targets are there?</a> Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).</li>
<li>Suh, B. C., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP2+is+a+necessary+cofactor+for+ion+channel+function%3A+How+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why?</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+High-affinity+Antibody-antigen+Binding+Kinetics+Using+Four+Biosensor+Platforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms.</a> J. Vis. Exp. (122), e55659(2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Membranowe kanały jonowe zostały zweryfikowane jako główne cele terapeutyczne ponad 13% obecnie znanych leków stosowanych w leczeniu różnych chorób człowieka, w tym zaburzeń sercowo-naczyniowych i neurologicznych18. Zapis patch-clamp, złoty standard pomiaru funkcjonalności kanałów jonowych z małymi cząsteczkami, jest szeroko stosowany do badań przesiewowych ligandów kanałów jonowych. Jednak takie podejścia elektrofizjologiczne nie mogą wykazać, czy małe cząsteczki wiążą się z kanałem bezpośrednio,...

Celowanie małymi cząsteczkami w białka kanałów jonowych dostępnych na powierzchni komórki oferuje ogromny potencjał dla badań przesiewowych ligandów i odkrywania leków biologicznych1,2,3. W związku z tym potrzebne jest odpowiednie narzędzie do badania interakcji między kanałem jonowym a małymi cząsteczkami i odpowiadającej im funkcji. Wykazano, że zapis patch-clamp jest unikalną i niezastąpioną techniką w teście funkcjonalnym kanałów jonowych. Jednak ustalenie, czy małe cząsteczki są bezpośrednio ukierunkowane na kanały jonowe, wymaga innych technologii. Tradycyjnie, test wiązania ligandów promieniotwórczych stosowano do obserwacji kinetyki wiązania między małą cząsteczką a jej docelowym białkiem kanału jonowego. Zastosowanie tej techniki jest jednak ograniczone ze względu na jej wymóg w zakresie znakowania i wykrywania substancji promieniotwórczych. Co więcej, warunkiem koniecznym do oznaczenia małego liganda w badaniu jest zapobieganie jego stosowaniu w wielu typach kanałów jonowych bez znanego specyficznego liganda. Niektóre techniki bezznacznikowe, takie jak spektroskopia NMR, dyfrakcja rentgenowska, termoforeza w mikroskali (MST)4 i powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) zostały wykorzystane do pomiaru oddziaływań białko-mała cząsteczka. Jednak tego typu testy zwykle nie są w stanie dostarczyć wystarczających informacji ze względu na trudności w uzyskaniu białka o pełnej długości, niską rozdzielczość dynamiki, niską przepustowość i wysoki koszt5. W przeciwieństwie do tych technik, interferometria biowarstwowa (BLI) wyłania się jako nowatorska metodologia bez znaczników, która ma przezwyciężyć te wady wykrywania interakcji białko-mała cząsteczka poprzez unieruchomienie niewielkiej ilości próbki białka na powierzchni biosensora i pomiar sygnałów zmiany optycznej6,7. Jako obiecująca platforma biosensoryczna, technika BLI jest już stosowana w celu obserwacji interakcji małych cząsteczek z naturalnymi białkami rozpuszczalnymi w wodzie, takimi jak ludzkie przeciwciało monoklonalne CR80208, a szczegółowa procedura testowa została opisana w poprzednim artykule9. Chociaż uznano kluczową rolę białka kanału jonowego w odkrywaniu nowych celów terapeutycznych, nie opisano testu interakcji białko-mała cząsteczka kanału jonowego opartego na BLI.
Ludzkie kanały Ether à go-go (hEAG1) są wyrażane w różnych typach komórek nowotworowych i ośrodkowego układu nerwowego, co czyni ten kanał potencjalnym celem terapeutycznym dla wielu nowotworów i zaburzeń neuronalnych10,11,12,13,14. Badanie elektrofizjologiczne w naszym laboratorium potwierdziło hamujące działanie fosfatydyloinozytolu 4,5-bisfosforanu (2) na kanał hEAG115. Opierając się na naszych wynikach, testowanie bezpośredniej interakcji2 z hEAG1 za pomocą techniki BLI może służyć jako model dla innych typów interakcji białko-drobnocząsteczkowy związek kanału jonowego, szczególnie dla tych kanałów, w których brakuje specyficznych ligandów. Zgodnie z instrukcjami testu BLI przygotowaliśmy biotynylowane białka hEAG1 i unieruchomiliśmy je na powierzchni końcówek biosensorów streptawidyny (SA), a następnie poddaliśmy je interakcji z roztworami2, aby zaobserwować ich bezpośrednie wiązanie między białkiem a lipidem. Po przyłączeniu2 do powierzchni pokrytej białkiem hEAG1, grubość warstwy na powierzchni wzrasta, co bezpośrednio koreluje przesunięcie widmowe i może być mierzone w czasie rzeczywistym16. Kinetykę wiązania można określić ze względu na dodatnie przesunięcie w kroku asocjacji i ujemne przesunięcie w kroku dysocjacji. Zgodnie z tą zasadą oczyściliśmy funkcjonalne białko kanału jonowego hEAG1 ze stabilnego systemu ekspresji HEK-239T za pomocą metody oczyszczania powinowactwa w celu utrzymania stanu funkcjonalnego in vitro, a następnie zmierzyliśmy kinetykę wiązania o różnym stężeniu2 i uzyskaliśmy możliwe do uzyskania dane kinetyczne, jak zaobserwowano w pomiarach elektrofizjologicznych15. Ścisła zgodność między wynikami BLI a pomiarami elektrofizjologicznymi po raz pierwszy pokazuje przydatność BLI jako odpowiedniego narzędzia analitycznego do interakcji białko-mała cząsteczka błony kanału jonowego.

