Name: Proste generowanie wysokowydajnej kultury indukowanych neuronów z dorosłych fibroblastów skóry człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj metodę generowania wysokowydajnych indukowanych neuronów z dorosłych fibroblastów skóry człowieka w zaledwie 25 dni. Ta technika umożliwia tworzenie modeli neuronalnych specyficznych dla pacjenta, zachowujących wiek komórek wyjściowych, co jest kluczowe dla badań nad chorobami neurologicznymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Marie Persson Vejgården za pomoc techniczną. Badania, które doprowadziły do uzyskania tych wyników, otrzymały finansowanie z New York Stem Cell Foundation, Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych w ramach Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej: FP/2007-2013 Neuro Stem Cell Repair (nr 602278) oraz Umowy o Grant ERBN nr 30971, Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych (umowa o grant 521-2012-5624, 2016-00873 i 70862601/ Bagadilico), Szwedzkiej Fundacji Parkinsona (Parkinsonfonden), oraz Strategiczny Obszar Badawczy w Lund University Multipark (multidyscyplinarne badania nad chorobą Parkinsona). Janelle Drouin-Ouellet jest wspierana przez stypendium Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR) (#358492), a Roger Barker jest wspierany przez grant NIHR Biomedical Research Center dla University of Cambridge/Addenbrooke's Hospital. Malin Parmar jest badaczką z New York Stem Cell Foundation Robertson. Shelby Shrigley jest finansowana ze środków programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 (H2020-MSCA-ITN-2015) w ramach Sieci Szkoleń Innowacyjnych Marii Skłodowskiej-Curie oraz umowy o grant nr 676408.

