Jednokomórkowa analiza mikroprzepływowa Bacillus subtilis
26 stycznia 2018
Przedstawiamy metodę analizy mikroprzepływowej poszczególnych linii komórek bakteryjnych na przykładzie Bacillus subtilis. Metoda ta przezwycięża niedociągnięcia tradycyjnych metod analitycznych w mikrobiologii, umożliwiając obserwację setek generacji komórek w ściśle kontrolowanych i jednolitych warunkach wzrostu.
Ogólnym celem tego mikroprzepływowego zestawu eksperymentalnego jest umożliwienie długotrwałej obserwacji pojedynczych komórek bakteryjnych w stałych, ściśle kontrolowanych warunkach środowiskowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii bakterii, takie jak jakie są długoterminowe wzorce reakcji poszczególnych komórek na stres lub jak heterogeniczny fenotyp w populacji zmienia się w czasie. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy obserwować poszczególne linie komórkowe przez dziesiątki, a nawet setki pokoleń, w stałych, jednolitych i ściśle kontrolowanych warunkach środowiskowych.
Po przygotowaniu polimeru PDMS zgodnie z protokołem tekstowym, umieść silikonowy wzorzec na kawałku nieprzerwanej folii aluminiowej na polistyrenowej szalce Petriego. Wlej odgazowaną mieszaninę PDMS na urządzenie główne na głębokość około pięciu milimetrów. Następnie odgazowuj naczynie przez co najmniej 10 minut.
Utwardź PDMS w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę i ostudź do temperatury pokojowej. Następnie usuń z płytki folię aluminiową zawierającą wzorzec i utwardzony PDMS. Ostrożnie naciąć go i oderwać folię aluminiową z tyłu mistrza.
Następnie ostrożnie oderwij PDMS od wzorca. Jako płytka zazwyczaj zawiera kilka urządzeń mikroprzepływowych o nieco różnych wymiarach. Użyj czystego, ostrego skalpela, aby przyciąć pojedyncze urządzenie do odpowiedniego rozmiaru.
Umieść kawałek półprzezroczystej taśmy biurowej na wzorzystej stronie urządzenia, aby zwiększyć widoczność wzorzystych elementów. Porty wlotowe i wylotowe są oznaczone jako okrągłe obszary na przeciwległych końcach widocznych kanałów płynowych. Odwróć urządzenie PDMS stroną ze wzorem do dołu i użyj dziurkacza do biopsji o średnicy 0,75 milimetra, aby przebić urządzenie do zaznaczonych kropek.
Następnie wyrzuć dziurki. Do usunięcia wykrojników z urządzenia może być potrzebna pęseta. Włóż oczyszczoną i wysuszoną szklaną pokrywę i urządzenie PDMS do myjki plazmowej i potraktuj urządzenie plazmowo zgodnie z ustawieniami pokazanymi tutaj.
Natychmiast po zakończeniu obróbki plazmowej należy zdjąć urządzenie i szkło nakrywkowe z myjki plazmowej. Odwróć PDMS i umieść go na środku szkła nakrywkowego tak, aby strona wzoru stykała się ze szkłem. Upewnij się, że kanały podające są wyrównane z długim dostępem szkła nakrywkowego.
Dociśnij bardzo delikatnie, aby upewnić się, że PDMS przylega do szkła. Zmontowane urządzenie pieczemy w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę. Po upieczeniu ręcznie sprawdź, czy PDMS jest połączony ze szkłem, delikatnie naciskając jeden róg urządzenia.
Po przecięciu rurki polimerowej zgodnie z protokołem tekstowym, zmontuj złącza Y dla zaworów zaciskowych, jeśli ich używasz, przecinając i mocując dwucentymetrowe odcinki elastycznych rurek silikonowych do górnych zadziorów Y i jednocentymetrowe odcinki rurki silikonowej do dolnego pręta Y.Następnie odetnij 10-centymetrowe odcinki rurki polimerowej, a następnie połącz je na jednym końcu ze złączem przełącznika, wkładając je do jednocentymetrowych odcinków rurki silikonowej na dolny zadzior Y. Połącz odcinki rurki na drugim końcu z igłami o rozmiarze 21, które zostały wyjęte z plastikowych adapterów strzykawek i wygięte pod kątem około 90 stopni około dziewięciu milimetrów od końca igły. Podłącz igły o rozmiarze 21 do jednego końca segmentów rurki, które będą biegły od strzykawek do aparatu przełączającego, wkładając igły do rurki. Włóż drugie końce każdej długości rurki do silikonowych segmentów rurki na króćcach wlotowych złączy Y.
