Name: Jednokomórkowa analiza mikroprzepływowa Bacillus subtilis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Poznaj mikroprzepływową analizę pojedynczych komórek bakteryjnych Bacillus subtilis. Ta metoda umożliwia wielopokoleniową obserwację linii komórkowych w kontrolowanych warunkach środowiskowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został sfinansowany przez National Institutes of Health pod GM018568. Protokół ten został częściowo przeprowadzony w Center for Nanoscale Systems (CNS), członku National Nanotechnology Coordinated Infrastructure Network (NNCI), która jest wspierana przez National Science Foundation w ramach nagrody NSF nr 1541959. CNS jest częścią Uniwersytetu Harvarda. Wielkie podziękowania należą się Thomasowi Normanowi i Nathanowi Lordowi za ich pracę włożoną w wymyślenie i wyprodukowanie wzorca używanego w pokazanych tutaj urządzeniach oraz za zbudowanie oryginalnej wersji urządzenia. Dziękujemy również Johanowi Paulssonowi za jego cenne wspólne rady i dziękujemy członkom jego laboratorium za ich rady i ciągłe ulepszenia bakteryjnych aparatów mikroprzepływowych.

1. Przesyłanie urządzeń PDMS
<ol>
	<li>W środowisku wolnym od pyłu wymieszaj polimer PDMS i utwardzacz w stosunku 10:1 i odgazuj w próżni przez co najmniej 10 minut.</li>
	<li>Umieść silikonowy wzorzec (lub jego epoksydową lub poliuretanową replikę) na kawałku nieprzerwanej folii aluminiowej w styropianowej płytce Petriego. Wlać odgazowaną mieszaninę PDMS na urządzenie wzorcowe na głębokość około 5 mm. Odgazować szalkę Petriego na co najmniej 10 minut. Użyj delikatnego strumienia powietrza, aby rozbić pęcherzyki powierzchniowe. 
	UWAGA: Wymiary zastosowanego urządzenia dwupoziomowego są podane w dołączonym pliku CAD 5 (patrz Plik uzupełniający 1). Plastikowa replika główna może częściowo unosić się na wodzie podczas odgazowywania; W takim przypadku należy docisnąć replikę czystym plastikowym aplikatorem.</li>
	<li>Utwardzać PDMS przez co najmniej 1 godzinę w piecu w temperaturze 60 °C i schłodzić do temperatury pokojowej. Usuń folię aluminiową zawierającą wzorzec i utwardzony PDMS z płytki Petriego. Ostrożnie odklej folię aluminiową z tyłu urządzenia głównego, a następnie ostrożnie oderwij PDMS od urządzenia głównego. 
	UWAGA: Alternatywnie, PDMS można utwardzać przez noc w temperaturze pokojowej. Względną kruchość wzorca wafla krzemowego można przezwyciężyć za pomocą kleju epoksydowego do trwałego połączenia płytki z aluminiowym dyskiem o grubości 1/16 cala i tym samym rozmiarze co płytka.</li>
	<li>Ponieważ płytka zawiera zazwyczaj kilka urządzeń mikroprzepływowych o nieco różnych wymiarach (patrz plik uzupełniający 1), przytnij pojedyncze urządzenie na wymiar za pomocą czystego, ostrego skalpela. 
	UWAGA: Do rutynowych prac z B. subtilis należy używać urządzeń z rowami komórkowymi o szerokości 1,0 μm, które są oznaczone literą C lub F w dołączonym pliku CAD.</li>
</ol>
2. Wykrawanie i klejenie urządzeń
<ol>
	<li>Umieść kawałek półprzezroczystej taśmy biurowej (patrz Tabela materiałów) na wzorzystej stronie urządzenia, aby zwiększyć widoczność wzorzystych elementów. Porty wlotowe i wylotowe są oznaczone jako okrągłe obszary na przeciwległych końcach widocznych kanałów przepływowych (Rysunek 1). Aby poprawić ich widoczność podczas wykrawania otworów w urządzeniu na kołki wlotowe i wylotowe, należy oznaczyć wloty i wyloty kropkami za pomocą markera z cienką końcówką. 
	UWAGA: Aby upewnić się, że kołki wlotowe i wylotowe nie są zatłoczone, każdy inny kanał jest dziurkowany, zaczynając od kanału znajdującego się tuż pod alfabetycznym oznaczeniem urządzenia.</li>
	<li>Odwróć urządzenie PDMS tak, aby wzorzysta strona była skierowana w dół, i przebij urządzenie do zaznaczonych kropek za pomocą dziurkacza do biopsji 0,75 mm; wyrzuć dziurki. 
	UWAGA: Urządzenia są dziurkowane wzorzystą stroną do dołu, ponieważ otwór generowany przez stempel biopsyjny jest zwykle lekko rozszerzony w miejscu, w którym stempel wchodzi w polimer. Przekrawanie urządzenia w odwróconej orientacji zapewnia, że otwór po wzorzystej stronie ma ostrą obwódkę.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu stereoskopowego upewnij się, że wybite otwory zachodzą na obszary wlotu i wylotu urządzenia. Użyj pęsety z cienką końcówką, aby usunąć wszelkie obce fragmenty PDMS z wybitych otworów.</li>
	<li>Użyj taśmy klejącej, aby usunąć kurz z obu stron urządzenia i umieść go w czystej styropianowej płytce Petriego. Przygotuj szklaną osłonę o wymiarach 22 mm x 40 mm, zwilżając ją 100% alkoholem izopropylowym i przecierając chusteczką do pomieszczeń czystych; suszyć strumieniem bezpyłowego powietrza lub azotu.</li>
	<li>Umieść dziurkowane urządzenie PDMS stroną do góry wraz z oczyszczoną szkłem nakrywkowym w tlenowym urządzeniu do czyszczenia plazmowego.
	<ol>
		<li>Urządzenie należy traktować plazmowo przy następujących ustawieniach: podciśnienie, 70 mTorr; Ciśnienie Ø2, 200 mTorr; czas trwania, 15 s; moc, 30 W. Natychmiast po zakończeniu okresu obróbki plazmowej wyjmij urządzenie i szkło osłonowe z myjki plazmowej.</li>
		<li>Odwróć PDMS i umieść go na środku szkła nakrywkowego tak, aby wzorzysta strona stykała się ze szkłem; upewnij się, że kanały zasilające (biegnące między obszarem wlotu i wylotu) są wyrównane z długą osią szkła nakrywkowego. Dociśnij bardzo delikatnie, aby upewnić się, że PDMS przylega do szkła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmontowane urządzenie piec w piekarniku przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 60 °C. Po upieczeniu ręcznie sprawdź, czy PDMS jest połączony ze szklanką, delikatnie naciskając jeden róg urządzenia. 
	UWAGA: Po połączeniu urządzenia należy je zużyć w ciągu 24 godzin, ponieważ polimer będzie stawał się coraz bardziej hydrofobowy wraz z upływem czasu po obróbce plazmowej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie mikroprzepływowej instalacji wodno-kanalizacyjnej
