Name: Ultraszybka rekonstytucja białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych bez użycia fusogenicznych proteoliposomów naładowanych komplementarnie. (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Poznaj ultraszybką metodę rekonstytucji białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych bez detergentów. Technika umożliwia budowę złożonych systemów błonowych i sztucznych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Robertowi Gennisowi z University of Illinois i Christophowi von Ballmoosowi z University of Bern za dostarczenie plazmidu i szczepu do ekspresjibo 3-oksydazy. Projekt został wsparty grantem BBSRC BB/L01985X/1 dla R.I. i R.B.

<ol><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Liposomes%2C+Pt+B%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Liposomes, Pt B. 372, 65-86 (2003).</li>
<li>Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins+by+reconstitution+through+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization of membrane proteins by reconstitution through dialysis.</a> Methods Mol Biol. 955 (31-58), 31(2013).</li>
<li>Dezi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li>
<li>Girard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+reconstitution+of+membrane+proteins+into+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys J. 87 (1), 419-429 (2004).</li>
<li>Angelova, M., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/BFb0116295">Preparation of Giant Vesicles by External Ac Electric-Fields - Kinetics and Applications.</a> Trends in Colloid and Interface Science Vi. 89, 127-131 (1992).</li>
<li>Leptihn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+droplet+interface+bilayers+from+the+contact+of+aqueous+droplets+in+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).</li>
<li>Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3750497/">A Tissue-Like Printed Material.</a> Science. 340 (6128), 48-52 (2013).</li>
<li>Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+applications+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: applications come of age.</a> Nat Rev Genet. 11 (5), 367-379 (2010).</li>
<li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Lett. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li>
<li>Church, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Realizing+the+potential+of+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Realizing the potential of synthetic biology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (4), 289-294 (2014).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+reconstituted+neuronal+SNARE+complexes+zipper+in+three+distinct+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages.</a> Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).</li>
<li>Nordlund, G., Brzezinski, P., von Ballmoos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-fusion+mediated+insertion+of+membrane+proteins+into+native+and+artificial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SNARE-fusion mediated insertion of membrane proteins into native and artificial membranes.</a> Nat Commun. 5, 4303(2014).</li>
<li>Decout, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+a+targeted+fusogenic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of a targeted fusogenic peptide.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 1372 (1), 102-116 (1998).</li>
<li>Chan, Y. H., van Lengerich, B., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+linker+sequences+on+vesicle+fusion+mediated+by+lipid-anchored+DNA+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Effects of linker sequences on vesicle fusion mediated by lipid-anchored DNA oligonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (4), 979-984 (2009).</li>
<li>Ishmukhametov, R. R., Russell, A. N., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+platform+for+one-step+assembly+of+multi-component+membrane+systems+by+fusion+of+charged+proteoliposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A modular platform for one-step assembly of multi-component membrane systems by fusion of charged proteoliposomes.</a> Nat Commun. 7, 13025(2016).</li>
<li>Biner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+membrane+proteins+into+small+and+giant+unilamellar+vesicles+by+charge-mediated+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Delivery of membrane proteins into small and giant unilamellar vesicles by charge-mediated fusion.</a> FEBS Lett. 590 (14), 2051-2062 (2016).</li>
<li>Bian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+SERCA+calcium+transport+and+small-molecule+inhibition+in+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct detection of SERCA calcium transport and small-molecule inhibition in giant unilamellar vesicles.</a> Biochem Biophys Res Commun. 481 (3-4), 206-211 (2016).</li>
<li>Schuette, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+liposome+fusion+mediated+by+synaptic+SNARE+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Determinants of liposome fusion mediated by synaptic SNARE proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (9), 2858-2863 (2004).</li>
<li>Spencer, A. C., Torre, P., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+encapsulation+of+cell-free+transcription+and+translation+machinery+in+vesicles+for+the+construction+of+cellular+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics.</a> J Vis Exp. (80), e51304(2013).</li>
<li>Verchere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+investigation+of+the+MexAB+efflux+pump+from+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro investigation of the MexAB efflux pump from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Vis Exp. (84), e50894(2014).</li>
<li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4083487">Determination of Microgram Quantities of Protein in the Presence of Milligram Levels of Lipid with Amido Black B-10.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 97-104 (1985).</li>
<li>Rumbley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+purification+of+histidine-tagged+cytochrome+bo3+from+Escherichia+coli+and+demonstration+that+associated+quinone+is+not+required+for+the+structural+integrity+of+the+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1340 (1), 131-142 (1997).</li>
<li>Taussky, H. H., Shorr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microcolorimetric+Method+for+the+Determination+of+Inorganic+Phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Microcolorimetric Method for the Determination of Inorganic Phosphorus.</a> Journal of Biological Chemistry. 202 (2), 675-685 (1953).</li>
<li>Galkin, M. A., Ishmukhametov, R. R., Vik, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+inactive%2C+cold-stabilized+form+of+the+Escherichia+coli+F1Fo+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta-Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">A functionally inactive, cold-stabilized form of the Escherichia coli F1Fo ATP synthase.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (3), 206-214 (2006).</li>
<li>Ishmukhametov, R. R., Galkin, M. A., Vik, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+purification+and+reconstitution+of+His-tagged+cysteine-less+Escherichia+coli+F1Fo+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Ultrafast purification and reconstitution of His-tagged cysteine-less Escherichia coli F1Fo ATP synthase.</a> Biochim Biophys Acta. 1706 (1-2), 110-116 (2005).</li>