Po napełnieniu strzykawek bakteryjną pożywką wzrostową, uzupełnioną BSA, zgodnie z protokołem tekstowym, należy podłączyć załadowane strzykawki do przygotowanych igieł o rozmiarze 21, podłączyć do rurki wlotowej i załadować strzykawki do pomp strzykawkowych. Usuń powietrze z kanalizacji wlotowej, uruchamiając pompy strzykawkowe z dużym natężeniem przepływu i ustawiając pompy strzykawkowe pionowo, stukając w strzykawki, aby doprowadzić pęcherzyki powietrza do góry. Po usunięciu powietrza ze strzykawki, należy ustawić pompę strzykawki poziomo i stopniowo stukać lub przesuwać przewody polimerowe ze strzykawek w górę przez aparat przełączający, aby usunąć i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
Powtórz ten proces dla drugiego zestawu strzykawek w przypadku zmiany pożywki. Po usunięciu pęcherzyków powietrza ustaw pompę strzykawkową drugiej fazy na 1,5 mikrolitra na minutę, a następnie wstrzymaj przepływ. Umieść małe zaciski do segregatora na segmentach elastycznej rurki na odgałęzieniu złączy Y odpowiadających drugiej fazie medium i kontynuuj uruchamianie pompy fazy pierwszej, aby przedmuchnąć drugie medium za złączem Y.
Aby załadować urządzenie PDMS, należy rozpocząć od delikatnego umieszczenia pustych, cienkich końcówek mikropipet z żelem w otworach wylotowych urządzenia mikroprzepływowego. Używając cienkich końcówek do ładowania żelu z mikropipetą P200, pasywuj urządzenie, wstrzykując medium zawierające jeden miligram na mililitr BSA do otworów wlotowych, obserwując końcówki i otwory wylotowe w celu monitorowania wypełnienia kanałów mikroprzepływowych. Inkubować urządzenie w temperaturze pokojowej przez około pięć minut.
Następnie, korzystając z podobnych końcówek, załaduj każdy kanał ponownie zawieszonymi ogniwami, korzystając z końcówek w kanale wylotowym, aby monitorować postęp komórek przez urządzenie. Delikatnie wyjmij końcówki żelowe z otworów wylotowych, pracując pojedynczo, aby zapobiec uszkodzeniu urządzenia. Odwirować urządzenie w mikrowirówce stołowej w odpowiednim adapterze wirnika z prędkością około 6 000 g przez 10 minut.
Sprawdź pomyślne ładowanie pod mikroskopem, ale bez mocowania urządzenia do wkładki stolika uchwytu szkiełkowego. Ostrożnie zamontuj załadowane urządzenie na wkładzie stage, przyklejając szkło nakrywkowe po obu stronach PDMS do dolnej części stage wkładka. Odwróć stage włóż zespół urządzenia tak, aby PDMS był skierowany do góry i umieść go na miękkiej powierzchni, takiej jak chusteczka bezpyłowa.
Dostosuj natężenie przepływu pompy strzykawkowej pierwszej fazy do 35 mikrolitrów na minutę. Następnie, pracując z jednym pasem na raz, włóż igłę wlotową, a następnie igłę wylotową, która biegnie do zlewki na odpady. Po oględzinach urządzenia pod kątem wycieków należy sprawdzić rurkę wylotową pod kątem nadmiaru komórek, które pojawiają się jako mętny pasek w środkowej menisku, który powoli przesuwa się w kierunku zlewki na odpady.
Gdy urządzenie będzie działać przez około 15 minut, ustaw pompę strzykawkową pierwszej fazy na 1,5 mikrolitra na minutę i wstrzymaj przepływ. Przyłóż całą pompę i aparaturę urządzenia do odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego i ponownie uruchom przepływ medium pierwszej fazy z prędkością 1,5 mikrolitra na minutę. Ostrożnie zamontuj stage wkładkę z urządzeniem na mikroskopie, używając w razie potrzeby taśmy do poprowadzenia rurki doprowadzającej i wylotowej.
