Uchwycenie kinetyki oddziaływania białka kanału jonowego z małymi cząsteczkami za pomocą testu interferometrii biowarstwowej

Ogólnym celem tego testu interferometrii warstwy biologicznej lub testu BLI jest zmierzenie potencjalnej interakcji między oczyszczonym białkiem kanału jonowego hEAG1 a lipidami drobnocząsteczkowymi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie farmakologii kanałów jonowych, takie jak to, czy mała cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania może bezpośrednio oddziaływać z tym kanałem jonowym i jaka jest kinetyka tej interakcji? Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to metoda bezrobotna i o wysokiej przepustowości.

Potrzebna jest tylko niewielka ilość unieruchomionego białka. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ udany test obejmuje wiele etapów, w tym ekspresję białka, oczyszczanie, etykietowanie, dokładnie dostrojony czujnik i analizę danych. Po wyhodowaniu limfocytów T HEK293 wykazujących ekspresję hEAG1 przez dwa do trzech dni, zbierz komórki, usuwając pożywkę wzrostową i użyj czterech mililitrów PBS do dwukrotnego przemycia komórek.

Wyrzuć PBS. Umieść komórki w dwóch mililitrach PBS na miskę i użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby przenieść je do komórek do 15-mililitrowej probówki. Odwiruj zawiesinę komórkową pod ciśnieniem 420-krotności grawitacji i czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie zdekantować supernatant i użyć czterech mililitrów buforu do lizy do ponownego zawieszenia osadu. Inkubować zawiesinę na lodzie przez 30 minut, dokładnie wirując lizat co 10 minut. Następnie odwiruj lizat komórkowy przy 12 000 razy grawitacji i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.

Następnie przenieś supernatant do pięciomililitrowej probówki i trzymaj go na lodzie do natychmiastowego użycia. Aby przygotować żywicę affinity anti-FLAG M2, dokładnie zawiesij żywicę przez delikatne odwrócenie, aby upewnić się, że butelka żelu anty-FLAG M2 affinity jest jednolitą zawiesiną kulek żelowych. Natychmiast przenieś 400 mikrolitrów zawiesiny do schłodzonej rurki o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie odwiruj zawiesinę pod ciśnieniem 8 000 razy większym niż grawitacja i cztery stopnie Celsjusza przez 30 sekund i ostrożnie wyrzuć supernatant, aby wypłukać bufor magazynowy. Aby ponownie zawiesić osad żywicy, dodaj 500 mikrolitrów supernatantu ekstraktu białkowego do żywicy i przenieś zawiesinę do nowej, schłodzonej, pięciomililitrowej probówki. Odpipetuj dodatkowe 500 mikrolitrów ekstraktu białkowego do oryginalnej probówki, aby zebrać wszelkie pozostałe kulki i przenieś ekstrakt do pięciomililitrowej probówki.

Inkubuj mieszaninę na wytrząsarce z prędkością ośmiu obrotów na minutę i czterech stopni Celsjusza przez noc, aby związać białko fuzyjne FLAG z żywicą. Następnie odwiruj mieszaninę pod ciśnieniem 1000 razy większym niż grawitacja w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Odrzucić supernatant i przemyć osad trzykrotnie 500 mikrolitrami jednego x PBS.

Trzymaj go na lodzie do natychmiastowego użycia. Dodaj 10 mikrolitrów trzech x roztworu elucyjnego FLAG do 390 mikrolitrów PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 200 nanogramów na mikrolitr. Następnie do wcześniej przygotowanych kulek żelowych dodać 400 mikrolitrów trzech x roztworu elucyjnego FLAG.

Inkubować próbkę w inkubatorze z wytrząsaniem przy ośmiu obr./min i czterech stopniach Celsjusza przez dwie godziny. Następnie odwiruj żywicę przy 8000 razy większej grawitacji przez 30 sekund. Przenieś supernatant do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza do natychmiastowego użycia.

Użyj testu białka BCA zgodnie z instrukcjami producenta, aby określić stężenie oczyszczonego białka. Następnie użyj próbki o objętości 30 mikrolitrów do analizy Western Blot z przeciwciałem anty-Flag, aby potwierdzić, że interesujące białko zostało oczyszczone. Aby oznaczyć oczyszczone białko biotyną, przygotuj pięć miligramów na mililitr roztworu podstawowego biotyny w PBS.

Do każdego testu dwóch biosensorów dodać trzykrotny molowy nadmiar biotyny do 20 mikrogramów oczyszczonego białka, aby uzyskać preferowaną N-końcową biotynylację oczyszczonego białka w PBS. Próbkę należy inkubować w ciemności na lodzie przez co najmniej 30 minut. Aby usunąć niezwiązaną biotynę i bufor, wymień białko na bufor SD.

