Proste generowanie wysokowydajnej kultury indukowanych neuronów z dorosłych fibroblastów skóry człowieka
February 5th, 2018
Bezpośrednie przeprogramowanie neuronów generuje neurony, które utrzymują wiek początkowej komórki somatycznej. W tym miejscu opisujemy pojedynczą metodę opartą na wektorach do generowania indukowanych neuronów z fibroblastów skóry uzyskanych od dorosłych dawców ludzkich.
Ogólnym celem tego protokołu jest wygenerowanie wysokowydajnej hodowli indukowanych neuronów z ludzkich fibroblastów skóry dorosłej osoby. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zaburzeń neurologicznych, ponieważ pozwala na degenerację układu nerwowego opartego na pacjencie, który utrzymuje wiek komórki. Główną zaletą tej metody jest to, że pozwala ona na wygenerowanie indukowanych neuronów od osób w każdym wieku w bardzo ustandaryzowany i wydajny sposób w zaledwie 25 dni.
Pozwala na szeroki wachlarz zastosowań biomedycznych, w tym modelowanie chorób, toksykologię, diagnostykę, a także testy przesiewowe leków na bardzo dużą skalę. Procedurę zademonstruje Shelby, doktorantka w jednostce, w której trenuje mózg, a także Karlonia, która znajduje się w naszym laboratorium. Na początek rozmroź fibroblasty skóry dorosłego człowieka za pomocą zautomatyzowanego systemu rozmrażania komórek.
Po zliczeniu liczby komórek za pomocą automatycznego licznika komórek, wysiewaj dwieście tysięcy komórek do kolby T-75 zawierającej 10 mililitrów pożywki fibroblastowej. Utrzymuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia zastąp starą pożywkę świeżą pożywką fibroblastów.
Zmieniaj pożywkę fibroblastów co trzy do czterech dni, aż komórki osiągną 95% zbieżności. Na godzinę przed posiewem fibroblastów skóry dorosłego człowieka po przeprogramowaniu, pokryj każdą studzienkę 24-dołkowej płytki 250 mikrolitrami 0,1% żelatyny. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Odessać pożywkę z fibroblastów z kolby i przemyć raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanami Dulbecco. Po umyciu liza komórek za pomocą 1,5 mililitra 0,05% trypsyny na kolbę T-75 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie dodaj trzy mililitry pożywki fibroblastowej, aby zneutralizować roztwór trypsyny.
Schłodzić oderwane komórki w 15-mililitrowej probówce, dwukrotnie wypłukując komórki z kolby. Następnie odwirować komórki pod ciśnieniem 400 G przez pięć minut. Wydalić supernatent i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze pożywki fibroblastowej.
Następnie przygotuj zawiesinę komórkową składającą się z 1 320 000 komórek w 13,2 mililitrach pożywki fibroblastowej, aby uzyskać 100 000 komórek na mililitr pożywki. Po zaessaniu żelatyny z płytki należy dwukrotnie umyć płytkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami firmy Dulbecco. Następnie dodaj 500 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej z studzienek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.
Podgrzej 13,2 mililitra pożywki fibroblastowej do 37 stopni Celsjusza. Następnie rozmrozić wektor lentiwirusowy w okapie laminarnym w temperaturze pokojowej. Dodać wymaganą objętość lentiwirusa niezbędną do zakażenia fibroblastów skóry dorosłego człowieka przy wielokrotności infekcji wynoszącej 20 do pożywki bez żadnych wzmacniaczy transdukcji.
Następnie zastąp pożywkę 500 mikrolitrami pożywki fibroblastowej z dodatkiem wektora lentiwirusowego. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia należy zastąpić pożywkę zawierającą lentiwirusa świeżą pożywką fibroblastową bez wektora lentiwirusowego.
Trzeciego dnia po transdukcji wirusa usuń pożywkę fibroblastów i dodaj 500 mikrolitrów pożywki do wczesnej konwersji neuronalnej. Dwa lub trzy razy w tygodniu zastąp 225 mikrolitrów starej pożywki z każdej studzienki 250 mikrolitrami świeżej pożywki z wczesnej konwersji neuronalnej. W 18 dniu po transdukcji wirusa usuń pożywkę wczesnej konwersji neuronalnej i zastąp 500 mikrolitrami późnej pożywki neuronalnej.