Znajdź odpowiednie pozycje na urządzeniu do obrazowania i rozpocznij obrazowanie zgodnie z potrzebami. Należy zauważyć, że komórki zazwyczaj potrzebują kilku godzin, aby odczytać stan ustalony, wykładniczy wzrost fazy, a początek akwizycji obrazu może być opóźniony w razie potrzeby, tak aby obrazowanie rozpoczęło się po okresie równowagi. Aby przełączać pożywkę między kolejnymi rundami obrazowania, wstrzymaj przepływ pompy strzykawkowej fazy pierwszej, ostrożnie odpiąć zaciski segregatora od silikonowej rurki fazy drugiej, przesuwając każdy z nich do rurki silikonowej na odgałęzieniu pierwszej fazy złącza Y, a następnie odblokuj przepływ pompy strzykawkowej fazy drugiej i kontynuuj obrazowanie.
Jak oceniono za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego, przed podłączeniem mikroprzepływowej instalacji hydraulicznej do urządzenia, początkowe obciążenie komórek byłoby uważane za udane, gdyby wszystkie lub prawie wszystkie boczne kanały mikroprzepływowe zawierały jedną lub więcej komórek bakteryjnych. Po początkowym załadowaniu urządzenie jest równoważone przy stosunkowo dużym natężeniu przepływu. Jak pokazano tutaj, badanie mikroskopowe urządzenia w równowadze powinno ujawnić kilka komórek zamkniętych w jednym pliku w większości kanałów bocznych.
Po umieszczeniu zrównoważonego urządzenia na mikroskopie pod przepływem 1,5 mikrolitra na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, komórki wznowią równomierny i stały wykładniczy wzrost fazowy w ciągu około dwóch godzin. Komórki, które wznowiły wzrost fazy wykładniczej, można wiarygodnie obrazować za pomocą mikroskopii jasnego pola lub mikroskopii fluorescencyjnej przez co najmniej 24 godziny. Wprowadzenie przełącznika pożywki rozszerza zakres eksperymentów, które można przeprowadzić, ale także zwiększa częstotliwość katastrofalnych zdarzeń śmierci komórki poprzez obecność pęcherzyków powietrza lub klastrów komórek na wlocie, które ulegają przemieszczeniu i przechodzą przez kanał zasilający.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około pięciu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Stosując tę procedurę, z różnymi reporterami fluorescencyjnymi, szczepami i warunkami środowiskowymi, można badać szeroką gamę zjawisk fizjologicznych, w tym bardzo rzadkie lub przejściowe zdarzenia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia mikrofluidyczną metodę analizy poszczególnych linii komórkowych bakterii, konkretnie z gatunku Bacillus subtilis. Technika ta umożliwia długoterminową obserwację generacji komórek w kontrolowanych warunkach wzrostu, co pozwala przezwyciężyć ograniczenia tradycyjnych metod mikrobiologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biologia komórki
- Mikrofluidyka
Wstęp
- Tradycyjne metody w mikrobiologii często nie pozwalają na obserwację zachowań poszczególnych komórek w czasie.
- Zrozumienie fizjologii bakterii wymaga wglądu w reakcje pojedynczych komórek na stres środowiskowy.
- Mikroprzepływy stanowią rozwiązanie umożliwiające kontrolowanie warunków eksperymentalnych.
- Bacillus subtilis służy jako organizm modelowy w niniejszym badaniu.
Cel badania
- W celu umożliwienia długoterminowej obserwacji pojedynczych komórek bakteryjnych.
- W celu zbadania wzorców odpowiedzi komórek na stres w czasie.
- W celu zbadania zmienności fenotypów w obrębie populacji bakteryjnych.
Zastosowane Metody
- Przygotowanie polimeru PDMS do urządzeń mikroprzepływowych.
- Wykorzystanie formy silikonowej do tworzenia kanałów mikroprzepływowych.
- Odpowietrzanie mieszaniny PDMS w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
- Obserwacja linii komórkowych w kontrolowanych warunkach.
Główne wyniki
- Pomyślna obserwacja linii poszczególnych komórek bakteryjnych przez wiele pokoleń.
- Wgląd w długoterminowe zachowanie komórek w warunkach stresu.
- Wykazanie zdolności techniki do utrzymania jednolitych warunków środowiskowych.
- Potencjalne zastosowania w badaniu fizjologii bakterii i dynamiki populacji.
Wnioski
- Metoda mikroprzepływowa stanowi potężne narzędzie w badaniach mikrobiologicznych.
- Umożliwia ona szczegółowe badania zachowania pojedynczych komórek w dłuższych przedziałach czasowych.