Dojrzałe fibroblasty skóry właściwej pozyskano z klinik badań nad chorobą Parkinsona i chorobą Huntingtona w John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, Wielka Brytania) i wykorzystano po uzyskaniu lokalnej zgody etycznej (REC 09/H0311/88). Szczegółowe informacje na temat procedury pobierania biopsji skóry znajdują się w referencji8.
1. Przygotowanie fibroblastów skóry do reprogramowania
<ol>
	<li>Używając zautomatyzowanego systemu rozmrażania komórek lub kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, rozmrozić ludzkie dojrzałe fibroblasty skórne (aHDFs) i wysiać 200 000 komórek na kolbę T75 (policzyć za pomocą automatycznego licznika komórek) w 10 mL pożywki dla fibroblastów (patrz Tabela 1) w temperaturze 37 °C w 5% CO2.</li>
	<li>Następnego dnia przeprowadzić całkowitą wymianę pożywki na pożywkę dla fibroblastów.</li>
	<li>Wymieniać pożywkę dla fibroblastów co 3–4 dni, aż komórki osiągną 95% konfluencji. 
	UWAGA: Jedna konfluencyjna kolba będzie zawierać około 1 000 000 komórek. Komórki aHDFs można zamrozić w celu stworzenia banku linii komórkowej (rozdział 2) lub bezpośrednio przesiać w celu przygotowania do reprogramowania (rozdział 3).</li>
</ol>
2. Mrożenie fibroblastów skóry
<ol>
	<li>Umieść pojemnik do mrożenia z kontrolowaną szybkością w pudełku z lodem lub w lodówce w temperaturze 4 &#176;C.</li>
	<li>Rozdziel komórki za pomocą 0,05% trypsyny (1,5 ml na kolbę T75) w 37 &#176;C przez 3–5 min.</li>
	<li>Dodać pożywkę do fibroblastów (zawierającą płodową surowicę bydlęcą (FBS)), aby zneutralizować trypsynę (3 ml na każde przepłukanie kolby T75), a następnie zebrać odczepione komórki do probówki 15 ml, wypłukując zawartość kolby dwukrotnie.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek; (zalecane) zamrozić około 500 000 aHDF w jednej probówce.</li>
	<li>Odwiruj komórki z prędkością 400 x g przez 5 min.</li>
	<li>Resuspenduj pellet komórkowy w 1 ml medium do mrożenia (patrz Tabela 1) i przenieść do probówki kriogenicznej. Probówki umieścić bezpośrednio w pojemniku do zamrażania z kontrolowaną szybkością chłodzenia.</li>
	<li>Przechowywać urządzenie do mrożenia z kontrolowaną szybkością w temperaturze -80 &#176;C przez noc. Następnego dnia przenieść probówki do -140 &#176;C zamrozić i przechowywać do momentu użycia.</li>
</ol>
3. Wysiewanie do reprogramowania (Dzień −1)
UWAGA: W przypadku eksperymentów krótkoterminowych (do 30 dni) zaleca się stosowanie powłoki żelatynowej; alternatywnie, w eksperymentach długoterminowych zaleca się rozpoczęcie pracy na powłoce z poli-L-ornityny, fibronektyny i lamininy (PFL).
<ol>
	<li>Na 60 min przed wysianiem aHDF do reprogramowania, pokryj płytkę 24-dołkową 0,1% żelatyną (250 µL/dołek) i inkubuj w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odsuń pożywkę dla fibroblastów z aHDF. Przemyj raz DPBS. Dysocjuj komórki za pomocą 0,05% trypsyny (1,5 mL na kolbę T75) w temperaturze 37 °C przez 3–5 min.</li>
	<li>Dodaj pożywkę dla fibroblastów, aby zneutralizować trypsynę (3 mL na jedno płukanie na kolbę T75), i zbierz oddzielone komórki do probówki 15 mL, płukając zawartość kolby dwukrotnie.</li>
	<li>Wirować komórki przy 400 x g przez 5 min. Odlej supernatant i resuspenduj osad komórkowy w 1 mL pożywki dla fibroblastów.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek (aby zapewnić wysoką jakość konwersji, sprawdź, czy żywotność komórek przekracza 90% przy użyciu barwienia błęknitem trypanowym).</li>
	<li>Dla pełnej płytki 24-dołkowej przygotuj zawiesinę 1 320 000 komórek w 13,2 mL pożywki dla fibroblastów, aby uzyskać stężenie 100 000 komórek/mL pożywki (lub 55 000 komórek/dołek w 550 µL pożywki dla fibroblastów pomnożone przez liczbę potrzebnych dołków).</li>
	<li>Odsuń żelatynę z płytki i przemyj ją dwukrotnie DPBS. Dodaj 500 µL zawiesiny komórkowej do każdego dołka i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2.</li>
</ol>
4. Transdukcja wirusowa (Dzień 0)
UWAGA: Praca z cząstkami lentiwirusowymi wymaga sprzętu kategorii 2 oraz zastosowania środka do neutralizacji wirusa. Zdecydowanie zaleca się również zakładanie podwójnych rękawiczek.
<ol>
	<li>Podgrzać 13,2 mL pożywki do fibroblastów do 37 °C.</li>
	<li>Rozmrozić w temperaturze pokojowej wektor lentiwirusowy zawierający czynniki transkrypcyjne Ascl1 i Brn2 z dwoma krótkimi rybnymi RNA (shRNA) celującymi w REST. 
	UWAGA: Patrz odniesienie8; konstrukt jest dostępny w repozytorium plazmidów. Szczegóły dotyczące procedury produkcji lentiwirusów znajdują się w odniesieniu9.</li>
	<li>Do pożywki bez dodatków zwiększających transdukcję dodać odpowiednią objętość lentiwirusa w celu zainfekowania aHDF z wielokrotnością infekcji (MOI) wynoszącą 20. 
	<img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/56904/56904eq1v2.jpg" /></li>
	<li>Wymienić pożywkę w płytce 24-dołkowej na pożywkę do fibroblastów zawierającą wektor lentiwirusowy (500 µL/dołek) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2.</li>
	<li>Następnego dnia wymienić pożywkę w dołkach na świeżą pożywkę do fibroblastów bez wektora lentiwirusowego. 
	UWAGA: Pożywkę uznaje się za zakaźną przez 7 dni, w związku z czym w pierwszym tygodniu po transdukcji wirusowej należy stosować odpowiednie procedury ochrony i obchodzenia się z materiałem.</li>
</ol>
5. Utrzymanie komórek konwertujących
UWAGA: Po rozpoczęciu konwersji komórki są podatne na odrywanie się; należy uważać, przechylając płytkę i używać pipety 1 000 µL podczas usuwania medium, aby zapobiec odrywaniu się komórek.
<ol>
	<li>W 3. dniu usunąć pożywkę do fibroblastów i dodać 500 µL pożywki do wczesnej konwersji neuronalnej (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Dwa do trzech razy w tygodniu usunąć 225 µL starej pożywki z dołka i dodać 250 µL świeżej pożywki do wczesnej konwersji neuronalnej.</li>
	<li>W 18. dniu usunąć całą pożywkę z każdego dołka i zastąpić ją 500 µL pożywki do późnej konwersji neuronalnej (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Kontynuować wymianę połowy pożywki w opisany wyżej sposób, stosując pożywkę do późnej konwersji neuronalnej co 2–3 dni aż do 25. dnia lub zakończenia eksperymentu (Rycina 1A). 
	UWAGA: Jeśli w eksperymencie nie wszystkie dołki są obsadzone komórkami, należy wypełnić puste dołki PBS lub wodą, aby zapobiec nadmiernemu odparowaniu pożywki i zminimalizować różnice między dołkami.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Stężenie roztworu zapasu</td>
			<td>Stężenie robocze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Pożywka dla fibroblastów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka podstawowa</td>
			<td>Nie dotyczy</td>
			<td>Nie dotyczy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicylina/streptomycyna</td>
			<td>10 000 J/ml</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>płytki FBS</td>
			<td>Z powodu braku tekstu źródłowego do przetłumaczenia, nie mogę wykonać zadania. Proszę o dostarczenie treści, którą należy przetłumaczyć na język polski.</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Pożywka do mrożenia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka dla fibroblastów</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
			<td>45%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>płytki surowicy bydlęcej</td>
			<td>Tekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści do tłumaczenia.</td>
			<td>45%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Z uwagi na brak tekstu źródłowego, proszę o dostarczenie treści, którą należy przetłumaczyć.</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Poziom medium do wczesnej konwersji neuronalnej (ENM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka do różnicowania neuronalnego&#160;</td>
			<td>Brak danych</td>
			<td>Brak danych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicylina/streptomycyna</td>
			<td>10 000 U/ml</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>2 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-431542</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>100 &#181;g/mL</td>
			<td>0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN-1931189</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>0.5 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VPA</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LM-22A4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>2 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>20 &#181;g/mL</td>
			<td>2 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT3</td>
			<td>10 &#181;g/mL</td>
			<td>10 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>db-cAMP</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>0,5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">późne medium do konwersji neuronalnej (LNM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poziomka do różnicowania neuronalnego&#160;</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
			<td>Brak danych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicylina/Streptomycyna</td>
			<td>10 000 U/ml</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LM-22A4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>2 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>20 &#181;g/mL</td>
			<td>2 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NT3</td>
			<td>10 &#181;g/mL</td>
			<td>10 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>db-cAMP</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>0,5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Bufor do FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 1x [bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej]</td>
			<td>Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o wprowadzenie treści, która ma zostać przełożona na język polski.</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Nie dotyczy</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaza</td>
			<td>Since no source text was provided, I am unable to perform a translation. Please provide the English text you would like translated into Polish.</td>
			<td>0.05%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład poszczególnych użytych pożywek. Pełny opis składu wszystkich pożywek wymaganych w tym protokole, w tym pożywki do fibroblastów, pożywki do mrożenia, wczesnej pożywki do konwersji neuronalnej, późnej pożywki do konwersji neuronalnej oraz buforu do FACS.
6. Szklane szkiełka nakrywki do pomiarów elektrofizjologicznych
UWAGA: Zaleca się noszenie fartucha laboratoryjnego, gogli, podwójnych rękawiczek oraz wykonywanie wszystkich prac w dygestorium. Niniejszy protokół został opracowany na podstawie 10.
<ol>
	<li>Umieść szklane lamellki na dnie szklanego naczynia tak, aby na siebie nie nachodziły.</li>
	<li>Dodaj ogólny detergent do czyszczenia laboratoryjnego, aby zanurzyć wszystkie lamellki, nie ryzykując przelania podczas wytrząsania (około 30 mL). Umieść naczynie na wytrząsarce orbitalnej przy małej prędkości na 2 h.</li>
	<li>Przemyj sześciokrotnie (po 30 min każdego razie) autoklawowaną wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Dodaj 95% etanol na 2 h.</li>
	<li>Usuń etanol i poczekaj, aż lamellki wyschną.</li>
	<li>Po wyschnięciu przenieś lamellki do szklanego zlewka i dodaj 70% kwas azotowy, aż lamellki zostaną zanurzone.</li>
	<li>Umieść szklany zlewek w kąpieli sonikacyjnej na 60 min.</li>
	<li>Usuń kwas azotowy i przemyj trzykrotnie autoklawowaną wodą dejonizowaną. 
	Przestroga: Zawsze dodawaj kwas do wody, nigdy odwrotnie, ponieważ może to doprowadzić do gwałtownej reakcji.</li>
	<li>Usuń ze zlewka jak najwięcej wody i dodaj stężony kwas solny (HCI), aż lamellki zostaną zanurzone; zakręć zlewkiem i przykryj folią parafnową.</li>
	<li>Sonicuj przez 60 min (50–60 Hz, 30 W).</li>
	<li>Usuń z lamellek jak najwięcej HCI i wlej go do odpowiedniego pojemnika na odpady. Przepłucz dwukrotnie autoklawowaną wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Wyjmij lamellki z dygestorium i płucz 20 razy (lub więcej) autoklawowaną wodą dejonizowaną, aż cały HCI zostanie usunięty.</li>
	<li>Po wyschnięciu umieść lamellki w sterylnych płytkach 24-dołkowych.</li>
	<li>Umieść płytki pod światłem ultrafioletowym (UV) na noc. Następnego dnia lamellki są gotowe do użycia. 
	UWAGA: W przypadku użycia szklanych lamellek zaleca się stosowanie powłoki PFL. Po prostu umieść jedną lamellkę w każdym dołku płytki 24-dołkowej (używając sterylnej pęsety) i postępuj zgodnie z poniższym protokołem.</li>
</ol>
7. Powlekanie PFL do długotrwałych hodowli
<ol>
	<li>Pokryć płytkę 24-dołkową poli-L-ornityną (500 µL/dołek) i pozostawić przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2.</li>
	<li>Odssać poli-L-ornitynę i odczekać, aż wyschnie na tyle, by na powierzchni utworzyły się krople.</li>
	<li>Nanieść kroplę (około 60 µL) lamininy na środek każdego dołka i rozprowadzić tak, aby pokryła całą powierzchnię szkiełka podstawowego. Pozostawić na 2 h 45 min w temperaturze 37 °C w 5% CO2.</li>
	<li>Przemyć trzykrotnie DPBS.</li>