Zmieniaj pożywkę co dwa do trzech dni, tak jak poprzednio, aż do 25 dnia lub eksperymentalnego punktu końcowego. Użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby usunąć podłoże. Następnie dodaj dwa 250 mikrolitrów środka dysocjującego komórki do każdej studzienki i pozostaw płytkę w inkubatorze na 10 do 20 minut, aż komórki odłączą się i unoszą jako pojedyncze komórki.
W międzyczasie przygotuj bufor FACS. Rozetrzeć pipetą o pojemności 1000 mikrolitrów. Inkubuj trochę dłużej, jeśli pozostały grudki komórek.
Otrzymaną zawiesinę jednokomórkową przenieść do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Przepłucz studzienki dwukrotnie pożywką do późnej konwersji neuronalnej i przenieś do tej samej 1,5 mililitrowej probówki. Następnie odwirować przy 400 G przez pięć minut i wyrzucić supernatczyność.
Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach bufora FACS. Ponownie odwirować komórki pod ciśnieniem 400 G przez pięć minut i wyrzucić supernatent. Ponownie zawieś komórki w buforze FACS i wirówce.
Powtórz jeszcze dwa razy. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 50 mikrolitrach buforu FACS zawierającego ludzkie przeciwciało CD56 w stężeniu od jednego do 50 przez 15 minut na lodzie, z dala od światła. Odwirować komórki pod ciśnieniem 400 G przez pięć minut i rozpuścić osad komórkowy w 200 mikrolitrach buforu FACS w celu przepłukania komórek.
Ponownie odwirować komórki o sile 400 G przez pięć minut. Dwukrotnie przemyć buforem FACS, a następnie odwirować. Na koniec ponownie zawiesić w 200 mikrolitrach buforu FACS zawierającego 10 mikrogramów na mililitr jodku propidyny.
Sortować komórki dodatnie NCAM i ujemne jodku propidyny za pomocą bramkowania na podstawie poziomu intensywności fluorescencji próbek kontrolnych, które nie zostały wybarwione przeciwciałem NCAM lub jodkiem propidyny. Użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć liczbę komórek i rozsiać 50 000 komórek na centymetr kwadratowy na płytce pokrytej fibronektyną poli-L-ornityną i lamininą z pożywką do późnej konwersji neuronalnej. Zmieniaj połowę pożywki dwa do trzech razy w tygodniu z pożywką z późną konwersją neuronalną, aż do eksperymentalnego punktu końcowego.
Reprezentatywne obrazy z kontrastem fazowym pokazują zmiany morfologiczne w komórkach w okresie konwersji. Znacząca przemiana w morfologii komórek jest widoczna od piątego dnia. Do 22 dnia około połowa komórek przekształciła się w neurony.
Reprezentatywne obrazy aminofluorescencji wskazują na obecność standardowych markerów neuronalnych w komórkach. Do 25 dnia komórki uzyskują morfologię neuronów i wyrażają markery neuronalne, takie jak MAP2 i TAU. Jądra są barwione DAPI.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować indukowane neurony z dorosłych ludzkich fibroblastów. Obejmuje to posiewanie komórek w celu przeprogramowania, transdukcji wirusa, konserwacji komórek, a także sortowania FACS w celu oczyszczenia. Rozwój tej techniki toruje drogę naukowcom zajmującym się zaburzeniami neurologicznymi do badania różnych cech związanych z chorobą, a także potencjalnych terapii.
Można to zrobić w systemie, który jest nie tylko ludzkim układem neuronowym, ale może być zarówno specyficzny dla pacjenta, jak i choroby.
Przegląd
To badanie przedstawia metodę opartą na wektorach do generowania indukowanych neuronów z dorosłych ludzkich fibroblastów skóry, zachowując cechy wieku wyjściowych komórek somatycznych. Podejście to ma na celu ułatwienie badań nad zaburzeniami neurologicznymi, umożliwiając stworzenie modeli neuronowych specyficznych dla pacjenta w ciągu zaledwie 25 dni.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Hodowla komórek
- Zaburzenia neurologiczne
Tło
- Bezpośrednie przeprogramowanie neuronalne utrzymuje wiek wyjściowych komórek somatycznych.
- Generowanie indukowanych neuronów może być korzystne dla modelowania chorób.
- Ta metoda pozwala na wysokowydajne kultury od osób w różnym wieku.
