$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Enzymy są katalizatorami biochemicznymi, które są niezbędne do życia. Testy enzymatyczne służą do badania właściwości kinetycznych reakcji enzymatycznych, wyjaśniając katalityczne działanie enzymów. W tym filmie omówiono kinetykę i testy enzymatyczne, omówiono ogólną procedurę i pokazano niektóre zastosowania.
Enzymy to białka, rzadziej RNA, które działają na określony reagent, zwany substratem. Enzym zmniejsza energię aktywacji potrzebną do zainicjowania reakcji biochemicznej, powodując, że reakcja zachodzi w szybszym tempie.
Reakcje enzymatyczne można podzielić na trzy podstawowe składniki. Pierwszym z nich jest tworzenie kompleksu enzym-substrat, powstającego w wyniku wiązania substratu z miejscem aktywnym enzymu. Kompleks może rozkładać się na swoje pierwotne składniki. Jest to druga elementarna reakcja. Alternatywnie, kompleks może utworzyć produkt i odzyskać enzym, trzecią reakcję elementarną.
Kinetyka reakcji elementarnej jest określona przez równanie prawa szybkości elementarnej. Równania prawa szybkości podają szybkość pod względem stężenia reagentów i stałą szybkości. Każda z reakcji elementarnych ma indywidualne równanie prawa szybkości, z własną stałą szybkości. Równania te można sprowadzić do modelu kinetycznego znanego jako równanie Michaelisa-Mentena. Daje to szybkość reakcji pod względem stężenia substratu; które można określić doświadczalnie. Niektóre ogólne trendy reakcji enzymatycznych można zidentyfikować za pomocą równania Michaelisa-Mentena. Przy wysokim stężeniu substratu osiągany jest punkt nasycenia, zwany Vmax. W tym przypadku szybkość jest ograniczona całkowitym stężeniem enzymu i liczbą cząsteczek substratu, które enzym przekształca w produkt w danym czasie, znanym również jako kcat. W kinetyce Michaelisa-Mentena kcat jest jedną z dwóch stałych rządzących szybkością reakcji. Druga stała, KM, jest znana jako stała powinowactwa. KM jest również równoważne stężeniu, w którym szybkość reakcji jest równoważna połowie Vmax . Enzym o wyższym powinowactwie będzie miał niższy KM i szybciej osiągnie Vmax, podczas gdy enzym o niższym powinowactwie będzie miał wyższy KM i zajmie więcej czasu, aby osiągnąć Vmax. Znajomość kcat i KM pozwala na porównywanie enzymów. Aby to zrobić, używamy współczynnika zwanego wydajnością enzymów. Wyższy kcat i niższy KM skutkują wyższą wydajnością, podczas gdy niższy kcat i wyższy KM skutkują niższym.
Czynniki używane do wyjaśnienia kinetyki enzymów muszą być określone doświadczalnie. Testy te są zwykle wykonywane przez zmieszanie roztworu enzymu i substratu w kontrolowanym środowisku. Obserwacje dokonuje się poprzez pomiar zmian stężenia substratu, produktu lub produktów ubocznych w odniesieniu do czasu.
Zmiana stężenia w czasie służy do określenia szybkości reakcji. W celu określenia kinetyki należy uzyskać dane dotyczące szybkości dla wielu stężeń. Jeśli wykres odwrotnej szybkości początkowej w funkcji odwrotnego stężenia początkowego, znany jako wykres Lineweavera-Burka, jest liniowy, to reakcja jest zgodna z kinetyką Michaelisa-Mentena. Nachylenie i punkt przecięcia linii pozwalają na wyznaczenie parametrów kinetycznych KM i Vmax, które można następnie wykorzystać do obliczenia kcat i wydajności enzymu.
Teraz, gdy zasady kinetyki enzymów zostały omówione, przyjrzyjmy się, jak przeprowadza się typowy test enzymatyczny.
W tej procedurze demonstrowany jest test kolorymetryczny. ? Pierwszym krokiem jest wygenerowanie krzywej wzorcowej, która skoreluje absorbancję ze stężeniem substratu. Roztwory o znanym stężeniu przygotowuje się wraz z próbką kontrolną. Roztwór wywoływacza, który reaguje z podłożem, jest dodawany w celu wytworzenia kolorowego związku. Absorbancja jest mierzona i wykreślana w stosunku do stężenia w celu wygenerowania krzywej wzorcowej.
Aby wykonać test, przygotowuje się znane stężenie substratu wraz z odpowiednią ilością enzymu. Enzym i substrat miesza się i pozostawia do inkubacji przez określony czas. pH i temperatura są kontrolowane za pomocą roztworów buforowych i bloków grzewczych. W celu zatrzymania reakcji dodaje się środek hartowniczy. Roztwór deweloperski jest następnie dodawany do reakcji i mieszany. Roztwory są następnie umieszczane w kuwetach i mierzona jest absorbancja. Ilość zużytego substratu określa się poprzez porównanie zmierzonej absorbancji z krzywą wzorcową. Na podstawie zebranych danych określa się początkowe szybkości reakcji poprzez wykreślenie stężenia w czasie. Na koniec, z danymi o dawce i stężeniu, tworzony jest wykres Michaelisa-Mentena. Pozwala to na określenie właściwości kinetycznych enzymu, takich jak liczba obrotów i wydajność enzymu.
Teraz, gdy dokonaliśmy przeglądu procedury testowej, przyjrzyjmy się innym sposobom wykonywania testów i ich zastosowaniom.
W tej procedurze analiza FRET służy do badania kinetyki proteazy hydrolizującej wiązanie peptydowe białka. Emisje te mogą być mierzone, co pozwala na ciągłą i ilościową analizę zużycia i produkcji substratów, pomagając w określeniu kinetyki reakcji.
Testy enzymatyczne mogą być wykorzystywane w naukach o środowisku do określania poziomów aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w środowisku. Wody, gleby i osady można zbierać ze środowiska i przetwarzać w laboratorium. Zewnątrzkomórkową aktywność enzymatyczną tych materiałów można następnie scharakteryzować za pomocą testów enzymatycznych. Jest to przydatne narzędzie do zrozumienia, w jaki sposób środowisko przetwarza materiał organiczny.
Mechanizm naprawy DNA w komórce można ocenić, badając kinetykę enzymów znajdujących się w jądrze. Szybkość, z jaką enzym usuwa zmiany lub uszkodzenia DNA, można zmierzyć za pomocą fluorescencyjnych latarni molekularnych, które fluoryzują tylko wtedy, gdy są związane z unikalnymi sekwencjami DNA. Poziom naprawy DNA można mierzyć w czasie rzeczywistym, wykrywając znakowane fluorescencyjnie produkty rozszczepienia.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat kinetyki enzymów i testów. W tym filmie wyjaśniono kinetykę enzymów, omówiono koncepcje testów, omówiono ogólną procedurę i opisano niektóre zastosowania.
Dzięki za oglądanie!
