Połączenie ilościowych testów spożycia pokarmu i wymuszonej aktywacji neuronów w celu zbadania apetytu u Drosophila
24 kwietnia 2018
Ilościowe testy spożycia żywności z farbowaną żywnością dostarczają solidnych i wydajnych środków do oceny motywacji do karmienia. Połączenie testu spożycia żywności z termogenetycznymi i optogenetycznymi badaniami przesiewowymi jest skutecznym podejściem do badania obwodów neuronalnych leżących u podstaw apetytu u dorosłych Drosophila melanogaster.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowy pomiar spożycia pokarmu przez dorosłe osobniki Drosophila, co zapewnia środki do oceny skutków manipulacji genetycznych, takich jak termogenetyczne i optogenetyczne aktywacje neuronów. Środki te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie żywienia, takie jak neuromechanika głodu, sytości i apetytu. Główną zaletą tej techniki jest to, że jednocześnie określa ilościowo spożycie pokarmu przez wiele grup much, co czyni ją szczególnie przydatną do identyfikacji nieprawidłowo żerujących much w genetycznych badaniach przesiewowych.
Na początek zbierz zapasy, aby przygotować zewnętrzny pojemnik. Zawiesić 0,5 grama agarozy i 50 mililitrów podwójnie destylowanej wody. Podgrzać przy częstym mieszaniu i zagotować do całkowitego rozpuszczenia na mieszadle magnetycznym z płytą grzewczą.
Gdy 1% agaroza ostygnie do około 60 stopni Celsjusza, przenieś pięć mililitrów do pustego pojemnika zewnętrznego i trzymaj pojemnik otwarty, aż agaroza ostygnie do temperatury pokojowej, aby uzyskać podkładkę agarozową. Następnie dodaj 0,5 grama agarozy do 50 mililitrów podwójnie destylowanej wody. Podgrzać przy częstym mieszaniu i zagotować do całkowitego rozpuszczenia na mieszadle magnetycznym z płytą grzewczą.
Gdy 1% agaroza ostygnie do około 60 stopni Celsjusza, dodaj 1,71 grama sacharozy do agarozy, aby uzyskać 100 milimoli sacharozy. Dodaj 0,25 grama niebieskiego barwnika do roztworu agarozy, aby uzyskać 0,5% wagowo na objętość barwionej żywności na etykiecie. Następnie przygotuj pojemnik wewnętrzny.
Umieść puste pojemniki wewnątrz na płaskiej poziomej powierzchni. Następnie dodaj 750 mikrolitrów żywności oznaczonej niebieskim barwnikiem do poszczególnych pojemników na żywność. Pozwól zastygnąć przez co najmniej pięć minut.
Przenieś napełniony pojemnik wewnętrzny do przygotowanego pojemnika zewnętrznego i umieść go na środku waby agarozowej. Przygotuj komory karmienia z pokarmem bezbarwnym do odejmowania tła. Pozostaw otwarte komory karmienia w temperaturze pokojowej na 40 minut, aż ścianka zewnętrznego pojemnika będzie wolna od kondensacji.
Przed eksperymentami behawioralnymi należy zrównoważyć przygotowane komory żywieniowe w eksperymentalnej temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby upewnić się, że temperatura w komorach żywieniowych jest względnie jednolita. Aby rozpocząć proces karmienia, ostrożnie przenieś 20 much z ich domowej fiolki do podgrzanej komory karmienia, delikatnie stukając. Kontynuuj proces karmienia w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 60 minut.
Przerwij karmienie, zamrażając komory karmienia w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 30 minut. Ostrożnie przenieś 20 much z jednej fiolki do komory karmienia, delikatnie stukając. A następnie umieść komorę bokiem na zestawie oświetleniowym.
