Name: Mleko matki wspomaga wzrost enteroidów: model proliferacji komórek ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Poznaj metodę hodowli enteroidów z jelita myszy i człowieka oraz ekstrakcję mleka matki do badań proliferacji komórek in vitro. Model ten wspiera badania nad chorobami przewodu pokarmowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MG jest wspierane przez granty K08DK101608 i R03DK111473 z National Institutes of Health, March of Dimes Foundation Grant No. 5-FY17-79, Children's Discovery Institute of Washington University i St. Louis Children's Hospital oraz Department of Pediatrics at Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL jest wspierany przez R01DK104946 (PI: Silverman), Children's Discovery Institute of Washington University i St. Louis Children's Hospital.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Waszyngtońskiego w St. Louis (Protokół 20160187) lub Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Pittsburghu (Protokół 14103918). Jelito cienkie ludzkiego płodu w okresie krótszym niż 24 tygodnie ciąży uzyskano zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu w Pittsburghu dotyczącymi pobierania tkanek anatomicznych po zatwierdzeniu przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (protokół PRO14100537) z Banku Tkanek Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu w Pittsburghu za pośrednictwem uczciwego systemu brokerskiego. Zanonimizowane mleko matki lub pasteryzowane mleko matki od dawczyni uzyskano po uzyskaniu zgody Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej Uniwersytetu w Pittsburghu.
1. Izolacja krypty i tworzenie enteroidów od nowonarodzonych myszy lub przedwcześnie urodzonych ludzkich jelit cienkich
<ol>
	<li>Przygotowanie podłoża 
	UWAGA: Pożywkę należy przygotować w kapturze dzień przed izolacją krypty.
	<ol>
		<li>Przygotować 1,11 l pożywki hodowlanej. Zacznij od 1 l zmodyfikowanej pożywki Dulbecco's Eagle's Substrate (DMEM) z 4,5 g/l glukozy i L-glutaminą i dodaj 110 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (końcowe stężenie 10%), 11 ml penicyliny-streptomycyny (końcowe stężenie 1%) i 1,1 ml sterylnej insuliny (końcowe stężenie 0,1%).</li>
		<li>Przygotuj 500 ml mieszaniny PBS z antybiotykiem. Zacznij od 500 ml 1x buforowanej fosforanem soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS) z 10% FBS i dodaj 5 ml gentamycyny (stężenie końcowe 1%), 1 ml amfoterycyny B (stężenie końcowe 0,2%) i 5 ml penicyliny-streptomycyny (stężenie końcowe 1%).</li>
		<li>Przygotuj 30 ml pożywki do rozbijania komórek #1. Najpierw przygotuj 30 ml pożywki hodowlanej. Dodać 600 μl 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (stężenie końcowe 10 mM), 300 μl gentamycyny (stężenie końcowe 1%) i 60 μl amfoterycyny B (stężenie końcowe 0,2%).</li>
		<li>Przygotuj 30 ml pożywki do rozbijania komórek #2. Najpierw przygotuj 30 ml pożywki hodowlanej. Dodać 300 μl 0,5 M EDTA (stężenie końcowe 5 mM), 300 μl gentamycyny (stężenie końcowe 1%) i 60 μl amfoterycyny B (stężenie końcowe 0,2%).</li>
		<li>Przygotować 50 ml pożywki do hodowli krypt bez czynników wzrostu. Odmierz 33,4 ml 1x Advanced DMEM/F-12 i dodaj 10 ml FBS (stężenie końcowe 20%).
		<ol>
			<li>Dodać 500 μL penicyliny-streptomycyny (stężenie końcowe 1%), 500 μL L-glutaminy (stężenie końcowe 1%), 500 μL gentamycyny (stężenie końcowe 1%), 100 μL amfoterycyny B (stężenie końcowe 0,2%), 2,5 μL 1 M kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowego (HEPES) (stężenie końcowe 0,05 mM), 500 μL 100 mM N-acetylocysteiny (stężenie końcowe 1 mM), 500 μL 100x suplement N-2, 1 ml 50x suplement bez serum (np. B-27) bez witaminy A i 500 μl 1 mM 100x Y-27632.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować 1 ml pożywki do hodowli krypt z czynnikami wzrostu. Najpierw przygotuj 1 ml pożywki do hodowli krypt bez czynników wzrostu. Dodać 2,5 μl 40 μg/ml Wnt3a (stężenie końcowe 100 ng/mL), 1 μl 100 μg/mL Noggin (stężenie końcowe 100 ng/mL), 2 μl 250 μg/ml R-Spondyny (stężenie końcowe 500 ng/mL) i 0,5 μL 100 μg/mL EGF (stężenie końcowe 50 ng/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja krypty
	<ol>
		<li>Rozpuszczony ekstrakt z błony podstawnej (patrz Tabela materiałów) umieść na lodzie do rozmrożenia przed rozpoczęciem. 
		UWAGA: Utrzymuj membranę podstawną na lodzie, w przeciwnym razie ulegnie polimeryzacji.</li>
		<li>Zgodnie z protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt dla myszy w wieku powyżej 14 dni, należy poddać myszy eutanazji dwiema metodami, z których druga to procedura fizyczna mająca na celu zapewnienie śmierci. 
		UWAGA: W przypadku myszy poniżej 14 dnia życia dekapitacja jest standardową procedurą przy użyciu nożyczek.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek i kleszczy wykonaj pionowe nacięcie wzdłuż linii środkowej brzucha, przez skórę i otrzewną, na całej długości brzucha. Wyciąć jelito cienkie od żołądka do jelita ślepego nożyczkami i usunąć krezkę kleszczami. 