<ol>
	<li>Przytnij odcinki rurek polimerowych (średnica wewnętrzna (ID) 0.02 cala, średnica zewnętrzna (OD) 0.06 cala) na odpowiednie długości, aby sięgały od pompy strzykawkowej do aparatu przełączającego (jeśli jest używany) i urządzenia po zamontowaniu na mikroskopie. Wytnij tyle długości, ile jest pasów mikroprzepływowych.</li>
	<li>Zamontuj złącza Y dla zaworów zaciskowych (jeśli używasz), przycinając i mocując 2-centymetrowe odcinki elastycznej rurki silikonowej (0.03 cala ID, 0.065 cala OD) do górnych zadziorów "Y" i 1-cm długości rurki silikonowej do dolnego króćca "Y".</li>
	<li>Wytnij 10-centymetrowe (lub odpowiednie) odcinki rurki polimerowej; podłącz je na jednym końcu do złącza przełącznika, wkładając je do 1-centymetrowych silikonowych segmentów rurki na dolnym zadziorze "Y". Podłącz je na drugim końcu do igieł 21G, które zostały wyjęte z plastikowych adapterów strzykawek i wygięte pod kątem około 90°, około 9 mm od końca igły.</li>
	<li>Podłącz igły 21G do jednego końca segmentów rurki, które będą biegły od strzykawek do aparatu przełączającego, wkładając igły do rurki. Włóż drugie końce każdej długości rurki do silikonowych segmentów rurki na króćcach wlotowych złączy Y. 
	UWAGA: Użyj jakiegoś urządzenia, aby przytrzymać zawory zaciskowe i złącza na miejscu; można to łatwo zrobić z pudełka na końcówki do mikropipet (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Odetnij odcinki rurek polimerowych, aby przenieść odpady z wylotu urządzenia do zlewki na odpady. Połącz je z jednej strony z wygiętymi igłami 21G przygotowanymi w sposób opisany powyżej. Przyklej drugi koniec rurek taśmą do zlewki na odpady.</li>
	<li>Przygotować odpowiednie objętości pożywki zawierającej 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i napełnić strzykawki żądaną wielkością i liczbą. Podłączyć strzykawki z BSA do przygotowanych igieł 21G przymocowanych do rurki wlotowej i załadować strzykawki do pomp strzykawkowych. 
	UWAGA: Do typowych eksperymentów używanych jest 5 kanałów urządzenia, każdy ze strzykawką o pojemności 20 ml. Eksperyment, w którym zmienia się pożywkę, będzie wymagał 2 banków po 5 strzykawek każdy. W tym przypadku pompa zawierająca pierwszy rząd jest określana jako pompa fazy 1, a pompa zawierająca drugi rząd, z medium po przełączeniu, jest określana jako pompa fazy 2.</li>
	<li>Usunąć powietrze z instalacji wodociągowej, uruchamiając pompy strzykawkowe z dużym natężeniem przepływu (>500 μl/min), zaczynając od ustawienia pomp strzykawkowych pionowo i stukania w strzykawki, aby doprowadzić pęcherzyki powietrza do góry. Po usunięciu powietrza ze strzykawek, należy ustawić pompę strzykawkową poziomo i stopniowo stukać lub przesuwać przewody polimerowe ze strzykawek w górę przez aparat przełączający, aby usunąć i usunąć pęcherzyki powietrza. Powtórzyć ten proces dla drugiego zestawu strzykawek (w przypadku zmiany pożywki).</li>
	<li>Po usunięciu pęcherzyków powietrza należy ustawić pompę strzykawkową fazy 2 (tj. z medium, które zostanie użyte jako drugie, po przełączniku) na 1,5 μl/min, a następnie wstrzymać przepływ. Umieść małe klipsy do segregatora na segmentach elastycznej rurki na odgałęzieniu złączy Y odpowiadających drugiej fazie medium. Kontynuuj pracę pompy strzykawkowej fazy 1 ze skromnym natężeniem przepływu (np. 10 μl/min) przez co najmniej 30 minut, aby usunąć drugie medium z rurki wlotowej za złączem Y.</li>
</ol>
4. Przygotowanie hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Wyhoduj prekulturę interesującej Cię odmiany w pożądanym podłożu z dnia na dzień, do fazy stacjonarnej. Szczep bakteryjny powinien zawierać mutację, która unieruchamia komórki, tak aby komórki nie wypływały z kanałów urządzenia. 
	UWAGA: W tym protokole szczepem bakteryjnym jest B. subtilis 3610 zawierający substytucję wiedźmyA233V (ta mutacja powoduje, że wić jest prosta, a nie spiralna, co zapobiega ruchliwości komórek), reporter PrsbV-mNeonGreen dla stresu komórkowego i konstytutywny reporter Phyperspank-mNeptune (czerwony) do podświetlania komórek. W przykładowym protokole użyto podłoża LB Lennox. Typowe szczepy do eksperymentów mikrofluidycznych zawierają jeden lub więcej fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i konstytutywnie wytwarzane, cytoplazmatyczne białko fluorescencyjne, aby ułatwić automatyczne wykrywanie komórek. Nie zaobserwowano wad wzrostu, gdy zastosowano pożywkę bogatą w LB Lennox, ale wzrost B. subtilis w minimalnej pożywce może być zahamowany w warunkach mikroprzepływowych, ponieważ wydzielane siderofory są wypłukiwane przez przepływ pożywki. W takich okolicznościach wzrost może zostać przywrócony przez dodanie cytrynianu sodu i chlorku żelaza do pożywki, jak podano dla S750 medium11.</li>
	<li>Rano w dniu eksperymentu rozcieńczyć komórki B. subtilis w stosunku 1:50 do przegrody 250 ml kolby zawierającej 25 ml pożywki wzrostowej. Hodować komórki przez 5-6 godzin w kulturze wytrząsającej w temperaturze 37 °C do gęstości optycznej większej niż 1, 
	UWAGA: Preferowana jest gęsta hodowla komórkowa, ponieważ komórki B. subtilis w fazie stacjonarnej są mniejsze i rzadziej występują w łańcuchach komórkowych, co ułatwia ładowanie urządzenia. Różne gatunki bakterii mogą wymagać innych pożywek lub warunków wzrostu w celu optymalnego obciążenia.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki wyposażonej w filtr o wielkości porów 5 μm przefiltruj około 15 ml kultury komórkowej do stożkowej probówki o pojemności 15 ml w celu usunięcia łańcuchów komórkowych B. subtilis (nie jest to konieczne w przypadku E. coli i może nie być konieczne w przypadku innych gatunków). 
	UWAGA: Należy usunąć stosunkowo niewiele komórek; Przesącz powinien być mętny.</li>
