Name: Połączenie ilościowych testów spożycia pokarmu i wymuszonej aktywacji neuronów w celu zbadania apetytu u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Poznaj ilościową metodę pomiaru spożycia pokarmu u dorosłych Drosophila melanogaster w połączeniu z technikami termogenetycznymi i optogenetycznymi. To podejście umożliwia badanie obwodów nerwowych regulujących apetyt w skali wysokoprzepustowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez National Basic Research Program of China (2012CB825504), National Natural Science Foundation of China (91232720 i 9163210042), Chińską Akademię Nauk (CAS) (GJHZ201302 i QYZDY-SSW-SMC015), Fundację Billa i Melindy Gatesów (OPP1119434) oraz Program 100 Talentów CAS dla Y. Zhu.

1. Przygotowanie komory karmienia
Uwaga: Komora karmienia do oznaczania barwnikiem składa się z dwóch części: pojemnika zewnętrznego (jako pokrywy) i pojemnika wewnętrznego (jako źródło pożywienia).
<ol>
	<li>Zmodyfikuj zewnętrzny pojemnik ze szklanej fiolki do hodowli Drosophila (o średnicy wewnętrznej 31,8 mm i wysokości 80 mm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A, 1C). Przykryj dno pojemnika warstwą 1% agarozy (5 ml), aby utrzymać odpowiednie nawilżenie zestawu do karmienia i służyć jako miękkie podłoże dla much, po którym mogą chodzić (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). W ten sposób pojemnik zapewnia kontrolowane, ale naturalistyczne otoczenie przy minimalnym stresie lub zakłóceniu much.
	<ol>
		<li>Przygotuj pojemnik zewnętrzny. Zawiesić 0,5 g agarozy w 50 ml podwójnie destylowanej wody, podgrzać z częstym mieszaniem i zagotować do całkowitego rozpuszczenia na mieszadle magnetycznym z płytką grzewczą.</li>
		<li>Gdy 1% agaroza ostygnie do około 60 °C, przenieś 5 ml 1% agarozy do pustego pojemnika zewnętrznego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B) i pozostaw pojemnik otwarty, aż ostygnie do temperatury pokojowej, aby uzyskać podkładkę agarozową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj żywność z etykietą barwnika. Skład żywności znakowanej barwnikiem różni się w zależności od różnych celów eksperymentalnych. Oto przykład przygotowania żywności oznaczonej barwnikiem zawierającej tylko sacharozę.
	<ol>
		<li>Dodaj 0,5 g agarozy do 50 ml podwójnie destylowanej wody, podgrzej z częstym mieszaniem i zagotuj do całkowitego rozpuszczenia na mieszadle magnetycznym z płytą grzewczą.</li>
		<li>Gdy powyższa 1% agaroza ostygnie do około 60 °C, dodaj 1,71 g sacharozy do agarozy, aby uzyskać 100 mM sacharozy.</li>
		<li>Dodać 0,25 g niebieskiego barwnika (erioglucyny disodowej) do roztworu agarozy, aby uzyskać 0,5% (w/v) żywności znakowanej barwnikiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj pojemnik wewnętrzny. Umieść puste pojemniki wewnętrzne na płaskiej poziomej powierzchni, a następnie dodaj 750 μl żywności oznaczonej niebieskim barwnikiem do indywidualnego pojemnika na żywność, pozwól mu zastygnąć przez co najmniej 5 minut. 
	nuta: Wewnątrz pojemnika znajduje się małe plastikowe naczynie o średnicy wewnętrznej 13,6 mm i wysokości 7,5 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A, 1C). Jest wypełniony żywnością oznakowaną barwnikiem, a następnie umieszcza się go na środku podkładki agarozowej zewnętrznego pojemnika.</li>
	<li>Przenieś napełniony pojemnik wewnętrzny do przygotowanego pojemnika zewnętrznego i umieść go na środku waby agarozowej. Pozostaw komory karmienia otwarte w temperaturze pokojowej przez 40 minut, aż ściana zewnętrznego pojemnika będzie wolna od kondensacji. 
	nuta: Sucha ściana jest niezbędna, aby muchy nie przyklejały się do ściany w kontakcie z kroplami wody.</li>
	<li>Przygotuj komory do karmienia z pokarmem bezbarwnikowym (ten sam skład, ale bez barwnika) do odejmowania tła.</li>
</ol>
2. Przygotowanie much
Uwaga: Dorosłe samice much od 5 do 10 dni po eklozji są zwykle używane do testów żywieniowych. Zaleca się przygotowanie much o różnych genotypach, w tym kontroli genetycznej, oraz równoległe testowanie. 20 much (z jednej komory karmienia) generuje jeden punkt danych.
<ol>
	<li>Weź pod uwagę gęstość zaludnienia do hodowli dorosłych much. Zazwyczaj kontroluj gęstość populacji, zmieniając liczbę much rodzicielskich w zależności od szczepów i wymiarów butelek hodowlanych. Na przykład przenieś 15 samców i 30 samic Canton-S do butelki hodowlanej (o średnicy 31,8 mm i wysokości 80 mm) i pozwól samicom złożyć jaja przez jeden dzień, a następnie usuń dorosłe muchy.</li>
	<li>Przygotuj muchy do aktywacji termogenetycznej.
	<ol>
		<li>Użyj systemu Gal4/UAS38, aby wyrazić dTRPA133 w różnych neuronach, krzyżując muchy UAS-dTrpA1 z różnymi liniami sterownika GAL4 (Rysunek 2B).</li>
		<li>Dorosłe muchy należy karmić standardowym pokarmem w temperaturze 22 °C, wilgotności względnej 60% i cyklu 12 godzin/12 godzin światła i ciemności.</li>
		<li>Dwa dni przed testem karmienia należy posortować i zebrać muchy na podkładce przeciwmuchowej CO2 pod mikroskopem stereoskopowym do fiolki ze świeżą żywnością i utrzymać gęstość 20 much na fiolkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj muchy do aktywacji optogenetycznej.
	<ol>
		<li>Użyj systemu Gal4/UAS38, aby wyrazić CsChrimson36 w różnych neuronach, krzyżując muchy UAS-CsChrimson z różnymi liniami sterownika GAL4.</li>
		<li>Zebrać nowo zamknięte (w ciągu 24 h) muchy i przenieść je do fiolki ze standardowym pokarmem zawierającym 400 μM all-trans-retinal.</li>
		<li>Aby zapobiec przedwczesnej aktywacji, owiń fiolki hodowlane folią aluminiową, a następnie włóż je do ciemnego pudełka, aby chronić muchy przed niepożądaną stymulacją światłem. Trzymaj muchy w temperaturze 25 °C, 60% wilgotności w ciemności przez 4 - 6 dni.</li>
		<li>Dwa dni przed testem karmienia sortuj samice much na podkładce przeciwmuchowej CO2 pod mikroskopem stereoskopowym. Zbierz 20 much do jednej fiolki z jedzeniem i trzymaj je w ciemności przed testem karmienia.</li>
		<li>Wszystkie operacje wykonuj przy słabym świetle tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć skutków spowodowanych światłem otoczenia. Użyj lampy LED umieszczonej daleko od obszaru roboczego, natężenie w obszarze roboczym wynosi 5 μW/cm2. 
		nuta: Użyj wygłodzonych much Canton-S jako pozytywnej kontroli do testu karmienia. Pozbawić te muchy pokarmu i utrzymywać 1% agarozy przez 24 godziny przed próbą karmienia. Poziomy spożycia pokarmu przez te muchy pomagają ocenić codzienne wahania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Aktywacja termogenetyczna