<table><tbody><tr><td>DMEM/Pożywka o wysokiej zawartości glukozy</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>1697550</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>150 mm X 25 mm</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Substytut</td><td>Amresco</td><td>E109</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>BBI Nauki Przyrodnicze</td><td>A610476</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>BBI Nauki Przyrodnicze</td><td>A610440</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>BBI Nauki Przyrodnicze A600332</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monolaurynian polioksyetyleno-20-sorbitanu</td><td>BBI Nauki przyrodnicze A600560</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>3x peptyd FLAG</td><td>Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Octet-RED96</td><td>Pal/Fort&eacute; Bio</td><td>30-5048</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>Wersja 7.1</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy danych</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>Wersja 7.1</td><td></td></tr><tr><td>Biosensor/Streptawidyna</td><td>Pal/Fort i ostry; Bio</td><td>18-5019</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do mikromiareczkowania</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS-LC-LC-Biotyna</td><td>ThermoFisher</td><td>21338</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna odśrodkowa</td><td>ThermoFisher</td><td>75004250</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Drabinka białkowa wstępnie barwiona</td><td>ThermoScientific</td><td>318120</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do ultrafiltracji</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC503008</td><td>NMWL 30 kDa</td></tr><tr><td>fosfatydyloinozytolu 4, 5-bisfosforan (2)</td><td>Sigma</td><td>P9763</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalne przeciwciało ANTI-FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>1:2000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>kozy anty-mysie przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>1:5000 Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Ulepszony zestaw do oznaczania białka BCA</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Tabletki koktajlowe</td><td>Roche</td><td>04693159001</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Imager 600 System obrazowania</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System Western blot</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uchwycenie kinetyki oddziaływania białka kanału jonowego z małymi cząsteczkami za pomocą testu interferometrii biowarstwowej

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Test interferometrii warstwy biologicznej (BLI) jest cennym narzędziem do pomiaru oddziaływań białko-białko i białko-mała cząsteczka. W tym miejscu najpierw opisujemy zastosowanie tej nowatorskiej techniki bezznacznikowej do badania interakcji ludzkich białek kanałowych EAG1 (hEAG1) z małą cząsteczką2. Kanał hEAG1 został uznany za potencjalny cel terapeutyczny ze względu na jego nieprawidłową nadekspresję w nowotworach i kilka mutacji związanych ze wzmocnieniem funkcji zaangażowanych w niektóre rodzaje chorób neurologicznych. Oczyściliśmy białka kanału hEAG1 ze stabilnego systemu ekspresji ssaków i zmierzyliśmy interakcję z2 przez BLI. Udany pomiar kinetyki wiązania między białkiem hEAG1 a2 pokazuje, że test BLI jest potencjalnym podejściem o wysokiej przepustowości stosowanym do nowych badań przesiewowych ligandów małocząsteczkowych w farmakologii kanałów jonowych.

Oczyszczono białko kanału hEAG1 z fuzją FLAG z komórek HEK-293T z trwałą nadekspresją hEAG1. Funkcję tego białka fuzyjnego wykazano przy użyciu metody patch-clamp, a jakość i swoistość oczyszczonego białka potwierdzono za pomocą Western blot (Rycina 1). Oczyszczone białko kanału poddano biotinylacji w celu przeprowadzenia analizy oddziaływań z lipidami (PIP2) przy użyciu analizy BLI w czasie rzeczywistym. Konfiguracja analizy wiązania BLI przedstaw...

Protokół tutaj opisuje interakcje oczyszczonego białka kanału jonowego hEAG1 z małocząsteczkowym ligandem lipidowym fosfatydyloinozytolem 4,5-bisfosforanem (2). Pomiar pokazuje, że BLI może być potencjalną metodą badań przesiewowych ligandów kanałów jonowych małych cząsteczek.