<li>Wiedenmann, A., Dimroth, P., von Ballmoos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deltapsi+and+DeltapH+are+equivalent+driving+forces+for+proton+transport+through+isolated+F%280%29+complexes+of+ATP+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Deltapsi and DeltapH are equivalent driving forces for proton transport through isolated F(0) complexes of ATP synthases.</a> Biochim Biophys Acta. 1777 (10), 1301-1310 (2008).</li>
<li>Morein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+Escherichia+coli+cells+regulate+the+membrane+lipid+composition+in+a+%26%2334%3Bwindow%26%2334%3B+between+gel+and+non-lamellar+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Wild-type Escherichia coli cells regulate the membrane lipid composition in a &#34;window&#34; between gel and non-lamellar structures.</a> J Biol Chem. 271 (12), 6801-6809 (1996).</li>
<li>Zinser, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+synthesis+and+lipid+composition+of+subcellular+membranes+in+the+unicellular+eukaryote+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 173 (6), 2026-2034 (1991).</li>
<li>Daum, G., Vance, J. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9624424">Import of lipids into mitochondria.</a> Prog Lipid Res. 36 (2-3), 103-130 (1997).</li>
<li>Pantazatos, D. P., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+observed+membrane+fusion+between+oppositely+charged+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Directly observed membrane fusion between oppositely charged phospholipid bilayers.</a> J Membr Biol. 170 (1), 27-38 (1999).</li>
<li>Pantazatos, D. P., Pantazatos, S. P., MacDonald, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilayer+mixing%2C+fusion%2C+and+lysis+following+the+interaction+of+populations+of+cationic+and+anionic+phospholipid+bilayer+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Bilayer mixing, fusion, and lysis following the interaction of populations of cationic and anionic phospholipid bilayer vesicles.</a> J Membr Biol. 194 (2), 129-139 (2003).</li>
<li>Sunami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+association+and+fusion+of+giant+vesicles+using+a+fluorescence-activated+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Detection of association and fusion of giant vesicles using a fluorescence-activated cell sorter.</a> Langmuir. 26 (19), 15098-15103 (2010).</li>
<li>Memoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+surfactants+on+the+spectral+behaviour+of+calcein+%28II%29%3A+a+method+of+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Effects of surfactants on the spectral behaviour of calcein (II): a method of evaluation.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 627-632 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby to eksperymentalne podejście zakończyło się sukcesem, należy wziąć pod uwagę kilka następujących kwestii:
Wybór ładunku lipidowego dla proteoliposomów i docelowych dwuwarstw: Lipidy kationowe nie występują w przyrodzie, natomiast lipidy anionowe występują obficie w błonach biologicznych sięgających np. ~25, 35 i 20% w błonie wewnętrznej E. coli, błonie plazmatycznej drożdży S. cerevisiae i wewnętrznych błonach mitochondrialnych wielu gatunków, odpowiednio 27,28,29. Rozsądne byłoby oczekiwanie, że na funkcjonalność białek błonowych w PL+ może mieć wpływ siła dodatniego ładunku dwuwarstwy, która z kolei zależałaby od względnej zawartości lipidów kationowych w dwuwarstwie i zewnętrznej siły jonowej. Dlatego ważne jest, aby eksperymentalnie ocenić, w jakim stopniu funkcjonalność baczących białek błonowych zależałaby od ładunku środowiska lipidów kationowych. Tutaj pokazujemy, że zarówno syntaza F1F o ATP, jak i oksydaza bo3 są wrażliwe na kationowe środowisko lipidowe, ale udało nam się modulować i odwrócić ten efekt, najpierw umieszczając białka w PL+ i dostarczając je do anionowych dwuwarstw akceptujących, a następnie zwiększając siłę jonową pożywki reakcyjnej po zakończeniu fuzji.
Wybór konkretnego lipidu kationowego: Większość dostępnych na rynku lipidów kationowych ma charakter nietriacyloglicerydowy; W związku z tym potencjalny kandydat na lipid musi zostać przetestowany pod kątem kompatybilności z białkami błonowymi będącymi przedmiotem zainteresowania. Stwierdziliśmywcześniej15 , że syntaza ATP zastosowana w tym badaniu wykazała najlepszą wydajność w PL+ utworzonej z etylo-PC, który ma największe podobieństwo strukturalne do naturalnych lipidów triacyloglicerydowych, podczas gdy w DOTAP (lipid nietriacyloglicerydowy) PL+ białko to było mniej aktywne.
Testy fuzji pęcherzyków: Prawdziwe zespolenie pęcherzyków (gdy miesza się płynna zawartość dopęcherzykowa) należy odróżnić od pośrednich stanów fuzji półkrwi, gdy pęcherzyki przylegają do siebie bez mieszania swojej zawartości wodnej, ale łatwo mieszają zawartość ich zewnętrznych lub obu płatków lipidowych30. W przypadku nieoptymalnych mieszanin lipidowych lub w pewnych warunkach, pęcherzyki wykazują również wyraźny wyciek płynnej zawartości podczas fuzji31. Minimalne stężenia naładowanych lipidów w mieszaninach fuzogennych umożliwiających prawdziwą fuzję muszą być znalezione eksperymentalnie dla każdego gatunku lipidów, ale ogólnie stwierdza się, że błony z mniej niż 10% naładowanymi lipidami są niefuzogenne 32.
Podczas tworzenia fuzogennego SUV w obecności jonów wielowartościowych ważne jest, aby nie mieszać przeciwnie naładowanych składników, ponieważ może to spowodować natychmiastowe zlepianie się i agregację lipidów przez te jony. Na przykład, przygotowując SUV do metody kobalt-kalceina-EDTA, ważne jest, aby unikać mieszania kationowej mieszaniny lipidów z EDTA, aby zapobiec zatkaniu filtra poliwęglanowego przez zlepione składniki.
Należy również wspomnieć, że metoda kobaltowo-kalceinowo-EDTA, choć jest bardzo czuła i wygodna do monitorowania fuzji w czasie rzeczywistym, może nadal zaniżać zakres fuzji ze względu na 1) samowygaszanie fluorescencji wolnej kalceiny wewnątrz pęcherzyków pofuzyjnych, które ma osiągnąć 1 mM, podczas gdy próg samowygaszania wynosi około 20 μM33, oraz 2) związana powierzchniowo kobaltowo-kalceina, która pozostaje związana z SUV+ nawet po przejściu przez żelową żywicę filtracyjną i barwi pęcherzyki do jasnopomarańczowego koloru, podczas gdy SUV0 ma bladopomarańczowy kolor. Należy również zauważyć, że uwalnianie związanego kobaltu-kalceiny po dodaniu detergentu Triton X-100 w obecności EDTA generuje znacznie silniejsze sygnały dla SUV+ (rysunek 3C, czerwony ślad) niż SUV0 (szary ślad).
Perspektywy: Spodziewamy się, że opisane tutaj szybkie podejścia mogą znacznie ułatwić i przyspieszyć montaż złożonych membran na potrzeby pojawiających się zastosowań biologii syntetycznej. Nasz protokół rekonstytucji białek błonowych zajmuje tylko pół godziny na odtworzenie delikatnych dużych białek błonowych, o których wiadomo, że są wrażliwe na długotrwałe techniki rekonstytucji oparte na dializie, podczas gdy to fuzogeniczne podejście zajmuje tylko 5 - 10 minut, aby dostarczyć takie białka do dużych dwuwarstw lipidowych. Tutaj pokazujemy zalety tych podejść, manipulując syntazą E. coli F1F o ATP, która jest przykładem kruchego białka. Składa się z 23 podjednostek i wiadomo, że łatwo traci swoją integralność, jeśli zostanie wystawione na działanie nieoptymalnych warunków (na przykład ciepła) podczas/po rozpuszczaniu, ale będąc stosowanym w tych procedurach, białko wykazuje powtarzalnie wysoką aktywność w pompowaniu protonów.