<ol>
	<li>Przeprowadzaj wszystkie eksperymenty żywieniowe o tej samej porze dnia, około czasu Zeitgeber 4 - 631,32, aby zminimalizować różnice spowodowane rytmem okołodobowym.</li>
	<li>Przygotuj inkubator (lub małe pomieszczenie z grzejnikiem z regulowaną temperaturą) jako środowisko grzewcze.</li>
	<li>Przed eksperymentami behawioralnymi należy zrównoważyć przygotowane komory karmienia w temperaturze doświadczalnej (30 °C) przez 2 godziny, aby upewnić się, że temperatura w komorze karmienia jest względnie jednolita.</li>
	<li>Aby rozpocząć proces karmienia, ostrożnie przenieś 20 much z ich domowej fiolki do podgrzanej komory karmienia, delikatnie stukając. Kontynuuj proces karmienia w temperaturze 30 °C przez 60 minut ( <silna klasa = "xfig" > Rysunek 3A) . 
	nuta: Częste poruszenia, takie jak otwieranie i zamykanie drzwi inkubatora, niekorzystnie wpływają na zachowanie żywieniowe, dlatego należy je zminimalizować.</li>
	<li>Przerwać karmienie po 60 minutach, zamrażając komory karmienia w temperaturze -80 °C (lub -20 °C) przez 30 min. 
	nuta: Zamrażanie pomaga zatrzymać karmienie we wszystkich komorach jednocześnie. Zamrażanie much w temperaturze -80 °C służy dwóm celom: eutanazji much i przechowywaniu do czasu homogenizacji przez okres do jednego tygodnia.</li>
	<li>W przypadku grupy kontrolującej temperaturę przenieś 20 much do komory karmienia o temperaturze pokojowej z pokarmem w kolorze barwnika, aby rozpocząć proces karmienia w temperaturze 22 °C przez 60 minut.</li>
	<li>Przerwać podawanie grupy kontrolującej temperaturę, zamrażając komory w temperaturze -80 °C (lub -20 °C) przez 30 minut.</li>
</ol>
4. Aktywacja optogenetyczna
<ol>
	<li>Przeprowadzaj wszystkie eksperymenty żywieniowe o tej samej porze dnia, około czasu Zeitgeber 4 - 631,32, aby zminimalizować różnice spowodowane rytmem okołodobowym.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś 20 much z jednej fiolki do komory karmienia, delikatnie stukając, a następnie umieść komorę bokiem na ustawie oświetleniowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A, 4B).
	<ol>
		<li>Do manipulacji optogenetycznej należy użyć zestawu pomarańczowych diod LED (607 nm) jako źródła stymulacji świetlnej i zamocować poziomą płytkę z pleksiglasu nad diodami LED, aby podeprzeć komory karmienia podczas oświetlenia. Utrzymuj konfigurację w inkubatorze w temperaturze 25 °C i wilgotności 60% (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A, 4B).</li>
		<li>Stymuluj muchy kontroli genetycznej równolegle z muchami Taotie>CsChrimson, ale w różnych komorach żywieniowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj proces karmienia przez 60 minut z tylnym oświetleniem pomarańczowym światłem.
	<ol>
		<li>Określ eksperymentalnie optymalne intensywności oświetlenia dla optogenetyki36. W przypadku much Taotie>CsChrimson intensywność 2,2 mW/mm2 wywołuje paraliż (zatrzymanie lokomocji i utratę kontroli postawy), dlatego należy użyć pośredniej intensywności 0,1 mW/mm2 do stymulacji much Taotie>CsChrimson podczas testu karmienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przerwij karmienie poprzez zamrożenie komór karmienia w temperaturze -80 °C (lub -20 °C) na 30 minut.</li>
</ol>
5. Wizualne oszacowanie konsumpcji żywności
Uwaga: Wizualne podejście do punktacji zapewnia półilościowe oszacowanie konsumpcji żywności. Chociaż nie jest tak obiektywna jak metoda optyczna, metoda ta pozwala na szybkie przejście przez dużą liczbę szczepów much, dzięki czemu nadaje się do pierwszej rundy genetycznego badania przesiewowego, aby szybko zawęzić listę kandydatów do dalszych testów.
<ol>
	<li>Po procesie karmienia znieczulij i naciąć muchy na podkładce przeciwmuchowej CO2 pod mikroskopem stereoskopowym. Przyznaj indywidualną ocenę każdej muchy na podstawie objętości i intensywności pokarmu w kolorze barwnika w jej odwłoku (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). 
	UWAGA: Kryteria oceny wizualnej: system punktacji ma 4 poziomy spożycia pokarmu odpowiadające różnym objętościom i intensywności kolorowego pokarmu w jamie brzusznej.
	<ol>
		<li>Muchy punktowe bez wykrywalnego pokarmu w kolorze barwnika uzyskaj wynik 0; daj tym ze słabym (ledwo wykrywalnym) niebieskim barwnikiem lub z pokarmem w kolorze barwnika zajmującym mniej niż jedną trzecią objętości brzucha wynik 1.</li>
		<li>Score leci z pokarmem o intensywnym kolorze barwnika, zajmującym połowę brzucha, co daje wynik 2.</li>
		<li>Osoby z intensywnie zabarwioną zawartością zajmującą więcej niż połowę brzucha oceniaj na 3 punkty (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz proporcję much z różnymi wynikami w każdym warunku eksperymentalnym (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja kolorymetryczna spożycia żywności
<ol>
	<li>Po zaprzestaniu karmienia wylej wszystkie 20 much z komory karmienia na kawałek papieru wagowego, a następnie przenieś je do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą miękkiej szczoteczki. 
	nuta: Nie wyjmuj wszystkich komór z przechowywania w temperaturze -80 °C w tym samym czasie, aby uniknąć przyklejania się much do ścianki komory z powodu kondensacji wody na zimnej komorze.</li>
	<li>Dodać 500 μl PBST do probówki i homogenizować muchy za pomocą młynka do mielenia o częstotliwości 60 Hz przez 5 s.
	<ol>
		<li>Potwierdzić wystarczającą homogenizację przez obserwację, gdy nie ma wykrywalnych fragmentów części ciała.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wiruj probówki z homogenatami przez 30 minut z prędkością 13 000 obr./min, aby usunąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Po odwirowaniu przenieść 100 μl supernatantu do studzienki na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Po załadowaniu wszystkich próbek należy umieścić płytkę w czytniku płytek w celu zmierzenia absorbancji próbek przy długości fali 630 nm.</li>
	<li>Aby usunąć absorbancję tła, odejmij absorbancję supernatantów od much karmionych pokarmem bez barwnika od absorbancji supernatantu od niebieskich much karmionych pokarmem. 
	nuta: Ten krok jest opcjonalny, w zależności od składu użytej żywności. Gdy pokarm muchowy (bez barwnika) generuje absorbancję przy 630 nm, konieczne jest wykonanie tego kroku w celu wyeliminowania tła.</li>
</ol>