		UWAGA: Dwutygodniowe młode myszy płci męskiej i żeńskiej C57BL/6J, każde o wadze 5,5 - 7 g, wykorzystano do izolacji krypty. Do izolacji krypty można użyć myszy w dowolnym wieku i rozmiarze.</li>
		<li>Aby przygotować świeżo pobrane jelito cienkie do izolacji krypty, ustaw jelito prosto i przetnij jelito wzdłuż na całej jego długości za pomocą nożyczek. 
		UWAGA: Jelito myszy i człowieka można przygotować podobnie.</li>
		<li>Oczyść stolec z jelita, delikatnie potrząsając jelitem w przód iw tył na szalce Petriego wypełnionej mieszanką antybiotyków PBS za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Dodaj 30 ml pożywki do rozbijania komórek #1 do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Pokrój jelito na kawałki o długości 0,5 cm bezpośrednio do probówki. Umieść rurkę w wiaderku na lód i delikatnie mieszaj na wytrząsarce na najniższych obrotach przez 15 minut.</li>
		<li>Gdy tkanki znajdują się na wytrząsarce, uzyskaj 24- lub 48-dołkowe płytki do wyhodowania krypt, jeśli enteroidy mają być używane do izolacji RNA, DNA lub białka. Użyj 8-dołkowych szkiełek komorowych do hodowli krypt, jeśli enteroidy mają być używane do obrazowania konfokalnego całego wierzchowca.</li>
		<li>W kapturze dodaj 15 μl membrany podstawnej na dno każdej studzienki płytki 24- lub 48-dołkowej. W przypadku korzystania ze szkiełek komorowych dodaj 9 μl membrany podstawnej na dno każdej komory. 
		UWAGA: W razie potrzeby dostosuj objętość membrany podstawnej w zależności od rozmiaru płyty.</li>
		<li>Szybko rozprowadź membranę podstawną za pomocą końcówki pipety, tak aby membrana podstawna utworzyła cienką warstwę na dnie studni. Umieścić płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze na 30 minut, aby umożliwić polimeryzację błony podstawnej. 
		UWAGA: Krypty nie przyczepią się, jeśli membrana podstawna nie jest cienką warstwą lub jeśli membrana podstawna zawiera pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Po 15 minutach na wytrząsarce przefiltruj tkankę przez sitko o średnicy 100 μm. Odrzuć przepływ.</li>
		<li>Dodaj 30 ml pożywki do rozbijania komórek #2 do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wyjmij chusteczkę z sitka i dodaj do probówki.</li>
		<li>Umieść rurkę w wiaderku na lód i delikatnie mieszaj na wytrząsarce na najniższych obrotach przez 15 minut.</li>
		<li>Po 15 minutach na wytrząsarce przefiltruj tkankę przez sitko o średnicy 100 μm. Utrzymuj przepływ na tym etapie, na wypadek, gdyby wydajność była niska w późniejszych krokach. 
		UWAGA: Wszystkie rurki przepływające muszą być utrzymywane na lodzie.</li>
		<li>Dodaj 15 ml DMEM z 4,5 g/l glukozy i L-glutaminą do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wyjmij chusteczkę z sitka i dodaj do probówki. Energicznie potrząsaj rurką ręcznie przez 10 s. Przefiltrować przez sitko o średnicy 100 μm i zebrać przez nie przepływ. Powtarzaj, aż przepływ nie będzie zawierał żadnych cząstek stałych.</li>
		<li>W kapturze przefiltruj przepływ z poprzedniego etapu do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 ml za pomocą filtrów siatkowych 70 μm do tkanek myszy lub filtrów 100 μm do tkanek ludzkich. 
		UWAGA: Miej dodatkowe sitka w trybie gotowości i wlewaj powoli, ponieważ sitka zapchają się zanieczyszczeniami.</li>
		<li>Odwirować probówkę o sile 200 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C i umieścić bezpośrednio w pojemniku na lód w okapie. Usunąć supernatant pipetą, nie naruszając osadu. Ponownie zawiesić osad z całkowitą pożądaną ilością pożywki do hodowli krypt bez czynników wzrostu. 
		UWAGA: Wzbogacone krypty to "piaszczysta" warstwa granulki. Każda studzienka wymaga 250 μl pożywki do hodowli krypt bez czynników wzrostu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakładanie enteroidów
	<ol>
		<li>Umieść mieszaninę mediów kryptowych bezpośrednio na membranie podstawnej.</li>
		<li>Sprawdź krypty pod mikroskopem, aby upewnić się, że proces izolacji się powiódł. 
		UWAGA: Pożądane są komórki i kulki komórek. W każdym dołku znajduje się około 100 pojedynczych krypt.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 3 godziny, aby krypty mogły przylgnąć do błony podstawnej. 
		UWAGA: Ta inkubacja odbywa się z pożywkami Crypt Culture bez czynników wzrostu.</li>
		<li>Powoli usuń nośnik i nadmiar krypt, których nie udało się podłączyć za pomocą pipety P-200. 
		UWAGA: Nie naruszaj membrany podstawnej, ponieważ przymocowane krypty mogą się przemieścić.</li>
		<li>Powoli dodawaj 250 μl pożywki do hodowli krypt z czynnikami wzrostu do każdej studzienki. 
		UWAGA: W przypadku płytek 24-, 48-dołkowych lub szkiełek komorowych wystarczy 250 μl pożywki do hodowli krypt z czynnikami wzrostu.</li>