	<li>Dodać fibronektynę (500 µL/dołek) i pozostawić przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2.</li>
	<li>Przemyć raz DPBS przed dodaniem komórek. 
	UWAGA: Powłoka PFL może być stosowana do długoterminowych hodowli iNs (powyżej 100 dni), choć od 30. dnia należy spodziewać się postępującej śmierci komórek.</li>
</ol>
8. FACS
UWAGA: Aby ponownie wysiać komórki po sortowaniu FACS, należy przygotować płytkę powleczoną PFL z 48-godzinnym wyprzedzeniem. Komórki można sortować, używając przeciwciała przeciwko cząsteczce adhezyjnej komórek neuronalnych (NCAM) od 20. dnia po transdukcji.
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę za pomocą pipety 1 000 µL (nie płukać, aby uniknąć odrywania się komórek).</li>
	<li>Dodać środek dysocjujący komórki (250 µL/dołek), pozostawić na 10–20 min, aż komórki odkleją się i będą unosić się jako pojedyncze komórki.</li>
	<li>W tym czasie przygotować bufor FACS.</li>
	<li>Delikatnie zhomogenizować za pomocą pipety 1 000 µL. Jeśli pozostaną grudki, inkubować nieco dłużej.</li>
	<li>Po uzyskaniu zawiesiny pojedynczych komórek, przenieść ją z dołka do probówki 1,5 mL.</li>
	<li>Wypłukać dołek dwukrotnie późną pożywką do konwersji neuronalnej i przenieść zawartość do tej samej probówki 1,5 mL.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 5 min i odrzucić nadsącz.</li>
	<li>Resuspendować osad komórkowy w 200 µL buforu FACS.</li>
	<li>Wirować komórki przy 400 x g przez 5 min i odrzucić nadsącz.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 8.8 i 8.9 dwukrotnie.</li>
	<li>Resuspendować osad komórkowy w 50 µL buforu FACS zawierającego przeciwciało przeciwko ludzkiemu CD56 (NCAM) w stężeniu 1:50 na 15 min w lodzie. Chronić przed światłem.</li>
	<li>Wirować komórki przy 400 x g przez 5 min.</li>
	<li>Resuspendować w 200 µL buforu FACS w celu przemycia i wirować komórki przy 400 x g przez 5 min.</li>
	<li>Powtórzyć krok 8.13.</li>
	<li>Resuspendować w 200 µL buforu FACS zawierającego jodek propidyny (PI; 10 µg/mL). Wyselekcjonować komórki NCAM-dodatnie (iNs) i PI-ujemne (żywe) za pomocą FACS, stosując bramkowanie w oparciu o poziom intensywności fluorescencji próbek kontrolnych, które nie były barwione przeciwciałem NCAM ani PI.</li>
	<li>Zebrać komórki NCAM-dodatnie do probówki zawierającej późną pożywkę do konwersji neuronalnej.</li>
	<li>Policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i wysiać je ponownie przy wysokiej gęstości (50 000 komórek/cm2) w późnej pożywce do konwersji neuronalnej w naczyniu powlekanym PFL.</li>
	<li>Kontynuować wymianę połowy pożywki 2–3 razy w tygodniu na późną pożywkę do konwersji neuronalnej aż do zakończenia eksperymentu (Rysunek 1A).</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17, 170-182 (2016).</li>
<li>Mertens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+Reprogrammed+Human+Neurons+Retain+Aging-Associated+Transcriptomic+Signatures+and+Reveal+Age-Related+Nucleocytoplasmic+Defects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly Reprogrammed Human Neurons Retain Aging-Associated Transcriptomic Signatures and Reveal Age-Related Nucleocytoplasmic Defects.</a> Cell Stem Cell. 17, 705-718 (2015).</li>
<li>Hashizume, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+the+nuclear-coded+GCAT+and+SHMT2+genes+confers+human+age-associated+mitochondrial+respiration+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of the nuclear-coded GCAT and SHMT2 genes confers human age-associated mitochondrial respiration defects.</a> Sci Rep. 5, 10434(2015).</li>
<li>Lapasset, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rejuvenating+senescent+and+centenarian+human+cells+by+reprogramming+through+the+pluripotent+state%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Rejuvenating senescent and centenarian human cells by reprogramming through the pluripotent state.</a> Genes Dev. 25, 2248-2253 (2011).</li>
<li>Huh, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+age+in+human+neurons+generated+by+microRNA-based+neuronal+conversion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Maintenance of age in human neurons generated by microRNA-based neuronal conversion of fibroblasts.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Drouin-Ouellet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REST+suppression+mediates+neural+conversion+of+adult+human+fibroblasts+via+microRNA-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">REST suppression mediates neural conversion of adult human fibroblasts via microRNA-dependent and -independent pathways.</a> EMBO Mol Med. , (2017).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li>
<li>Richner, M., Victor, M. B., Liu, Y., Abernathy, D., Yoo, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-based+conversion+of+human+fibroblasts+into+striatal+medium+spiny+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-based conversion of human fibroblasts into striatal medium spiny neurons.</a> Nat Protoc. 10, 1543-1555 (2015).</li>
<li>Lau, S., Rylander Ottosson, D., Jakobsson, J., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neural+conversion+from+human+fibroblasts+using+self-regulating+and+nonintegrating+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct neural conversion from human fibroblasts using self-regulating and nonintegrating viral vectors.</a> Cell Rep. 9, 1673-1680 (2014).</li>
<li>Pfisterer, U., Wood, J., Nihlberg, K., Hallgren, O., Bjermer, L., Westergren -Thorsson, G., Lindvall, O., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+functional+neurons+from+adult+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of functional neurons from adult human fibroblasts.</a> Cell Cycle. 10, 3311-3316 (2011).</li>
<li>Caiazzo, M., Dell'Anno, M. T., Dvoretskova, E., Lazarevic, D., Taverna, S., Leo, D., Sotnikova, T. D., Menegon, A., Roncaglia, P., Colciago, G., Russo, G., Carninci, P., Pezzoli, G., Gainetdinov, R. R., Gustincich, S., Dityatev, A., Broccoli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li>
<li>Masserdotti, G., Gascón, S., Götz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+reprogramming%3A+learning+from+and+for+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal reprogramming: learning from and for development.</a> Development. 143, 2494-2510 (2016).</li>
<li>Pereira, M., Pfisterer, U., Rylander, D., Torper, O., Lau, S., Lundblad, M., Grealish, S., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+generation+of+induced+neurons+from+human+fibroblasts+that+transplantation+into+the+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly efficient generation of induced neurons from human fibroblasts that transplantation into the adult rat brain.</a> Sci Rep. 4, 6330(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ta jednoetapowa/jednowektorowa metoda przeprogramowania zapewnia skuteczny sposób uzyskiwania iN z dorosłych ludzkich fibroblastów. Dorosłe fibroblasty ludzkie są zwykle znacznie trudniejsze do ukrycia niż fibroblasty płodowe, a ograniczone badania wcześniej wykazały skuteczność około 5-10%12,13. Jednak dzięki temu nowemu protokołowi możliwe jest osiągnięcie wydajności neuronalnej (mierzonej jako komórki MAP2+) na poziomie około 50%8. Dodatkowo nasz protokół może być stosowany na fibroblastach skóry, które zostały wielokrotnie przepasane bez utraty efektywności konwersji. Do tej pory używaliśmy ogniw pasażowanych do 14 razy, nie wykrywając żadnego spadku wydajności konwersji. Nie ma również różnicy w skuteczności przeprogramowania w naszych rękach z fibroblastami od dawców w wieku od 52 do 87 lat. Więcej informacji na temat wieku i choroby innych linii komórkowych badanych za pomocą tego konstruktu można znaleźć w odnośniku8. Inne badania również nie wykazały różnicy w wydajności konwersji przy użyciu protokołu opartego na lentiwirusie i wzmocnionego małymi cząsteczkami z dawcami w wieku od 0 do 89 lat4. Co więcej, konsekwentne zastosowanie do przeprogramowania neuronów opartego na miRNA odnotowano w fibroblastach w każdym wieku, z dawcami w wieku od 0 do 86 lat7. Dzięki tej drodze dojrzałe neurony można uzyskać w ciągu około 12–15 tygodni in vitro lub około 8 tygodni po przeszczepie in vivo8. Jest to korzystne, ponieważ daje dostęp zarówno do specyficznych dla choroby, jak i pacjenta ludzkich iN z łatwo dostępnych tkanek. Chociaż protokół ten jest skuteczny, nie zapewni 100% wydajności neuronalnej, dlatego wymagany jest etap oczyszczania, na przykład za pomocą FACS.
Najważniejszym etapem w ramach tego protokołu jest transdukcja wirusa (sekcja 4 protokołu). Bardzo ważne jest, aby miano wirusa było precyzyjne, a także aby posiano dokładną liczbę aHDF do konwersji. Zalecane miano dla tego protokołu wynosi od 4 x 108 do 4 x 109. Używanie miana poniżej 1 x 108 nie byłoby zalecane, ponieważ dodanie dużych ilości wirusa będzie toksyczne dla komórek. Co więcej, gdy fibroblasty zaczną ukrywać się do iNs, staną się bardziej kruche i podatne na podnoszenie. Ważne jest, aby zachować ostrożność podczas zmiany podłoża, aby nie przeszkadzać zbytnio komórkom. Można to zrobić, powoli usuwając płyn za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl. Wreszcie, podczas posiewu w celu przeprogramowania (sekcja 3 protokołu) ważne jest, aby zapewnić zdrową populację fibroblastów przed rozpoczęciem eksperymentu; Wskazuje na to żywotność komórek powyżej 90% z barwieniem błękitem trypanowym. AHDF powinny być zawsze przepuszczane przed osiągnięciem 95% zbieżności.
Jeśli przed transdukcją wirusa zauważalna jest śmierć komórki, nie rozpoczynaj konwersji: dokładnie sprawdź, czy żywotność komórki przekracza 90% i czy nie było problemów z pokryciem płytki. Oczekuje się, że po transdukcji wirusa dojdzie do niewielkiej śmierci komórki, jednak nie powinno to być znaczące. W takim przypadku potwierdź dokładne wysiew 50 000 aHDF/studzienkę i sprawdź miano wirusa. Jeśli podczas konwersji zauważalna jest niespójność między studzienkami, należy najpierw sprawdzić, czy każda studzienka zawiera równą ilość pożywki i czy na krawędziach nie dochodzi do jawnego parowania (w razie potrzeby można dodać dodatkowe media do studzienek krawędziowych). Alternatywnie, sprawdzić krok 4.4 i upewnić się, że podczas transdukcji należy odpowiednio wymieszać w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny. Bardzo ważne jest, aby najpierw dodać lentiwirusa do pożywki, zanim doda się go do studzienek. Bezpośrednie dodanie lentiwirusa do studzienek zwiększy zmienność studni i może być również toksyczne dla komórek. Na koniec należy zawsze sprawdzić, czy podłoże jest podgrzane do temperatury 37 °C przed dodaniem do komórek.
Protokół ten zawiera opcjonalne sekcje dotyczące warunków powlekania dla długotrwałej hodowli iNs i sortowania FACS w celu zwiększenia czystości neuronalnej. Do eksperymentów mających na celu zbadanie charakterystyki funkcjonalnej iNs dołączono również protokół przygotowania szkiełek nakrywkowych do elektrofizjologii. Protokół konwersji jest tutaj skonfigurowany do użytku z płytką 24-dołkową; W razie potrzeby można to zmodyfikować do 6-, 12-, 48-, 96-dołkowej płytki lub kolb. W takim przypadku należy dostosować wszystkie objętości do powierzchni używanej płytki lub kolby.
Protokół ten wykorzystuje wymuszoną ekspresję Ascl1 i Brn2 w połączeniu z knockdownem REST, wszystkie zapakowane w jeden pojedynczy wektor8 w celu wygenerowania iN fenotypu panneuronalnego. Generowanie jakichkolwiek podtypów glejowych za pomocą tej metody nie zostało jednak ocenione. Metoda ta musiałaby zatem zostać zmodyfikowana do użycia z innymi czynnikami przeprogramowującymi w celu uzyskania neuronów specyficznych dla podtypu. Bezpośrednie przeprogramowanie wykazało wcześniej możliwość generowania neuronów ruchowych, neuronów czuciowych, fotoreceptorów, środkowych neuronów kolczastych prążkowia i neuronów dopaminergicznych10,14. Będzie to korzystne podczas badania chorób neurologicznych, w których preferencyjnie dotknięty jest określony podtyp neuronów, na przykład choroba Parkinsona i neurony dopaminergiczne.
Do niedawna technologia bezpośredniego przeprogramowania neuronowego nie pozwalała na wytwarzanie iN w ustandaryzowany i wydajny sposób – do poziomu, który jest wymagany do toksykologicznych i przesiewowych testów leków na dużą skalę. Ta nowa metoda jest bardzo skuteczna i może być stosowana na fibroblastach, które były wielokrotnie pasażowane, dzięki czemu teraz usuwa te ograniczenia i otwiera szeroki wachlarz badań, nie tylko w ludzkim układzie nerwowym, ale także w systemie, który może być specyficzny dla pacjenta. Prostota tego podejścia sprawia, że technologia iN jest dostępna dla wszystkich grup, które chcą przeprowadzić podobne badania we własnym zakresie i może być łatwo wykorzystana nie tylko do zastosowań biomedycznych na dużą skalę, takich jak badania przesiewowe leków i testy toksykologiczne, ale także do wspierania danych pochodzących z modeli zwierzęcych i próbek tkanek pobranych pośmiertnie przez ludzi.