- Podejście to może prowadzić do nowych odkryć w zakresie fizjologii bakterii.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
To podejście mikroprzepływowe umożliwia długoterminową analizę fizjologii bakterii z rozdzielczością pojedynczych komórek w ściśle kontrolowanych warunkach, rozwiązując kluczowy problem w walidacji celów przeciwdrobnoustrojowych, gdzie dane uśrednione dla całej populacji mogą maskować heterogeniczne odpowiedzi. Poprzez rejestrowanie specyficznych dla linii odpowiedzi na stres oraz zmienności fenotypowej na przestrzeni setek pokoleń, metoda ta wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w fazie wczesnego odkrywania, wyjaśniając, czy obserwowane fenotypy są stabilne, dziedziczne czy przejściowe. Ta pewność prognostyczna pomaga w priorytetyzacji celów o spójnym mechanizmie działania, co zmniejsza ryzyko niepowodzeń na późnych etapach programów opracowywania leków przeciwbakteryjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie dynamiki ekspresji genów w pojedynczych komórkach z efektami funkcjonalnymi pod wpływem określonych bodźców.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ilościowych, rozdzielczych w czasie danych na temat heterogenicznych fenotypów, co zwiększa pewność w ocenie stopnia zaangażowania celu oraz modulacji szlaków sygnałowych.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje znormalizowane, powtarzalne odczyty z pojedynczych komórek, które mogą być wykorzystane do oceny wpływu związków na szlaki odpowiedzi stresowej.
- Wartość operacyjna: Wspiera przygotowanie testów poprzez jednolitą kontrolę środowiskową, co redukuje zmienność pomiarów zależności dawka-odpowiedź w kampaniach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia modelowanie systemów istotnych dla chorób poprzez rejestrowanie trwałych odpowiedzi bakteryjnych na bodźce przeciwmikrobowe, co wspomaga identyfikację translacyjnych biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość przejścia od badań nad mechanizmem działania do walidacji przedklinicznej dzięki dostarczaniu podłużnych danych fenotypowych z monitorowaniem linii komórkowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków — od screeningu hipotez dotyczących celu po optymalizację związku wiodącego, gdzie zrozumienie dynamicznych odpowiedzi pojedynczych komórek na perturbacje środowiskowe dostarcza informacji o zależnościach struktura-aktywność oraz pozwala na prognozowanie mechanizmów oporności.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ujawnienie, czy heterogeniczność fenotypowa wpływa na spójność celu w różnych liniach komórkowych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych odczytów opartych na fluorescencji lub kontraście fazowym, które umożliwiają porównanie indukowanych przez związki reakcji stresowych w czasie.
- Analityka: Generuje podłużne zbiory danych z pojedynczych komórek, odpowiednie do statystycznej analizy kinetyki wzrostu, aktywacji reporterów i stratyfikacji populacji.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez modelowanie warunków długotrwałej ekspozycji istotnych dla mikrośrodowisk infekcji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi funkcjonalność platformy możliwą do zastosowania w wielu szczepach bakteryjnych i czynnikach stresogennych, co sprzyja standaryzacji międzyprojektowej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez rozstrzyganie zmienności klonalnej oraz odróżnianie odpowiedzi adaptacyjnych od stochastycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji mikrofluidycznej, minimalizując efekty serii w przesiewaniu fenotypowym.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go, dostarczając wglądu mechanistycznego w czas trwania i spójność efektów pośredniczonych przez cel.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowane do ryzyka wdrażanie poprzez identyfikację celów o jednorodnym i trwałym mechanizmie działania we wszystkich liniach.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych, sterylnego obchodzenia się z cieczami oraz mikroskopii time-lapse.
- Zależy od dostępu do urządzeń do czyszczenia plazmą tlenową, precyzyjnych pomp strzykawkowych oraz odwróconych mikroskopów fluorescencyjnych.
- Wymaga standaryzacji protokołów wymiany medium oraz czasu podawania bodźców pomiędzy zespołami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy rozszerzaniu badań na patogeny niebędące modelami lub złożone systemy konsorcjalne.
- Ograniczenia praktyczne obejmują podatność na krytyczne awarie spowodowane pęcherzykami powietrza lub agregatami komórkowymi, co wymaga rygorystycznego przestrzegania technik aseptycznych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
PDMS Device Casting
1:54
Device Punching and Bonding
3:19
Microfluidic Plumbing Preparation
5:35
Device Loading
6:47
Device Assembly, Equilibration, and Mounting
8:47
Results: Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis
10:05
Conclusion
