Name: Wytwarzanie i hodowla pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Poznaj metodę izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłej do badań biologii skóry in vitro. Technika ta umożliwia modelowanie chorób zapalnych skóry i regulacji różnicowania komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor pragnie podziękować Annette Blak Rasmussen i Kristine Moeller za ich wsparcie techniczne

Pobieranie próbek skóry od zdrowych dorosłych ochotników poddanych operacji plastycznej wymaga zgody komisji etycznej w instytucjach goszczących. Protokół ten został zatwierdzony przez Regionalną Komisję Etyczną Regionu Midtjylland w Danii (M-20110027). Opisana tutaj metoda wywodzi się z podobnych badań przeprowadzonych przez Maciaqa i wsp.10 oraz Liu i Karasek11.
1. Izolacja keratynocytów od ludzkiej skóry
<ol>
	<li>Zacznij od przygotowania następujących roztworów: 50 ml roztworu 0,25% trypsyny i 0,1% glukozy w DPBS. Wymieszać i przefiltrować, wysterylizować (0,2 μm) roztwór. Przygotuj 10 ml RPMI-1640 + 2% roztworu FBS, 50 ml DPBS i pożywki bez keratynocytów (KSFM). Dodaj suplementy KSFM i 250 μl gentamycyny do 500 ml KSFM. Przed użyciem podgrzej roztwory do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Zbieraj skórę od zdrowych dorosłych ochotników poddawanych operacji plastycznej. Użyte próbki skóry mają wymiary około 10 cm x 15 cm, ale mogą różnić się wielkością. Utrzymuj skórę w chłodzie podczas transportu, transportując próbki skóry w styropianowym pudełku zawierającym element chłodzący. W razie potrzeby próbka skóry może być przechowywana przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usuń tłuszcz spod skóry za pomocą wysterylizowanych nożyczek, skalpeli i kleszczy.</li>
	<li>Zapiąć część skóry (około 10 cm x 15 cm) na sterylnej osłonie na wierzchu płytki za pomocą igieł. Najpierw oczyść skórę suchym, wysterylizowanym gazikiem. Następnie oczyść skórę za pomocą wysterylizowanego gazika z 70% etanolem.</li>
	<li>Za pomocą strugarki nożnej odetnij górną warstwę (naskórek) części skóry i umieść ją na szalce Petriego o średnicy 9 cm. Następnie natychmiast dodaj 25 ml roztworu DPBS/trypsyna/glukozy (przygotowanego w kroku 1.1) do szalki Petriego. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Za pomocą pipety usuń roztwór DPBS/trypsyny/glukozy z szalki Petriego i dodaj 10 ml RPMI-1640 + 2% FBS, aby dezaktywować trypsynę.</li>
	<li>Za pomocą dwóch kleszczy uwolnij teraz komórki naskórka do podłoża, delikatnie zeskrobując i mieszając zarówno naskórek, jak i przedział skórny części skóry.</li>
	<li>Przefiltruj zawiesinę komórek naskórka przez metalowy filtr (otwór o średnicy 1 mm) i zbierz w probówce o pojemności 50 ml. Dodaj pozostałe skrawki skóry do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml RPMI-1640 bez FBS i wiruj przez 10 sekund. Przefiltrować zawiesinę przez metalowy filtr do probówki o pojemności 50 ml zawierającej zawiesinę komórek naskórka. Dodaj DPBS do całkowitej objętości 50 ml.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową przez 10 minut przy 450 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek naskórka w około 10 ml KSFM o temperaturze 37 °C, w zależności od wielkości osadu komórkowego. Policz komórki za pomocą metody barwienia błękitem trypanowym pod mikroskopem. Liczba komórek uzyskanych z odcinka skóry o wymiarach 10 cm x 15 cm wynosi około 50 - 100 x 106 komórek. Do każdej kolby hodowlanejo długości 75 cm2 przenieść 8 x 106 komórek wraz z 12 ml KSFM o temperaturze 37 °C. Delikatnie wstrząsnąć kolbami hodowlanymi, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek.</li>
	<li>Inkubować keratynocyty w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy wilgotności 100% i 5% CO2 . Zmień podłoże po 2 dniach i trzy razy w tygodniu. Pasaż komórek, gdy hodowla jest zlewająca się w 70 - 80%, co trwa około 2 tygodni w zależności od szybkości proliferacji keratynocytów.</li>
</ol>
2. Pasażowanie keratynocytów
<ol>