		<li>Wymieniaj pożywkę co 2 dni na świeże podłoża do hodowli krypt z czynnikami wzrostu na 5 dni przed zabiegami, aby umożliwić optymalne przywiązanie i wzrost.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kolekcja mleka matki myszy
<ol>
	<li>Matkę laktacyjną C57BL/6J należy oddzielić od jej młodych w wieku 7 - 12 dni od jej szczeniąt na 6 godzin przed udojem.</li>
	<li>Znieczulić matkę laktacyjną izofluranem przez stożek nosowy i podać podskórnie wstrzyknięcie oksytocyny w stężeniu 0,15 j.m./kg masy ciała. Odczekaj 3 minuty przed przystąpieniem do procedury doju.</li>
	<li>Przed zabiegiem udojowym oczyść strzyki 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia.</li>
	<li>Pobieraj mleko ze smoczków pojedynczo za pomocą elektrycznego laktatora z silikonową rurką o rozmiarze pasującym do smoczków myszy w probówce o pojemności 5 ml. 
	UWAGA: Laktatory optymalne mają dwa ustawienia, jedno dla prędkości i jedno dla ssania. Najlepiej zacząć od najniższych ustawień każdego z nich i powoli zwiększać, aż mleko zostanie wyekstrahowane. Idealnie, całkowita wydajność wyniesie ~ 500 μL - 1 ml mleka matki myszy na matkę karmiącą.</li>
	<li>Natychmiast przelać mleko matki i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Unikaj cykli zamrażania/rozmrażania.</li>
	<li>Leczyć enteroidy w dniu 5 dawką 50 μl/ml mleka matki myszy na ml pożywki Crypt Culture z czynnikami wzrostu przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
3. Barwienie całego wierzchowca enteroidów
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynników
	<ol>
		<li>Przygotuj 16 ml 1x PBS na 8 dołków.</li>
		<li>Przygotować 2 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS na 8 dołków.</li>
		<li>Przygotuj 2 ml 0,1% Triton X-100 w 1x PBS na 8 dołków.</li>
		<li>Przygotuj 24 ml PBS Tween (PBST to 0,1% Tween 20 w 1x PBS) na 8 dołków.</li>
		<li>Przygotuj 2 ml 10% normalnej surowicy osła (NDS) w 0,1% PBST (10% NDS/PBST) na 8 dołków.</li>
		<li>Przygotować 4 ml 1% NDS w 0,1% PBST (1% NDS/PBST) na 8 dołków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie Dzień 1
	<ol>
		<li>Odessać leki i przemyć enteroidy PBS. Dodać 250 μl 4% PFA na studzienkę. Umieścić na rotatorze na 1 - 2 godziny w temperaturze 4 °C. Usunąć 4% PFA za pomocą pipety.</li>
		<li>Przemyć 4 razy 250 μL/studzienkę 1x PBS. Umieścić na rotatorze na 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). 
		UWAGA: W razie potrzeby możliwe jest przechowywanie płytki przez 1 - 2 dni w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodać 250 μl/basenik 0,1% Triton X-100. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Usunąć 0,1% Triton X-100 za pomocą pipety.</li>
		<li>Przemyć 4 razy 250 μL/studzienkę 1x PBS. Umieść na rotatorze na 15 minut w temperaturze RT.</li>
		<li>Dodać 250 μl/basenik 10% NDS/PBST. Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć 10% NDS/PBST za pomocą pipety.</li>
		<li>Dodać 250 μl/basenik przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczonego w stosunku 1/250 w 1% NDS/PBST i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Optymalne rozcieńczenie przeciwciał różni się w zależności od producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie Dzień 2
	<ol>
		<li>Myć co najmniej 5 razy przez 4 - 5 godzin 250 μl/studzienkę PBST. Umieszczać na rotatorze w temperaturze 4 °C między każdym praniem.</li>
		<li>Dodać 250 μl / basenik przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczonego 1/1,000 w 1% NDS/PBST. Zawinąć płytkę w folię i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie Dzień 3
	<ol>
		<li>Dodać 250 μl/studzienkę barwienia jądrowego 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) przez 15 minut 
		UWAGA: Trzymaj płytę w ciemności.</li>
		<li>Przemyć 6 razy 250 μl/studzienkę PBST. Umieścić na rotatorze na 10 minut w temperaturze 4 °C między każdym praniem.</li>
		<li>Zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku komory z nośnikiem montażowym.</li>
		<li>Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 40X i równomiernie renderuj je w edytorze grafiki rastrowej (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Patel, R. M., Denning, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+use+of+prebiotics%2C+probiotics%2C+and+postbiotics+to+prevent+necrotizing+enterocolitis%3A+what+is+the+current+evidence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence?</a> Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).</li>
<li>Caplan, M. S., Jilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pediatr%22%5BJournal%5D)">New concepts in necrotizing enterocolitis.</a> Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).</li>
<li>Henry, M. C., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Necrotizing enterocolitis.</a> Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).</li>