Funkcjonalizacja sztucznych dwuwarstw lipidowych z białkami błonowymi jest kluczowym krokiem w tworzeniu systemów modeli błonowych. Najprostszy model, proteoliposomy (PL), składa się z małych (30-200 nm średnicy) pęcherzyków jednowarstwowych (SUV, zwanych również liposomami), z białkami zintegrowanymi z ich błonami. PL są tradycyjnie tworzone w dwóch krokach1. Po pierwsze, wstępnie uformowane SUV miesza się z interesującym białkiem błonowym i detergentem w stężeniu powyżej krytycznego stężenia miceli (CMC). Po drugie, detergent jest usuwany za pomocą różnych technik dializy, "bio-kulek" lub filtracji żelowej, pozostawiając białko w membranie. Drugie podejście jest znacznie szybsze (~30 min1) i dlatego jest preferowane do rekonstytucji delikatnych i wrażliwych białek błonowych, podczas gdy pierwsze dwa podejścia są ograniczone szybkością usuwania detergentu, co zajmuje wiele godzin i może spowodować znaczną utratę aktywności i utratę integralności strukturalnej białek. Funkcjonalizacja większych pęcherzyków (duże pęcherzyki jednowarstwowe, LUV, do 1 μm średnicy) przy takim podejściu jest trudniejsza, ponieważ rozmiar pęcherzyków zmniejsza się po usunięciu detergentu i nie jest możliwy w przypadku gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV, >1 μm), ponieważ są one destabilizowane przez detergenty (ale patrz Johnson i wsp.2 dla powolnej krystalizacji 2D białek błonowych w dużych dwuwarstwach). Istnieją alternatywne podejścia do funkcjonalizacji membrany GUV3,4,5 istnieją, ale są pracochłonne, czasochłonne i nadal wymagają pewnej ilości detergentu w stężeniach poniżej CMC. Bardziej złożone lub kruche modele lipidowe (na przykład Droplet Hydrogel Bilayers6 i dwuwarstwowe sztuczne tkanki oparte na dwuwarstwowym interfejsie kropelkowym do druku 3D7) nie tolerują detergentów. Szybko pojawiające się aplikacje biologii syntetycznej8,9,10 krytycznie zależą od funkcjonalizacji tak złożonych struktur błonowych. W związku z tym bardzo poszukiwana jest łatwa i niezawodna metoda pozwalająca na szybkie i delikatne dostarczanie białek błonowych do docelowych delikatnych warstw dwuwarstwowych.
Alternatywną, bezdetergentową metodą dostarczania białka jest fuzja pęcherzyków, gdzie błony oddziałujących na siebie pęcherzyków łączą się w nienaruszoną dwuwarstwę pofuzyjną, podczas gdy ich wewnątrzpęcherzykowa zawartość wodna miesza się, nie będąc uwalnianą do środowiska zewnętrznego. Fuzja pęcherzyków jest możliwa i napędzana albo przez rearanżacje konformacyjne w komplementarnych czynnikach fuzogennych (niektóre białka11,12 i peptydy13 lub specjalnie zmodyfikowane DNA14) znajdujące się w kontaktujących się dwuwarstwach, albo interakcje kulombowskie między dwuwarstwami lipidów utworzonymi z komplementarnie naładowanych lipidów kationowych i anionowych15,16, czyli dwuwarstwy kationowe i ujemnie naładowane białka<klasa sup="xref">17.
Pierwsze podejście wymaga obecności czynników fuzogennych w oddziałujących membranach przed fuzją, jest stosunkowo powolne (~30 minut, aby osiągnąć połowę maksimum fuzji12,18), ale może być stosowane zarówno do naturalnych, jak i sztucznych membran.
Zaletą podejścia wykorzystującego fuzogeniczne lipidy (Rysunek 1) jest to, że umożliwia ono znacznie szybszą fuzję błonową (~1 min do osiągnięcia połowy maksimum i 5-10 min do zakończenia reakcji). Dodatkowo, zakres fuzji może być kontrolowany przez i) łatwą do sformułowania względną zawartość naładowanych lipidów w fuzogennych dwuwarstwach oraz ii) jonową i ogólnie osmotyczną siłę pożywki reakcyjnej (sole o sile powyżej 50 mM i, na przykład, sacharoza15 zatrzymują fuzję) lub kombinację obu. Aby zainicjować fuzję, przeciwnie naładowane pęcherzyki fuzogeniczne miesza się w pożywce o niskiej sile jonowej (zwykle 10-20 mM soli) przez 5-10 minut. Względną wadą metody jest to, że lipidy kationowe mogą wywierać negatywny wpływ na funkcjonalność białek błonowych w proteoliposomach kationowych przed fuzją, zwłaszcza przy niskiej sile jonowej, ale efekt ten jest odwracalny i łagodzony przez naturalny skład lipidowy błony pofuzyjnej i jej powrót do normalnego podłoża o sile jonowej.