	<li>Podgrzać odpowiednią ilość 0,05% roztworu trypsyny-EDTA do temperatury 37 °C w inkubatorze. Użyj 4,5 ml 0,05% roztworu trypsyny-EDTA w kolbie hodowlanej o średnicy 75cm2.</li>
	<li>Usuń pożywkę z komórek i dodaj do komórek 4,5 ml/75 cm2 kolby hodowlanej, wstępnie podgrzany 0,05% roztwór trypsyny-EDTA. Umieścić kolbę hodowlaną w inkubatorze (37 °C) i po około 5 minutach sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki zaczęły się rozluźniać.</li>
	<li>Gdy około 50% komórek się rozluźni, delikatnie uderz kolbą hodowlaną o rękę, aby poluzować pozostałe komórki. Następnie, aby dezaktywować trypsynę, dodaj 6 ml RPMI-1640 + 2% FBS (37 °C) do kolby hodowlanej o długości 75cm2 i przenieś zawiesinę komórkową do probówek o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przepłukać kolby hodowlane 3 ml RPMI 1640 + 2% FBS i dodać do probówek o pojemności 50 ml. Wirować komórki przez 10 minut przy 450 x g w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Zawiesić granulowane komórki w 10 ml KSFM (37 °C). Policz komórki i przenieś 3 x 106 komórek do kolby hodowlanej o długości 150cm2 razem z 20 ml KSFM (37 °C). Delikatnie wstrząsnąć kolbą hodowlaną, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Zamroź komórki, gdy hodowla jest zlewająca się w 80 - 90%, co trwa około 4-6 dni w zależności od szybkości proliferacji keratynocytów (patrz sekcja 3, protokół zamrażania poniżej). Rozszerz keratynocyty, aby wytworzyć odpowiednie zamrożone zapasy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zamrożenie keratynocytów
<ol>
	<li>Podgrzać odpowiednią ilość 0,05% roztworu trypsyny-EDTA do temperatury 37 °C w inkubatorze. Użyj 9 ml 0,05% roztworu trypsyny-EDTA w kolbie hodowlanej o średnicy 150cm2.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z komórek i dodać do komórek 9 ml/150 cm2 kolby hodowlanej wstępnie podgrzany 0,05% roztwór trypsyny-EDTA. Umieścić kolbę hodowlaną w inkubatorze (37 °C) i po około 5 minutach sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki zaczęły się rozluźniać.</li>
	<li>Gdy około 50% komórek się rozluźni, delikatnie uderz kolbą hodowlaną o rękę, aby poluzować pozostałe komórki. Następnie, aby dezaktywować trypsynę, dodaj 12 ml RPMI-1640 + 2% FBS (37 °C) do kolby hodowlanej o średnicy 150cm2 i odessaj zawiesinę komórek do probówek o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przepłukać kolby hodowlane 6 ml RPMI 1640 + 2% FBS i dodać do probówek o pojemności 50 ml. Wirować probówki przez 10 minut przy 450 x g w temperaturze 4 °C. Przygotować lodowato zimne medium do zamrażania komórek (KSFM + 10% DMSO).</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w KSFM + 10% DMSO, policzyć komórki i zamrozić komórki w gęstości 6 x 106 komórek/ml przy użyciu standardowych metod kriokonserwacji powolnego zamrażania12.</li>
	<li>Przechowuj keratynocyty w ciekłym azocie (faza parowa) do momentu, gdy będą gotowe do użycia.</li>
</ol>
4. Rozmrażanie i hodowla zamrożonych keratynocytów
<ol>
	<li>Odpowiednie zamrożone fiolki należy szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Użyj 70% etanolu do czyszczenia zewnętrznej części kriowialu. Przenieść odpowiednią liczbę komórek (około 15 000 komórek/cm2) do kolby hodowlanej i natychmiast dodać wstępnie ogrzaną pożywkę wzrostową (KSFM) do kolby hodowlanej. 
	Można użyć kolb hodowlanych o dowolnym rozmiarze, w zależności od konfiguracji eksperymentu.</li>
	<li>Użyć 5 ml pożywki hodowlanej do kolby hodowlanejo średnicy 25 cm2. Liczba komórek dodanych do kolby hodowlanej może się różnić, ponieważ wzrost komórek różni się w zależności od dawcy. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy wilgotności 100% i 5% CO2 .</li>
	<li>Zmień podłoże po 2 dniach i trzy razy w tygodniu, używając świeżego, wstępnie podgrzanego KSFM. 
	Uwaga: Nasze dane wykazały, że średnio 95% komórek wyizolowanych za pomocą opisanego tutaj protokołu jest dodatnich dla markera keratynocytów cytokeratyny-1413.</li>
</ol>