Rozwój skutecznych metod leczenia zaburzeń neurologicznych został utrudniony przez ograniczony dostęp do żywych komórek mózgowych do przeprowadzania badań mechanistycznych i testów funkcjonalnych. Około dekady temu sytuacja ta radykalnie się zmieniła wraz z rozwojem technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs)1,2. To, w połączeniu z lepszym zrozumieniem mechanizmów różnicowania neuronalnego zachodzących podczas normalnego rozwoju człowieka, pozwoliło na wygenerowanie zdefiniowanych i zróżnicowanych podtypów neuronów z materiału specyficznego dla pacjenta i choroby. Dzięki takiemu materiałowi możliwe jest teraz badanie wewnątrzkomórkowych mechanizmów leżących u podstaw chorób neurologicznych oraz potencjału różnych związków w łagodzeniu tych cech patologicznych3.
Chociaż iPSC były rewolucyjne w dziedzinie neuronauki, jedną z głównych wad tych komórek jest to, że ich sygnatura starzenia się jest usuwana podczas procesu przeprogramowania w taki sposób, że odmłodzony neuron nie zachowuje podatności związanej ze starzeniem się4,5,6. Ta szczególna cecha wytwarzanych neuronów może okazać się kluczowa dla rekapitulacji wielu aspektów wewnątrzkomórkowej kaskady patogennej, szczególnie w przypadku chorób, w przypadku których starość jest ważnym czynnikiem ryzyka.
Bezpośrednie przeprogramowanie neuronów to technologia, w której komórka somatyczna jest bezpośrednio przekształcana w iN bez przechodzenia przez pośredni etap pluripotencjalny. Pozwala to na szybkie generowanie ludzkich neuronów in vitro, które mogą być specyficzne zarówno dla pacjenta, jak i choroby. Jedną z niezwykłych cech bezpośredniego przeprogramowania jest to, że zachowany jest początkowy wiek komórki dawcy, a co za tym idzie, jej podatność na procesy starzenia, takie jak zwiększona produkcja stresu oksydacyjnego4,7. W rezultacie, iN od pacjentów z chorobami neurologicznymi związanymi ze starzeniem się, takimi jak choroba Alzheimera i Parkinsona, doskonale nadają się do szerokiego zakresu zastosowań biomedycznych, w tym modelowania chorób, testów przesiewowych leków i badań toksykologicznych.
Głównym zastrzeżeniem, które uniemożliwiło powszechne stosowanie iN u pacjentów z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, jest to, że nie są one łatwe do przeprogramowania, a staje się to jeszcze trudniejsze wraz z ekspansją fibroblastów. W rezultacie, generowanie komórek iN w ilościach wymaganych dla tego typu aplikacji nie zostało osiągnięte aż do niedawna8. Opracowaliśmy prostą metodę bardzo skutecznego przeprogramowania fibroblastów od dawców w każdym wieku. Metoda ta łączy wymuszoną ekspresję neuronalnych czynników transkrypcyjnych Ascl1 i Brn2 z knockdownem czynnika transkrypcyjnego wyciszającego RE1 białka represorowego (REST) przy użyciu pojedynczego wektora. W tym miejscu opisujemy różne etapy prowadzące do wytworzenia iN przekształconych z fibroblastów skóry pobranych z biopsji od dawców w podeszłym wieku.