	<li>Przefiltrowaną kulturę należy odwirowywać przez 10 minut przy 4 000 x g w temperaturze pokojowej. Odlać sklarowany osad i ponownie zawiesić osad komórek w pozostałym płynie sklarowanym nad osadem pozostałym w probówce, dodając około 500 μl świeżej pożywki, jeśli to konieczne, aby ułatwić pipetowanie zawiesiny komórek.</li>
</ol>
5. Wczytywanie urządzenia
<ol>
	<li>Delikatnie umieść puste, cienkie końcówki mikropipet z żelem (patrz Tabela materiałów) w otworach wylotowych urządzenia mikroprzepływowego.</li>
	<li>Używając cienkich końcówek do ładowania żelu z mikropipetą P200, pasywować urządzenie, wstrzykując pożywkę zawierającą 1 mg/ml BSA do otworów wlotowych, obserwując końcówki w otworach wylotowych w celu monitorowania wypełnienia kanałów mikroprzepływowych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Inkubować urządzenie w temperaturze pokojowej przez około 5 minut 
	UWAGA: BSA jest powszechnie stosowany jako środek blokujący lub pasywacyjny, który wiąże się z hydrofobową powierzchnią polimeru PDMS, zwiększając jego hydrofilowość i zmniejszając wiązanie innych białek lub komórek (poprzez cząsteczki na powierzchni komórki).</li>
	<li>Używając cienkich końcówek do ładowania żelu, załaduj każdy kanał ponownie zawieszonymi komórkami (z sekcji 4), używając końcówek w kanale wylotowym do monitorowania postępu ogniw przez urządzenie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B). 
	UWAGA: Ładowanie ułatwia ustawienie maksymalnej objętości mikropipety P200 wynoszącej 200 μl, a następnie zassanie poduszki powietrznej przed zassaniem niewielkiej objętości (około połowy objętości cienkiej części końcówki pipety) komórek. Objętość zawieszonych komórek nie musi być precyzyjna, ponieważ objętość urządzenia PDMS jest mała w stosunku do objętości mikropipety. Nie znamy górnego limitu gęstości ponownie zawieszonych komórek, o ile zawiesina komórek może być pipetowana do urządzenia. Grudki komórek mogą zatkać urządzenie i należy ich unikać poprzez dokładne pipetowanie i/lub mieszanie wirowe.</li>
	<li>Delikatnie wyjmij końcówki żelowe z otworów wylotowych, pracując pojedynczo, aby zapobiec uszkodzeniu urządzenia.</li>
	<li>Odwirować urządzenie w mikrowirówce stołowej w odpowiednim adapterze wirnika o sile około 6 000 x g przez 10 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). 
	UWAGA: Użyto specjalnie obrobionego aluminiowego adaptera wirnika, który został zaprojektowany tak, aby pasował do wirnika mikrowirówki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C); Różne modele wirówek mogą być używane z odpowiednimi adapterami wirnika. Ważną cechą adaptera jest to, że zapewnia on siłę boczną w kierunku zamkniętych końców rowów komórkowych, wpychając w ten sposób komórki do kanałów bocznych.</li>
	<li>Sprawdź pomyślne ładowanie pod mikroskopem (<silna klasa="xfig">Rysunek 3), ale bez mocowania urządzenia do uchwytu szkiełka/wkładki stolika. 
	UWAGA: W tym protokole obiektyw zanurzeniowy 60X, 1,4 NA Ph3 jest używany zarówno do weryfikacji na tym etapie, jak i do późniejszego obrazowania.</li>
</ol>
6. Montaż, równoważenie i montaż urządzenia
<ol>
	<li>Ostrożnie zamontuj załadowane urządzenie na wkładzie stage, przyklejając szkło osłonowe po obu stronach PDMS do dolnej części stage insert (tj. odwróć stage insert przed zamocowaniem urządzenia). Odwróć zespół wkładki stage i urządzenia tak, aby PDMS był skierowany do góry i umieść na miękkiej powierzchni, takiej jak chusteczka bezpyłowa (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D).</li>
	<li>Dostosować natężenie przepływu pompy strzykawkowej fazy 1 do 35 μl/min. Pracując z jednym pasem na raz, włożyć igłę wlotową, a następnie igłę wylotową (tj. biegnącą do zlewki na odpady; <silna klasa="xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Zetrzyj nadmiar medium czystą, bezpyłową chusteczką i sprawdź wzrokowo urządzenie pod kątem wycieków. Zbadaj rurkę wylotową pod kątem nadmiaru komórek (zwykle pojawiających się jako mętny pasek) i średniej menisku, która powoli przesuwa się w kierunku zlewki na odpady.</li>
	<li>Pozwól urządzeniu pracować z prędkością 35 μl/min przez około 15 - 30 minut, aż wszystkie połączone tory spłyną do zlewki na odpady.</li>
	<li>Ustawić pompę strzykawkową fazy 1 na 1,5 μl/min i wstrzymać przepływ. Przynieś całą pompę i aparaturę urządzenia do mikroskopu (proces ten jest wspomagany przez umieszczenie wszystkiego na wózku na kółkach) i uruchom ponownie przepływ medium fazy 1 z prędkością 1,5 μl/min. Ostrożnie zamontuj stage wkładkę z urządzeniem na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym, używając w razie potrzeby taśmy do poprowadzenia rurki dolotowej i wylotowej.</li>
	<li>Zlokalizuj żądane pozycje na urządzeniu do obrazowania i rozpocznij obrazowanie zgodnie z potrzebami. Należy pamiętać, że komórki zazwyczaj potrzebują kilku godzin (około 10 pokoleń), aby osiągnąć wzrost w fazie wykładniczej w stanie ustalonym, a początek akwizycji obrazu może być opóźniony w zależności od potrzeb, tak aby obrazowanie rozpoczęło się po okresie równowagi. 
	UWAGA: Wzrost komórek w stanie ustalonym utrzymywanych w fazie wykładniczej powinien być weryfikowany podczas późniejszej analizy obrazu poprzez śledzenie czasów podziału komórek i upewnienie się, że osiągnęły one stałą wartość minimalną.</li>
</ol>
7. Przełączanie medium
<ol>
	<li>Pomiędzy kolejnymi rundami obrazowania należy wstrzymać przepływ pompy strzykawkowej fazy 1. Ostrożnie odpiąć zaciski segregatora od silikonowej rurki fazy 2, przesuwając każdy z nich do silikonowej rurki na odgałęzieniu fazy 1 złącza Y. Odblokuj wstrzymanie przepływu pompy strzykawkowej fazy 2 (która została ustawiona na 1,5 μl/min w kroku 3.8) i kontynuuj obrazowanie. 
	UWAGA: Przy prędkości 1,5 μm/min z rurką polimerową o długości 10 cm za złączami Y, medium drugiej fazy dociera do urządzenia w ciągu około 50 minut. Czas do urządzenia można empirycznie przetestować przy użyciu pożywek zawierających fluorescencyjne cząstki znacznikowe.</li>
</ol>