<table><tbody><tr><td>DOPC neutralny lipid</td><td>Avanti Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>POPA anionowy lipid</td><td>Avanti Lipids</td><td>840857</td><td></td></tr><tr><td>E-PC Lipidy kationowe</td><td>Avanti Lipids</td><td>890704</td><td></td></tr><tr><td>Cholesteryl-Bodipy-FL12</td><td>Thermofisher</td><td>C3927MP</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50, Super Fine</td><td>Sigma</td><td>G5050</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400, Typ 400-DL</td><td>Sigma</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>ACMA</td><td>Sigma</td><td>A5806</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Q1</td><td>Sigma</td><td>C7956</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma</td><td>860077</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>PK</td><td>Sigma</td><td>P9136-1KU</td><td></td></tr><tr><td>LDH</td><td>Sigma</td><td>L1254-1KU</td><td></td></tr><tr><td>Lucyferyna</td><td>Sigma</td><td>L6882</td><td></td></tr><tr><td>Lucyferazy</td><td>Sigma/Roche</td><td>10411523001</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Insight Biotechnology</td><td>sc-202090</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2</td><td>Sigma</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Sulforodamina 101</td><td>Sigma</td><td>S7635</td><td></td></tr><tr><td>System wytłaczania</td><td>Wytłaczarka</td><td></td><td></td>Avanti</tr><tr><td>Luminometr jednorurowy, model Sirius L</td><td>Titertek Berthold</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr poliwęglanowy, D19 mm</td><td>Sigma, membrany trawione Whatman NucleporeTrack,</td><td>WHA800309, WHA800284</td><td>100 lub 200 nm, aby utworzyć SUV i 400 lub 800 nm dla LUV</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Buffers stosowane w papierze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer A</td><td></td><td></td><td>100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7,4, 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Bufor B</td><td></td><td></td><td>20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7,4, 0,1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Buffer C</td><td></td><td></td><td>100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7,4</td></tr><tr><td>Bufor D</td><td></td><td></td><td>1 mM MOPS pH 7,4 Różne stężenia KCl</td></tr></tbody></table>

ultraszybka rekonstytucja białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych bez użycia fusogenicznych proteoliposomów naładowanych komplementarnie.

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergenty są niezbędne do dostarczania białek błonowych do małych jednowarstwowych pęcherzyków o długości 30-100 nm, podczas gdy bardziej złożone, większe modele dwuwarstwowe lipidów są mniej kompatybilne z detergentami.
Tutaj opisujemy strategię omijania tego podstawowego ograniczenia za pomocą fuzogennych przeciwnie naładowanych liposomów zawierających interesujące białko błonowe. Fuzja między takimi pęcherzykami zachodzi w ciągu 5 minut w buforze o niskiej sile jonowej. Dodatnio naładowane liposomy fuzogeniczne mogą być używane jako proste wektory wahadłowe do dostarczania białek błonowych bez detergentów do biomimetycznych docelowych dwuwarstw lipidowych, które są naładowane ujemnie. Pokazujemy również, jak rozpuścić białka błonowe w fuzogenne proteoliposomy za pomocą szybkiego 30-minutowego protokołu.
Łącząc te dwa podejścia, demonstrujemy szybkie składanie łańcucha transportu elektronów składającego się z dwóch białek błonowych z >E. coli, pierwotnej pompy protonowej bo 3-oksydazy i syntazy F1Fo ATP, w błonach pęcherzyków o różnych rozmiarach, od 0,1 do >10 mikronów, a także produkcję ATP przez ten łańcuch.

