Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości sieci neurowyspiowej ludzkiej trzustki

Ogólnym celem tego protokołu jest zademonstrowanie zoptymalizowanej, pasywnej metody oczyszczania optycznego, która jest odpowiednia do stosowania z ludzką tkanką trzustki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii związane z cukrzycą, dostarczając szczegółowych informacji na temat unerwienia wysp trzustkowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że metoda clearingu zapewnia przezroczystość ludzkiej tkanki trzustki do zastosowania w obrazowaniu konfokalnym o wysokiej rozdzielczości.

Na początek utrwal próbkę trzustki, umieszczając ją w świeżo przygotowanym 4% paraformaldehydzie i inkubuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 48 godzin. Następnie schłodzić kolbę, umieszczając ją w wiadrze z lodem. A następnie umieść wiadro na magnetycznej płycie mieszającej.

Upewnij się, że kolba jest płaska i dodaj mieszadło magnetyczne. Wlej 147,8 mililitra lodowatej destylowanej, dejonizowanej wody do kolby. Następnie dodaj 20 mililitrów 0,1 molowego PBS, 20 mililitrów lodowatego 40% roztworu akrylamidu, 12,2 mililitra 16% roztworu paraformaldehydu i 250 miligramów inicjatora VA-044.

Mieszaj cały roztwór hydrożelu przez co najmniej 10 minut. Następnie umieść stożkową rurkę o pojemności 15 mililitrów w lodzie obok kolby zawierającej roztwór hydrożelu. Odpipetować 14 mililitrów roztworu monomeru do probówki.

i dodać jedną część utrwalonej i pociętej próbki tkanki. Następnie zakryj rurkę. Próbkę inkubować w roztworze monomeru przez 3 dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc ją przed światłem.

Po inkubacji umieścić próbkę na lodzie. Następnie podłącz rurkę do zbiornika azotu przez zawór odcinający. Trzymając próbkę na lodzie, ostrożnie użyj igły podskórnej o rozmiarze 18, aby przekłuć nasadkę stożkowej rurki zawierającej próbkę z jednej strony.

Włóż igłę do probówki, aż znajdzie się pod powierzchnią ciekłego roztworu monomeru. Następnie użyj kolejnej igły podskórnej o rozmiarze 18, aby nakłuć przeciwną stronę nasadki, ale nie pozwól, aby zanurzyła się w roztworze, aby mogła działać jak odpowietrznik. Podłącz rurkę ze zbiornika azotu do igły podskórnej zanurzonej pod hydrożelem i powoli włączaj azot, aż zacznie równomiernie bulgotać w cieczy.

Po odtlenieniu szybko usuń obie igły i przykryj nakrętkę folią parafinową, aby zapobiec dalszej wymianie gazów między rurką a otoczeniem. Na koniec umieść próbkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy godziny, aby spolimeryzować hydrożel. Po polimeryzacji odlej pozostałą część hydrożelu.

Następnie przemyj próbkę w 3 do 5 wymianach 0,01 mola PBS przez 15 minut na każdym etapie mycia. Po umyciu przenieść próbkę do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów zawierającej 40 mililitrów lub buforu czyszczącego. Inkubować próbkę w buforze czyszczącym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i zmieniać próbkę na świeży bufor czyszczący co drugi dzień.

Aby sprawdzić, czy jest prawidłowo oczyszczona, przytrzymaj próbkę pod światłem i upewnij się, że próbka przepuszcza światło, ale zachowuje pewne brązowe zabarwienie w obszarach zewnątrzwydzielniczych. Nadmiernie oczyszczona próbka będzie wydawała się postrzępiona na krawędziach, a tekstura będzie bardzo miękka po zebraniu kleszczami. Często zdarza się, że próbka oczyszcza się nierównomiernie.

Wymień bufor czyszczący na 40 mililitrów 0,01 molowego PBS i umieść próbki na wytrząsarce z prędkością 60 obr./min na jeden dzień w temperaturze pokojowej. Wykonaj cztery do pięciu zmian bufora i pozwól, aby końcowe mycie trwało przez noc. Następnie przygotuj bufor barwiący PACT w probówce o płaskim dnie o pojemności 2 mililitrów i dodaj 2% normalnej surowicy do 1 mililitra podstawowego buforu PACT.