<ol><li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-cell+chemostat%3A+an+agarose-based%2C+microfluidic+device+for+high-throughput%2C+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li>
<li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).</li>
<li>Dusny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+bias+of+microcultivation+environments+on+single-cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology.</a> Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li>
<li>Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+and+modularity+in+cell-fate+decision+making%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Memory and modularity in cell-fate decision making.</a> Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).</li>
<li>Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Organ%2FBody-on-a-Chip+Devices+at+the+Convergence+of+Biology+and+Microengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering.</a> Sensors. 15 (12), Basel. 31142-31170 (2015).</li>
<li>Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+analysis+of+C.+elegans+muscular+forces+and+locomotion+patterns+in+microstructured+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments.</a> Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+between+distant+biofilms+and+emergence+of+nutrient+time-sharing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing.</a> Science. 356 (6338), 638-642 (2017).</li>
<li>Choi, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+cell-laden+microgels+using+double+emulsion+drops+with+a+sacrificial+ultra-thin+oil+shell%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell.</a> Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).</li>
<li>Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+meets+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microfabrication meets microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).</li>
<li>Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25747591">Single-Cell Physiology.</a> Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).</li>
<li>Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+physical+mechanisms+and+biofilm+processes%3A+review+of+microfluidic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods.</a> Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).</li>
<li>Yu, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+microfluidic+tracking+of+coccoid+cyanobacterial+cells+reveals+robust+control+of+division+timing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing.</a> BMC Biol. 15 (1), 11(2017).</li>
<li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+constant+size+extension+drives+bacterial+cell+size+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis.</a> Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).</li>
<li>Taheri-Araghi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-size+control+and+homeostasis+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-size control and homeostasis in bacteria.</a> Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).</li>
<li>Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization%2C+competition%2C+and+dispersal+of+pathogens+in+fluid+flow+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks.</a> Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).</li>
<li>Connell, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+prokaryotic+social+behaviors+with+bacterial+%22lobster+traps%22%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Probing prokaryotic social behaviors with bacterial "lobster traps".</a> MBio. 1 (4), (2010).</li>
<li>Long, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+bacterial+adaptation+dynamics+at+the+single-cell+level+using+a+microfluidic+chemostat+and+time-lapse+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy.</a> Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).</li>
<li>Okumus, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+slowing-down+of+cytoplasmic+diffusion+allows+in+vivo+counting+of+proteins+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells.</a> Nat Commun. 7, 11641(2016).</li>
<li>Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+circadian+oscillations+in+growing+cyanobacteria+require+transcriptional+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback.</a> Science. 340 (6133), 737-740 (2013).</li>
<li>Baker, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable%2C+Pneumatically+Actuated+Microfluidic+Device+with+an+Integrated+Nanochannel+Array+To+Track+Development+of+Individual+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria.</a> Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).</li>
<li>Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+in+a+phosphorelay+drives+stochastic+entry+into+sporulation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis.</a> EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).</li>
<li>Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+microfluidic+platform+to+uncover+basic+features+of+energy+and+environmental+stress+responses+in+individual+cells+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis.</a> PLoS Genet. 13 (7), e1006901(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten protokół mikrofluidyczny jest elastyczny pod tym względem, że wiele kroków może być modyfikowanych w celu optymalizacji jego użycia dla określonego gatunku lub szczepu lub do określonego celu. Rzeczywiście, w tym protokole dokonaliśmy modyfikacji oryginalnej koncepcji "maszyny matki"4 , aby zoptymalizować jej użycie z B. subtilis. Często rowy, w których zamknięte są komórki, stanowią element jednowarstwowy, podczas gdy w tym protokole stosujemy dwuwarstwowe rowy komórkowe, z płytkim k...