<ol><li>Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+as+initiators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes as initiators of inflammation.</a> Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).</li>
<li>Nickoloff, B. J., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes%3A+key+immunocytes+of+the+integument%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes: key immunocytes of the integument.</a> Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).</li>
<li>Fuchs, E., Raghavan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+under+the+skin+of+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Getting under the skin of epidermal morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).</li>
<li>Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+immune+system+Its+cellular+constituents+and+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">The skin immune system Its cellular constituents and their interactions.</a> Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).</li>
<li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).</li>
<li>Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+in+inflammatory+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets+Inflamm+Allergy%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes in inflammatory skin diseases.</a> Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).</li>
<li>Gilliet, M., Lande, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+and+self-DNA+in+autoimmune+skin+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation.</a> Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).</li>
<li>Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+inhibits+ERK-mediated+collagenase-1+%28MMP-1%29+expression+in+collagen-activated+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).</li>
<li>Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+IL-33+expression+by+IFN-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+in+normal+human+epidermal+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).</li>
<li>Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endocrine+approach+to+the+control+of+epidermal+growth%3A+serum-free+cultivation+of+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes.</a> Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).</li>
<li>Liu, S. C., Karasek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+growth+of+adult+human+epidermal+keratinocytes+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.</a> J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).</li>
<li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).</li>
<li>Otkjaer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-20+gene+expression+is+induced+by+IL-1beta+through+mitogen-activated+protein+kinase+and+NF-kappaB-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms.</a> J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).</li>
<li>Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involucrin+and+other+markers+of+keratinocyte+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).</li>
<li>Boyce, S. T., Ham, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+differentiation+of+normal+human+epidermal+keratinocytes+in+chemically+defined+clonal+culture+and+serum-free+serial+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).</li>
<li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+models+of+normal+and+diseased+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).</li>
<li>Kamsteeg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+helper+T-cell+cytokines+induce+morphologic+and+molecular+characteristics+of+atopic+dermatitis+in+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent.</a> Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).</li>
<li>van den Bogaard, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+keratinocytes+and+T+cells+in+a+3D+microenvironment%3A+a+model+to+study+inflammatory+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases.</a> J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).</li>
<li>Raaby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cell+markers+CD1a+and+CD207+are+the+most+rapidly+responding+genes+in+lesional+psoriatic+skin+following+adalimumab+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment.</a> Exp Dermatol. , (2017).</li>
</ol>

. Autor nie pozostaje w konflikcie interesów.

W tym miejscu opisujemy, jak łatwo wyizolować pierwotne ludzkie keratynocyty ze skóry dorosłego człowieka i jak hodować je in vitro. Model ten może mieć szerokie zastosowanie w badaniach biologii komórek naskórka i może być przydatny dla naukowców zainteresowanych badaniem chorób skóry.
Niektóre z zalet opisanego tutaj protokołu polegają na tym, że w przeciwieństwie do keratynocytów wyizolowanych z napletka noworodka uzyskanego od nowonarodzonych mężczyzn poddawanych obrzezaniu, pierw...