<table><tbody><tr><td><silne>Linie komórkowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dorosłe ludzkie fibroblasty skórne&nbsp;</td><td></td><td></td><td>[C2 fragment #7] Dawcą była 67-letnia kobieta. Komórki uzyskane z choroby Parkinsona" Badania nad chorobą Huntingtona i choroba Huntingtona" Kliniki Chorób Mózgu im. Johna van Geesta (Cambridge, Wielka Brytania).</td></tr><tr><td>Odczynniki do hodowli, transdukcji i konwersji fibroblastów</td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[-CaCl2, -MgCl2]</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA [0,5%]</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>Rozcieńczyć do 0,05% w DPBS.</td></tr><tr><td>Virkon (środek stosowany do neutralizacji wirusa)</td><td>Viroderm</td><td>7511&nbsp;</td><td>Rozcieńczyć do 1% roztworu ciepłą wodą.</td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Woda Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td><mocny>Podstawowy średni</mocny> - Dulbecco' s Zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) + GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>61965059</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna [10 000 U/mL]</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS&reg; &nbsp; sulfotlenek dimetylu (DMSO) 10</td><td>Miltenyi</td><td>170-076-303</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże różnicowania neuronów - NDiff 227</td><td>Takara-Clontech</td><td>Y40002</td><td></td></tr><tr><td>LM-22A4&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>4607</td><td>Rozcieńczyć 10 mg w 1450 &mikro; L DMSO. Stężenie fabryczne: 20 mM.</td></tr><tr><td>Czynnik neurotroficzny pochodzenia z linii komórek glejowych (GDNF) [rekombinowany człowiek]</td><td>R& Systemy D</td><td>212-GD-010</td><td>Rozcieńczyć 10 ug w 500 &mikro; L 0,1% BSA w DPBS. <silny> Stężenie zapasów: 20 i mikro; g/ml.&nbsp; </td></tr><tr><td>NT3 [rekombinowany człowiek]</td><td>R& Systemy D</td><td>267-N3-025</td><td>Rozcieńczyć 25 &mikro; g w 2,5 ml 0,1% BSA w DPBS. <silny> Stężenie w magazynie: 10 i mikro; g/ml.&nbsp; </td></tr><tr><td>db-cAMP&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0627</td><td>Rozcieńczyć 1 g w 40,7 ml wody Milli-Q. Filtruj i rób 500 &mikro; Porcje L lub probówki podstawowe o pojemności 10 ml. <silny>Stężenie magazynowe: 50 mM.&nbsp; </td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>Rozcieńczony 2 &mikro; g w 429,8 i mikro; L DMSO. <silny>Stężenie w magazynie: 10 mM.&nbsp; </td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Axon</td><td>1661</td><td>Rozcieńczyć 5 mg w 595 &mikro; L DMSO. <silny>Stężenie w magazynie: 20 mM.&nbsp; </td></tr><tr><td>Noggin [rekombinowany człowiek]</td> <td>Miltenyi</td><td>130-103-456</td><td>Rozcieńczony 100 &mikro; g w 100 i mikro; L wody Milli-Q + 900 &mikro; L 0,1% BSA w DPBS. <silny> Stężenie zapasów: 100 &mikro; g/mL.</td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Axon</td><td>1509</td><td>Rozcieńczyć 2 mg w 360 &mikro; L DMSO. Stężenie podstawowe: 10 mM.</td></tr><tr><td>sól sodowa kwasu walproinowego (VPA)</td><td>Merck Millipore</td><td>676380</td><td>Rozcieńczyć 5 g w wodzie Milli-Q, aby uzyskać <mocne>stężenie wyjściowe 1 M. UWAGA: Unikaj spożycia, kontaktu ze skórą i wdychania pyłu.</td></tr><tr><td>Odczynniki do powłok</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>żelatyna&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2500</td><td>Rozcieńczyć do 0,1% w wodzie Milli-Q.</td></tr><tr><td>Poli-L-ornityna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td>Rozpuścić w wodzie Milli-Q. <silny>Stosować w 15&mikro; g/ml.&nbsp; </td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33010-018</td><td>2 ml wody Milli-Q + 70 &mikro; L 0,25 M NaOH. <silny>Stosować przy 5 &mikro; g/ml.&nbsp; </td></tr><tr><td>Laminin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>Przechowywać w temperaturze -80°C. Rozmrozić na lodzie, przechowywać w chłodnym miejscu i porcjować 30 &mikro;L. <silny>Stosować w temperaturze 5 &mikro; g/ml.&nbsp; </td></tr><tr><td>Odczynniki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Środek dysocjacji komórek - Accutase (Stem Pro)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) 1X [-wapń, -magnez, - czerwień fenolowa]</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175-046</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>Stosować w stężeniu 1% dla Anti-Human CD56 (NCAM).</td></tr><tr><td>DNAaza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN-25</td><td>Stosować w stężeniu 0,05%.</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD56 (NCAM) [Mysz]</td><td>BD Pharmingen</td><td>555518</td><td>Stosować w 1: 50.</td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td>Rozcieńczyć do 1 mg/ml w PBS i zachować sterylność. <silny>Użyj w stosunku 1:1000, aby uzyskać stężenie 10&mikro; g/ml.<</td></tr><tr><td>strong>Odczynniki do szkiełek nakrywkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoklawizowana woda</td><td></td><td></td><td></td>dejonizowana</tr><tr><td>Detergent Alconox</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z273228</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 95%</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kwas azotowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438073-M</td><td>UWAGA: Stężony kwas azotowy jest silnie, a jego opary są potencjalnie szkodliwe.</td></tr><tr><td>Stężony kwas solny (HCI)</td><td></td><td></td> <td>< silny>UWAGA: </silny> Stężony kwas solny jest silnie, a jego opary są potencjalnie szkodliwe.</td></tr><tr><td>Odczynniki do immunocytochemii</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Merck Millipore</td><td>1040051000</td><td>Stosować w stężeniu 4%. <silny>UWAGA:</silny> PFA jest silnym utrwalaczem. Unikać spożycia i kontaktu ze skórą</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific 10254640</td><td></td><td>Stosować w stężeniu 0,1%.</td></tr><tr><td>Surowica [Osioł]</td><td>Merck Millipore</td><td>S30-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-MAP2 [Kurczak]</td><td>Abcam</td><td>ab5392</td><td>Stosować w stężeniu 1 : 5,000.</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne Tau HT7 [Mysz]</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MN1000</td><td>Stosować w stężeniu 1 : 500.</td></tr><tr><td>Cy3 Przeciwciało przeciwko kurczakom [Osioł]</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-165-155</td><td>Stosować w stężeniu 1 : 400.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor488 Przeciwciało przeciw myszy [Osioł]</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-150</td><td>Stosować w stężeniu 1 : 400.</td></tr><tr><td>Dichlorowodorek 4&prime;,6-diamidyno-2&prime;-fenyloindolu (DAPI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>Rozpuść proszek w wodzie Milli-Q do 1 mg / ml. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20&deg; C, <silny>światłoczuły</silny>. Stosować w stężeniu 1 : 500.</td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolba T75 [Nunclon Delta Surface]</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka [Nunc]</td><td>ThermoFisher Scientific 142485</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówka polipropylenowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z336769</td><td></td></tr><tr><td>15 ml&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka sokoła&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Rurka CryoPure 1,6 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.380</td><td></td></tr><tr>Kontroler <td></td><td></td><td>Pippette</td><td>Do pipetowania objętości 1-25 mL.</td></tr><tr><td>Sterylne pipety serologiczne: 5, 10 i 25 ml&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>Pipety o regulowanej objętości: 5, 20, 200 i 1 000 &mikro; L&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne końcówki</td><td></td><td></td> do pipet <td>Do pipetowania objętości 0,5 - 1 000 &mikrolitrów.</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>NeuVitro</td><td>GG-12-1.5-oz</td><td>#1.5 grubość, średnica 12 mm, 0,5 uncji, certyfikat CE, pasują do płytek 24-dołkowych.</td></tr><tr><td>Szklane naczynie</td><td></td><td></td><td>o średnicy około 150 mm.</td></tr><tr><td>Szklana zlewka</td><td></td><td></td><td>Upewnij się, że dostępna jest zlewka o odpowiednim rozmiarze do kąpieli sonicyjnej. Woda z kąpieli sonikołatora nie powinna przelewać się do szklanej zlewki.</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThawSTAR Automatyczny system rozmrażania komórek</td><td>BioCision</td><td>BCS-601</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automatyczny licznik komórek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Komory zliczania komórek [50 szkiełek] i błękit trypanowy [0,4%]</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td>Do użytku z automatycznym licznikiem komórek Countess II.</td></tr><tr><td>CoolCell Cell LX Pojemnik do zamrażania o kontrolowanej szybkości</td><td>Biocision</td><td>BCS-405</td><td></td></tr><tr>Okap <td></td><td></td><td></td><td>z przepływem laminarnym</td></tr><tr><td>Nawilżany 5% CO2 37 &deg; C Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td>Nadaje się do probówek 1,5, 15 i 50 ml.</td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td></td><td></td><td></td>orbitalna</tr><tr><td>Sonicator - Bransonic Model B200 środek czyszczący</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z305359</td><td>Częstotliwość = 50-60Hz, amplituda = 30 watów</td></tr><tr><td>Sortownik komórek FACS Aria III</td><td>BD Pharmingen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z kontrastem fazowym</td><td>Olympus</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny odwrócony</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr></tbody></table>