Wykorzystanie fuzogennych proteoliposomów o przeciwstawnych ładunkach do szybkiego dostarczania białek błonowych do docelowych błon dwuwarstwowych bez użycia detergentów obejmuje trzy kroki (Rysunek 1): A, tworzenie fuzogennych SUV z mieszanin lipidowych o wysokiej zawartości lipidów naładowanych; SUV te mogą opcjonalnie przenosić ładunek wewnątrz pęcherzyka; B, konwersja fuzogennych SUV w PL przy użyciu naszej metody szybkiej rekonstytucji białek błonowych; C, fuzja fuzogennych PL z docelowymi dwuwarstwami w środowisku o niskim zasoleniu, a następnie dodanie soli o wysokim stężeniu w celu zatrzymania reakcji fuzji. W przypadku dużych pęcherzyków (D), preferowaną strategią jest dostarczenie białka błonowego do anionowej dwuwarstwy docelowej, co zapewnia lepsze środowisko lipidowe dla aktywności białek błonowych (omówione szerzej w tekście).
Protokół tworzenia GUV metodą odwróconej emulsji został szczegółowo przedstawiony na Rysunku 2. W mieszaninie lipidowo-olejowej preferujemy stosowanie heksadekanu ze względu na jego stosunkowo wysoką (18 °C) temperaturę krzepnięcia, co umożliwia łatwe usunięcie zestalonego oleju po pelletowaniu GUV.
Rysunek 3 przedstawia fuzję pęcherzyków z wykorzystaniem metody kobalt-kalceina-EDTA. Fuzja jest obserwowana tylko wtedy, gdy stosowane są pęcherzyki o przeciwnych ładunkach w buforach o niskim zasoleniu, natomiast wyższe stężenia soli (&gt;50 mM14) lub użycie pęcherzyków niefuzogennych nie wykazują fuzji.
Ten szybki protokół rekonstytucji białek błonowych do fuzogennych SUV został przedstawiony na Rysunku 4A. Stosując ten protokół, demonstrujemy szybką rekonstytucję pierwotnej pompy protonowej bo3-oksydazy oraz syntazy ATP F1Fo do PL oraz ocenę ich aktywności specyficznej w tych błonach. Należy zaznaczyć, że wydajność rekonstytucji białek nie zależy od ładunku zastosowanego lipidu15 i wynosi około 50 - 75%25,12, a po rekonstytucji do PL białko może być przechowywane przez co najmniej trzy dni, nawet w temperaturze pokojowej, bez wyraźnej utraty aktywności białka. Procedura ta zapewnia również jednokierunkową orientację syntazy ATP, w której ponad 95% cząsteczek ma swoją hydrofilową domenę F1 zorientowaną na zewnątrz15,26.
Rysunek 5 pokazuje, że aktywność pompowania protonów F1Fo (Panel A) oraz bo3-oksydazy (Panel B) w lipidach kationowych jest zredukowana i wrażliwa na niską siłę jonową w porównaniu do środowiska lipidów anionowych i neutralnych, jednak efekt ten ulega złagodzeniu w membranach pofuzyjnych po fuzji PL+ z anionowymi LUV-.
Rysunek 6 przedstawia dostarczanie syntazy ATP F1Fo do błon dużych pęcherzyków. W tym doświadczeniu PL+ i 800 nm LUV- scalono w 20 mM KCl przez 5 min, a produkt reakcji odwirowano w celu usunięcia niescalonych PL+, po czym ponownie zawespiono i poddano analizie pod kątem pompowania protonów. Doświadczenia kontrolne nie wykazały pompowania protonów w przypadku użycia LUV0 zamiast LUV- w reakcji łączenia (linia czarna) lub analizy samych pustych LUV- (linia niebieska).
Szybki montaż funkcjonującego łańcucha transportu elektronów w błonach dużych pęcherzyków za pomocą fusogennych fosfolipidów (PL) przedstawiono na Rysunku 7. Do fuzji z LUV- o rozmiarze 800 nm wykorzystano SUV+ F1Fo oraz SUV+ bo3, a produkcję ATP przez ten łańcuch w pęcherzykach powstałych po fuzji wykazano poprzez sekwencyjne dodawanie koenzymu Q1 i DTT w celu zenergizowania błon, a następnie dodanie fosforanu w celu zainicjowania syntezy ATP przez F1Fo.
<img alt="Schemat procesu oddziaływań lipidowych z mechanizmami kationowymi i anionowymi, strukturami chemicznymi oraz etapami fuzji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Koncepcja ultraszybkiego dostarczania białek błonowych do docelowych dwuwarstw lipidowych bez użycia detergentów poprzez fuzję pęcherzyków jednowarstwowych utworzonych z lipidów o przeciwstawnych ładunkach. (A) tworzenie kationowych i anionowych fuzogennych małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUV+, SUV-), opcjonalnie załadowanych ładunkiem wewnątrz pęcherzykowym. (B) konwersja fuzogennych SUV w fuzogenne proteoliposomy (PL) poprzez rekonstytucję białek błonowych. (C) dostarczanie białek błonowych do błon po fuzji za pomocą fuzogennych PL bez użycia detergentów. (D) preferowana strategia dostarczania białek błonowych do błon dużych pęcherzyków, zilustrowana fuzją między PL+ o rozmiarze 100 nm a LUV- o rozmiarze 800 nm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu emulsji lipidowej z mieszaniną lipidów C16, emulsyfikacją, wirowaniem i wynikami GUV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Protokół tworzenia GUV z wykorzystaniem metody emulsji odwróconej. (A) Tworzenie monowarstwy lipidowej na granicy między mieszaniną olej-lipid a wodą. (B) Tworzenie emulsji odwróconej (woda w oleju). (C) Tworzenie GUV poprzez przeciskanie emulsji przez granicę olej-woda za pomocą wirowania. (D) Chłodzenie probówki poniżej &lt;18 °C w celu zestalenia i usunięcia oleju. (E) Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej GUV zawierającego fluorescencyjny lipid (1% ułamka wagowego cholesteryl-Bodipy-FL12) w błonie (zielony) oraz polarny fluorofor (1 mM Sulforhodamine 101) w świetle pęcherzyka (czerwony). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu fuzji pęcherzyków i wykres fluorescencji; analiza wpływu KCl na fuzję oraz roli EDTA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Badanie fuzji pęcherzyków lipidowych metodą kobalt-kalceina-EDTA. (A) Schemat metody, w której wolna kalceina jest uwalniana z niefluorescencyjnego kompleksu kobalt-kalceina przez EDTA. (B) Fuzja SUV w różnych stężeniach KCl. (C) Uwalnianie wewnątrz pęcherzykowej kalceiny poprzez dodanie EDTA i detergentu Triton X-100 do pęcherzyków po fuzji przedstawionych w B, zgodnie z opisem w tekście. Stopień fuzji (%) dla śladu czerwonego oblicza się, dzieląc maksymalny sygnał fuzji skorygowany o tło (1 - 2) przez maksymalny sygnał skorygowany o tło po uwolnieniu enkapsulowanej kalceiny (3 - 2) i mnożąc przez 100. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Tworzenie liposomów i test fluorescencyjny z białkami błonowymi. Schemat i wykres w badaniu naukowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Ultraszybka rekonstytucja bo3-oksydazy i F1Fo do fuzogennych proteoliposomów oraz pomiary aktywności białek w takich proteoliposomach. (A) Schemat protokołu rekonstytucji. (B) Pompowanie protonów napędzane utlenianiem koenzymu Q1 przez bo3-oksydazę w PL, mierzone za pomocą wygaszania ACMA (wyjaśniono w tekście). (C) Pompowanie protonów napędzane hydrolizą ATP przez F1Fo w PL, mierzone za pomocą wygaszania ACMA (wyjaśniono w tekście). (D) Hydroliza ATP przez F1Fo w PL, mierzona przy użyciu systemu regeneracji ATP (wyjaśniono w tekście), oraz jej stymulacja przez odsprzęgacz. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres kinetyki gaszenia lipidów, wpływ ATP/DTT na stany PL, analiza przejściowego pochłaniania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Wpływ środowiska lipidowego i siły jonowej na aktywność białek błonowych. Pompowanie protonów przez F1Fo (A) oraz oksydazę bo3 (B) w kationowych PL (linia czerwona), anionowych PL (linia niebieska), neutralnych PL (linia czarna) oraz kationowych PL połączonych z anionowymi LUV (linia zielona) w 20 i 100 mM KCl. Linia kontrolna (szara) nie wykazuje zmian w pompowaniu protonów przez F1Fo PL- po zmieszaniu z SUV-. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat fuzji błon i wykres wygaszania pokazujący proces fuzji pęcherzyków lipidowych oraz wyniki testu ACMA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Dostarczenie syntazy ATP F1Fo do błon 800 nm LUV- poprzez fuzję z PL+. (A) schemat eksperymentu: PL+ i 800 nm LUV- poddano fuzji w 1 mM MOPS (pH 7.4), 1 mM MgCl2, 20 mM KCl przez 5 min, odwirowano w celu usunięcia niefuzjowanych PL, a następnie zawieszono ponownie w tym samym buforze. (B) Pompowanie protonów przez LUV po fuzji (linia czerwona). Eksperymenty kontrolne nie wykazały wygaszania ACMA podczas mieszania PL0 z LUV- (linia czarna) ani podczas badania samych pustych LUV- (linia niebieska). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Synteza ATP poprzez gradient protonowy w liposomach; schemat i wykres wyników eksperymentu z lucyferazą." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56909/56909fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: 5-minutowy montaż łańcucha transportu elektronów w błonach LUV- 800 nm bez użycia detergentu poprzez fuzję z PL+. (A) schemat eksperymentu: PL+ F1Fo 100 nm oraz PL+ oksydazy bo3- 100 nm poddano fuzji z LUV-, zgodnie z opisem na Rysunku 6. Fuzję przerwano poprzez dodanie KCl i MOPS do stężeń odpowiednio 100 i 50 mM. Błony zmieszano z koktajlem ADP-lucyferyna-lucyferaza i aktywowano poprzez dodanie DTT i Q1, jak opisano w tekście. Produkcję ATP zainicjowano poprzez dodanie 1 mM fosforanu (Pi) i monitorowano w czasie rzeczywistym za pomocą systemu lucyferaza-lucyferyna, zgodnie z opisem w tekście. (B) Synteza ATP przez pęcherzyki po fuzji (linia czerwona). Eksperymenty kontrolne nie wykazały produkcji ATP, gdy PL+ zmieszano z LUV- w wysokim stężeniu soli (linia szara), lub gdy PL0 zmieszano z LUV- (linia czarna). Szybkość syntezy ATP obliczono zgodnie z wyjaśnieniami w tekście (kroki 8.8 - 8.9). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56909/56909fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy dwa ultraszybkie protokoły do rekonstytucji białek błonowych w fuzogenne proteoliposomy oraz fuzji takich proteoliposomów z docelowymi dwuwarstwami lipidowymi w celu bezdetergentowego dostarczania tych białek błonowych do dwuwarstwy pofuzyjnej. Połączenie tych podejść umożliwia szybki i łatwy w obsłudze montaż złożonych, wieloskładnikowych systemów membranowych.