Następnie dodaj około pięciokrotność standardowej ilości przeciwciała pierwszorzędowego do buforu barwiącego. Za pomocą szpatułki wyjąć próbkę z buforu do płukania i nanieść nadmiar buforu na ręcznik papierowy. Umieścić próbkę w probówce z pierwszorzędowym roztworem przeciwciała i inkubować ją w roztworze przez dwa do czterech dni w temperaturze pokojowej, na wytrząsarce, z prędkością 60 obr./min.

Po inkubacji usunąć roztwór przeciwciała i dodać 0,01 molowego PBS. Dokładnie umyć próbki na wytrząsarce z prędkością 60 obr./min, zmieniając bufor na świeży cztery do pięciu razy i pozostawiając końcowe płukanie na wytrząsarce na noc. Następnie dodać przeciwciało drugorzędowe w stężeniu od 1 do 200 do buforu barwiącego PACT z 2% dodatkiem surowicy.

Za pomocą szpatułki wyjmij próbkę z bufora do mycia i zetrzyj nadmiar buforu na ręcznik papierowy. Następnie umieść próbkę w probówce z wtórnym roztworem przeciwciała. Chronić próbkę przed światłem podczas inkubacji próbki w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przy 60 obr./min przez dwa dni.

Po inkubacji usunąć roztwór przeciwciała i zastąpić go 0,01 molowym PBS. Dokładnie umyć próbki na wytrząsarce z prędkością 60 obr./min, zmieniając cztery do pięciu razy na świeży bufor i pozostawiając końcowe płukanie na wytrząsarce na noc. Na początek przygotuj bufor roztworu dopasowanego do współczynnika załamania światła, najpierw ważąc 11 gramów ośrodka o gradiencie gęstości niejonowej i ostrożnie przenosząc go do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Następnie dodaj 5 mililitrów 0,02-molowego buforu fosforanowego za pomocą szpatułki, aby uwolnić powietrze ze sproszkowanego podłoża o gradiencie gęstości niejonowej. W razie potrzeby zwiększ objętość do 10 mililitrów, używając więcej 0,02 molowego buforu fosforanowego, wymieszaj go szpatułką, a następnie zeskrob nadmiar ze szpatułki do probówki. Inkubować bufor w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż całkowicie się rozpuści, odwracając go i delikatnie mieszając od czasu do czasu.

Przenieść próbki do buforu roztworu dopasowania indeksu refrakcji i inkubować je na stole chronionym przed światłem przez dwa do czterech dni przed obrazowaniem. Tuż przed obrazowaniem umieść niewielką ilość roztworu dopasowania indeksu refrakcji w szkiełku nakrywkowym z ośmiodołkową dolną komorą. Następnie dodaj próbkę do studzienki i zakryj szkiełko.

W ludzkiej trzustce wyspy trzustkowe mogą być wyznaczone przez insulinę, glukagon i wydzielany Grana Three odpowiednio dla komórek beta, komórek alfa lub wszystkich komórek endokrynnych. Komórki Schwanna wydają się białe, a komórki endokrynne są wybarwione insuliną lub glukagonem. Nerwy, krążące obok naczyń krwionośnych na obrzeżach wysp wysepkowych, wyróżniają się białymi liniami i rozciągają się w głąb wysepek.

Tutaj wyraźnie widać kontakt między komórkami Schwanna a komórkami endokrynnymi. W tym przypadku próbka przygotowana przy użyciu metod pokazanych na tym filmie została wybarwiona pod kątem wazoaktywnego peptydu jelitowego i zobrazowana za pomocą mikroskopu z użyciem arkusza światła. Włókna nerwowe są wyraźnie widoczne w wysokiej rozdzielczości i pokazane są owijając przewód na pierwszym planie i ganglion w tle.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o użyciu obszarów zrazikowych trzustki, które są wolne od głównych przewodów i naczyń.