proste generowanie wysokowydajnej kultury indukowanych neuronów z dorosłych fibroblastów skóry człowieka

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Indukowane neurony (iNs), produkt komórek somatycznych bezpośrednio przekształconych w neurony, są sposobem na uzyskanie neuronów pochodzących od pacjenta z łatwo dostępnej tkanki. Dzięki tej drodze dojrzałe neurony można uzyskać w ciągu kilku tygodni. W tym miejscu opisujemy prosty i szybki jednoetapowy protokół uzyskiwania iN z fibroblastów skóry uzyskanych za pomocą próbek biopsyjnych od dorosłych dawców ludzkich. Wyjaśniamy każdy etap procesu, w tym utrzymanie fibroblastów skóry, procedurę zamrażania w celu zbudowania zapasu linii komórkowej, wysiewanie komórek w celu przeprogramowania, a także warunki hodowli podczas procesu konwersji. Ponadto opisujemy przygotowanie szkiełek nakrywkowych do zapisów elektrofizjologicznych, długotrwałe warunki powlekania oraz sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Ilustrujemy również przykłady oczekiwanych wyników. Opisany tutaj protokół jest łatwy do wykonania i może być stosowany do ludzkich fibroblastów pochodzących z biopsji ludzkiej skóry od pacjentów o różnych diagnozach i wieku. Protokół ten generuje wystarczającą ilość iN, które można wykorzystać w szerokim zakresie zastosowań biomedycznych, w tym w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych leków i walidacji celów.