<li>Lin, P. W., Stoll, B. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17027734">Necrotising enterocolitis.</a> Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).</li>
<li>Neu, J., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Necrotizing enterocolitis.</a> N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).</li>
<li>Bartick, M., Reinhold, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burden+of+suboptimal+breastfeeding+in+the+United+States%3A+a+pediatric+cost+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis.</a> Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).</li>
<li>Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+necrotizing+enterocolitis+on+length+of+stay+and+hospital+charges+in+very+low+birth+weight+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants.</a> Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).</li>
<li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li>
<li>Gribar, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+expression+and+signaling+of+TLR4+and+TLR9+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis.</a> J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).</li>
<li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+fluid+inhibits+Toll-like+receptor+4+signaling+in+the+fetal+and+neonatal+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).</li>
<li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+milk+protects+against+the+development+of+necrotizing+enterocolitis+through+inhibition+of+Toll-like+receptor+4+in+the+intestinal+epithelium+via+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).</li>
<li>Yazji, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TLR4+activation+impairs+intestinal+microcirculatory+perfusion+in+necrotizing+enterocolitis+via+eNOS-NO-nitrite+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).</li>
<li>Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+glutamine+supplemented+parenteral+nutrition+on+the+incidence+of+necrotizing+enterocolitis%2C+nosocomial+sepsis+and+length+of+hospital+stay+in+very+low+birth+weight+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Wieku+Rozwoj%22%5BJournal%5D)">Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants.</a> Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+decreases+lipopolysaccharide-induced+intestinal+inflammation+in+infant+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).</li>
<li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+milk+oligosaccharide+2%27-fucosyllactose+attenuates+the+severity+of+experimental+necrotising+enterocolitis+by+enhancing+mesenteric+perfusion+in+the+neonatal+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nutr%22%5BJournal%5D)">The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine.</a> Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).</li>
<li>Jantscher-Krenn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+milk+oligosaccharide+disialyllacto-N-tetraose+prevents+necrotising+enterocolitis+in+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats.</a> Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).</li>
<li>Akin, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+lactoferrin+to+prevent+nosocomial+sepsis+and+necrotizing+enterocolitis+of+premature+neonates+and+effect+on+T-regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells.</a> Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).</li>
<li>Amin, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+supplementation+prevents+necrotizing+enterocolitis+in+the+premature+infant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant.</a> J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).</li>
<li>Rodgers, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+aspects+of+milk+collection+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Practical aspects of milk collection in the rat.</a> Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).</li>
<li>DePeters, E. J., Hovey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+collecting+milk+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Methods for collecting milk from mice.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).</li>
<li>Willingham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milk+collection+methods+for+mice+and+Reeves%27+muntjac+deer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Intestinal+Enteroids%3A+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection%2C+Host+Restriction%2C+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Enteroids%2FColonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li>
<li>Drummond, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroviruses+infect+human+enteroids+and+induce+antiviral+signaling+in+a+cell+lineage-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).</li>
<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie mają konfliktu interesów.