Do manipulacji optogenetycznej użyj szeregu pomarańczowych diod LED jako źródła stymulacji świetlnej i zamocuj poziomą płytkę z pleksiglasu nad diodami LED, aby podeprzeć komory karmienia podczas oświetlenia. Utrzymuj konfigurację w inkubatorze w temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności 60%. Stymuluj muchy kontroli genetycznej równolegle z muchami Taotie-GAL4 UAS CsChrimson, ale w różnych komorach żywieniowych.
Kontynuuj proces karmienia przez 60 minut z tylnym oświetleniem pomarańczowym światłem. Następnie zamroź komory karmienia w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 30 minut. Po zakończeniu karmienia wysyp wszystkie 20 much z komory karmienia na kartkę papieru wagowego.
Następnie przenieś je do 1,5 mililitrowej rurki za pomocą miękkiej szczoteczki. Dodaj 500 mikrolitrów PBST do probówki i homogenizuj muchy za pomocą młynka mielącego o częstotliwości 60 Hz przez pięć sekund. Następnie potwierdzić wystarczającą homogenizację przez obserwację, gdy nie ma wykrywalnych fragmentów części ciała.
Wiruj probówki z homogenatami przez 30 minut z prędkością 1300 obr./min, aby usunąć zanieczyszczenia. Po odwirowaniu przenieść 100 mikrolitrów supernatantu do studzienki z 96-dołkową płytką. Aby uniknąć błędnego obliczenia absorbentów spowodowanego zanieczyszczeniami, delikatnie wyjmij używaną rurkę z wirówki i ostrożnie upuść supernatant, nie naruszając palety.
Po załadowaniu wszystkich próbek umieść płytkę w czytniku płytek, aby zmierzyć absorbenty próbek na głębokości 630 nanometrów. Reakcję na karmienie określono ilościowo poprzez wizualną inspekcję i ocenę muszek z wykrywalnym barwnikiem w jelitach. Po aktywacji neuronów Taotie około 58% much Taotie dTRPA1 wykazywało silne zachowania żywieniowe.
A 23% z nich wykazało łagodne zachowania żywieniowe. Ostre neurony Taotie-GAL4 aktywowane przez TRPA1 dramatycznie zwiększyły spożycie pokarmu, co sugeruje, że neurony znakowane Taotie-GAL4 uczestniczą w regulacji spożycia pokarmu przez dorosłe Drosophila. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo ilość przyjmowanego pokarmu po manipulowaniu aktywnością neuronów w celu zbadania neuromechanizmów kontroli karmienia u dorosłych Drosophila melanogaster.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje ilościowy test pobierania pokarmu z wykorzystaniem barwionego pożywienia w celu oceny motywacji pokarmowej u dorosłych osobników Drosophila melanogaster. Metoda ta umożliwia analizę wysokoprzepustową i może być łączona z przesiewami termogenetycznymi oraz optogenetycznymi w celu zbadania obwodów neuronalnych uczestniczących w regulacji apetytu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia behawioralna
- Genetyka
Wstęp
- Zrozumienie zachowań żywieniowych jest kluczowe dla uzyskania wiedzy na temat regulacji apetytu.
- Manipulacje genetyczne mogą wpływać na motywację do jedzenia oraz sytość.
- Wysokoprzepustowe metody są niezbędne do jednoczesnej analizy wielu osobników.
- Drosophila melanogaster służy jako organizm modelowy do badania tych mechanizmów.
Cel badania
- Ilościowe pomiar spożycia pokarmu u dorosłych much *Drosophila*.
- Ocena wpływu manipulacji genetycznych na zachowanie żywieniowe.
- Badanie neuromonmechanizmów głodu i apetytu.
Zastosowane metody
- Przygotowanie pożywki na bazie agarosy do testu.
- Wykorzystanie barwionej pożywki do śledzenia spożycia.
- Zastosowanie technik termogenetycznych i optogenetycznych.
- Jednoczesny pomiar spożycia pokarmu w wielu grupach much.