Od 5. dnia powinna być widoczna wyraźna zmiana morfologii komórek (Ryc. 1B). Po transdukcji wirusowej należy spodziewać się pewnej śmierci komórkowej, choć nie powinna być ona drastyczna. Z każdego dołka w płytce 24-dołkowej do 25. dnia należy spodziewać się całkowitego uzysku od 20 000 do 40 000 komórek, z czego około połowa powinna przekształcić się w neurony. Należy zauważyć, że uzysk i czystość mogą się różnić w zależności od linii komórkowej, stanu chorobowego oraz partii wirusa.
Komórki będą wykazywać ekspresję większości standardowych markerów neuronalnych, w tym MAP2 i TAU (Rycyna 1C), w 25. dniu, wykazując jednocześnie dojrzałą morfologię neuronalną. Możliwe jest uzyskanie czystej populacji iN poprzez zastosowanie FACS w oparciu o marker NCAM (patrz referencje8,11). Następnie komórki można ponownie wysiać na potrójną powłokę PFL (patrz referencja10) lub bezpośrednio zamrozić do analiz biomolekularnych.
Jeśli komórki nie zostaną poddane sortowaniu, należy przeprowadzić znakowanie immunofluorescencyjne przy użyciu MAP2 lub TAU w celu zidentyfikowania pomyślnie przekształconych komórek i ich współznakowania z białkiem będącym przedmiotem badania.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56904/56904fig1.jpg" /> 
Rycina 1: Ewolucja konwersji iN w czasie. (A) Oś czasu eksperymentu i mapa konstruktu zapakowanego do lentiwirusa użytego do przeprogramowania dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych. Każda czarna strzałka oznacza zmianę pożywki. (B) Reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym przedstawiające zmiany morfologii komórek podczas procesu konwersji od dnia 0 do dnia 22 (zgodnie z oznaczeniem w prawym górnym rogu każdego panelu). Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu fazowego z użyciem obiektywu 10X. (C) Obraz immunofluorescencyjny podwójnego barwienia na TAU i MAP2 w 35. dniu po transdukcji. Komórki utrwalono w 4% paraformaldehydzie i permeabilizowano 0,1% Tritonem w DPBS przez 10 min. Komórki blokowano przez 30 min w 5% roztworze surowicy w DPBS. Przeciwciała rozcieńczono w roztworze blokującym i inkubowano przez noc w 4 °C. Przeciwciała wtórne sprzężone z fluoroforami rozcieńczono w roztworze blokującym i inkubowano przez 2 h. Komórki przeciwbarwiono DAPI przez 15 min, po czym wykonano 3 płukania DPBS. Obrazy wykonano za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z użyciem obiektywu 20X. Paski skali = 100 µm (B, C). Skróty: ENM: wczesna pożywka neuronalna; LNM: późna pożywka neuronalna. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56904/56904fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Bezpośrednie przeprogramowanie neuronów generuje neurony, które utrzymują wiek początkowej komórki somatycznej. W tym miejscu opisujemy pojedynczą metodę opartą na wektorach do generowania indukowanych neuronów z fibroblastów skóry uzyskanych od dorosłych dawców ludzkich.

Proste generowanie wysokowydajnej kultury indukowanych neuronów z dorosłych fibroblastów skóry człowieka

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Ogólnym celem tego protokołu jest wygenerowanie wysokowydajnej hodowli indukowanych neuronów z ludzkich fibroblastów skóry dorosłej osoby. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zaburzeń neurologicznych, ponieważ pozwala na degenerację układu nerwowego opartego na pacjencie, który utrzymuje wiek komórki. Główną zaletą tej metody jest to, że pozwala ona na wygenerowanie indukowanych neuronów od osób w każdym wieku w bardzo ustandaryzowany i wydajny sposób w zaledwie 25 dni.Pozwala na szeroki wachlarz zastosowań biomedycznych, w tym modelowanie chorób, toksykologię, diagnostykę, a także testy przesiewowe leków na bardzo dużą skalę. Procedurę zademonstruje Shelby, doktorantka w jednostce, w której trenuje mózg, a także Karlonia, która znajduje się w naszym laboratorium. Na początek rozmroź fibroblasty skóry dorosłego człowieka za pomocą zautomatyzowanego systemu rozmrażania komórek.Po zliczeniu liczby komórek za pomocą automatycznego licznika komórek, wysiewaj dwieście tysięcy komórek do kolby T-75 zawierającej 10 mililitrów pożywki fibroblastowej. Utrzymuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia zastąp starą pożywkę świeżą pożywką fibroblastów.Zmieniaj pożywkę fibroblastów co trzy do czterech dni, aż komórki osiągną 95% zbieżności. Na godzinę przed posiewem fibroblastów skóry dorosłego człowieka po przeprogramowaniu, pokryj każdą studzienkę 24-dołkowej płytki 250 mikrolitrami 0,1% żelatyny. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Odessać pożywkę z fibroblastów z kolby i przemyć raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanami Dulbecco. Po umyciu liza komórek za pomocą 1,5 mililitra 0,05% trypsyny na kolbę T-75 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie dodaj trzy mililitry pożywki fibroblastowej, aby zneutralizować roztwór trypsyny.Schłodzić oderwane komórki w 15-mililitrowej probówce, dwukrotnie wypłukując komórki z kolby. Następnie odwirować komórki pod ciśnieniem 400 G przez pięć minut. Wydalić supernatent i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze pożywki fibroblastowej.Następnie przygotuj zawiesinę komórkową składającą się z 1 320 000 komórek w 13,2 mililitrach pożywki fibroblastowej, aby uzyskać 100 000 komórek na mililitr pożywki. Po zaessaniu żelatyny z płytki należy dwukrotnie umyć płytkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami firmy Dulbecco. Następnie dodaj 500 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej z studzienek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.Podgrzej 13,2 mililitra pożywki fibroblastowej do 37 stopni Celsjusza. Następnie rozmrozić wektor lentiwirusowy w okapie laminarnym w temperaturze pokojowej. Dodać wymaganą objętość lentiwirusa niezbędną do zakażenia fibroblastów skóry dorosłego człowieka przy wielokrotności infekcji wynoszącej 20 do pożywki bez żadnych wzmacniaczy transdukcji.Następnie zastąp pożywkę 500 mikrolitrami pożywki fibroblastowej z dodatkiem wektora lentiwirusowego. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia należy zastąpić pożywkę zawierającą lentiwirusa świeżą pożywką fibroblastową bez wektora lentiwirusowego.Trzeciego dnia po transdukcji wirusa usuń pożywkę fibroblastów i dodaj 500 mikrolitrów pożywki do wczesnej konwersji neuronalnej. Dwa lub trzy razy w tygodniu zastąp 225 mikrolitrów starej pożywki z każdej studzienki 250 mikrolitrami świeżej pożywki z wczesnej konwersji neuronalnej. W 18 dniu po transdukcji wirusa usuń pożywkę wczesnej konwersji neuronalnej i zastąp 500 mikrolitrami późnej pożywki neuronalnej.Zmieniaj pożywkę co dwa do trzech dni, tak jak poprzednio, aż do 25 dnia lub eksperymentalnego punktu końcowego. Użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby usunąć podłoże. Następnie dodaj dwa 250 mikrolitrów środka dysocjującego komórki do każdej studzienki i pozostaw płytkę w inkubatorze na 10 do 20 minut, aż komórki odłączą się i unoszą jako pojedyncze komórki.W międzyczasie przygotuj bufor FACS. Rozetrzeć pipetą o pojemności 1000 mikrolitrów. Inkubuj trochę dłużej, jeśli pozostały grudki komórek.Otrzymaną zawiesinę jednokomórkową przenieść do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Przepłucz studzienki dwukrotnie pożywką do późnej konwersji neuronalnej i przenieś do tej samej 1,5 mililitrowej probówki. Następnie odwirować przy 400 G przez pięć minut i wyrzucić supernatczyność.Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach bufora FACS. Ponownie odwirować komórki pod ciśnieniem 400 G przez pięć minut i wyrzucić supernatent. Ponownie zawieś komórki w buforze FACS i wirówce.Powtórz jeszcze dwa razy. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 50 mikrolitrach buforu FACS zawierającego ludzkie przeciwciało CD56 w stężeniu od jednego do 50 przez 15 minut na lodzie, z dala od światła. Odwirować komórki pod ciśnieniem 400 G przez pięć minut i rozpuścić osad komórkowy w 200 mikrolitrach buforu FACS w celu przepłukania komórek.Ponownie odwirować komórki o sile 400 G przez pięć minut. Dwukrotnie przemyć buforem FACS, a następnie odwirować. Na koniec ponownie zawiesić w 200 mikrolitrach buforu FACS zawierającego 10 mikrogramów na mililitr jodku propidyny.Sortować komórki dodatnie NCAM i ujemne jodku propidyny za pomocą bramkowania na podstawie poziomu intensywności fluorescencji próbek kontrolnych, które nie zostały wybarwione przeciwciałem NCAM lub jodkiem propidyny. Użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć liczbę komórek i rozsiać 50 000 komórek na centymetr kwadratowy na płytce pokrytej fibronektyną poli-L-ornityną i lamininą z pożywką do późnej konwersji neuronalnej. Zmieniaj połowę pożywki dwa do trzech razy w tygodniu z pożywką z późną konwersją neuronalną, aż do eksperymentalnego punktu końcowego.Reprezentatywne obrazy z kontrastem fazowym pokazują zmiany morfologiczne w komórkach w okresie konwersji. Znacząca przemiana w morfologii komórek jest widoczna od piątego dnia. Do 22 dnia około połowa komórek przekształciła się w neurony.Reprezentatywne obrazy aminofluorescencji wskazują na obecność standardowych markerów neuronalnych w komórkach. Do 25 dnia komórki uzyskują morfologię neuronów i wyrażają markery neuronalne, takie jak MAP2 i TAU. Jądra są barwione DAPI.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować indukowane neurony z dorosłych ludzkich fibroblastów. Obejmuje to posiewanie komórek w celu przeprogramowania, transdukcji wirusa, konserwacji komórek, a także sortowania FACS w celu oczyszczenia. Rozwój tej techniki toruje drogę naukowcom zajmującym się zaburzeniami neurologicznymi do badania różnych cech związanych z chorobą, a także potencjalnych terapii.Można to zrobić w systemie, który jest nie tylko ludzkim układem neuronowym, ale może być zarówno specyficzny dla pacjenta, jak i choroby.

simple-generation-high-yield-culture-induced-neurons-from-human-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Protokoły różnicowania neuronalnego pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych (hPSCs) są często czasochłonne i wymagają zaawansowanych umiejętności w hodowli komórkowej. W niniejszej pracy dostosowaliśmy procedurę różnicowania opartą na małych cząsteczkach do formatu płytek wielodobojowych, co umożliwia prostą, szybką i wydajną generację ludzkich neuronów w sposób kontrolowany.

Szybka i wydajna generacja neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płyt wielodołkowych

Ten film demonstruje technikę izolowania indukowanych nerwowych komórek progenitorowych (iNPC) pochodzących z dorosłych ludzkich fibroblastów. Przedstawiono w nim etapy związane z izolacją kolonii iNPC i hodowlą ich w wielodołkowych dołkach płytkowych pokrytych lamininą w obecności odpowiednich pożywek hodowlanych, które ułatwiają ciągłą proliferację i ekspansję populacji iNPC.

Izolowanie indukowanych kolonii nerwowych komórek progenitorowych pochodzących z fibroblastów dorosłego człowieka

Film pokazuje generowanie neuronów z dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych (aHDF). aHDF są przeprogramowywane przy użyciu wektora lentiwirusowego przenoszącego geny neuronalnych czynników transkrypcyjnych i krótkich RNA spinki do włosów (shRNA). ShRNA hamują ekspresję neuronalnego represora transkrypcyjnego, a neuronalne czynniki transkrypcyjne aktywują geny do różnicowania aHDF w neurony. Te przeprogramowane aHDF są hodowane we wczesnej i późnej pożywce konwersji neuronalnej w celu...

Generowanie neuronów poprzez przeprogramowanie ludzkich komórek fibroblastów skóry

Ten film opisuje metodę przygotowania szklanych szkiełek nakrywkowych pokrytych poliornityną i lamininą w celu zwiększenia adhezji i wzrostu nerwowych komórek macierzystych. Technika ta obejmuje sekwencyjne inkubacje i płukanie, ułatwiając tworzenie macierzy podporowej, która wspomaga wzrost i różnicowanie komórek neuronalnych, naśladując struktury znajdujące się w neuronach.

Generowanie neuronów piramidowych korowych z ludzkich nerwowych komórek macierzystych

Opisujemy metodę izolowania naiwnych multipotencjalnych komórek prekursorowych pochodzenia skórnego (SKP) z pierwotnych kultur ludzkich fibroblastów. Pokazujemy, że te SKP pochodzące z kultur fibroblastów mają podobne właściwości komórek macierzystych do tych pochodzących bezpośrednio z biopsji ludzkiej skóry. Komórki te wyrażają marker grzebienia nerwowego, nestynę, oprócz markerów multipotencjalnych, takich jak OCT4 i Nanog.

Izolacja naiwnych dorosłych komórek macierzystych z pierwotnych kultur ludzkich fibroblastów

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Solidne pochodzenie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS) zostało osiągnięte dzięki zastosowaniu nieintegrującego wirusa Sendai (SeV) wektorowego przeprogramowania fibroblastów skóry. Utrzymanie komórek hiPS i ekspansja klonalna przeprowadzono przy użyciu wolnych od ksenotypów i chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli z rekombinowaną ludzką lamininą 521 (LN-521) i podłożem Essential E8 (E8).

Bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy Laminin 521

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Opisujemy protokół przeprogramowania fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry w indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC), a następnie ich różnicowanie w indukowane astrocyty (iAs). Metoda ta prowadzi do szybkiego i powtarzalnego generowania iNPC i iA w dużych ilościach.

Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty

Poznaj metodę generowania wysokowydajnych indukowanych neuronów z dorosłych fibroblastów skóry człowieka w zaledwie 25 dni. Ta technika umożliwia tworzenie modeli neuronalnych specyficznych dla pacjenta, zachowujących wiek komórek wyjściowych, co jest kluczowe dla badań nad chorobami neurologicznymi.

Proste generowanie wysokowydajnej kultury indukowanych neuronów z dorosłych fibroblastów skóry człowieka

Przeglądaj więcej filmów