Skóra jest największym organem ludzkiego ciała i służy jako bariera ochronna przed środowiskiem zewnętrznym. Skóra składa się z dwóch głównych warstw: skóry właściwej i naskórka, przy czym naskórek stanowi najbardziej zewnętrzną warstwę skóry. Najliczniejszym typem komórek w naskórku są keratynocyty stanowiące ponad 95% masy komórkowej1,2. Keratynocyty są utrzymywane na różnych etapach różnicowania w naskórku i są zorganizowane w warstwy podstawne, kolczyste, ziarniste i zrogowaciałe, które odpowiadają określonym etapom różnicowania3. Podstawową funkcją keratynocytów jest zapewnienie integralności strukturalnej naskórka, wytwarzając w ten sposób nienaruszoną barierę dla świata zewnętrznego.
Keratynocyty również reprezentują pierwszą linię obrony przed patogenami w skórze, a zatem odgrywają ważną rolę we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej4,5. Narażenie keratynocytów na bodźce zewnętrzne prowadzi do aktywacji wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych, a następnie do produkcji wielu różnych mediatorów stanu zapalnego, w tym cytokin, chemokin i peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Te białka pochodzące z keratynocytów uczestniczą w odpowiedzi zapalnej poprzez rekrutację i aktywację komórek odpornościowych, takich jak komórki dendrytyczne, neutrofile i specyficzne limfocyty T6,7. W związku z tym, że keratynocyty odgrywają kluczową rolę w wielu procesach biologicznych, uzasadnieniem przedstawionej tutaj techniki było wygenerowanie modelu in vitro do badania biologii skóry. Pierwotne kultury keratynocytów uzyskane z napletka noworodka są często wykorzystywane do badania biologii skóry8,9. Jednak dzięki opisanej tutaj technice uzyskuje się keratynocyty obu płci, co skutkuje większą różnorodnością biologiczną komórek.
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i generowania pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłego człowieka, w tym konserwacji i zamrażania keratynocytów. Ogólnym celem tej metody jest wygenerowanie pierwotnych ludzkich keratynocytów, które można wykorzystać jako model do badania biologii skóry in vitro.

<table><tbody><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Suplementy KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>Suplementy dla KSFM</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td>DPBS bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Dimetylosulfoksydek</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td>Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Filtr sterylizacyjny</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td>Filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,2 i mikro; m</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7409</td><td>Służy do trypsynizacji komórek</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-RPMI-1640</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010-FBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16000044</td><td>Służy do inaktywacji kleszczy trypsyny</td></tr> <tr><td></td><td>-</td><td></td> <td>można użyć</td></tr> <tr>kleszczy dowolnej firmy<td>Nożyczki</td> <td>-</td><td></td> <td>można użyć nożyczek dowolnej firmy</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Swann Morton</td><td>0501</td><td>Można użyć skalpeli dowolnej firmy</td></tr><tr><td>70% etanolu</td> <td>-</td><td>--</td><td></td></tr> <tr><td>Gaziki</td><td>NOBAMED</td><td>875420</td> Można <td>użyć nakładek z gazy od dowolnego dostawcy</td></tr><tr><td>Strugarka nożna</td><td>Credo Solingen</td><td>1510</td><td>Można użyć</td></tr> <tr>strugarki nożnej od dowolnego dostawcy<td>Szalki Petriego</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Można używać szalek Petriego od dowolnego dostawcy</td></tr><tr><td>Filtr metalowy</td> <td>-</td><td></td> <td>Wewnętrzny filtr metalowy o średnicy 1 mm</td></tr><tr><td>75 cm2 kolby hodowlane</td><td>NUNC</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>156499-150 cm2 Termos</td> Scientific <td>TTP</td><td>90151-0,05</td><td></td></tr><tr><td>% Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td>Służy do trypsynizacji komórek podczas pasażu</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i hodowla pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłej

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Główną funkcją keratynocytów jest zapewnienie strukturalnej integralności naskórka, a tym samym utrzymanie mechanicznej bariery dla świata zewnętrznego. Ponadto keratynocyty odgrywają istotną rolę w inicjacji, utrzymaniu i regulacji odpowiedzi immunologicznej naskórka, będąc częścią wrodzonego układu odpornościowego reagującego na bodźce antygenowe w szybki, niespecyficzny sposób. W tym miejscu opisujemy protokół izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłej i wykazujemy, że komórki te reagują na końcowe różnicowanie wywołane wapniem, mierzone zwiększoną ekspresją markera różnicowania inwolukryny. Ponadto pokazujemy, że izolowane keratynocyty reagują na indukowaną przez IL-1β aktywację wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych, mierzoną aktywacją szlaku p38 MAPK. Podsumowując, opisujemy metodę izolacji i hodowli pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłej osoby. Ponieważ keratynocyty są dominującym typem komórek w naskórku, metoda ta jest przydatna do badania mechanizmów molekularnych w biologii skóry in vitro.