- Podejście oferuje standaryzowane i wydajne protokoły konwersji neuronowej.
Cel badania
- Opracowanie skutecznej metody generowania indukowanych neuronów.
- Dostarczenie narzędzi do badania zaburzeń neurologicznych.
- Standaryzacja procedur przeprogramowania w różnych grupach wiekowych.
Stosowane metody
- Główna platforma wykorzystuje dorosłe ludzkie fibroblasty skóry.
- Kluczowym modelem biologicznym są indukowane neurony wygenerowane z komórek fibroblastów.
- Wiąże się z serią zmian medium i obróbkami komórkowymi przez 25 dni.
- Obejmują transdukcję wirusową do konwersji neuronowej.
- Ostateczne wyniki badano pod kątem ekspresji markerów neuronowych i zmian morfologicznych.
Główne wyniki
- Indukowane neurony wykazały znaczącą transformację morfologiczną w ciągu 25 dni.
- Do dnia 22 około połowa fibroblastów przekształciła się w neurony z typowymi markerami.
- Markery neuronowe takie jak MAP2 i TAU były ekspresowane do dnia 25.
- Zastosowany metod pozwala na wydajne generowanie układów neuronowych specyficznych dla pacjenta.
Wnioski
- Ta metoda wykazuje niezawodne podejście do generowania indukowanych neuronów do badań.
- Poprawia rozumienie przeprogramowania komórkowego w kontekście chorób neurologicznych.
- Wyniki sugerują potencjał rozwoju modeli terapeutycznych dostosowanych do indywidualnych pacjentów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid generation of patient-specific induced neurons from adult human skin fibroblasts, preserving donor age for accurate neurological disease modeling. The standardized 25-day workflow supports scalable production of neural systems for target validation and mechanistic de-risking in early discovery. It provides a renewable, disease-relevant human cell source that bridges donor variability and translational screening needs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses using age-matched human neural systems derived from donor fibroblasts.
- Operational Value: Produces high-yield induced neuron cultures suitable for pathway clarification and functional target assessment.
- Predictive Value: Supports predictive confidence by maintaining donor age and disease context in a scalable human model.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified neuronal populations via FACS sorting for consistent, reproducible assay inputs.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable cell preparations compatible with multi-well plating and automated handling.
- Assay Readiness: Provides electrophysiology-ready neurons on coated coverslips for functional readout validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers disease-relevant human neural systems that maintain donor-specific genetic and epigenetic backgrounds.
- Operational Value: Enables longitudinal culture beyond 25 days for chronic dosing and target engagement studies.
- Translational Continuity: Supports biomarker-aligned screening through expression of MAP2, TAU, and neuronal morphology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing to lead identification, providing a human neural platform for target de-risking prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via direct conversion of fibroblasts to neurons, preserving donor age for accurate disease modeling.
- Screening: Enables assay-ready neuronal cultures with quantified transduction efficiency and purification via FACS for NCAM+/PI- populations.
- Analytics: Facilitates quantitative assessment of neuronal conversion through marker expression (MAP2, TAU) and morphological tracking over 25 days.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing patient-derived neurons that reflect donor age and potential disease genotype.
- Enterprise Reuse: Establishes a frozen fibroblast stock workflow enabling on-demand neuron generation across projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by using human neurons that retain donor age and disease-relevant context.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized medium changes, viral transduction at MOI 20, and defined conversion stages.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early target validation in age-stratified human neural systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through scalable, donor-matched models for cross-indication screening.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral transduction, sterile cell culture, and FACS sorting for neuronal purification.
- Dependent on lentiviral vector availability, fibroblast sourcing, and CO2-controlled incubation infrastructure.
- Necessitates standardization of gelatin coating, medium exchange schedules, and dissociation timing across users.
- Adaptation to alternative neuronal subtypes may require reprogramming factor optimization beyond the current protocol.
- Practical limitations include donor fibroblast variability and the need for aseptic handling during 25-day culture.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:02
Preparation of Skin Fibroblasts for Reprogramming
1:43
Plating for Reprogramming (Day 1)
3:22
Viral Transduction (Day 0)
4:12
Maintenance of the Converting Cells
4:58
FACS
7:33
Results: Generation of Induced Neurons from Adult Human Dermal Fibroblasts
8:15
Conclusion
