Name: Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP do analizy stanów chromatyny w tkankach nowotworowych i liniach komórkowych raka. Ta technika umożliwia jednoczesne przetwarzanie wielu próbek i modyfikacji histonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Marcusowi Coyle'owi, Curtisowi Gumbsowi, rdzeniowi SMF w MDACC za wsparcie w sekwencjonowaniu. Praca opisana w tym artykule została wsparta grantami z grantu NIH (CA016672) dla SMF Core i nagród NCI (1K99CA160578 i R00CA160578) dla K. R.

<ol><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li>
<li>Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulated+Neighborhoods%3A+Structural+and+Functional+Units+of+Mammalian+Gene+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control.</a> Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).</li>
<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMARCB1-mediated+SWI%2FSNF+complex+function+is+essential+for+enhancer+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation.</a> Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).</li>
<li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li>
<li>Jäger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+Hi-C+identifies+the+chromatin+interactome+of+colorectal+cancer+risk+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci.</a> Nat Commun. 6, 6178(2015).</li>
<li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).</li>
<li>Mansour, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+regulation.+An+oncogenic+super-enhancer+formed+through+somatic+mutation+of+a+noncoding+intergenic+element%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element.</a> Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).</li>
<li>Weischenfeldt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-cancer+analysis+of+somatic+copy-number+alterations+implicates+IRS4+and+IGF2+in+enhancer+hijacking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking.</a> Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).</li>
<li>Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(14)00205-6">Enhancer malfunction in cancer.</a> Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17320507">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+67+histone+marks+and+histone+lysine+crotonylation+as+a+new+type+of+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification.</a> Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).</li>
<li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li>
<li>Consortium, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Rivera, C. M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(13)01148-3">Mapping human epigenomes.</a> Cell. 155 (1), 39-55 (2013).</li>
<li>Stergachis, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+fate+and+cellular+maturity+encoded+in+human+regulatory+DNA+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes.</a> Cell. 154 (4), 888-903 (2013).</li>
<li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomic+analysis+of+multilineage+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells.</a> Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+diversity+during+lineage+commitment+of+human+blood+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors.</a> Science. 345 (6204), 1251033(2014).</li>
<li>Saeed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+programming+of+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+trained+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity.</a> Science. 345 (6204), 1251086(2014).</li>
<li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NIH+Roadmap+Epigenomics+Mapping+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium.</a> Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).</li>
<li>Roadmap Epigenomics, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Ernst, J., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChromHMM%3A+automating+chromatin-state+discovery+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization.</a> Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).</li>
<li>Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+ChIP-seq+enrichment+using+MACS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Identifying ChIP-seq enrichment using MACS.</a> Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18798982">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+characterization+of+the+early+embryo+with+a+chromatin+immunoprecipitation+protocol+applicable+to+small+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.</a> Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).</li>
<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q2ChIP%2C+a+quick+and+quantitative+chromatin+immunoprecipitation+assay%2C+unravels+epigenetic+dynamics+of+developmentally+regulated+genes+in+human+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells.</a> Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li>
<li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4me3+epigenomic+landscape+derived+from+ChIP-Seq+of+1%2C000+mouse+early+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells.</a> Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).</li>
<li>Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate-based+chromatin+immunoprecipitation+method%2C+Matrix+ChIP%3A+a+platform+to+study+signaling+of+complex+genomic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events.</a> Nucleic Acids Res. 36 (3), e17(2008).</li>
<li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16397291">Fast chromatin immunoprecipitation assay.</a> Nucleic Acids Res. 34 (1), e2(2006).</li>
<li>Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interactive+environment+for+agile+analysis+and+visualization+of+ChIP-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li>
<li>Blecher-Gonen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).</li>
<li>Tang, M. <a target="_blank" href="https://zenodo.org/record/819971#.WilfHUtrxZ0">pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline.</a> Zenodo. , (2017).</li>
<li>Koster, J., Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakemake--a+scalable+bioinformatics+workflow+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).</li>
<li>Bailey, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+guidelines+for+the+comprehensive+analysis+of+ChIP-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data.</a> PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326(2013).</li>
<li>Fiziev, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Epigenomic+Analysis+Reveals+Chromatin+States+Associated+with+Melanoma+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression.</a> Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+chromosomal+domains+of+histone+modification+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans.</a> Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Rai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Roles+of+RNF2+in+Melanoma+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression.</a> Cancer Discov. , (2015).</li>
<li>Cotney, J. L., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+with+fixed+animal+tissues+and+preparation+for+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing.</a> Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).</li>
<li>Cejas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+from+fixed+clinical+tissues+reveals+tumor-specific+enhancer+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles.</a> Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktów.