Różnicowanie końcowe indukowane wapniem 
Ludzkie keratynocyty ulegają różnicowaniu końcowemu po potraktowaniu wapniem14,15,16. Pierwotne ludzkie keratynocyty wyizolowano i hodowano zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Po osiągnięciu konfluencji na poziomie około 50 - 60%, komórki stymulowano wapniem (1,2 mM) lub placebo, a zdjęcia komórek wykonano w dniu 0, 1 i 2. Rycina 1 prze...

Ludzka skóra działa jako pierwsza linia obrony przed środowiskiem zewnętrznym. Przedstawiono metodę izolacji pierwotnych keratynocytów ludzkich od skóry osoby dorosłej. Te izolowane keratynocyty są przydatne w wielu konfiguracjach eksperymentalnych i są bardzo odpowiednim modelem do badania mechanizmów molekularnych w biologii skóry in vitro.

Wytwarzanie i hodowla pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłej

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie pierwotnych ludzkich keratynocytów, które można wykorzystać jako model do badania biologii skóry in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek naskórka, takie jak sposób regulowania różnicowania ludzkich keratynocytów lub jako model do badania zapalnych chorób skóry. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że pierwotne ludzkie keratynocyty mogą być konwencjonalnie izolowane ze skóry dorosłych mężczyzn i kobiet i mogą obejmować skórę osób w każdym wieku powyżej 18 lat.Procedurę zademonstruje Annette Blak Rasmussen, technik z mojego laboratorium. Na początek przygotuj 50 mililitrowy roztwór 0,25% trypsyny i 0,1% glukozy w DPBS. Następnie wymieszaj i przefiltruj roztwór.Przygotuj 10 mililitrów RPMI 1640 plus 2% FBS, 50 mililitrów DPBS i pożywki wolnej od keratynocytów w surowicy lub KSFM. Dodaj suplementy KSFM i 250 mikrolitrów gentamycyny do 500 mililitrów KSFM. Następnie przed użyciem podgrzej roztwory do 37 stopni Celsjusza.Zbierz próbki skóry o wymiarach 10 na 15 centymetrów od zdrowych dorosłych ochotników poddawanych operacji plastycznej. Utrzymuj skórę w chłodzie, transportując próbki skóry w styropianowym pudełku zawierającym element chłodzący. W razie potrzeby przechowuj próbkę skóry w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Za pomocą wysterylizowanych nożyczek, skalpeli i kleszczy usuń tłuszcz spod skóry. Następnie, za pomocą igieł, zapnij część skóry na sterylnej osłonie na wierzchu płytki. Suchym, wysterylizowanym gazikiem oczyść skórę.Następnie dodaj 70% etanol na wysterylizowaną gazik. Następnie za pomocą strugarki do stóp odetnij górną warstwę naskórka części skóry i przenieś ją na dziewięciocentymetrową szalkę Petriego. Następnie natychmiast dodaj 25 mililitrów wcześniej przygotowanego roztworu glukozy trypsyny DPBS do szalki Petriego.Próbki należy inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Za pomocą pipety usuń roztwór glukozy trypsyny DPBS z szalki Petriego i dodaj 10 mililitrów RPMI 1640 plus 2% FBS, aby dezaktywować trypsynę. Teraz za pomocą dwóch kleszczyków uwolnij komórki naskórka do podłoża, delikatnie zeskrobując i mieszając zarówno naskórkowy, jak i skórny przedział części skóry.Przefiltruj zawiesinę komórek naskórka przez metalowy filtr i zbierz filtrat do 50-mililitrowej probówki. Dodaj pozostałe skrawki skóry do 50-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów RPMI 1640 bez FBS i wiruj przez 10 sekund. Przefiltruj tę zawiesinę przez metalowy filtr do 50-mililitrowej probówki zawierającej zawiesinę komórek naskórka.Następnie dodaj DPBS do całkowitej objętości 50 mililitrów. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 450 razy G i temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie usuń supernatant i w zależności od wielkości osadu komórkowego ponownie zawieś osad komórek naskórka w około 10 mililitrach 37 stopni Celsjusza KSFM.Stosując metodę barwienia błękitem trypanowym, policz komórki pod mikroskopem. Następnie do każdej kolby hodowlanej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych przenieś osiem razy 10 do szóstej komórki razem z 12 mililitrami KSFM o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Delikatnie wstrząsnąć kolbami