<ol><li>Gao, Q., Horvath, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+feeding+and+energy+expenditure%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of feeding and energy expenditure.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).</li>
<li>Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+amino+acids+in+a+dopaminergic+circuitry+promotes+rejection+of+an+incomplete+diet+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila.</a> Cell. 156 (3), 510-521 (2014).</li>
<li>Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+feeding+behavior+in+adult+Drosophila+melanogaster+varies+with+feeding+regime+and+nutritional+state%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state.</a> J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).</li>
<li>Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fructose+receptor+functions+as+a+nutrient+sensor+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain.</a> Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).</li>
<li>Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+control+of+food+intake+and+body+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Central nervous system control of food intake and body weight.</a> Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).</li>
<li>Pool, A. H., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+regulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Feeding regulation in Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).</li>
<li>Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-Producing+Cells+in+the+Drosophila+Brain+also+Express+Satiety-Inducing+Cholecystokinin-Like+Peptide%2C+Drosulfakinin%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109(2012).</li>
<li>Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+taste+and+calorie+sensing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integration of taste and calorie sensing in Drosophila.</a> J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).</li>
<li>Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+hunger-driven+behaviors+by+neural+ribosomal+S6+kinase+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).</li>
<li>Itskov, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+monitoring+and+quantitative+analysis+of+feeding+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila.</a> Nat Commun. 5, 4560(2014).</li>
<li>Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calories+do+not+explain+extension+of+life+span+by+dietary+restriction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila.</a> PLoS Biol. 3 (7), e223(2005).</li>
<li>Diegelmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CApillary+FEeder+Assay+Measures+Food+Intake+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (121), (2017).</li>
<li>Ja, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prandiology+of+Drosophila+and+the+CAFE+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prandiology of Drosophila and the CAFE assay.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).</li>
<li>Shiraiwa, T., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proboscis+extension+response+%28PER%29+assay+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila.</a> J Vis Exp. (3), e193(2007).</li>
<li>Qi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+feeding+assay+in+adult+Drosophila+reveals+rapid+modulation+of+food+ingestion+by+its+nutritional+value%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value.</a> Mol Brain. 8, 87(2015).</li>
<li>Ja, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-+and+nutrient-dependent+effects+of+dietary+restriction+on+Drosophila+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).</li>
<li>Deshpande, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Drosophila+food+intake%3A+comparative+analysis+of+current+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology.</a> Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li>
<li>Deshpande, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+Food+pH+Increases+Palatability+and+Consumption+and+Extends+Drosophila+Lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan.</a> J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).</li>
<li>Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste-independent+detection+of+the+caloric+content+of+sugar+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).</li>
<li>Shen, P., Cai, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuropeptide+F+mediates+integration+of+chemosensory+stimulation+and+conditioning+of+the+nervous+system+by+food%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food.</a> J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octopamine+mediates+starvation-induced+hyperactivity+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).</li>
<li>Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurogenetics+of+group+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster.</a> J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).</li>
<li>Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanosensory+receptor+required+for+food+texture+detection+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila.</a> Nat Commun. 8, 14192(2017).</li>
<li>Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taotie+neurons+regulate+appetite+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Taotie neurons regulate appetite in Drosophila.</a> Nat Commun. 7, 13633(2016).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+starvation-induced+hyperactivity+by+insulin+and+glucagon+signaling+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Wood, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirtuin+activators+mimic+caloric+restriction+and+delay+ageing+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans.</a> Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).</li>
<li>Inagaki, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Neuromodulation+In+Vivo%3A+TANGO-Mapping+of+Dopamine+Signaling+Reveals+Appetite+Control+of+Sugar+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing.</a> Cell. 148 (3), 583-595 (2012).</li>
<li>Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+food+intake+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantification of food intake in Drosophila.</a> PLoS One. 4 (6), e6063(2009).</li>
<li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moonwalker+Descending+Neurons+Mediate+Visually+Evoked+Retreat+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila.</a> Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).</li>
<li>Ewing, L. S., Ewing, A. W. <a target="_blank" href="http://booksandjournals.brillonline.com/content/journals/10.1163/156853987x00477">Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state.</a> Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).</li>
<li>Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gustatory+physiology+and+appetitive+behavior+by+the+Drosophila+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock.</a> Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).</li>
<li>Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+feeding+and+metabolism+by+neuronal+and+peripheral+clocks+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila.</a> Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).</li>
<li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).</li>
<li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nature/journal/v423/n6942/full/423822a.html">Ion channels - Opposite thermosensor in fruitfly and mouse.</a> Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+starvation-induced+hyperactivity+by+insulin+and+glucagon+signaling+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+thermosensor+in+fruitfly+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opposite thermosensor in fruitfly and mouse.</a> Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene-Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+short+neuropeptide+F+regulates+food+intake+and+body+size%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size.</a> J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).</li>
<li>Marella, S., Mann, K., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+Modulation+of+Sucrose+Acceptance+Behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila.</a> Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).</li>
<li>Albin, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Subset+of+Serotonergic+Neurons+Evokes+Hunger+in+Adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila.</a> Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).</li>
<li>Ro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+signaling+mediates+protein+valuation+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Serotonin signaling mediates protein valuation and aging.</a> eLife. 5, e16843(2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Niniejszy raport koncentruje się na technicznym procesie znakowania barwnikami, oznaczania żywieniowego konsumpcji żywności w kontekście aktywacji termogenetycznej i optogenetycznej w celu manipulowania neuronami kontrolującymi karmienie. Ten prosty i niezawodny protokół pomoże wyjaśnić funkcję neuronów kandydujących w kontroli karmienia, zmierzyć preferencje żywieniowe much oraz zidentyfikować nowych graczy w obwodach kontroli żywienia za pomocą genetycznych badań przesiewowych opartych na żywieniu24</...