Protokół ten opisuje kompletny i wszechstronny moduł ChIP-seq o wysokiej przepustowości do mapowania stanów chromatyny w całym genomie w ludzkich tkankach nowotworowych i liniach komórkowych. W każdym protokole ChIP-seq jednym z najważniejszych etapów jest swoistość przeciwciał. W tym przypadku metoda ta ilustruje warunki immunoprecypitacji dla opisanych sześciu modyfikacji histonów, z których wszystkie są klasy ChIP i zostały wcześniej zwalidowane w naszych i innych laboratoriach 42,44,45.</...

Większość genomów ssaków (98 - 99%) składa się z sekwencji niekodującej, a te regiony kodowania zawierają elementy regulatorowe, o których wiadomo, że uczestniczą w kontrolowaniu ekspresji genów i organizacji chromatyny1,2. W normalnej komórce specyficzne złożenie genomowego DNA w zagęszczoną strukturę chromatyny ma kluczowe znaczenie dla organizacji przestrzennej, regulacji i precyzyjnego czasu różnych procesów związanych z DNA3,4,5. Jednak w komórce nowotworowej modyfikacje chromatyny przez nieprawidłowe mechanizmy epigenetyczne mogą prowadzić do niewłaściwej organizacji struktury chromatyny, w tym dostępu do elementów regulatorowych, systemów pętli chromosomowych i wzorców ekspresji genów6,7,8,9,10.
Pomimo ostatnich osiągnięć, mamy ograniczoną wiedzę na temat zmian epigenetycznych, które są związane z progresją guza lub odpowiedzią terapeutyczną. Epigenom składa się z szeregu modyfikacji, w tym znaczników histonowych i metylacji DNA, które wspólnie tworzą stan dynamiczny (określany jako stan chromatyny), który wpływa na sieci ekspresji genów i inne procesy krytyczne dla utrzymania tożsamości komórkowej. Ostatnio wykazano zmiany w wzmacniaczach w wielu nowotworach złośliwych, badając profile H3K27Ac11. Chociaż takie badania dają wgląd w korelację izolowanych znaczników epigenetycznych, zidentyfikowano ponad 100 modyfikacji epigenetycznych12,13 bez jasnego zrozumienia ich ról biologicznych i współzależności. Co więcej, istnieje jeszcze większa liczba możliwych wzorców kombinatorycznych tych modyfikacji histonów i DNA, i to właśnie te wzorce kombinatoryczne - a nie indywidualne modyfikacje - dyktują stany epigenetyczne14. W związku z tym istnieje ogromna potrzeba zidentyfikowania zmian w tych stanach chromatyny podczas progresji raka lub odpowiedzi na terapię. Kompleksowa wiedza na temat zmian epigenomu w nowotworach pozostaje w tyle częściowo ze względu na wyzwania techniczne (np. generowanie danych na dużą skalę z niewielkiej ilości materiału klinicznego/pojedynczych komórek) i analityczne (np. algorytmy do definiowania stanów kombinatorycznych). W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na solidne, wysokoprzepustowe metody profilowania dużej liczby znaczników modyfikacji histonów z materiału klinicznego oraz łatwe do wdrożenia podejścia obliczeniowe do przewidywania wzorców kombinatorycznych, które ułatwią określenie stanów epigenetycznych związanych z różnymi etapami nowotworzenia i opornością terapeutyczną. Ponadto dostępne są dane z ostatnich badań profilowania epigenomu15,16,17,18,19,20,21,22,23 W normalnych tkankach i liniach komórkowych można zintegrować z profilami chromatyny guzów w celu uzyskania dalszych informacji na temat wkładu epigenomu w biologię nowotworu.