Ultraszybka rekonstytucja białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych bez użycia fusogenicznych proteoliposomów naładowanych komplementarnie.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Ogólnym celem naszej łatwej do wdrożenia procedury jest zademonstrowanie szybkiego, bezdetergentowego dostarczania białek błonowych do dwuwarstw lipidowych o różnych rozmiarach przy użyciu fuzji między dwuwarstwami lipidowymi utworzonymi z przeciwnie naładowanych lipidów. Nasza metodologia może być stosowana w biochemii i biofizyce do jednoetapowego montażu wieloskładnikowych systemów dwuwarstwowych lipidów w metrycznych biomerach z poszczególnych warstw składników. Należy wspomnieć, że zaletą naszego podejścia jest szybka funkcjonalizacja, a mianowicie złożony model biliazy lipidowej, z białkami, lipidami i innymi interesującymi cząsteczkami.Metodologia ta może być również wykorzystana do badania procesów transportu błonowego, które wymagają energizacji błony lipidowej. Na przykład pompy pierwotne mogą być wykorzystywane do napędzania transportu wtórnego umożliwianego przez inne białka błonowe. Nasza metoda może również służyć na potrzeby biologii syntetycznej.Na przykład do tworzenia pęcherzyków błonowych o różnych funkcjach programu. W przyszłości uwięzienie małych pęcherzyków, takich jak te, wewnątrz podobnych, większych, może być krokiem w kierunku budowy sztucznej komórki. Aby utworzyć roztwór lipidów i oleju, wymieszaj bulion chloroformowy z jednym mililitrem heksadekanu w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej.Następnie, aby odparować chloroform, stale mieszaj i podgrzewaj mieszaninę w poziomej wytrząsarce w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 30 minut, pozostawiając otwartą rurkę. Po odparowaniu zamknij rurkę i ostudź do temperatury pokojowej. Następnie, aby utworzyć monowarstwę lipidową, na granicy faz wodnego buforu lipidowego w oleju, weź 1,5 mililitrową probówkę wirówkową i przenieś 200 mikrolitrów lipidów w roztworze oleju na 0,5 mililitra buforu B. Następnie odczekaj 30-60 minut w temperaturze pokojowej, aż granica separacji faz spłaszczy się, wskazując na tworzenie się monowarstwy lipidowej.Wypukły kształt granicy separacji faz wynika z niedopasowania napięcia powierzchniowego między olejem a buforem wodnym. Następnie, aby przygotować emulsję wodno-olejową, wymieszaj roztwór niejonowego polisacharydu w buforze B o gęstości wyższej niż woda. Następnie przenieś 0,5 mikrolitra mieszaniny do nowej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej, zawierającej 100 mikrolitrów lipidów w roztworze oleju.Następnie sonikuj mieszaninę z częstotliwością 44 kiloherców i 14 watów przez 30 sekund w ultradźwiękowej łaźni wodnej. Po sonikacji energicznie wiruj przez 45 minut, aby uformować wodę w emulsję olejową. Następnie, aby przekształcić emulsję wodno-olejową w anionowy GUV, ostrożnie przenieś emulsję na powierzchnię wodnego granicy faz lipidów i oleju.W emulsji każda kropla jest pokryta monowarstwą lipidową. Prawidłowa syndykacja wirowania wody w emulsji olejowej decyduje o powodzeniu powstawania GUV. Jeśli nie zostanie prawidłowo uformowana, kropla emulsji będzie się z kolei łączyć, zmniejszając wydajność tworzenia GUV.Aby uzyskać granulat GUV, należy szybko odwirować próbkę o sile 1000 razy G przez dwie minuty. Umieść wygięty metalowy drut w rurce tak, aby znajdował się w oleju. Następnie pozostaw probówkę na lodzie, aby zestalić mieszaninę lipidów i oleju.Ostrożnie usuń zamrożony olej i zbierz fazę wodną. Następnie ponownie zawiesić granulat GUV w 50 mikrolitrach świeżego buforu B i przenieść do nowej probówki. Sprawdź GUV pod obiektywem emersyjnym 100 X w mikroskopie fluorescencyjnym.Użyj żelowej żywicy filtracyjnej, aby przygotować kolumnę przepływu grawitacyjnego i wyrównać z buforem A utrzymywanym w temperaturze pokojowej. Następnie rozcieńczyć oczyszczone białko błonowe do końcowego stężenia 0,7 miligrama na mililitr za pomocą buforu ekstrakcyjnego. Następnie wymieszaj białko z wstępnie uformowanym kationowym SUV w stosunku od jednego do 30 wraz z kolatem zawierającym bufor A do końcowej objętości 660 mikrolitrów.Następnie umieść probówkę z próbką na kołysce i delikatnie potrząsaj mieszaniną przez 15 minut. Następnie przepuść mieszaninę przez żelową żywicę filtracyjną i zbierz mętne frakcje proteoliposomów i odwiruj pod ciśnieniem 4 000 razy G przez 15 minut. Następnie wyrzuć nieodtworzony supernatant białkowy i rozpuść osad w jednym mililitrze świeżego buforu A.In kuwecie fluorometrycznej, dodaj 20 mikrolitrów proteoliposomu z oksydazą B03 wraz z dwoma mililitrami buforu A w obecności 0,5 mikromolowego ACMA i poczekaj na stabilny sygnał przy wzbudzeniu 430 nanometrów i emisji 515 nanometrów.Następnie dodaj 40 mikromolów koenzymu Q1 do kuwety. Następnie dodaj dwa milimolowe DTT do proteoliposomu, aby rozpocząć pompowanie protonów, a następnie rozproszyć utworzone pH delta. W osobnej kuwecie dodaj 40 mikrolitrów proteoliposomów z F1-F0 do 2 mililitrów buforu A w obecności 0,5 mikromolowego ACMA i uruchom pompowanie protonów, dodając 0,2 milimolowego ATP do proteoliposomu, a następnie rozproszyć utworzone pH delta.Połącz 50 mikrolitrów PL+ z 50 mikrolitrami 800 nanometrów LUV-w jednym mililitrze buforu D, uzupełnionym jednym milimolem chlorku magnezu i 20 milimolowym chlorkiem potasu przez pięć minut. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 6 000 razy G przez pięć minut, aby zagnieździć LUV po fuzji. Po odwirowaniu odrzucić supernatant składający się z nieprzereagowanego PL+, a następnie ponownie zawiesić osad utworzony w jednym mililitrze buforu D, uzupełnionym jednym milimolowym chlorkiem magnezu i 100-milimolowym chlorkiem potasu.Ponownie przeprowadź test hartowania ACM. Najpierw wymieszaj ze sobą trzy mikrolitry oksydazy B03 PL + i pięć mikrolitrów F1F0 PL +, a następnie połącz mieszaninę z trzema mikrolitrami LUV lub GUV w 800 mikrolitrach w buforze D, uzupełnionymi 20 milimolowym chlorkiem potasu i jednym milimolowym chlorkiem magnezu przez pięć minut. Następnie dodaj chlorek potasu i bufor Mops do stopionej mieszaniny membranowej w końcowym stężeniu 150 milimolów.Wymieszaj 400 mikromolowych ADP, 50 mikromolowych lucyferyny i 2,5 lucyferazy w 200 mikrolitrach buforu A, aby przygotować koktajl ADP lucyferyny lucyferyny. Następnie dodaj koktajl do stopionej mieszanki membranowej. Dla prawidłowego pomiaru syntezy ADP ważne jest, aby mieć stabilny sygnał lucyferazy, aby uniknąć fałszywie dodatniego wyniku przed dodaniem Q1 i DTT.Następnie dodaj 40 mikromolowy utleniony koenzym Q1, a następnie dodaj dwa milimolowe DTT, aby zainicjować energetyzację stopionej membrany. Po jednej minucie dodaj pięciomilimolowy roztwór fosforanu potasu do energetyzowanych pęcherzyków, aby rozpocząć syntezę ATP. Do zbadania ponownie zawieszonego GUV po usunięciu zamrożonego heksadekanu z mieszaniny lipidów i oleju wykorzystano mikroskopię fluorescencyjną.Uzyskane obrazy GUV wskazują na obecność fluorescencyjnego cholesterolu biopoty FL12 na jego błonie oraz autoerdyminy 101, polarnego fluoroforu w świetle. Aby określić ilościowo fuzję SUV w rosnącym stężeniu chlorku potasu, sporządzono wykres. Wykres wyjaśnia, że wraz ze wzrostem stężenia chlorku potasu powyżej 50 milimoli fuzja pęcherzyków lipidowych SUV zaczyna się zmniejszać.Jednak przy niskim stężeniu chlorku potasu, od jednego do 20 milimolów, komplementarne naładowane pęcherzyki łączą się. Następnie, aby zmierzyć utlenianie koenzymu Q1 za pomocą oksydazy BO3 za pomocą pompowania protonów, wykonano wykres oparty na teście hartowania ACMA. Wyniki pokazują, że dodanie rozprzęgacza zwiększa sygnał fluorescencji ACMA reprezentowany wzdłuż osi Y wykresu.Następnie zmierzono również pompowanie protonów zależne od hydrolizy ATP przez F1F0 w oparciu o test hartowania ACMA. Na wykresie widać, że dodanie rozprzęgacza zwiększa sygnał fluorescencji AMCA. Co więcej, system lucyferazy lucyferyny wykorzystano do monitorowania syntezy ATP w połączonych pęcherzykach.Sekwencyjne dodawanie koenzymu Q1 DTT, a następnie dodawanie fosforanów, pokazuje pomyślną produkcję ATP przez stopione pęcherzyki. Po opanowaniu, pierwsza technika tworzenia fuzogennego proteoliposomu z detergentów symbolizowanych białkami błonowymi i zrostowymi miomedycznymi może być wykonana w zaledwie 30 minut. Druga technika, fuzja fizyczna, może być wykonana jeszcze szybciej w ciągu zaledwie dziesięciu minut.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób można konstruować wieloskładnikowe systemy błonowe, łącząc różne indywidualne elementy budulcowe, które są prezentowane przez funkcjonalizowane pęcherzyki lipidowe. Spodziewamy się takich modułowych systemów, w których główne właściwości i funkcje są niemożliwe do odtworzenia w jednym kroku białek błonowych. Ogólnie rzecz biorąc, nasze procedury zapewniają proste ramy do budowania złożonych, podzielonych na przedziały systemów biochemicznych, z prostszych, tak zwanych bio-cegiełek.