Jedną z najbardziej uderzających cech życia na Ziemi jest jego wielka odporność i różnorodność. Głównym celem biologii molekularnej jest zrozumienie logiki, za pomocą której komórki wykorzystują geny i białka, aby zmaksymalizować swój wzrost i przystosowanie w wielu różnych warunkach środowiskowych. Aby osiągnąć ten cel, naukowcy muszą być w stanie z pewnością obserwować, jak poszczególne komórki rosną, dzielą się i wyrażają swoje geny w danych warunkach, zauważając, jak komórki reagują na kolejne zmiany w ich środowisku. Jednak tradycyjne metody analityczne w mikrobiologii mają ograniczenia techniczne, które wpływają na rodzaje pytań, na które można odpowiedzieć. Na przykład analizy oparte na masowych hodowlach były bardzo przydatne na przestrzeni lat, ale oferują tylko dane na poziomie populacji, które mogą maskować znaczące różnice między komórkami lub zachowania mniejszych subpopulacji komórek w całej populacji. Analizy pojedynczych komórek żywych bakterii oparte na mikroskopii świetlnej ujawniają zachowanie pojedynczych komórek, ale są również ograniczone technicznie. Bakterie są zazwyczaj unieruchomione na płatkach agarozy zawierających pożywkę wzrostową, ale wzrost i podział komórek zapycha mikroskopowy widok i wyczerpuje dostępne składniki odżywcze już po kilku cyklach komórkowych, znacznie ograniczając czas obserwacji1,2. Co więcej, miejscowe wyczerpanie składników odżywczych i jednoczesne gromadzenie się metabolicznych produktów ubocznych w wyniku wzrostu komórek stale zmienia lokalne środowisko wzrostu komórek w sposób, który jest trudny do zmierzenia lub przewidzenia. Takie zmiany środowiskowe przy użyciu płatków agarozy stanowią wyzwanie dla badań nad zachowaniami w stanie ustalonym lub reakcjami komórkowymi na określone zmiany w warunkach wzrostu3.
Technologia mikroprzepływowa, w której płynne medium jest stale przepływane przez urządzenia wykonane w mikrofabrykach, oferuje rozwiązanie klasycznych ograniczeń eksperymentalnych. Urządzenie mikroprzepływowe może utrzymywać poszczególne komórki w pozycji do mikroskopii żywych komórek, podczas gdy przepływ pożywki wzrostowej stale dostarcza komórkom świeżych składników odżywczych i zmywa produkty uboczne przemiany materii i nadmiar komórek, tworząc w ten sposób wysoce jednolite środowisko wzrostu. W stałych warunkach wzrostu zachowania komórek można obserwować w izolacji od wpływu czynników środowiskowych, co pozwala na niezakłócony wgląd w wewnętrzną logikę komórek. Ponieważ przepływ płynu zapobiega zatłoczeniu urządzenia mikroprzepływowego komórkami, możliwa staje się obserwacja pojedynczych linii komórkowych przez dziesiątki lub setki pokoleń4,5. Tak długi czas obserwacji pozwala na wykrycie niewykrywalnych w inny sposób długoterminowych lub rzadkich zachowań komórek. Wreszcie, skład pożywki, która przepływa przez urządzenie, może być dowolnie zmieniany, co pozwala na obserwację komórek, gdy reagują na nadejście stresu lub na wprowadzenie lub usunięcie określonego związku.
Mikrofluidyka ma już wiele ważnych zastosowań. Na przykład, został on wykorzystany w urządzeniach tkankowych, narządowych lub typu ciało na chipie, w których wiele typów komórek ludzkich jest hodowanych wspólnie w celu symulacji stanu in vivo6; do badania ruchu nicieni w środowiskach mikrostrukturalnych<klasa SUP="xref">7; do badania interakcji między biofilmami bakteryjnymi (np. 8); oraz do hermetyzacji i manipulacji małymi objętościami komórek lub substancji chemicznych (np. 9). Urządzenia mikroprzepływowe stają się również coraz bardziej popularne w dziedzinie mikrobiologii (doskonałe recenzje można znaleźć w 10 i 11), zwłaszcza że ich właściwości fizyczne i przepływowe są dobrze dopasowane do naturalnych nisz mikrobiologicznych12. Na przykład mikrofluidyka została ostatnio wykorzystana przez mikrobiologów do takich celów, jak precyzyjny pomiar wzrostu i podziału komórek13,14,15, analizowanie ruchu patogenów16, monitorowanie quorum sensing17 i fizjologiczne przejścia18, oraz do zliczania białek19, wśród wielu innych przykładów. Przedstawiona tutaj metoda została specjalnie zaprojektowana do analizy pojedynczych linii komórek bakteryjnych, a nie kombinacji szczepów lub gatunków. Zademonstrowane tutaj urządzenie mikroprzepływowe wykorzystuje jedną z odmian projektu "maszyny matki"4, w którym komórki są hodowane pojedynczo w rowie mikroprzepływowym z jednym zamkniętym końcem i jednym otwartym końcem; Wzrost i podział komórek wypycha komórki potomne w górę i na zewnątrz otwartego końca do przepływu płynu. Nasze analizy zazwyczaj koncentrują się tylko na komórce "macierzystej", która jest zamknięta na zamkniętym końcu wykopu. Uważamy tę metodę za postęp w stosunku do poprzednich technik analizy pojedynczych komórek opartych na mikroskopii świetlnej, takich jak immobilizacja komórek na płatkach agarozowych. Podczas gdy B. subtilis jest tutaj używany jako model, metoda ta ma również zastosowanie do innych gatunków bakterii (Escherichia coli jest innym powszechnym modelem; niektóre gatunki o różnych rozmiarach komórek lub morfologii mogą wymagać produkcji nowych urządzeń o innych wymiarach). Wykorzystanie fluorescencyjnych reporterów do oznaczania komórek i wizualizacji zmian w ekspresji genów wymaga użycia genetycznie podatnych gatunków; Jednak analizy wzrostu i morfologii komórek są możliwe nawet bez markerów fluorescencyjnych.
Obecny protokół wyklucza proces wytwarzania wzorca krzemowego za pomocą fotolitografii, który został obszernie opisany gdzie indziej5; mastery można również łatwo zlecić na zewnątrz z zakładów mikroprodukcji. Obejmuje formowanie urządzenia PDMS ze wzmocnionego wzorca krzemowego; przyklejenie urządzenia do kawałka szkła nakrywkowego; montaż mikroprzepływowej instalacji wlotowej i wylotowej, w tym zaworów zaciskowych umożliwiających przełączanie medium; pasywacja urządzenia, przygotowanie komórek bakteryjnych i załadowanie do urządzenia komórek bakteryjnych; podłączenie instalacji wodno-kanalizacyjnej do urządzenia i wyrównanie komórek; i załadowanie urządzenia do mikroskopu fluorescencyjnego w celu obrazowania. Ponieważ do wizualizacji i analizy różnych interesujących nas danych można użyć wielu różnych narzędzi programowych do akwizycji i przetwarzania obrazów4,5, pokazane są przykładowe obrazy, ale metody przechwytywania obrazów nie są uwzględnione w tym protokole.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>W protokole jest to określane jako PDMS. Istnieją 2 składniki, które są mieszane w stosunku 10:1</td></tr>, <tr><td>0,75 mm dziurkacz do biopsji</td>, <td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 mm Szkło osłonowe nr 1,5</td><td>VWR</td><td>48393 172</td><td></td></tr><tr><td>Wytrawianie plazmowe PE-50</td><td>Plasma Etch Inc.</td><td>PE-50</td><td>Przyrząd służący do łączenia PDMS ze szkłem za pomocą obróbki plazmą tlenową</td></tr><tr><td>Tygon elastyczny przewód ID 0,02", OD 0,06"</td> <td>Saint-Gobain PPL Corp.</td><td>AAD04103</td><td>Do głównej części rurki, np. przymocowanej do igieł</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa, 0,04" ID, 0,085" OD</td><td>HelixMark Standardowa rurka silikonowa</td><td>60-795-05</td><td>Do zaworów zaciskowych i złącza Y</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td>Stosowany jako środek pasywacyjny</td></tr><tr><td>ART Żelowe końcówki do pipet (P200)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>2155</td><td>Do załadunku urządzenia medium i komórek</td></tr><tr><td>Acrodisc 32-mm filtr strzykawkowy z 5-&mu; m Membrana Supor</td><td>Pall Life Sciences</td><td>4560</td><td>Do filtrowania kultur przed załadowaniem urządzenia</td></tr><tr><td>igły 21-ga, 1"</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A681</td><td></td></tr><tr><td>Złącze Y z zadziorami serii 200, rurka 1/16" ID, polipropylen</td><td>Nordson Medical</td><td>Y210-6005</td><td>Firma jest AKA Value Plastics</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td>Ta jednostka została wycofana przez producenta i została zastąpiona przez Ti 2 E.</td></tr><tr><td>LB Lennox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis szczep NCIB3610</td><td>Bacillus Genetic Stock Center</td><td>3A1</td> szczep <td>rodzicielski typu dzikiego zmodyfikowany do wykorzystania w eksperymentach przedstawionych w tym protokole</td></tr><tr><td>Grawitacyjny piec konwekcyjny</td><td>VWR</td><td>414005-106</td><td>do utwardzania PDMS i pieczenia zmontowany urządzenia</td></tr><tr><td>Zestaw Scotch-Weld Epoxy Kit</td><td>3M</td><td>2216 B/A</td><td>może być używany do przyklejania płytki krzemowej do aluminiowej płyty nośnej</td></tr><tr><td>Taśma Scotch Magic o szerokości 3/4"</td><td>3M</td><td></td><td>do usuwania kurzu z urządzeń PDMS oraz do umieszczania na elementach zwiększających widoczność (oznaczona w protokole jako "taśma biurowa" lub "taśma samoprzylepna")</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>wymienione tutaj jako przykład; prawie każdy mikroskop stereoskopowy to zrobi</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td>Do czyszczenia szkła nakrywkowego</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa, 6-kanałowa</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>marka chusteczek bezpyłowych</td></tr></tbody></table>