Profilowanie chromatyny stało się potężnym narzędziem do identyfikacji globalnych wzorców wiązania różnych modyfikacji chromatyny15,24. W ostatnich latach ChIP-seq stał się "złotym standardem" w badaniu interakcji DNA-białko na skalę globalną25,26,27. W przypadku każdego eksperymentu ChIP-seq istnieją kluczowe etapy niezbędne do jego powodzenia, w tym przetwarzanie i dysocjacja tkanek, określanie optymalnych warunków sonikacji, określanie optymalnego stężenia przeciwciał do wytrącania, przygotowanie biblioteki, przetwarzanie danych po sekwencjonowaniu i dalsza analiza. Każdy z tych kroków zawiera kluczowe punkty kontrolne kontroli jakości, a gdy są rozpatrywane razem, mają kluczowe znaczenie dla prawidłowej identyfikacji potencjalnych celów walidacji funkcjonalnej. Dzięki innowacjom na tych etapach, w kilku wcześniejszych badaniach opracowano metodologie wykonywania ChIP lub ChIP-Seq z niewielkiej ilości tkanek28,29,30,31,32. Co więcej, niektóre badania sugerują protokoły dla wysokoprzepustowych eksperymentów ChIP, a następnie kwantyfikację opartą na PCR33,34. Wreszcie, niektóre publicznie dostępne platformy analityczne dla danych ChIP-Seq są już dostępne, takie jak Easeq35 i Galaxy36. Brakowało jednak zintegrowanej platformy do wykonywania ChIP-Seq w sposób wysokoprzepustowy w połączeniu z potokiem obliczeniowym do wykonywania analiz pojedynczych znaczników oraz stanu chromatyny.
Ten protokół opisuje kompletny i wszechstronny przepływ pracy ChIP-seq do mapowania całego genomu stanów chromatyny w tkankach nowotworowych i liniach komórkowych, z łatwymi do naśladowania wytycznymi obejmującymi wszystkie kroki niezbędne do udanego eksperymentu. Przyjmując metodę wysokoprzepustową opisaną wcześniej przez Blechera-Gonena i wsp.37, ten protokół może być wykonywany na dziesiątkach próbek równolegle i został z powodzeniem zastosowany na liniach komórek rakowych i nowotworach ludzkich, takich jak czerniak, okrężnica, prostata i glejak wielopostaciowy. Pokazujemy metodologię sześciu podstawowych modyfikacji histonów, które reprezentują kluczowe elementy epigenetycznego krajobrazu regulacyjnego w ludzkich liniach komórkowych czerniaka i próbkach guza. Modyfikacje te obejmują H3K27ac (wzmacniacze), H3K4me1 (aktywne i zrównoważone wzmacniacze), H3K4me3 (promotory), H3K79me2 (transkrybowane regiony), H3K27me3 (represja polycomb) i H3K9me3 (represja heterochromatyczna). Znaczniki te mogą być używane samodzielnie lub w połączeniu do identyfikacji funkcjonalnie odrębnych stanów chromatyny reprezentujących zarówno domeny represyjne, jak i aktywne.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało H3K4me1 klasy ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab8895</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało H3K27ac klasy ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało H3K4me3 klasy ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało H3K79me2 klasy ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab3594</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało H3K27me3 klasy ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab6002</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało H3K9me3 klasy ChIP H3K9me3 przeciwciało</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris HCl, pH 8,0</td><td>Teknova</td><td>T1080</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma - Życie Sciences</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746460</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1% TWEEN-20</td><td>Bioodczynniki Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA - Sigma bez IgG</td><td>- Życie Sciences</td><td>A2058-5G</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibo</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Rurka GentleMACS C</td><td>GentleMACS</td><td>120-008-466</td><td>rurka