Ilościowe określenie ilości spożywanego pokarmu jest ważne dla oceny wielu aspektów kontroli odżywiania przez mózg w odpowiedzi na potrzeby wewnętrzne (takie jak stany głodu) i czynniki zewnętrzne (takie jak jakość jedzenia i smakowitość)1,2,3,4,5,6,7,8,9. W ostatnich latach wysiłki zmierzające do rozszyfrowania neuronalnych substratów kontroli karmienia u Drosophila doprowadziły do opracowania wielu testów do bezpośredniego ilościowego określania ilości spożywanego pokarmu lub służenia jako wskaźnik motywacji do karmienia10,11,12,13,14,15,16.
Test CApillary FEeder (CAFE)12,13 został opracowany do pomiaru ilości spożywanej płynnej żywności w szklanej mikrokapilarze. Test CAFE jest bardzo czuły i powtarzalny17 i upraszcza pomiar spożycia żywności, szczególnie w celu ilościowego określenia długotrwałego karmienia18. Jednak ten test wymaga, aby muchy wspięły się na wierzchołek mikrokapilary i żerowały do góry nogami, co nie jest odpowiednie dla wszystkich szczepów. Ponadto, ponieważ muchy, które mają być badane za pomocą testu CAFE, muszą być hodowane na płynnym pokarmie, wpływ tych warunków chowu na stan metabolizmu lub potencjalne niedożywienie pozostaje do ustalenia.
Test odpowiedzi na wydłużenie trąby (PER)11,14 zlicza częstotliwość reakcji rozszerzenia trąbki na delikatne dotknięcia kropli jedzenia. Test PER okazał się doskonałym sposobem oceny motywacji żywieniowej poszczególnych much i oceny wpływu smakowitości i zawartości pokarmu18,19. Nie jest to jednak bezpośrednia kwantyfikacja ilości spożycia.
Ostatnio opracowano półautomatyczną metodę, test ręcznego karmienia (MAFE)15. W MAFE pojedyncza unieruchomiona mucha jest karmiona ręcznie mikrokapilarą zawierającą pokarm. Biorąc pod uwagę, że reakcje na wydłużenie trąbki i spożycie żywności mogą być monitorowane jednocześnie, MAFE nadaje się do oceny wartości odżywczych i skutków manipulacji farmakologicznej. Jednak unieruchomienie muchy może negatywnie wpłynąć na jej wydajność behawioralną, w tym żerowanie.
Dodatkowo, Fly Proboscis and Activity Detector (FlyPAD)10 został opracowany w celu automatycznego ilościowego określania zachowań żywieniowych. Korzystając z metod widzenia maszynowego, FlyPAD rejestruje fizyczne interakcje między muchą a pokarmem, aby określić ilościowo częstotliwość i czas trwania przedłużania trąbki jako wskaźnik motywacji do karmienia. FlyPAD zapewnia wysokowydajne podejście do monitorowania zachowań żywieniowych swobodnie poruszających się much, chociaż czułość i solidność tego systemu musi zostać potwierdzona przez więcej badań12.
Strategie etykietowania są często używane do oszacowania spożycia pokarmu przez muchy. Powszechne jest oznaczanie żywności znacznikami chemicznymi, a po karmieniu mierzenie ilości spożytego znacznika w celu obliczenia ilości pobranego pokarmu. Radioaktywne znaczniki16,17,20,21,22,23,24,25 pozwalają na wykrycie przez naskórek bez homogenizacji much. Metoda ta zapewnia wyjątkowo niską zmienność i wysoką czułość18 i jest możliwa do przeprowadzenia w długoterminowym badaniu spożycia pokarmu. Jednak podczas pracy z tym testem należy wziąć pod uwagę dostępność użytecznych izotopów promieniotwórczych oraz różne szybkości absorpcji i wydalania.
Etykietowanie i śledzenie spożycia żywności za pomocą nietoksycznych barwników spożywczych jest bezpieczniejszą i prostszą alternatywą2,3,26,27,28. Muchy są homogenizowane po karmieniu pokarmem zawierającym rozpuszczalne i niewchłanialne barwniki, a ilość spożytego barwnika jest później oznaczana ilościowo za pomocą spektrofotometru3,24,28,29. Strategia etykietowania jest łatwa do wykonania i zapewnia wysoką wydajność, ale z zastrzeżeniem. Objętość spożycia pokarmu szacowana na podstawie spożytego barwnika jest mniejsza niż rzeczywista objętość, ponieważ wydalanie rozpoczyna się już po 15 minutach od rozpoczęcia karmienia przez muchy17. Ponadto test ocenia spożycie pokarmu zwykle w ciągu 60 minut, co jest odpowiednie tylko do badania krótkoterminowych zachowań żywieniowych24,28. Ponadto wiele czynników wewnętrznych i zewnętrznych, takich jak genotyp17, gender17, stan krycia17, gęstość hodowli30, rytm okołodobowy31,32, oraz jakość żywności3,8,16, wpływać na przyjmowanie pokarmu. W związku z tym może być konieczne dostosowanie czasu karmienia do określonych warunków eksperymentalnych. Oprócz ułatwienia ilościowego określania spożycia pokarmu, barwniki żywności są również używane do oceny wyborów żywieniowych2,19,27, oraz do wizualizacji łąkotki w mikrokapilarze w teście CAFE12.
Tutaj wprowadzamy protokół łączący manipulację aktywnością neuronów z podejściem do znakowania barwnikami. Strategia ta okazała się przydatna w naszym badaniu neurogenetycznym dotyczącym kontroli karmienia u dorosłych muszek owocowych24. Metoda punktacji wizualnej pozwala na szybkie oszacowanie spożycia żywności; W związku z tym jest przydatny do przesiewania dużej liczby szczepów w odpowiednim czasie. Kandydaci z ekranu są następnie szczegółowo analizowani przy użyciu metody kolorymetrycznej, aby zapewnić obiektywną i precyzyjną kwantyfikację w dodatkowym badaniu.
Oprócz testów żywieniowych, opisujemy również metody termogenetyczne27,33,34,35 i optogenetic36 metod przymusowej aktywacji docelowych neuronów u Drosophila. Aktywacja neuronów za pomocą operacji termogenetycznej jest prosta i wygodna dzięki Drosophila Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (dTRPA1), który jest kanałem kationowym bramkowanym temperaturą i napięciem, który zwiększa pobudliwość neuronów, gdy temperatura otoczenia wzrasta powyżej 23 °C33,37; Jednak testowanie zwierząt w wysokich temperaturach może mieć niekorzystny wpływ na zachowanie. Innym skutecznym podejściem do aktywacji neuronów u Drosophila jest użycie optogenetyki z CsChrimson36, który jest przesuniętym ku czerwieni wariantem rodopsyny kanałowej, który zwiększa pobudliwość neuronów pod wpływem światła. Optogenetyka oferuje wyższą rozdzielczość czasową i mniejsze zakłócenia zachowań niż termogenetyka. Połączenie ilościowego pomiaru spożycia pokarmu z manipulacją aktywnością neuronalną stanowi skuteczne podejście do badania neuronalnych mechanizmów żywienia.
Szczegółowo opisujemy przygotowanie komory karmienia i much, które mają być testowane. Używając muchy Taotie-Gal4 jako modelu24, opisujemy aktywację neuronów za pomocą termogenetyki i optogenetyki. W protokole opisano również dwa testy ilościowego oznaczania spożycia żywności z żywnością znakowaną barwnikiem.