jednokomórkowa analiza mikroprzepływowa bacillus subtilis

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Technologia mikroprzepływowa pokonuje wiele ograniczeń tradycyjnych metod analitycznych w mikrobiologii. W przeciwieństwie do metod hodowli masowej, oferuje rozdzielczość pojedynczej komórki i długi czas obserwacji obejmujący setki pokoleń; W przeciwieństwie do mikroskopii opartej na padach agarozowych, ma jednolite warunki wzrostu, które można ściśle kontrolować. Ponieważ ciągły przepływ pożywki wzrostowej izoluje komórki w urządzeniu mikroprzepływowym od nieprzewidywalnych zmian w lokalnym środowisku chemicznym spowodowanych wzrostem i metabolizmem komórek, można z większą pewnością zaobserwować autentyczne zmiany w ekspresji genów i wzroście komórek w odpowiedzi na określone bodźce. Bacillus subtilis jest tutaj używany jako modelowy gatunek bakterii w celu zademonstrowania metody typu "maszyna matka" do analizy komórkowej. Pokazujemy, jak skonstruować i ustawić urządzenie mikroprzepływowe, obciążyć je komórkami, zainicjować obrazowanie mikroskopowe i wystawić komórki na bodziec poprzez przełączanie z jednej pożywki wzrostowej na drugą. Reporter reagujący na stres jest używany jako przykład w celu ujawnienia rodzaju danych, które można uzyskać tą metodą. Pokrótce omówiono również dalsze zastosowania tej metody w innych typach eksperymentów, takich jak analiza zarodnikowania bakterii.

Prawidłowe wstępne załadowanie komórek, oceniane za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej przed podłączeniem układu mikrofluidycznego do urządzenia, uznaje się za dokonane, gdy wszystkie lub prawie wszystkie boczne kanały mikrofluidyczne zawierają jedną lub więcej komórek bakteryjnych (Rycina 3A). Optymalne załadowanie objawia się obecnością kilku komórek w każdym kanale, niemniej jednak kanały wypełnią się komórkami w wyniku ich wzrostu podczas okresu równo...

Przedstawiamy metodę analizy mikroprzepływowej poszczególnych linii komórek bakteryjnych na przykładzie Bacillus subtilis. Metoda ta przezwycięża niedociągnięcia tradycyjnych metod analitycznych w mikrobiologii, umożliwiając obserwację setek generacji komórek w ściśle kontrolowanych i jednolitych warunkach wzrostu.

Jednokomórkowa analiza mikroprzepływowa Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