Uchwycenie kinetyki oddziaływania białka kanału jonowego z małymi cząsteczkami za pomocą testu interferometrii biowarstwowej

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Ogólnym celem tego testu interferometrii warstwy biologicznej lub testu BLI jest zmierzenie potencjalnej interakcji między oczyszczonym białkiem kanału jonowego hEAG1 a lipidami drobnocząsteczkowymi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie farmakologii kanałów jonowych, takie jak to, czy mała cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania może bezpośrednio oddziaływać z tym kanałem jonowym i jaka jest kinetyka tej interakcji? Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to metoda bezrobotna i o wysokiej przepustowości.Potrzebna jest tylko niewielka ilość unieruchomionego białka. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ udany test obejmuje wiele etapów, w tym ekspresję białka, oczyszczanie, etykietowanie, dokładnie dostrojony czujnik i analizę danych. Po wyhodowaniu limfocytów T HEK293 wykazujących ekspresję hEAG1 przez dwa do trzech dni, zbierz komórki, usuwając pożywkę wzrostową i użyj czterech mililitrów PBS do dwukrotnego przemycia komórek.Wyrzuć PBS. Umieść komórki w dwóch mililitrach PBS na miskę i użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby przenieść je do komórek do 15-mililitrowej probówki. Odwiru

capturing-interaction-kinetics-an-ion-channel-protein-with-small

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy technologię interferometrii biowarstw (BLI) do wykrywania interakcji międzycząsteczkowych między ligandami a docelowymi analitami w czasie rzeczywistym. BLI mierzy zmiany we wzorze interferencji światła białego odbitego od warstwy unieruchomionych ligandów na powierzchni biosensora, gdy oddziałują one z analitami w roztworze.

Technologia interferometrii biowarstw do wykrywania interakcji między ligandem a analitem

Protokoły tutaj opisują kinetyczne testy interakcji białko-białko za pomocą interferometrii warstwy biologicznej. Syntaza ATP typu F, która bierze udział w metabolizmie energii komórkowej, może być hamowana przez swoją ε podjednostka u bakterii. Dostosowaliśmy interferometrię biowarstw do badania oddziaływań kompleksu katalitycznego z hamującą domeną C-końcową ε.

Interferometria biowarstwowa do pomiaru kinetyki oddziaływań białko-białko i efektów ligandów allosterycznych

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Interakcje czynników transkrypcyjnych (TF) z polimerazą RNA są zwykle badane za pomocą testów pulldown. Stosujemy technologię interferometrii biowarstwowej (BLI) w celu scharakteryzowania oddziaływania GrgA z polimerazą chlamydiowego RNA. W porównaniu z testami pulldown, BLI wykrywa asocjację i dysocjację w czasie rzeczywistym, oferuje wyższą czułość i jest wysoce ilościowy.

Zastosowanie interferometrii biowarstwowej (BLI) do badania interakcji białko-białko w transkrypcji

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Ten artykuł opisuje protokół badania interakcji DNA-białko za pomocą systemu interferometrii biowarstwowej (BLI) opartego na streptawidynie. Przedstawiono w nim podstawowe kroki i rozważania dotyczące wykorzystania podstawowej lub zaawansowanej kinetyki wiązania w celu określenia powinowactwa wiązania równowagi (KD) oddziaływania.

Analiza interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie

Interakcja między kanałami HCN a ich podjednostką pomocniczą została zidentyfikowana jako cel terapeutyczny w dużym zaburzeniu depresyjnym. W tym artykule przedstawiono opartą na polaryzacji fluorescencyjnej metodę identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów tej interakcji białko-białko.

Metoda identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów oddziaływania białko-białko między HCN1 i TRIP8b

Interakcje białko-białko mogą zachodzić zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie komórki. Aby zbadać te interakcje, stosuje się tradycyjną koimmunoprecypitację i nowoczesny test ligacji zbliżeniowej. W tym badaniu porównujemy te dwie metody wizualizacji rozkładu oddziaływań NF90-RBM3 w jądrze i cytoplazmie.

Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Mechanowrażliwe kanały jonowe są często badane pod kątem wrażliwości na przepływ płynu/siłę ścinającą z zapisem patch-clamp. Jednakże, w zależności od protokołu eksperymentalnego, wynik dotyczący regulacji przepływu płynów w kanałach jonowych może być błędny. W tym miejscu przedstawiamy metody zapobiegania i korygowania takich błędów wraz z podstawami teoretycznymi.

Pomiar stężenia jonów w niezmieszanej warstwie granicznej za pomocą otwartej pipety krosowej: implikacje w kontroli kanałów jonowych przez przepływ płynu

Poznaj metodę interferometrii biowarstwowej do badania kinetyki oddziaływań białka kanału jonowego hEAG1 z małymi cząsteczkami lipidów. Technika ta umożliwia szybki, wysokoprzepustowy screening ligandów przy minimalnym zużyciu próbki białka.

Uchwycenie kinetyki oddziaływania białka kanału jonowego z małymi cząsteczkami za pomocą testu interferometrii biowarstwowej

Przeglądaj więcej filmów