Przenieś białko do urządzenia ultrafiltracyjnego z odcięciem molekularnym 30 kilodaltonów. Następnie dodaj bufor SD i odwiruj próbkę pod ciśnieniem 12 000 razy większym niż grawitacja i cztery stopnie Celsjusza przez 10 minut. Usunąć ultrafiltrat z probówki wirówkowej.

Dodać 200 mikrolitrów buforu SD do urządzenia filtrującego i ponownie odwirować próbkę. Powtórz proces co najmniej trzy razy. Zbierz próbkę wymienioną w buforze, obracając urządzenie filtrujące i umieść ją w probówce o pojemności 1,5 mililitra.

Odwirować próbkę w temperaturze 2 000 razy większej niż grawitacja i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Przechowywać próbkę na lodzie do natychmiastowego użycia. Aby przeprowadzić test BLI, 30 minut przed badaniem należy rozgrzać sprzęt, włączając instrument.

Przed rozpoczęciem sprawdź okno stanu urządzenia, aby potwierdzić, że urządzenie jest w stanie gotowości. Upewnij się, że drzwi instrumentu są zamknięte przed otwarciem oprogramowania do akwizycji danych i w kreatorze eksperymentu wybierz Nowy eksperyment kinetyczny. Zdefiniuj dołki, które mają być używane na płycie 96-dołkowej, klikając prawym przyciskiem myszy, aby wybrać bufor, ładunek i próbkę.

W przypadku studzienek na próbki jednostką stężenia PIP2 powinny być wprowadzone w postaci zębów trzonowych. Aby zdefiniować kroki testu, wybierz krok i kliknij dwukrotnie odpowiednią kolumnę. Dla czujników kontrolnych ustawiany jest duplikat definicji testu.

Ustaw prędkość obrotową na 1 000. Wybierz jedną minutę dla kroku planu bazowego i od pięciu do 10 minut odpowiednio dla ładowania, skojarzenia i dysocjacji. Wykonaj test w temperaturze pokojowej.

Kliknij kolumny zawierające czujniki, a następnie kliknij przycisk Wypełnij, aby wskazać położenie czujników w zasobniku czujników. Przejrzyj wszystkie zaplanowane kroki, aby sprawdzić, czy nie ma błędów, i wróć, aby je poprawić. W całym działaniu testu BLI etap przeglądu wszystkich zaplanowanych kroków może zostać zaniedbany przez badacza.

Jednak bardzo ważne jest, aby sprawdzić, czy wszystkie zaplanowane kroki są poprawne. Ustaw lokalizację plików danych i kliknij przycisk Przejdź, aby rozpocząć test. Uruchom test i przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym.

Jak widać w tym eksperymencie z zaciskiem krosowym w limfocytie T HEK293, stabilnie wyrażającym hEAG1, zależne od napięcia zewnętrzne prądy potasowe sugerują, że funkcjonalne kanały hEAG1 są wysoce eksprymowane w komórkach. Za pomocą przeciwciała anty-FLAG ten Western Blot hEAG1 z oczyszczonych próbek białka wskazuje na jakość i swoistość oczyszczonego białka. Oczyszczone białko kanałowe poddano biotynylacji w celu przeprowadzenia testu interakcji z lipidem PIP2 przy użyciu testu BLI w czasie rzeczywistym.

Typowa krzywa wiązania między hEAG1 i PIP2 jest pokazana tutaj. hEAG1 jest związany z PIP2 w sposób zależny od stężenia. Skumulowane stężenia PIP2 odpowiadają śladom danych biosensora.

Ten reprezentatywny test pokazuje zmiany w interferencji optycznej w różnych stężeniach PIP2. Na koniec uzyskano dopasowanie krzywej z równaniem Hilla na podstawie wartości szczytowej sygnału zakłóceń optycznych zmierzonej przy różnych stężeniach PIP2 i wyznaczono stałe dysocjacji równowagi między hEAG1 i PIP2. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, bardzo ważne jest, aby pamiętać o przejrzeniu wszystkich zaplanowanych kroków, aby upewnić się, że ta procedura jest poprawna. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak zacisk krosowy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak identyfikacja funkcji tego kanału jonowego po związaniu małej cząsteczki. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniem przesiewowym kanałów jonowych ligandów w celu zbadania nowych ligandów w odkrywaniu leków w kanałach jonowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować białko kanału jonowego i jak przetestować jego interakcję z małymi cząsteczkami metodą BLI.