Ogólnym celem tego mikroprzepływowego zestawu eksperymentalnego jest umożliwienie długotrwałej obserwacji pojedynczych komórek bakteryjnych w stałych, ściśle kontrolowanych warunkach środowiskowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii bakterii, takie jak jakie są długoterminowe wzorce reakcji poszczególnych komórek na stres lub jak heterogeniczny fenotyp w populacji zmienia się w czasie. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy obserwować poszczególne linie komórkowe przez dziesiątki, a nawet setki pokoleń, w stałych, jednolitych i ściśle kontrolowanych warunkach środowiskowych.Po przygotowaniu polimeru PDMS zgodnie z protokołem tekstowym, umieść silikonowy wzorzec na kawałku nieprzerwanej folii aluminiowej na polistyrenowej szalce Petriego. Wlej odgazowaną mieszaninę PDMS na urządzenie główne na głębokość około pięciu milimetrów. Następnie odgazowuj naczynie przez co najmniej 10 minut.Utwardź PDMS w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę i ostudź do temperatury pokojowej. Następnie usuń z płytki folię aluminiową zawierającą wzorzec i utwardzony PDMS. Ostrożnie naciąć go i oderwać folię aluminiową z tyłu mistrza.Następnie ostrożnie oderwij PDMS od wzorca. Jako płytka zazwyczaj zawiera kilka urządzeń mikroprzepływowych o nieco różnych wymiarach. Użyj czystego, ostrego skalpela, aby przyciąć pojedyncze urządzenie do odpowiedniego rozmiaru.Umieść kawałek półprzezroczystej taśmy biurowej na wzorzystej stronie urządzenia, aby zwiększyć widoczność wzorzystych elementów. Porty wlotowe i wylotowe są oznaczone jako okrągłe obszary na przeciwległych końcach widocznych kanałów płynowych. Odwróć urządzenie PDMS stroną ze wzorem do dołu i użyj dziurkacza do biopsji o średnicy 0,75 milimetra, aby przebić urządzenie do zaznaczonych kropek.Następnie wyrzuć dziurki. Do usunięcia wykrojników z urządzenia może być potrzebna pęseta. Włóż oczyszczoną i wysuszoną szklaną pokrywę i urządzenie PDMS do myjki plazmowej i potraktuj urządzenie plazmowo zgodnie z ustawieniami pokazanymi tutaj.Natychmiast po zakończeniu obróbki plazmowej należy zdjąć urządzenie i szkło nakrywkowe z myjki plazmowej. Odwróć PDMS i umieść go na środku szkła nakrywkowego tak, aby strona wzoru stykała się ze szkłem. Upewnij się, że kanały podające są wyrównane z długim dostępem szkła nakrywkowego.Dociśnij bardzo delikatnie, aby upewnić się, że PDMS przylega do szkła. Zmontowane urządzenie pieczemy w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę. Po upieczeniu ręcznie sprawdź, czy PDMS jest połączony ze szkłem, delikatnie naciskając jeden róg urządzenia.Po przecięciu rurki polimerowej zgodnie z protokołem tekstowym, zmontuj złącza Y dla zaworów zaciskowych, jeśli ich używasz, przecinając i mocując dwucentymetrowe odcinki elastycznych rurek silikonowych do górnych zadziorów Y i jednocentymetrowe odcinki rurki silikonowej do dolnego pręta Y.Następnie odetnij 10-centymetrowe odcinki rurki polimerowej, a następnie połącz je na jednym końcu ze złączem przełącznika, wkładając je do jednocentymetrowych odcinków rurki silikonowej na dolny zadzior Y. Połącz odcinki rurki na drugim końcu z igłami o rozmiarze 21, które zostały wyjęte z plastikowych adapterów strzykawek i wygięte pod kątem około 90 stopni około dziewięciu milimetrów od końca igły. Podłącz igły o rozmiarze 21 do jednego końca segmentów rurki, które będą biegły od strzykawek do aparatu przełączającego, wkładając igły do rurki. Włóż drugie końce każdej długości rurki do silikonowych segmentów rurki na króćcach wlotowych złączy Y.Po napełnieniu strzykawek bakteryjną pożywką wzrostową, uzupełnioną BSA, zgodnie z protokołem tekstowym, należy podłączyć załadowane strzykawki do przygotowanych igieł o rozmiarze 21, podłączyć do rurki wlotowej i załadować strzykawki do pomp strzykawkowych. Usuń powietrze z kanalizacji wlotowej, uruchamiając pompy strzykawkowe z dużym natężeniem przepływu i ustawiając pompy strzykawkowe pionowo, stukając w strzykawki, aby doprowadzić pęcherzyki powietrza do góry. Po usunięciu powietrza ze strzykawki, należy ustawić pompę strzykawki poziomo i stopniowo stukać lub przesuwać przewody polimerowe ze strzykawek w górę przez aparat przełączający, aby usunąć i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.Powtórz ten proces dla drugiego zestawu strzykawek w przypadku zmiany pożywki. Po usunięciu pęcherzyków powietrza ustaw pompę strzykawkową drugiej fazy na 1,5 mikrolitra na minutę, a następnie wstrzymaj przepływ. Umieść małe zaciski do segregatora na segmentach elastycznej rurki na odgałęzieniu złączy Y odpowiadających drugiej fazie medium i kontynuuj uruchamianie pompy fazy pierwszej, aby przedmuchnąć drugie medium za złączem Y.Aby załadować urządzenie PDMS, należy rozpocząć od delikatnego umieszczenia pustych, cienkich końcówek mikropipet z żelem w otworach wylotowych urządzenia mikroprzepływowego. Używając cienkich końcówek do ładowania żelu z mikropipetą P200, pasywuj urządzenie, wstrzykując medium zawierające jeden miligram na mililitr BSA do otworów wlotowych, obserwując końcówki i otwory wylotowe w celu monitorowania wypełnienia kanałów mikroprzepływowych. Inkubować urządzenie w temperaturze pokojowej przez około pięć minut.Następnie, korzystając z podobnych końcówek, załaduj każdy kanał ponownie zawieszonymi ogniwami, korzystając z końcówek w kanale wylotowym, aby monitorować postęp komórek przez urządzenie. Delikatnie wyjmij końcówki żelowe z otworów wylotowych, pracując pojedynczo, aby zapobiec uszkodzeniu urządzenia. Odwirować urządzenie w mikrowirówce stołowej w odpowiednim adapterze wirnika z prędkością około 6 000 g przez 10 minut.Sprawdź pomyślne ładowanie pod mikroskopem, ale bez mocowania urządzenia do wkładki stolika uchwytu szkiełkowego. Ostrożnie zamontuj załadowane urządzenie na wkładzie stage, przyklejając szkło nakrywkowe po obu stronach PDMS do dolnej części stage wkładka. Odwróć stage włóż zespół urządzenia tak, aby PDMS był skierowany do góry i umieść go na miękkiej powierzchni, takiej jak chusteczka bezpyłowa.Dostosuj natężenie przepływu pompy strzykawkowej pierwszej fazy do 35 mikrolitrów na minutę. Następnie, pracując z jednym pasem na raz, włóż igłę wlotową, a następnie igłę wylotową, która biegnie do zlewki na odpady. Po oględzinach urządzenia pod kątem wycieków należy sprawdzić rurkę wylotową pod kątem nadmiaru komórek, które pojawiają się jako mętny pasek w środkowej menisku, który powoli przesuwa się w kierunku zlewki na odpady.Gdy urządzenie będzie działać przez około 15 minut, ustaw pompę strzykawkową pierwszej fazy na 1,5 mikrolitra na minutę i wstrzymaj przepływ. Przyłóż całą pompę i aparaturę urządzenia do odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego i ponownie uruchom przepływ medium pierwszej fazy z prędkością 1,5 mikrolitra na minutę. Ostrożnie zamontuj stage wkładkę z urządzeniem na mikroskopie, używając w razie potrzeby taśmy do poprowadzenia rurki doprowadzającej i wylotowej.Znajdź odpowiednie pozycje na urządzeniu do obrazowania i rozpocznij obrazowanie zgodnie z potrzebami. Należy zauważyć, że komórki zazwyczaj potrzebują kilku godzin, aby odczytać stan ustalony, wykładniczy wzrost fazy, a początek akwizycji obrazu może być opóźniony w razie potrzeby, tak aby obrazowanie rozpoczęło się po okresie równowagi. Aby przełączać pożywkę między kolejnymi rundami obrazowania, wstrzymaj przepływ pompy strzykawkowej fazy pierwszej, ostrożnie odpiąć zaciski segregatora od silikonowej rurki fazy drugiej, przesuwając każdy z nich do rurki silikonowej na odgałęzieniu pierwszej fazy złącza Y, a następnie odblokuj przepływ pompy strzykawkowej fazy drugiej i kontynuuj obrazowanie.Jak oceniono za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego, przed podłączeniem mikroprzepływowej instalacji hydraulicznej do urządzenia, początkowe obciążenie komórek byłoby uważane za udane, gdyby wszystkie lub prawie wszystkie boczne kanały mikroprzepływowe zawierały jedną lub więcej komórek bakteryjnych. Po początkowym załadowaniu urządzenie jest równoważone przy stosunkowo dużym natężeniu przepływu. Jak pokazano tutaj, badanie mikroskopowe urządzenia w równowadze powinno ujawnić kilka komórek zamkniętych w jednym pliku w większości kanałów bocznych.Po umieszczeniu zrównoważonego urządzenia na mikroskopie pod przepływem 1,5 mikrolitra na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, komórki wznowią równomierny i stały wykładniczy wzrost fazowy w ciągu około dwóch godzin. Komórki, które wznowiły wzrost fazy wykładniczej, można wiarygodnie obrazować za pomocą mikroskopii jasnego pola lub mikroskopii fluorescencyjnej przez co najmniej 24 godziny. Wprowadzenie przełącznika pożywki rozszerza zakres eksperymentów, które można przeprowadzić, ale także zwiększa częstotliwość katastrofalnych zdarzeń śmierci komórki poprzez obecność pęcherzyków powietrza lub klastrów komórek na wlocie, które ulegają przemieszczeniu i przechodzą przez kanał zasilający.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około pięciu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Stosując tę procedurę, z różnymi reporterami fluorescencyjnymi, szczepami i warunkami środowiskowymi, można badać szeroką gamę zjawisk fizjologicznych, w tym bardzo rzadkie lub przejściowe zdarzenia.