hodowlanymi, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek.Inkubuj keratynocyty w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przy wilgotności 100% i 5% CO2. Zmień podłoże po dwóch dniach, a następnie trzy razy w tygodniu. Gdy komórki osiągną zbieżność 70-80%, utrzymuj odpowiednią ilość 0,05% roztworu trypsyny EDTA do 37 stopni Celsjusza w inkubatorze.Usuń pożywkę z komórek i dodaj 4,5 mililitra na 75 centymetrów kwadratowych kolby hodowlanej wstępnie podgrzanego 0,05% roztworu trypsyny EDTA do komórek. Po umieszczeniu kolby hodowlanej w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na około pięć minut, sprawdź pod mikroskopem, czy komórki zaczęły się rozluźniać. Gdy około 50% komórek się rozluźni, delikatnie uderz kolbą hodowlaną o rękę, aby poluzować pozostałe komórki.Następnie, aby dezaktywować trypsynę, dodaj sześć mililitrów 37 stopni Celsjusza RPMI 1640 plus 2% FBS do kolby hodowlanej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych i przenieś zawiesinę komórkową do 50-mililitrowych probówek. Przepłukać kolby hodowlane trzema mililitrami RPMI 1640 plus 2% FBS i dodać pożywkę do 50-mililitrowych probówek. Następnie odwiruj komórki przez 10 minut w temperaturze 450 razy G i temperaturze pokojowej.Użyj 10 mililitrów KSFM o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby ponownie zawiesić granulowane ogniwa. Następnie policz i przenieś trzy razy 10 do szóstych komórek do kolby hodowlanej o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych razem z 20 mililitrami KSFM o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Delikatnie wstrząsnąć kolbą hodowlaną, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek, przed powrotem komórek do inkubatora.Gdy kultura jest w 80-90% zlewna, po trypsynizacji i przeniesieniu komórek do 50-mililitrowych probówek, jak pokazano wcześniej w tym filmie, przepłucz kolby hodowlane sześcioma mililitrami RPMI 1640 plus 2% FBS i dodaj je do 50-mililitrowych probówek. Wirować probówki przez 10 minut w temperaturze 450 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Następnie przygotuj lodowato zimną pożywkę do zamrażania komórek.Ponownie zawieś granulat ogniwa w KSFM plus 10% DMSO. Następnie, po policzeniu komórek, zamroź je w gęstości od sześciu razy 10 do szóstych komórek na mililitr, stosując standardowe, wolno zamrażające metody kriokonserwacji. Przechowuj keratynocyty w ciekłym azocie, aż będą gotowe do użycia.Jak widać tutaj, ludzkie keratynocyty zostały wyizolowane i wyhodowane, jak pokazano w tym filmie, a następnie stymulowane wapniem. Obrazy te pokazują zmiany morfologiczne spowodowane dodaniem wapnia w pierwszym i drugim dniu, w porównaniu z kontrolowanymi komórkami leczonymi. Oprócz zmian morfologicznych dodanie wapnia spowodowało również wzrost transkrypcji mRNA dla markera różnicowania inwolukryny, 5,5-krotnie po 24 godzinach i 3,5-krotnie po 48 godzinach.W tym eksperymencie wyhodowane keratynocyty stymulowano IL-1 beta przez różne okresy czasu. Jak zaobserwowano w Western blotting, w ciągu pięciu minut stymulacja IL-1 beta doprowadziła do szybkiej fosforylacji aktywacji kinazy p38 MAP, ponieważ stymulacja IL-1 beta nie miała wpływu na całkowity poziom białka kinazy p38 MAP. Po godzinie fosforylacja kinazy p38 MAP indukowana przez IL-1 beta powróciła do poziomu podstawowego.Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią ludzkich komórek naskórka do zbadania roli keratynocytów we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, a także w rozwoju skóry. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i hodować pierwotne keratynocyty ze skóry dorosłego człowieka, które można wykorzystać jako model do badania biologii skóry in vitro.

generation-culturing-primary-human-keratinocytes-from-adult

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano szybką i skuteczną metodę izolacji żywych dorosłych komórek macierzystych nabłonka ze skóry ludzkiej. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne macierzy kolagenowej skóry, a następnie wyrywanie mieszków włosowych i izolację zawiesin pojedynczych komórek lub fragmentów tkanki do hodowli komórkowej.