Nabłonek jelitowy składa się z wielu podtypów komórkowych, które są odpowiedzialne za zapewnienie obrony gospodarza przed patogenami, utrzymanie integralności bariery jelitowej i mogą zostać naruszone w patogenezie kilku chorób. Podczas gdy modele zwierzęce mogą podsumować niektóre aspekty choroby, model ex vivo enteroidów pochodzących z jelita cienkiego myszy i ludzi stanowi platformę do testowania efektów różnych metod leczenia. Znaczenie modelu enteroidalnego pozwala naukowcom hodować i różnicować jelitowe ko...

Martwicze zapalenie jelit (NEC) jest główną przyczyną zgonów z powodu chorób przewodu pokarmowego u wcześniaków, dotykając prawie 1 na 10 niemowląt urodzonych przed 29 tygodniem ciąży1,2,3. Połowa niemowląt z NEC przechodzi do najcięższej postaci, w której przeżywalność wynosi tylko 10 - 30%4,5. Szacuje się, że w Stanach Zjednoczonych na leczenie niemowląt NEC6,7 wydaje się na leczenie niemowląt za pomocą NECsup class="xref"7, jednak ani wskaźnik przeżywalności, ani terapia nie zmieniły się w ciągu ostatnich 30 lat. Patogeneza NEC charakteryzuje się uszkodzeniem jelit i upośledzonym gojeniem błony śluzowej8,9,10,11, jednak szlaki sygnałowe prowadzące do zaostrzenia odpowiedzi zapalnej i mechanizmy odwracania stanu zapalnego pozostają nie w pełni poznane.
Stwierdzono, że podawanie mleka matki jest jedyną strategią ochrony przed NEC u wcześniaków. Wcześniej wykazaliśmy, że mleko matki chroni przed rozwojem NEC poprzez hamowanie wrodzonego receptora immunologicznego toll-like receptor 4 (TLR4) w nabłonku jelitowym poprzez szlak sygnałowy receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR)11. Suplementacja mleka matki eksperymentalną formułą NEC osłabiła odpowiedź zapalną obserwowaną w NEC, czego dowodem jest hamowanie apoptozy enterocytów i przywrócenie proliferacji enterocytów w sposób zależny od naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i EGFR11. W innym badaniu wykazano, że azotany, inny składnik mleka matki, przyczyniają się do jego ochronnego charakteru poprzez modulowanie perfuzji jelitowej, w porównaniu z mlekiem modyfikowanym dla niemowląt, w którym brakuje azotanów i mogą przyczyniać się do zwiększonej częstości występowania NEC u niemowląt karmionych mlekiem modyfikowanym12,13. Inne związki obecne w mleku matki, które, jak wykazano, biorą udział w ochronie przed NEC, to oligosacharydy mleka ludzkiego, L-arginina, glutamina i laktoferyna14,15,16,17,18,19. Te korzystne elementy mleka matki ujawniają konieczność jego stosowania w profilaktyce NEC, ale także podkreślają znaczenie badania mechanizmów, szlaków sygnałowych i efektów komórkowych zaangażowanych w sposób, w jaki mleko matki pośredniczy w ochronie przed NEC.
W celu dalszego badania właściwości ochronnych mleka matki w mysim modelu NEC, opracowaliśmy nową, łatwą w użyciu technikę, dzięki której mleko matki myszy może być pobierane ze znieczulonej matki za pomocą elektrycznego laktatora ludzkiego11,12. Ta strategia pozyskiwania mleka matki myszy jest korzystna nie tylko dlatego, że laktatory są łatwo dostępne i skuteczne w pozyskiwaniu mleka matki, ale także dlatego, że metoda ta pozwala na analizę mleka matki specyficzną dla danego gatunku. W rezultacie możemy porównać wpływ mleka matki myszy z odciągniętym mlekiem matki, a także pasteryzowanym mlekiem dawczyni z banku mleka w modelach specyficznych dla gatunku. Technika ta pozwala na badanie składników mleka matki w odniesieniu do ich wkładu w profilaktykę NEC. Inni badacze opracowali metody ekstrakcji mleka matki, jednak techniki te są ręczne i zazwyczaj wymagają więcej niż jednego członka laboratorium20,21,22. Tutaj przedstawiono prostą technikę, którą można wykorzystać, modyfikując ludzki laktator elektryczny w celu pobrania mleka od myszy. Technikę tę można również zastosować do innych gatunków.
Aby odpowiednio zbadać szlaki sygnałowe związane z NEC, potrzebne są systemy modelowe, które ocenią wszystkie typy komórek, o których wiadomo, że są dotknięte procesem chorobowym. W tym miejscu omawiamy jeden z takich układów modelowych - enteroidy - i ich powstanie z mysiego i ludzkiego jelita cienkiego. Ludzkie enteroidy jelitowe (HIEs) są szczególnie obiecujące, ponieważ oferują innowacyjny, genetycznie zróżnicowany model człowieka ex vivo, który pomaga w badaniu procesów patofizjologicznych zachodzących w przewodzie pokarmowym23. Stwierdzono, że enteroidy są hodowane długoterminowo i mogą być zamrażane do późniejszego wykorzystania23, i w przeciwieństwie do ludzkich organoidów jelitowych (HIO), których kultury są rozwijane z indukowalnych pluripotencjalnych komórek macierzystych, enteroidy są generowane z komórek macierzystych w izolowanych kryptach jelitowych24. Enteroidy wymagają mniej konserwacji, mogą być szybko zainfekowane25 i można je łatwo ustalić, ponieważ krypty jelitowe są bardziej zróżnicowane niż HIOs23. W związku z tym HIE oferują wiele zalet w porównaniu z istniejącymi technikami, ponieważ mogą być rozwijane tak, aby wykazywały specyficzne dla regionu właściwości składowe i funkcjonalne ludzkiego nabłonka przewodu pokarmowego23. Stosowanie enteroidów jest bardzo skutecznym wyborem, gdy potrzebny jest ludzki model jelita, z zachowaniem ograniczeń specyficznych dla regionu i łatwością użycia. Tutaj demonstrujemy technikę izolowania i utrzymywania pierwotnych enteroidów jelita cienkiego pochodzących z komórek macierzystych od myszy i wcześniaków.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) z 4,5 g/l glukozy i L-glutaminą</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humulin N (Insulina)</td> <td>Eli Lilly And Company</td><td>0002-8315</td><td></td></tr><tr><td>1x Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco ( DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1x Zaawansowany DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>1 M Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>100x Suplement N-2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>50x B-27 Suplement Minus Witamina A</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>100x Inhibitor ROCK Y-27632, Dichlorowodorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane białko myszy Wnt3a R</td><td>& D Systems</td><td>1324-WN</td><td></td></tr><tr><td>Mysz mysia Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Mysz rekombinowana R-Spondin 1</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Zredukowana matryca błony podstawnej</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Hodowla komórkowa</td><td>Szalka Petriego Eppendorf</td><td>0030700112</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Eppendorf</td><td>0030722116</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowa komórka Płytka hodowlana</td><td>Eppendorf</td><td>0030723112</td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowy system szkiełek komorowych Nunc Lab-Tek II</td><td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Rurka stożkowa</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; M Sterylne sitko komórkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; M Sterylne sitko komórkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,2</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyd (PFA)</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Normalny osioł Surowica (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek (DAPI)</td>Szkło pokrywowe <td>mikroskopu Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Leica TCS SP8 X</td><td>Leica Microsystems</td><td>Nie</td><td></td></tr> dotyczy <tr><td>Photoshop CS6</td><td>Adobe Systems</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>18 G 1,5-calowa igła</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Oxytocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3251</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki podwójny laktator elektryczny</td><td>Lansinoh</td><td>044677530163</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Probówka z okrągłym dnem</td><td>Corning</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Gumowe korki</td><td>Frey Scientific</td><td>560761</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Ki67</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki starter Mki67 F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'Zintegrowane</td> <td>technologie DNA</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr></tbody></table>