<table><tbody><tr><td>UAS-CsChrimson</td><td>Bloomintoon</td><td>55135</td><td></td></tr><tr><td>UAS-dTrpA1</td><td>Bloomintoon</td><td>26263</td><td></td></tr><tr><td>TDC1-GAL4&nbsp;</td><td>Bloomintoon</td><td>9312</td><td></td></tr><tr><td>TDC2-GAL4</td><td>Bloomintoon</td><td>9313</td><td></td></tr><tr><td>sNPF-GAL4</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez Z. Zhao</td></tr><tr><td>NPF-GAL4</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez Y. Rao</td></tr><tr><td>TH-GAL4</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez Y. Rao</td></tr><tr><td>5-HT-GAL4</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez Y. Rao</td></tr><tr><td>AKH-GAL4</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez Y. Rao</td></tr><tr><td>dip2-GAL4</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez Y. Rao</td></tr><tr><td>Taotie-GAL4</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez J. Carlson</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Biowest</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Erioglaucyna sól disodowa</td><td>Sigma</td><td>861146</td><td></td></tr><tr><td>all-trans-retinal&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>R2500</td><td>przechowywany w ciemności</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>9002-93-01</td><td></td></tr><tr>Pokarm <td></td><td>na muchy</td><td>1 L karma zawiera: 77,7 g mączki kukurydzianej, 32,19 g drożdży, 5 g agaru, 0,726 g CaCl2, 31,62 g sacharozy, 63,2 g glukozy, 2 g sorbinianu potasu, pH&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 1x bufor PBS&nbsp;</td><td></td><td>1 L 1X PBS zawiera: 8 g Nacl, 0,2 g Kcl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, bufor pH 7,4</td><td></td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td>1X PBS z 1% Triton X-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Młyn szlifierski</td><td>Shang Hai Jing Xin</td><td>Tissuelyser-24</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Ning Bo Jiang Nan</td><td>HWS-80</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne z płytą grzewczą</td><td>Chang Zhou Bo Yuan</td><td>CJJ 78-1</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr</td><td>Thorlabs</td><td>CCS200/M</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikropłytkowy</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Multiskan GO Typ: 1510, REF 51119200</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny&nbsp;</td><td>Leica</td><td>&nbsp; M205FA</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica&nbsp;</td><td>S6E</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik zewnętrzny</td><td>Jiang Su Hai Men</td><td>szklana fiolka o średnicy 31,8 mm i wysokości 80 mm (wymiar wewnętrzny)</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik wewnętrzny&nbsp;</td><td>Plastikowa czasza z fabryki maszyn Beijing Yi Ran</td> o <td>średnicy 13,6 mm i wysokości 7,5 mm (wymiar wewnętrzny)</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki Eppendorf</td><td>Hai Men Ning Mong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Płytka 96-dołkowa</td><td>Corning Incorporated</td><td>&nbsp; Diody LED Costar 3599</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Xin Xing Yuan Guangdian</td><td>607 nm, 3W&nbsp;</td><td>https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058</td></tr></tbody></table>