dysocjująca</td></tr><tr><td>16% Formaldehyd</td><td>Peierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>inhibitor miniproteazy&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836153001</td><td>tabletki z inhibitorem proteazy</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G&nbsp;</td><td>Probówki Invitrogen</td><td>10009D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor NGS 0,65 ml</td><td>Probówki do sonikacji</td><td>Diagenode</td><td>C30010011</td></tr><tr><td>DynaMag - 96 Boczne listwy</td><td>Invitrogen</td><td>120.27</td><td>96-dołkowy stojak magnetyczny</td></tr><tr><td>Bufor</td><td>TE Promega</td><td>V6231</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Invitrogen</td><td>100005393</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki AMPure XP Koraliki</td><td>paramagnetyczne</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania wysokiej czułości Qubit ds DNA</td><td>Odczynniki DNA o wysokiej czułości</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania biblioteki DNA NEBNext Ultra II Zestaw do przygotowania</td><td>biblioteki DNA</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td></tr><tr><td>Woda</td> <td>wolna od nukleazAmbion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Taśma ScreenTape o wysokiej czułości D1000</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td>odczynniki DNA o wysokiej czułości</td></tr><tr><td>Odczynniki D1000 o wysokiej czułości</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td>odczynniki DNA o wysokiej czułości</td></tr><tr><td>Multiplex Oligos (Startery indeksowe - Zestaw 1)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7335L</td><td>Multiplex Oligos&nbsp;</td></tr><tr><td>Multipleksy Oligonukleotyda (Startery indeksowe - Zestaw 2)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7500L</td><td>Multiplex Oligos&nbsp;</td></tr><tr><td>TapeStation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td>instrument do elektroferogramu DNA o wysokiej czułości</td></tr><tr><td>Urządzenie do sonikacji Bioruptor Pico&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>B01060001</td><td>łaźnia wodna Disruputor</td></tr><tr><td>Mikser</td><td>Nutator</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad C1000 Dotykowy termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>PCR Termocykler</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>2322</td><td></td></tr><tr><td>Wielokanałowa pipeta</td><td>Denville</td><td>1003123</td><td></td></tr><tr><td>Tube Rewolwer</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td>88881001</tr><tr><td>96-dołkowa płytka przypodłogowa</td><td>Eppendorf</td><td>47744-110</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Allegra X-12R&nbsp;</td><td>Wirówka stołowa</td> <td>Beckman Coulter</td><td>A99464</td></tr> Wirówka stołowa <tr><td>5424</td><td>Wirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>22620461</td></tr><tr><td>Paski tub optycznych (8x pasek)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Nasadki do tub optycznych (8x pasek)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki ładowania, 10 szt</td>. <td>Agilent Technologies</td><td>5067-5599</td><td></td></tr><tr><td>Wir IKA MS3</td><td>Wir</td> <td>IKA</td><td>3617000</td></tr></tbody></table>

zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania chip w tkankach nowotworowych