Izolacja i hodowla dorosłych epitelialnych komórek macierzystych ze skóry człowieka

Ten film opisuje izolację keratynocytów - najważniejszych komórek warstwy naskórka ludzkiej skóry, poprzez zastosowanie kombinacji trawienia enzymatycznego i metod mechanicznego zakłócania. Ta metoda pomaga w preferencyjnym wzroście keratynocytów w porównaniu z innymi typami komórek skóry przy użyciu selektywnej pożywki wzrostowej.

Izolacja keratynocytów ludzkiej skóry: metoda hodowli pierwotnych keratynocytów z próbek skóry

Ten film opisuje szczegółowy protokół produkcji genetycznie modyfikowanych pierwotnych rekombinowanych retrowirusów ludzkich keratynocytów. Metoda ta może być stosowana do manipulowania ekspresją genów w keratynocytach.

Modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich keratynocytów: metoda genetycznej manipulacji keratynocytami przy użyciu rekombinowanych retrowirusów

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku procedurę pozyskiwania i utrzymywania ludzkich keratynocytów z wyrwanych włosów oraz późniejszej generacji wolnych od integracji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) za pomocą wektorów epizodycznych.

Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego i szczegółowego protokołu generowania genetycznie zmodyfikowanej ludzkiej organotypowej skóry z keratynocytów naskórka i zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej

Keratynocyty naskórka tworzą funkcjonalną barierę skórną i są umieszczone na pierwszej linii obrony gospodarza przed zewnętrznymi zniewagami środowiskowymi. W tym miejscu opisano metody izolacji i pierwotnej hodowli keratynocytów naskórka ze skóry noworodków i dorosłych myszy oraz indukcji różnicowania końcowego i odpowiedzi zapalnej wywołanej promieniowaniem UVB przez keratynocyty.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów myszy ze skóry noworodków i dorosłych myszy

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego izolowania pierwotnych ludzkich keratynocytów z tkanek skóry dorosłych. Metoda ta upraszcza konwencjonalną procedurę poprzez zastosowanie inhibitora ROCK Y-27632 w pożywce do inokulacji w celu spontanicznego oddzielenia komórek naskórka od komórek skóry właściwej.

Uproszczona i skuteczna metoda izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłej tkanki skórnej

Ten protokół opisuje prostą metodę hodowli trójwymiarowego, zrekonstruowanego ludzkiego naskórka w powtarzalny i solidny sposób. Dodatkowo scharakteryzowano zależność struktura-funkcja modelu bariery naskórkowej. Przedstawiono również reakcje biologiczne zrekonstruowanego naskórka ludzkiego na bodźce prozapalne.

Hodowla trójwymiarowego zrekonstruowanego ludzkiego naskórka na dużą skalę

Tutaj opisujemy protokół systematycznej hodowli sferoidów naskórka w hodowli zawiesinowej 3D. Protokół ten ma szerokie zastosowanie do stosowania w różnych typach tkanek nabłonkowych oraz do modelowania kilku chorób i stanów u ludzi.

Opracowanie wysokoprzepustowego systemu hodowli sferoidów naskórka do modelowania plastyczności komórek macierzystych keratynocytów

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę keratynocytów jamy ustnej pochodzących z podniebienia dorosłej myszy. Podano również metodę oceny z wykorzystaniem barwienia immunologicznego.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów jamy ustnej z podniebienia dorosłej myszy

Protokół ten określa hodowlę świeżo pozyskanych (przepustka 0) keratynocytów do wykorzystania w obrazowaniu żywych komórek.

Generowanie hodowli pierwotnych do obrazowania żywych komórek keratinocytów

Poznaj metodę izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłej do badań biologii skóry in vitro. Technika ta umożliwia modelowanie chorób zapalnych skóry i regulacji różnicowania komórek.

Wytwarzanie i hodowla pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłej

Przeglądaj więcej filmów