mleko matki wspomaga wzrost enteroidów: model proliferacji komórek ex vivo

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Ludzkie enteroidy jelita cienkiego pochodzą z krypt i gdy są hodowane w niszy komórek macierzystych, zawierają wszystkie typy komórek nabłonkowych. Zdolność do tworzenia ludzkich enteroidalnych systemów hodowli ex vivo jest ważna dla modelowania patofizjologii jelit i badania konkretnych zaangażowanych reakcji komórkowych. W ostatnich latach enteroidy od myszy i ludzi są hodowane, pasażowane i odkładane do wykorzystania w przyszłości w kilku laboratoriach na całym świecie. Ta platforma enteroidalna może być wykorzystana do testowania efektów różnych zabiegów i leków oraz jaki wpływ wywiera się na różne typy komórek w jelicie. W tym miejscu przedstawiono protokół ustalania pierwotnych enteroidów jelita cienkiego pochodzących z komórek macierzystych pochodzących od nowonarodzonych myszy i przedwcześnie urodzonych w jelicie ludzkim. Co więcej, ten system hodowli enteroidów został wykorzystany do przetestowania wpływu mleka matki specyficznego dla danego gatunku. Mleko matki myszy można skutecznie uzyskać za pomocą zmodyfikowanego laktatora ludzkiego, a odciągnięte mleko myszy można następnie wykorzystać do dalszych eksperymentów badawczych. Wykazujemy teraz wpływ odciągniętego mleka matki myszy, człowieka i dawczyni na wzrost i proliferację enteroidów pochodzących od nowonarodzonych myszy lub wcześniaków ludzkiego jelita cienkiego.

W pierwszej kolejności postanowiliśmy zbadać, czy odciągnięte ludzkie mleko matki lub pasteryzowane mleko matki od dawczyni wpływa na enteroidy jelita cienkiego. Rzeczywiście, ludzkie mleko matki oraz mleko matki od dawczyni zwiększyły wzrost enteroidów pochodzących od noworodków myszy (Ryc. 1A) oraz od przedwcześnie urodzonych ludzi (Ryc. 1B).
Ponieważ ludzkie mleko ko...

Ten protokół opisuje, jak stworzyć system hodowli enteroidów z noworodków myszy lub przedwcześnie urodzonych ludzi z jelita ludzkiego, a także skuteczną metodę pobierania mleka od myszy.