połączenie ilościowych testów spożycia pokarmu i wymuszonej aktywacji neuronów w celu zbadania apetytu u drosophila

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Konsumpcja jedzenia jest pod ścisłą kontrolą mózgu, który integruje stan fizjologiczny, smakowitość i zawartość składników odżywczych jedzenia oraz wydaje polecenia, aby rozpocząć lub zakończyć karmienie. Rozszyfrowanie procesów leżących u podstaw podejmowania decyzji o terminowym i umiarkowanym karmieniu niesie ze sobą poważne implikacje dla naszego zrozumienia zaburzeń fizjologicznych i psychologicznych związanych z kontrolą żywienia. Potrzebne są proste, ilościowe i solidne metody pomiaru spożycia pokarmu przez zwierzęta po manipulacjach eksperymentalnych, takich jak wymuszone zwiększenie aktywności niektórych neuronów docelowych. W tym miejscu wprowadziliśmy testy żywieniowe oparte na znakowaniu barwnikiem, aby ułatwić badanie neurogenetyczne kontroli karmienia u dorosłych muszek owocowych. Dokonujemy przeglądu dostępnych testów żywieniowych, a następnie opisujemy nasze metody krok po kroku od konfiguracji do analizy, które łączą termogenetyczną i optogenetyczną manipulację neuronów kontrolujących motywację do karmienia z testem spożycia żywności znakowanym barwnikiem. Omawiamy również zalety i ograniczenia naszych metod w porównaniu z innymi testami żywieniowymi, aby pomóc czytelnikom w wyborze odpowiedniego testu.

Przesiew termogenetyczny.
Nieprawidłowo zwiększony apetyt powoduje zwiększone spożycie pokarmu, niezależnie od potrzeb fizjologicznych. Wykorzystaliśmy ten schemat do zaprojektowania wysokoprzepustowego badania behawioralnego w celu uzyskania genetycznych narzędzi do manipulacji neuronami związanymi ze stanami głodu i sytości (Rycina 1). Badanie to pozwoliło wytypować Taotie-Gal4<sup class=...

Ilościowe testy spożycia żywności z farbowaną żywnością dostarczają solidnych i wydajnych środków do oceny motywacji do karmienia. Połączenie testu spożycia żywności z termogenetycznymi i optogenetycznymi badaniami przesiewowymi jest skutecznym podejściem do badania obwodów neuronalnych leżących u podstaw apetytu u dorosłych Drosophila melanogaster.