Główne wyniki
- Test skutecznie ilościowo określa spożycie pokarmu w różnych podłożach genetycznych.
- Identyfikuje muchy o nieprawidłowych wzorcach żerowania w przesiewach genetycznych.
- Umożliwia poznanie obwodów neuronalnych regulujących apetyt.
- Wykazuje niezawodność metody w analizach wysokoprzepustowych.
Wnioski
- Analiza spożycia pokarmu jest cennym narzędziem do badania zachowań żywieniowych.
- Połączenie tej metody z manipulacjami genetycznymi pozwala na lepsze zrozumienie regulacji apetytu.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać to podejście do eksploracji złożonych zachowań żywieniowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Ilościowe testy spożycia pokarmu połączone z aktywacją neuronów u Drosophila umożliwiają precyzyjne badanie obwodów neuronalnych sterujących apetytem i zachowaniem żerowania. Podejście to wspiera wczesną walidację celów oraz mechanistyczną redukcję ryzyka dla szlaków neurobiologicznych uwikłanych w zaburzenia metaboliczne i apetytu. Skalowalność tej metody oraz ilościowe wyniki pozycjonują ją jako solidną platformę do wysokoprzepustowego przesiewu genetycznego i funkcjonalnej analizy szlaków w procesach odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia walidację funkcjonalną celów neuronalnych wpływających na motywację do jedzenia i sytość.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie aktywacji neuronalnej z mierzalnymi efektami behawioralnymi.
- Ułatwia selekcję potencjalnych szlaków do dalszych badań w modelach chorób metabolicznych.
Przesiew i opracowanie testu
- Zapewnia standaryzowany, ilościowy test do oceny zaburzeń genetycznych i farmakologicznych.
- Umożliwia powtarzalny, wysokoprzepustowy pomiar spożycia pokarmu w wielu grupach eksperymentalnych.
- Pozwala na niezawodną identyfikację nieprawidłowych fenotypów żywieniowych w screeningu genetycznym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z mechanizmami istotnymi dla chorób poprzez modelowanie regulacji apetytu w systemie podatnym na analizę.
- Wspiera ciągłość przejścia od etapu odkrycia do przedklinicznej walidacji celów neurobiologicznych.
- Oferuje wartość prognostyczną dla dalszych badań w bardziej zaawansowanych modelach zaburzeń odżywiania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, obejmujący etapy od wczesnego testowania hipotez, przez identyfikację związków wiodących, aż po wybór modeli przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowy pomiar spożycia pokarmu umożliwia badanie obwodów neuronalnych w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiewy: Standaryzacja i skalowalność testu wspierają niezawodne procesy przesiewowe genetyczne i farmakologiczne.
- Analityka: Kwantyfikacja oparta na absorbancji zapewnia obiektywne i porównywalne wyniki dla analizy międzywarunkowej.
- Badania translacyjne: Wyniki funkcjonalne pomagają w dostosowaniu biomarkerów i zapewnieniu ciągłości translacyjnej dla celów związanych z apetytem.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Platforma testowa jest dostosowalna do różnorodnych manipulacji genetycznych i kampanii przesiewowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów neuronalnych i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zstandaryzowane, powtarzalne i skalowalne wyniki analiz do użytku międzyzespołowego.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego ograniczania ryzyka hipotez biologicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów neurobiologicznych w ramach programów badań nad chorobami metabolicznymi.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu genetyki Drosophila oraz technik manipulacji neurogenetycznych.
- Wymaga dostępu do czytników płytek, układów do stymulacji światłem i kontrolowanej temperatury oraz podstawowej infrastruktury biologii molekularnej.
- Wymaga standaryzacji warunków analizy i protokołów analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do zastosowania w różnych backgroundach genetycznych i dla różnych celów neuronalnych w modelu Drosophila.
- Ograniczenia obejmują specyfikę organizmu modelowego oraz konieczność dokładnego odejmowania tła w pomiarach absorbancji.