Mleko matki wspomaga wzrost enteroidów: model proliferacji komórek ex vivo

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Ogólnym celem tej procedury jest hodowla miniaturowych jelit, zwanych enteroidami, w laboratorium. Enteroidy są leczone mlekiem matki myszy ekstrahowanym w laboratorium w celu wyjaśnienia wpływu mleka matki na proliferację in vitro. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z różnymi chorobami przewodu pokarmowego, takimi jak martwicze zapalenie jelit, które dotyka wcześniaki.Główną zaletą tej techniki jest to, że enteroidy wymagają niewielkiej konserwacji, można je szybko ustalić i wykazują wiele właściwości funkcjonalnych nabłonka przewodu pokarmowego. Ta technika tworzenia enteroidów jest wysoce skutecznym modelem ludzkiego jelita cienkiego. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w jelito cienkie, może być również stosowana do innych układów narządów w innych regionach przewodu pokarmowego.Na początek rozmrozić rozpuszczony ekstrakt z błony podstawnej na lodzie. Następnie użyj nożyczek i kleszczy, aby wykonać pionowe nacięcie wzdłuż całej linii środkowej brzucha myszy poddanej eutanazji. Za pomocą kleszczy wytnij jelito cienkie i usuń krezkę.Aby przygotować jelito cienkie do izolacji krypty i stworzenia enteroidu, ustaw jelito prosto i nożyczkami przeciąć wzdłużnie na całej jego długości. Usuń stolec, delikatnie potrząsając jelitem kleszczami na szalce Petriego wypełnionej mieszaniną antybiotyków PBS. Następnie dodaj 30 mililitrów pożywki rozbijającej komórki numer jeden do 50-mililitrowej stożkowej probówki.Umieść półcentymetrowe segmenty jelita w probówce i umieść rurkę w wiaderku na lodzie na shakerze. W okapie dodaj 9 mikrolitrów membrany podstawnej na dno każdej studzienki w szkiełku z ośmioma dołkami. Szybko rozprowadź membranę za pomocą końcówki pipety i pozwól błonie podstawnej na polimeryzację w inkubatorze.Ważne jest, aby szybko rozprowadzić membranę podstawną, aby utworzyła cienką warstwę na dnie studni. Krypty nie przyczepią się, jeśli obecne są pęcherzyki powietrza lub jeśli membrana podstawna jest zbyt gruba. Po wymieszaniu stożkowej rurki użyj sitka o średnicy 100 mikrometrów, aby przefiltrować tkankę membrany i wyrzucić przepływ.Dodaj 30 mililitrów pożywki do rozbijania komórek numer dwa do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki, a następnie dodaj tkankę jelitową do probówki. Po mieszaniu probówki przez 15 minut przefiltruj tkankę przez sitko o średnicy 100 mikrometrów. Zachowaj przepływ z tego kroku.Dodaj 15 mililitrów TMEM z 4,5 grama glukozy i L-glutaminą na litr do nowej stożkowej probówki. Usuń tkankę z sitka o średnicy 100 mikrometrów i dodaj ją do nowej stożkowej probówki. Następnie ręcznie potrząsaj probówką przez 10 sekund i przefiltruj przez sitko o średnicy 100 mikrometrów.W kapturze użyj sitka o średnicy 70 mikrometrów, aby przefiltrować tkankę do nowej stożkowej rurki. Po odwirowaniu probówki przez 8 minut umieść ją w wiaderku na lód w okapie. Za pomocą pipety ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania utworzonego osadu.Ponownie zawiesić osad z odpowiednią ilością pożywki do hodowli krypto bez czynników wzrostu. Po inkubacji szkiełka komorowego przez 30 minut, mieszaninę pożywki kryptowej należy umieścić bezpośrednio na membranie podstawnej i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 3 godziny, podczas gdy krypty przylegają. Po okresie inkubacji użyj pipety P200, aby ostrożnie usunąć wszelkie nośniki i niepodłączone krypty.Kolejnym krytycznym krokiem jest powolne usuwanie nośników i nadmiaru krypt, których nie udało się podłączyć za pomocą pipety P200. Nie naruszaj membrany podstawnej, ponieważ przymocowane krypty mogą się przemieścić. Powoli dodaj 250 mikrolitrów pożywki do hodowli krypt z czynnikami wzrostu do każdej studzienki.Znieczulić matkę laktacyjną izofluranem podawanym przez stożek nosowy i podać odpowiednią dawkę podskórnej oksytocyny. Oczyść strzyki 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia przed rozpoczęciem procedury doju. Używając elektrycznego laktatora wyposażonego w silikonową rurkę dopasowaną do myszy i rurkę o pojemności 5 mililitrów, odciągaj mleko ze strzyków pojedynczo.Na koniec natychmiast podlej mleko i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Traktuj enteroidy w piątym dniu przechowywanym mlekiem matki myszy przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W pierwszym dniu barwienia użyj PBS, aby usunąć eksperymentalne zabiegi i umyć enteroidy.Dodaj 250 mikrolitrów 4% PFA do każdej studzienki i umieść szkiełko na rotatorze na 1 do 2 godzin w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Użyj pipety, aby usunąć PFA, a następnie delikatnie umyj każdą studzienkę cztery razy 250 mikrolitrami PBS. Umieść szkiełko komory na rotatorze na 10 minut w temperaturze pokojowej.Dodaj 250 mikrolitrów 0,1% Triton X-100 do każdej studzienki i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji wyjąć Triton X-100 za pomocą pipety i przemyć cztery razy 250 mikrolitrami PBS w każdym dołku. Umieść szkiełko na rotatorze na 15 minut w temperaturze pokojowej.Dodaj 250 mikrolitrów 10% NDS/PBST do każdej studzienki i inkubuj przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji usunąć NDS/PBST za pomocą pipety. Na koniec dodaj 250 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego do każdej studzienki i inkubuj przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.W drugim dniu barwienia umyj każdą studzienkę co najmniej pięć razy 250 mikrolitrami PBST i umieść szkiełko na rotatorze w temperaturze 4 stopni Celsjusza między każdym praniem. Dodaj 250 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego w 1% NDS / PBST do każdej studzienki. Zawiń szkiełko w folię i inkubuj przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.W ostatnim dniu barwienia dodaj 250 mikrolitrów barwionego jądrowo DAPI do każdej studzienki i pozostaw na 15 minut. Następnie umyj każdą studzienkę sześć razy 250 mikrolitrami PBST. Umieść szkiełko na rotatorze na 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza między każdym praniem.Na koniec przygotuj szkiełko do obrazowania mikroskopowego, montując szkiełko nakrywkowe na szkiełku komorowym z mediami montażowymi i pozostawiając do wyschnięcia na 24 godziny. W tym badaniu enteroidy jelita cienkiego pochodzące od nowonarodzonych myszy traktowano mlekiem matki pobranym od myszy karmiących. Jak pokazano na tym rysunku, mleko matki myszy zwiększało proliferację w enteroidach myszy.Aby zbadać specyficzny dla gatunku wpływ mleka matki, mleko matki i pasteryzowane mleko dawcy zastosowano również do enteroidów myszy. Jak pokazano na tym rysunku, mleko ludzkie i pasteryzowane dawczynie zwiększało proliferację enteroidów myszy. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby krypty były zamrożone podczas etapów izolacji.Powoli i delikatnie wykonuj wszystkie metody po tym, jak enteroidy znajdą się w hodowli. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak leczenie komórkami odpornościowymi, mikrobiotą lub różnymi lekami, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, aby lepiej podsumować mikrośrodowisko jelita. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować, leczyć i przeprowadzać immunofluorescencję na enteroidach.Ponadto powinnaś być w stanie skutecznie wydobyć mleko matki od myszy w okresie laktacji. Nie zapominaj, że praca z ludzkimi tkankami i płynami ustrojowymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tych zabiegów należy zawsze nosić środki ochrony osobistej.

breast-milk-enhances-growth-enteroids-an-ex-vivo-model-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.

Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

Enteroidy wyłaniają się jako nowy model w badaniach nad chorobami ludzkimi. Protokół opisuje, w jaki sposób symulować enteroidalny model ludzkiego martwiczego zapalenia jelit za pomocą leczenia lipopolisacharydami (LPS) enteroidów generowanych z tkanki noworodka. Pobrane enteroidy wykazują zmiany zapalne podobne do tych obserwowanych w ludzkim martwiczym zapaleniu jelit.

Nowy ludzki nabłonkowy enteroidalny model martwiczego zapalenia jelit

Organoidy powstałe z mysich gruczołów sutkowych zostały napromieniowane i scharakteryzowane w celu oceny cech nabłonka i interakcji z komórkami odpornościowymi. Napromieniowane organoidy można wykorzystać do lepszej oceny interakcji komórka-komórka, które mogą prowadzić do rekrutacji komórek nowotworowych w napromieniowanej normalnej tkance.

Wzrost i charakterystyka napromieniowanych organoidów z gruczołów sutkowych

Prezentowany protokół wykorzystuje cytometrię przepływową do ilościowego określenia liczby proliferujących i martwych komórek w hodowanych enteroidach myszy. Metoda ta jest pomocna w ocenie wpływu leczenia farmakologicznego na proliferację organoidów i przeżycie.

Kwantyfikacja komórek proliferacyjnych i martwych w enteroidach

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych narzędzi in vitro do oceny transformacji ludzkich komórek sutkowych. Opisano szczegółowe kroki monitorowania tempa proliferacji komórek, zdolności wzrostu niezależnej od zakotwiczenia i dystrybucji linii komórkowych w kulturach 3D z macierzą błony podstawnej.

Ocena in vitro transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka

Wzajemne oddziaływanie między komórkami nabłonka sutka a komórkami śródbłonka przyczynia się do progresji raka piersi, wzrostu guza i przerzutów. W tym badaniu sferoidy zostały wykonane z komórek raka piersi wraz z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych i/lub limfatycznych i wykazują ich przydatność jako systemu in vitro do badań nad rakiem piersi.

Sferoidy komórek nabłonka i śródbłonka sutka jako potencjalny funkcjonalny model in vitro do badań nad rakiem piersi

Ten protokół opisuje model wierzchołkowego martwiczego zapalenia jelit (NEC) w naczyniu, wykorzystujący enteroidy jelita cienkiego z odwróconą polaryzacją, umożliwiającą dostęp do powierzchni wierzchołkowej. Zapewniamy protokół barwienia immunofluorescencyjnego w celu wykrycia przerwania nabłonka związanego z NEC oraz metodę określania żywotności enteroidów wierzchołkowych poddanych protokołowi NEC-in-a-dish.

In vitro Wierzchołkowy model enteroidalny martwiczego zapalenia jelit

Ten protokół szczegółowo opisuje tworzenie enteroidów, trójwymiarowego modelu jelitowego, z tkanki jelitowej płodu. Do charakterystyki modelu wykorzystano obrazowanie immunofluorescencyjne biomarkerów nabłonkowych. Wierzchołkowa ekspozycja lipopolisacharydów, endotoksyny bakteryjnej, przy użyciu techniki mikroiniekcji indukowała przepuszczalność nabłonka w sposób zależny od dawki, mierzoną przez wyciek dekstranu fluorescencyjnego.

Badanie przepuszczalności nabłonka w enteroidach pochodzących z tkanek płodowych

Enteroidy pojawiają się jako nowy model do badania fizjologii i patofizjologii tkanek, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. W tym miejscu opisujemy system hodowli 2D enteroidów pochodzących z komórek pierwotnych bydła, który umożliwia kohodowlę z odpowiednimi typami komórek tkankowych. Model ten oferuje przewagę translacyjną w modelowaniu badań żołądkowo-jelitowych.

Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych

Obecne badanie przedstawia łatwiejszy, oszczędzający czas i ekonomiczny protokół efektywnego izolowania i hodowania pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka (HMEC) z małych ilości tkanki sutka. Protokół ten jest odpowiedni do szybkiego wytwarzania pierwotnych HMEC zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych.

Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka

Poznaj metodę hodowli enteroidów z jelita myszy i człowieka oraz ekstrakcję mleka matki do badań proliferacji komórek in vitro. Model ten wspiera badania nad chorobami przewodu pokarmowego.

Mleko matki wspomaga wzrost enteroidów: model proliferacji komórek ex vivo

Przeglądaj więcej filmów