single-cell-microfluidic-analysis-of-bacillus-subtilis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje mikrofluidyczny model kokultury do jednoczesnej i zlokalizowanej hodowli komórek nabłonkowych oraz bakterii. Model ten może być wykorzystany do badania roli różnych rozpuszczalnych sygnałów molekularnych w patogenezie, a także do oceny skuteczności potencjalnych probiotycznych szczepów bakteryjnych.

Mikrofluidyczna kokultura komórek nabłonkowych i bakterii do badania oddziaływań zapśredniczonych przez sygnały rozpuszczalne

Niniejszy protokół przedstawia szczegółową procedurę monitorowania zachowania pojedynczych komórek różnych bakterii w czasie, z wykorzystaniem zautomatyzowanej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Ponadto przedstawiamy wytyczne dotyczące analizy uzyskanych obrazów mikroskopowych.

Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej

Biofilmy mikrobiologiczne są zazwyczaj tworzone przez odrębne subpopulacje wyspecjalizowanych komórek. Analiza pojedynczych komórek w tych subpopulacjach wymaga zastosowania reporterów fluorescencyjnych. W niniejszym protokole opisujemy metodę wizualizacji i monitorowania kilku subpopulacji w biofilmach B. subtilis przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej oraz cytometrii przepływowej.

Analiza pojedynczych komórek biofilmu Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Źródło: Pioli, R., et al., Modeling of microorganisms and microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje metodę wychwytywania pojedynczych, znakowanych fluorescencyjnie komórek Escherichia coli (E. coli) w pułapkach mikroprzepływowych przy użyciu bezwęglowej zawiesiny i kontrolowanego przepływu, a następnie dodawania składników odżywczych w celu wyzwalania wzrostu i obrazowania fluorescencyjnego mikrokolonii.

Wzorce mikroprzepływowe i śledzenie wzrostu bakterii jednokomórkowych na podstawie fluorescencji

Źródło: Cabeen, M. T. i in. Analiza mikrofluidyczna pojedynczych komórek Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)Film pokazuje użycie urządzenia mikrofluidycznego do obserwacji wzrostu bakterii na poziomie pojedynczych komórek. Pokazuje, jak nieruchome komórki bakteryjne, zamknięte w mikroskalowych rowach, są nieustannie odżywiane i obrazowane pod mikroskopem fluorescencyjnym. System ten umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym podziału komórek i śledzenia linii genealogicznej na przestrzeni...

Śledzenie wzrostu bakterii z rozdzielczością pojedynczych komórek w układzie mikrofluidowym

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Ten protokół pozwala na czasowy opis wzrostu bakterii w warunkach stresu na poziomie pojedynczej komórki i populacji komórek.

Wieloskalowa analiza wzrostu bakterii w warunkach leczenia stresem

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Trwałość antybiotyku opisuje zdolność małych subpopulacji we wrażliwej populacji izogenicznej do przejściowego tolerowania wysokich dawek antybiotyków bakteriobójczych. Niniejszy protokół łączy podejścia do scharakteryzowania fenotypu trwałości antybiotyku na poziomie molekularnym i komórkowym po wystawieniu Escherichia coli na działanie śmiertelnych dawek ofloksacyny.

Analiza populacyjna i jednokomórkowa trwałości antybiotyków w Escherichia coli

Ten protokół skupia się na wykorzystaniu cytometrii przepływowej i liczenia koralików do ilościowego oznaczania zarodników bakterii znakowanych bromkiem etydyny. Metoda ta jest również skuteczna w analizie kowalencyjnego sprzężenia białek na powierzchni nienaruszonych zarodników.

Poprawa liczenia zarodników Bacillus subtilis i analizy znaczników w cytometrii przepływowej

Poznaj mikroprzepływową analizę pojedynczych komórek bakteryjnych Bacillus subtilis. Ta metoda umożliwia wielopokoleniową obserwację linii komórkowych w kontrolowanych warunkach środowiskowych.

Jednokomórkowa analiza mikroprzepływowa Bacillus subtilis

Przeglądaj więcej filmów