Połączenie ilościowych testów spożycia pokarmu i wymuszonej aktywacji neuronów w celu zbadania apetytu u Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowy pomiar spożycia pokarmu przez dorosłe osobniki Drosophila, co zapewnia środki do oceny skutków manipulacji genetycznych, takich jak termogenetyczne i optogenetyczne aktywacje neuronów. Środki te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie żywienia, takie jak neuromechanika głodu, sytości i apetytu. Główną zaletą tej techniki jest to, że jednocześnie określa ilościowo spożycie pokarmu przez wiele grup much, co czyni ją szczególnie przydatną do identyfikacji nieprawidłowo żerujących much w genetycznych badaniach przesiewowych.Na początek zbierz zapasy, aby przygotować zewnętrzny pojemnik. Zawiesić 0,5 grama agarozy i 50 mililitrów podwójnie destylowanej wody. Podgrzać przy częstym mieszaniu i zagotować do całkowitego rozpuszczenia na mieszadle magnetycznym z płytą grzewczą.Gdy 1% agaroza ostygnie do około 60 stopni Celsjusza, przenieś pięć mililitrów do pustego pojemnika zewnętrznego i trzymaj pojemnik otwarty, aż agaroza ostygnie do temperatury pokojowej, aby uzyskać podkładkę agarozową. Następnie dodaj 0,5 grama agarozy do 50 mililitrów podwójnie destylowanej wody. Podgrzać przy częstym mieszaniu i zagotować do całkowitego rozpuszczenia na mieszadle magnetycznym z płytą grzewczą.Gdy 1% agaroza ostygnie do około 60 stopni Celsjusza, dodaj 1,71 grama sacharozy do agarozy, aby uzyskać 100 milimoli sacharozy. Dodaj 0,25 grama niebieskiego barwnika do roztworu agarozy, aby uzyskać 0,5% wagowo na objętość barwionej żywności na etykiecie. Następnie przygotuj pojemnik wewnętrzny.Umieść puste pojemniki wewnątrz na płaskiej poziomej powierzchni. Następnie dodaj 750 mikrolitrów żywności oznaczonej niebieskim barwnikiem do poszczególnych pojemników na żywność. Pozwól zastygnąć przez co najmniej pięć minut.Przenieś napełniony pojemnik wewnętrzny do przygotowanego pojemnika zewnętrznego i umieść go na środku waby agarozowej. Przygotuj komory karmienia z pokarmem bezbarwnym do odejmowania tła. Pozostaw otwarte komory karmienia w temperaturze pokojowej na 40 minut, aż ścianka zewnętrznego pojemnika będzie wolna od kondensacji.Przed eksperymentami behawioralnymi należy zrównoważyć przygotowane komory żywieniowe w eksperymentalnej temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby upewnić się, że temperatura w komorach żywieniowych jest względnie jednolita. Aby rozpocząć proces karmienia, ostrożnie przenieś 20 much z ich domowej fiolki do podgrzanej komory karmienia, delikatnie stukając. Kontynuuj proces karmienia w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 60 minut.Przerwij karmienie, zamrażając komory karmienia w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 30 minut. Ostrożnie przenieś 20 much z jednej fiolki do komory karmienia, delikatnie stukając. A następnie umieść komorę bokiem na zestawie oświetleniowym.Do manipulacji optogenetycznej użyj szeregu pomarańczowych diod LED jako źródła stymulacji świetlnej i zamocuj poziomą płytkę z pleksiglasu nad diodami LED, aby podeprzeć komory karmienia podczas oświetlenia. Utrzymuj konfigurację w inkubatorze w temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności 60%. Stymuluj muchy kontroli genetycznej równolegle z muchami Taotie-GAL4 UAS CsChrimson, ale w różnych komorach żywieniowych.Kontynuuj proces karmienia przez 60 minut z tylnym oświetleniem pomarańczowym światłem. Następnie zamroź komory karmienia w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 30 minut. Po zakończeniu karmienia wysyp wszystkie 20 much z komory karmienia na kartkę papieru wagowego.Następnie przenieś je do 1,5 mililitrowej rurki za pomocą miękkiej szczoteczki. Dodaj 500 mikrolitrów PBST do probówki i homogenizuj muchy za pomocą młynka mielącego o częstotliwości 60 Hz przez pięć sekund. Następnie potwierdzić wystarczającą homogenizację przez obserwację, gdy nie ma wykrywalnych fragmentów części ciała.Wiruj probówki z homogenatami przez 30 minut z prędkością 1300 obr./min, aby usunąć zanieczyszczenia. Po odwirowaniu przenieść 100 mikrolitrów supernatantu do studzienki z 96-dołkową płytką. Aby uniknąć błędnego obliczenia absorbentów spowodowanego zanieczyszczeniami, delikatnie wyjmij używaną rurkę z wirówki i ostrożnie upuść supernatant, nie naruszając palety.Po załadowaniu wszystkich próbek umieść płytkę w czytniku płytek, aby zmierzyć absorbenty próbek na głębokości 630 nanometrów. Reakcję na karmienie określono ilościowo poprzez wizualną inspekcję i ocenę muszek z wykrywalnym barwnikiem w jelitach. Po aktywacji neuronów Taotie około 58% much Taotie dTRPA1 wykazywało silne zachowania żywieniowe.A 23% z nich wykazało łagodne zachowania żywieniowe. Ostre neurony Taotie-GAL4 aktywowane przez TRPA1 dramatycznie zwiększyły spożycie pokarmu, co sugeruje, że neurony znakowane Taotie-GAL4 uczestniczą w regulacji spożycia pokarmu przez dorosłe Drosophila. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo ilość przyjmowanego pokarmu po manipulowaniu aktywnością neuronów w celu zbadania neuromechanizmów kontroli karmienia u dorosłych Drosophila melanogaster.

combining-quantitative-food-intake-assays-forcibly-activating-neurons

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Muszka owocówka, Drosophila melanogaster, wysuwa swój trąbek w celu żerowania w odpowiedzi na bodziec cukrowy działający na trąbek lub tarsus. Połączyłem obserwacje reakcji wysuwania trąbka (PER) z techniką obrazowania wapnia, co pozwala nam monitorować aktywność neuronów w mózgu równocześnie z obserwacją behawioralną.