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Modyfikacje histonów stanowią główny składnik epigenomu i odgrywają ważną rolę regulacyjną w określaniu statusu transkrypcyjnego powiązanych loci. Ponadto obecność określonych modyfikacji została wykorzystana do określenia pozycji i tożsamości niekodujących elementów funkcjonalnych, takich jak wzmacniacze. W ostatnich latach immunoprecypitacja chromatyny, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (ChIP-seq) stało się potężnym narzędziem do określania profili poszczególnych modyfikacji histonów w całym genomie. Jednak staje się coraz bardziej jasne, że kombinatoryczne wzorce modyfikacji chromatyny, określane jako stany chromatyny, określają tożsamość i charakter powiązanego locus genomu. W związku z tym do kompleksowego określania stanów epigenomicznych w dużej liczbie próbek potrzebne są przepływy pracy składające się z solidnych metodologii o wysokiej przepustowości (HT) do profilowania wielu znaczników modyfikacji histonów, a także potoków analiz obliczeniowych zdolnych do obsługi niezliczonych zestawów danych profilowania ChIP-Seq. Przedstawiony tutaj przepływ pracy HT-ChIP-Seq składa się z dwóch modułów: 1) eksperymentalnego protokołu profilowania kilku modyfikacji histonów z niewielkich ilości próbek guza i linii komórkowych w formacie 96-dołkowym; oraz 2) potok obliczeniowej analizy danych, który łączy istniejące narzędzia do obliczania zarówno indywidualnego zajętości znaczników, jak i kombinatorycznych wzorców stanu chromatyny. Razem te dwa moduły ułatwiają łatwe przetwarzanie setek próbek ChIP-Seq w szybki i wydajny sposób. Przedstawiony tutaj przepływ pracy służy do wyprowadzania wzorców stanu chromatyny z 6 profili znaczników histonów w guzach czerniaka i liniach komórkowych. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiamy kompleksowy przepływ pracy ChIP-seq, który można zastosować do dziesiątek próbek ludzkich guzów i linii komórek rakowych w celu określenia aberracji epigenomicznych w różnych nowotworach złośliwych.

Niniejszy protokół umożliwia immunoprecypitację z zamrożonych tkanek nowotworowych oraz linii komórkowych, którą można przeprowadzić równolegle dla kilkudziesięciu próbek przy użyciu metody wysokoprzepustowej (Rysunek 1A). Fragmenty chromatyny powinny mieć długość od ~200 do 1000 bps dla optymalnej immunoprecypitacji. Zauważono, że czas potrzebny do uzyskania tej samej długości fragmentów po sonicacji różni się w zależności od rodzaju tkanki ...

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół sekwencjonowania ChIP o wysokiej przepustowości oraz potok analiz obliczeniowych do określania wzorców stanu chromatyny w całym genomie z zamrożonych tkanek nowotworowych i linii komórkowych.

Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Ogólnym celem tego protokołu jest bezstronna identyfikacja kombinatorycznych wzorców stanu chromatyny w tkankach nowotworowych i liniach komórek rakowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki nowotworów, takie jak to, w jaki sposób jałowe stany modyfikacji histonów mogą przyczynić się do genezy guza. Główną zaletą tej techniki jest to, że wiele modyfikacji histonów, a także wiele próbek może być przetwarzanych zarówno jednocześnie, jak i wydajnie.Najpierw ręcznie oddziel 50 miligramów tkanki czerniaka i dwa mililitry Hank's Balanced Salt Solution lub HBSS za pomocą sterylnej żyletki. Zmielić tkankę na trzy lub cztery milimetrowe kawałki przez około pięć minut w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowych. Przenieś roztwór tkankowy do probówki dysocjacyjnej i dodaj kolejne osiem mililitrów HBSS.Dalej dysocjuj tkankę za pomocą dysocjatora, aż do homogenizacji. Następnie usieciuj tkankę, dodając 200 mikrolitrów 16% formaldehydu na trzy mililitry HBSS. Za pomocą miksera potrząsaj mieszaniną z prędkością 10 obr./min dokładnie przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po wyjęciu próbki z inkubatora dodaj 200 mikrolitrów glicyny nowotworowej na trzy mililitry próbki i potrząsaj mieszaniną z prędkością 10 obr./min przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wirować próbkę pod ciśnieniem 934 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą wirówki stołowej. Po zakończeniu usuń supernatant i dodaj pięć mililitrów lodowatego PBS.Następnie ponownie odwirować próbkę pod ciśnieniem 934 razy g, a