detergent-free-ultrafast-reconstitution-membrane-proteins-into-lipid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano procedury całkowitego odtworzenia prototypu kanału potasowego bramkowanego napięciem do błon lipidowych. Odtworzone kanały nadają się do testów biochemicznych, zapisów elektrycznych, badań przesiewowych ligandów i badań krystalograficznych elektronów. Metody te mogą mieć ogólne zastosowanie w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych innych białek błonowych.

Rekonstytucja kanału Kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania pojedynczych, zapośredniczonych przez SNARE zdarzeń fuzji między liposomami a wspieranymi dwuwarstwami w kanałach mikroprzepływowych za pomocą spolaryzowanego TIRFM, z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms. Uwalnianie lipidów i rozpuszczalnego ładunku może być wykrywane jednocześnie. Mierzy się wielkość liposomów, dyfuzyjność lipidów i właściwości porów fuzyjnych.

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

Liposomy zawierające amfifile jednołańcuchowe, szczególnie kwasy tłuszczowe, wykazują odmienne właściwości w porównaniu do tych zawierających diacylofosfolipidy ze względu na unikalne właściwości chemiczne amfifilów jednołańcuchowych. Tutaj opisujemy techniki przygotowania, oczyszczania i stosowania liposomów składających się z części lub całości tych amfifilów.

Przygotowanie, oczyszczanie i stosowanie liposomów zawierających kwasy tłuszczowe

Biologiczna fuzja błonowa jest katalizowana przez wyspecjalizowane białka fuzyjne. Pomiar właściwości fuzogennych białek można osiągnąć za pomocą testów mieszania lipidów. Przedstawiamy metodę oczyszczania rekombinowanej atlastyny Drosophila, białka pośredniczącego w homotypowej fuzji ER, odtwarzaniu go do wstępnie uformowanych liposomów i testowaniu zdolności fuzyjnej.

Rekonstytucja rekombinowanej Drosophila Atlastin w liposomach wspomagana detergentami do testów mieszających lipidy

Fuzja mitochondriów jest ważną reakcją homeostatyczną leżącą u podstaw dynamiki mitochondriów. Opisano tutaj system rekonstytucji in vitro do badania fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej, która może rozwiązać problem wiązania błony, dokowania, heminacji i otwierania porów. Omówiono wszechstronność tego podejścia w badaniu systemów błon komórkowych.

Modelowa platforma membranowa do odtwarzania dynamiki błon mitochondrialnych

Ten protokół wykorzystuje pęcznienie agarozy jako potężną i dającą się uogólnić technikę włączania integralnych białek błonowych (IMP) do gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków lipidowych (GUV), jak opisano tutaj dla rekonstytucji ludzkiego białka receptora serotoninowego 1A (5-HT1AR), jednej z klas farmakologicznie ważnych receptorów sprzężonych z białkiem G.

Budowa modelowych błon lipidowych zawierających receptory sprzężone z białkiem G (GPCR)

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Rekonstytucja bez komórek była kluczowym narzędziem do zrozumienia montażu cytoszkieletu, a prace w ostatniej dekadzie ustaliły podejścia do badania dynamiki septyny w systemach minimalnych. Przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach membranowych: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe.

Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Poznaj ultraszybką metodę rekonstytucji białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych bez detergentów. Technika umożliwia budowę złożonych systemów błonowych i sztucznych komórek.

Ultraszybka rekonstytucja białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych bez użycia fusogenicznych proteoliposomów naładowanych komplementarnie. (Wideo) | JoVE Journal

Ultraszybka rekonstytucja białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych bez użycia fusogenicznych proteoliposomów naładowanych komplementarnie.

Przeglądaj więcej filmów