Jednoczesna rejestracja sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowań żerowania Drosophila melanogaster

Drosophila larwy są w stanie kojarzyć bodźce zapachowe z nagrodą smakową. W niniejszej pracy opisujemy prosty paradygmat behawioralny, który umożliwia analizę apetytywnego uczenia się asocjacyjnego w odpowiedzi na zapachy.

Apetytywne warunkowanie węchowe u larw Drosophila

Ten film opisuje test preferencji smakowych, metodę behawioralną używaną do pomiaru atrakcyjności lub unikania kolorowych roztworów, które smakują inaczej, poprzez ocenę zabarwienia brzucha muchy po spożyciu preferowanej substancji. Przedstawiony protokół przedstawia procedurę zastosowaną do pomiaru preferencji muszek w stosunku do roztworów o różnych stężeniach sacharozy.

Test preferencji smakowych: metoda pomiaru zachowań żywieniowych u Drosophila

Ten film opisuje test CApillary FEeder, czyli CAFE, metodę behawioralną, która mierzy spożycie pokarmu i preferencje niepohamowanych muszek owocowych. Przedstawiony protokół pokazuje, jak przeprowadzić test przy minimalnym parowaniu z wypełnionych płynem naczyń włosowatych używanych do dostarczania pokarmu i śledzenia jego spożycia.

Test CApillary FEeder (CAFE): metoda śledzenia spożycia i preferencji żywieniowych u Drosophila

W tym artykule wideo opisujemy zautomatyzowany test do pomiaru wpływu głodu lub sytości na zależne od węchu zachowanie związane z poszukiwaniem pokarmu u dorosłej muszki owocowej Drosophila melanogaster.

Test pojedynczej muchy na zachowania żerowe u Drosophila

Opisujemy protokół wywoływania nagradzających i nienagradzających doświadczeń u muszek owocowych (Drosophila melanogaster) przy użyciu dobrowolnego spożycia etanolu jako miary zmian w stanach nagrody.

Prosty sposób na zmierzenie zmian w zachowaniu związanym z poszukiwaniem nagrody za pomocą Drosophila melanogaster

Test CApillary FEeder (CAFE) jest prostą, niedrogą i wysoce niezawodną metodą badania mechanizmów leżących u podstaw przyjmowania pokarmu. Stosowany w połączeniu z wysoce wszechstronnym modelem genetycznym Drosophila melanogaster, stanowi potężny środek do uzyskania nowego wglądu w mechanizmy regulacyjne przyjmowania pokarmu.

Test CApillary FEeder mierzy spożycie pokarmu u Drosophila melanogaster

Opisany tutaj jest protokół, który umożliwia kolorymetryczną kwantyfikację ilości jedzenia spożywanego w określonym przedziale czasu przez larwy Drosophila melanogaster wystawione na działanie diety o różnej jakości makroskładników. Testy te są przeprowadzane w kontekście neuronalnego badania termogenetycznego.

Kwantyfikacja spożycia makroskładników odżywczych w termogenetycznym badaniu przesiewowym neuronów przy użyciu larw Drosophila

Przedstawiamy protokół dla testu żywieniowego dla much z dwoma opcjami. Ten test żywieniowy jest szybki i łatwy do przeprowadzenia i nadaje się nie tylko do badań laboratoryjnych na małą skalę, ale także do wysokowydajnych badań behawioralnych u much.

Szybki test preferencji żywieniowych u Drosophila

Test podawania mikropłytek oferuje ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania spożycia płynów u Drosophila. Urządzenie wydrukowane w 3D łączy 96-dołkową mikropłytkę, w której trzymane są muchy, z 1536-dołkową mikropłytką, z której muchy spożywają roztwór pokarmowy z barwnikiem znacznikowym. Spadek objętości roztworu jest mierzony spektrofotometrycznie.

Wysokoprzepustowy test na mikropłytkach do ilościowego oznaczania spożycia u Drosophila

Podejście do obrazowania wapnia umożliwia rejestrowanie reakcji wywołanych smakiem w mózgach obudzonych muszek, podczas gdy roztwór jest nakładany na labellum. Jako przykład podano pierwotne reakcje smakowe u Drosophila melanogaster, ale protokół ten można dostosować do badania neuronów w dół rzeki lub innych gatunków.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia reakcji neuronalnych wywołanych smakiem u dorosłych Drosophila

Poznaj ilościową metodę pomiaru spożycia pokarmu u dorosłych Drosophila melanogaster w połączeniu z technikami termogenetycznymi i optogenetycznymi. To podejście umożliwia badanie obwodów nerwowych regulujących apetyt w skali wysokoprzepustowej.

Połączenie ilościowych testów spożycia pokarmu i wymuszonej aktywacji neuronów w celu zbadania apetytu u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów