Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa

Dwuwymiarowa lub 2D elektroforeza żelowa to technika wykorzystująca dwie różne metody separacji, które mogą oddzielić tysiące białek z jednej mieszaniny. Jedna z technik, SDS-PAGE lub elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu, nie jest w stanie samodzielnie całkowicie oddzielić złożonych mieszanin. Elektroforeza żelowa 2D sprzęga SDS-PAGE z drugą metodą, ogniskowaniem izoelektrycznym lub IEF, która rozdziela się na podstawie punktów izoelektrycznych, co pozwala na rozdzielczość potencjalnie wszystkich białek w lizacie komórkowym. Ten film pokaże zasady elektroforezy żelowej 2D, ogólną procedurę i niektóre z jej zastosowań biomedycznych.

Elektroforeza żelowa 2D zaczyna się od IEF jako pierwszego wymiaru. Każde białko ma wartość pH, zwaną punktem izoelektrycznym lub pI, gdzie ładunek netto wynosi zero. Kiedy białko jest poddawane działaniu pola elektrycznego, porusza się w kierunku elektrody z przeciwnym ładunkiem. Interesujące próbki są ładowane na unieruchomione paski gradientu pH lub IPG, które mają osadzone amfolity, cząsteczki zawierające zarówno grupy kwasowe, jak i zasadowe. Pole elektryczne jest następnie przykładane do paska gradientu pH, powodując migrację białek, aż osiągną wartość pH odpowiadającą ich pI, gdzie tracą ładunek netto.

Przed uruchomieniem drugiego wymiaru, osadzone białka są traktowane SDS, denaturując je i zapewniając jednorodny ładunek ujemny. Po zakończeniu paski IPG umieszcza się na żelu poliakrylamidowym. Zastosowane pole elektryczne przyciąga białka w kierunku anody, przy czym większe białka poruszają się wolniej przez żel.

Po oddzieleniu mieszaniny białek zgodnie z pI i masą cząsteczkową, mapa proteomu jest wizualizowana za pomocą barwienia i identyfikowane są białka będące przedmiotem zainteresowania.

Teraz, gdy omówiliśmy zasady elektroforezy żelowej 2D, przejdźmy do typowej procedury laboratoryjnej.

Zanim eksperyment będzie mógł zostać przeprowadzony, białka muszą zostać rozpuszczone w pożywce. Solubilizacja próbki uzyskuje się poprzez deagregację białek za pomocą kombinacji środków chaotropowych do zakłócania oddziaływań wiązań wodorowych, niejonowych detergentów zapobiegających zmianie ładunku białek, środków redukujących do zrywania wiązań dwusiarczkowych i buforów. Aby usunąć interferencyjne obfite białka i inne cząsteczki, materiał jest sekwencyjnie ekstrahowany przez wirowanie i zbieranie powstałego osadu; następnie leczenie endonukleazą, enzymem używanym do spożywania dowolnego DNA, które mogłoby zakłócać eksperyment.

Po rozpuszczeniu białek paski IPG przygotowuje się przez spłukiwanie roztworem do czyszczenia pasków i pozostawia do wyschnięcia do góry nogami. Każdemu paskowi przypisywany jest następnie numer uchwytu paska. Po przygotowaniu ekstrakt komórkowy jest ładowany na paski powolnym, przesuwającym się ruchem od końca ujemnego do dodatniego. W celu nawodnienia wilgotną bibułę umieszcza się na elektrodzie i pod paskami żelu; paski IPG są następnie nakładane na instrument IEF. Przykładany jest wysoki prąd elektryczny, a białka zaczynają migrować.

Po wykonaniu pierwszego wymiaru, żel do SDS-PAGE jest przygotowywany w aparacie odlewniczym. Paski IPG są poddawane obróbce poprzez umieszczenie ich stroną zadrukowaną do dołu w buforze równowagi zawierającym SDS. Jednostka elektroforezy jest przygotowywana z dodatkiem buforu do elektroforezy. Obrobione paski IPG są zbierane za pomocą pęsety, umieszczane na płytkach żelowych i uszczelniane roztworem uszczelniającym agarozę. Następnie źródło napięcia przykłada pole elektryczne, które jest utrzymywane do momentu, gdy najszybciej poruszające się białka znajdą się 1 cm od dna żelu.

Po zakończeniu elektroforezy białka muszą zostać uwidocznione. Tradycyjnie odbywa się to poprzez barwienie niebieskim lub srebrnym azotanem Coomassie. Białka będące przedmiotem zainteresowania mogą być przenoszone z żelu i analizowane za pomocą analizy Western blot.

Drugie podejście do identyfikacji polega na wycięciu białek z żelu, trawieniu ich, a następnie analizie za pomocą spektrometrii mas.

Teraz, gdy omówiliśmy procedurę, przyjrzyjmy się niektórym zastosowaniom elektroforezy żelowej 2D.

Jednym z najczęstszych zastosowań tej techniki jest identyfikacja cząsteczek biorących udział w inicjacji i progresji choroby. Elektroforeza żelowa 2D, w połączeniu ze spektrometrią mas, może wykryć regulację w górę lub w dół określonych białek w chorych obszarach w porównaniu ze zdrowymi.

Dodatkowo, elektroforeza żelowa 2D jest przydatna w śledzeniu postępów reakcji pacjentów na potencjalny lek terapeutyczny. Próbki mogą być pobierane od pacjentów w różnych punktach czasowych po podaniu leku. W ten sposób elektroforeza żelowa 2D w połączeniu z analizą Western blot lub spektrometrią mas może wykryć białka związane z negatywnymi reakcjami, takimi jak stan zapalny; lub brak białek w stanie złagodzonym.

Innym zastosowaniem elektroforezy żelowej 2D jest badanie struktury i funkcji białek po modyfikacji potranslacyjnej lub PTM, które są dodatkami do białek po ich translacji z mRNA. PTM mogą regulować różne funkcje, w tym sygnalizację białkową, ekspresję genów lub powodować uszkodzenia oksydacyjne. Elektroforeza żelowa 2D jest wrażliwa na modyfikacje, takie jak metylacja lub acetylacja, które mogą powodować zmianę pI, a także masy cząsteczkowej.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat elektroforezy żelowej 2D. Film ten opisywał zasady techniki, typową procedurę eksperymentalną i kilka jej zastosowań w dziedzinie biomedycyny.

Dzięki za oglądanie!