następnie usunąć supernatant. Dodać 300 mikrolitrów buforu do zbierania ChIP z inhibitorami proteazy na 50 miligramów tkanki i lizować próbki przez 30 minut na lodzie. Podczas lizy komórek włącz zakłócacz kąpieli wodnej i związany z nim system chłodzenia i pozwól, aby temperatura osiągnęła cztery stopnie Celsjusza.Umieść rurkę sonikatora w substancji zakłócającej kąpiel wodną i poddaj sonifikację tkanki czerniaka przez 60 cykli po 30 sekundach włączenia i 30 sekund przerwy, aby uzyskać fragmenty chromatyny o długości od 200 do 600 par zasad. Na osiem miligramów tkanki czerniaka inkubować trzy mikrogramy każdego przeciwciała histonowego z 20 mikrolitrami kulek magnetycznych białka g i 100 mikrolitrami buforu blokującego wiązanie przez dwie godziny w czterech stopniach Celsjusza z rotacją, za pomocą rewolweru rurowego. Po sonikacji rozcieńczyć próbkę pięciokrotnie za pomocą buforu rozcieńczającego ChIP, aby obniżyć stężenie SDS do 0,1%Po zakończeniu inkubacji przeciwciała i kulek magnetycznych g należy usunąć bufor rozcieńczający ChIP i ponownie zawiesić kulki w 240 mikrolitrach świeżego buforu.Następnie umieść 20 mikrolitrów porcji kulek w 12 oddzielnych probówkach, z których każda zostanie użyta do oddzielnej próbki tkanki. Podwielokrotność sonikowanego materiału równomiernie do kulek białkowych g ze specyficznym przeciwciałem i obracać probówki za pomocą rewolweru rurowego przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka po odwrotnym sieciowaniu przenieś roztwór białka przeciwciała na 96-dołkową płytkę i umieść go na stojaku magnetycznym.Po pozostawieniu kulek do przylegania przez co najmniej 30 sekund, usuń supernatant. Umyj kulki pięciokrotnie 150 mikrolitrami lodowatego buforu myjącego RIPA za pomocą pipety wielokanałowej. Przesuwaj magnes w sposób ciągły przez 30 sekund na pranie, a następnie usuń supernatant.Po etapach przemywania dodać główną mieszankę buforu elucyjnego, zawierającą 44 mikrolitry buforu do bezpośredniej elucji, jeden mikrolitr Rnazy i pięć mikrolitrów protenazy k na chip i wprowadzić próbkę do odwrotnego sieciowania. Próbki należy inkubować za pomocą termocyklera PCR przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, cztery godziny w temperaturze 50 stopni Celsjusza i od ośmiu do 16 godzin w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Następnego ranka umieść próbki z powrotem na magnesie i przenieś supernatant na nową 96-dołkową płytkę PCR, która zawiera wytrącone aminokwasami DNA.Dodaj 2,3 x kulki paramagnetyczne do roztworu i ostrożnie pipetuj w górę i w dół 25 razy za pomocą pipety wielokanałowej. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Następnie umieść próbki z powrotem na magnesie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez kolejne cztery minuty.Po odrzuceniu supernatantu dodać do próbek 150 mikrolitrów 70% etanolu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 sekund bez naruszania kulek. Po pozostawieniu kulek do wyschnięcia, usuń próbki z magnesu i dodaj 30 mikrolitrów 10-milimolowego śladu. Wymieszać pipetując 25 razy.Po inkubacji próbek w temperaturze pokojowej umieść je z powrotem na magnesie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez kolejne cztery minuty. Przenieś 20 mikrolitrów każdej próbki na nową 96-dołkową płytkę w celu przygotowania biblioteki. Po amplifikacji PCR usuń próbki i doprowadź całkowitą objętość do 100 mikrolitrów za pomocą wody wolnej od jądra.Dokonaj dwustronnego wyboru wielkości paramagnetycznej, najpierw dodając 55 mikrolitrów kulek do każdej próbki i mieszając 25 razy za pomocą pipety. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Umieść próbki z powrotem na magnesie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez kolejne cztery minuty, aby uzyskać duże fragmenty na kulkach, które nie nadają się do sekwencjonowania.Po inkubacji przenieść supernatant na nową 96-dołkową płytkę do PCR. Dodaj kolejne 25 mikrolitrów kulek paramagnetycznych i wymieszaj pipetując 25 razy i inkubuj w temperaturze pokojowej z magnesu przez cztery minuty. Po inkubacji w temperaturze pokojowej umieść próbki z powrotem na magnesie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez cztery minuty.Następnie odrzucić supernatant. Pozostawiając próbki na magnesie, dodaj 150 mikrolitrów 70% etanolu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 sekund bez naruszania kulek. Usuń etanol i powtórz pranie.Po pozostawieniu kulek do wyschnięcia, usuń próbki z magnesu i dodaj 25 mikrolitrów 10 milimolowych śladowych pH 8,0. Wymieszać pipetując 25 razy i inkubować w temperaturze pokojowej, z dala od magnesu przez cztery minuty. Po inkubacji w temperaturze pokojowej umieść próbki z powrotem na magnesie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez cztery minuty.Teraz określ ilościowo biblioteki za pomocą elektroferogramu DNA o wysokiej czułości przed multipleksowaniem, aby upewnić się, że rozmiary są odpowiednie do sekwencjonowania. Protokół ten umożliwia immunoprecypitację zamrożonych tkanek nowotworowych i linii komórkowych, którą można przeprowadzić na dziesiątkach próbek i równolegle przy użyciu metody wysokoprzepustowej. Fragmenty chromatyny powinny mieścić się w zakresie od 200 do 1000 par zasad dla optymalnej immunoprecypitacji.Oczyszczone DNA ChIP należy określić ilościowo przed przystąpieniem do przygotowania biblioteki. Ukończone biblioteki nadające się do multipleksowania i sekwencjonowania nowej generacji powinny zawierać od 200 do 600 par zasad i być pozbawione jakichkolwiek dimerów starterów. Po sekwencjonowaniu końcowym istnieje wiele wskaźników kontroli jakości, które powinny zostać spełnione przed przejściem do dalszych kroków potoku, takich jak wywołania szczytowe macs i analiza chromHmm.Próbki ChIP powinny być wzbogacone o wejściowe DNA, a każda modyfikacja histonów powinna wykazywać odrębny profil reprezentujący określony składnik krajobrazu epigenetycznego. Chromowy algorytm HMM wykorzystuje wielowymiarowy ukryty model Markowa do identyfikacji najbardziej widocznych powtarzających się kombinatorycznych i przestrzennych wzorców chromatyny w oparciu o badane modyfikacje histonów. Korzystając z tych sześciu modyfikacji, chrom HMM identyfikuje funkcjonalnie odrębne stany chromatyny reprezentujące zarówno domeny represyjne, jak i aktywne, takie jak represja polycomb, represja heterochromatyczna, aktywna transkrypcja i aktywne wzmacniacze.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby określić optymalne warunki sonikacji i specyfikację przeciwciał przed kontynuowaniem przygotowywania biblioteki i analizy danych. Aby nauczyć się tej procedury, można wykonać inne metody, takie jak sekwencjonowanie RRS i przechwytywanie potwierdzenia chromosomu, aby określić koalicję części stanu chromatyny z ekspresją genu i wyższą strukturą chromatyny.Po eksperymencie technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się epigenetyką nowotworów do zbadania wzorców stanu chromatyny w próbkach guza pacjenta. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przetwarzać i oddzielać tkanki nowotworowe, przeprowadzać immunoprecypitację chromatyny, przygotowywać biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji, przetwarzać dane po sekwencjonowaniu i uzyskać wgląd w początkowe etapy dalszej analizy. Nie zapominaj, że podczas pracy z formaldehydem może to być bardzo niebezpieczne i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak odpowiedni wyciąg.

an-integrated-platform-for-genome-wide-mapping-chromatin-states-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Metoda Hi-C umożliwia bezstronną, genomową identyfikację oddziaływań chromatyny (1). Hi-C łączy ligację bliskościową z sekwencjonowaniem masowo równoległym. Wynikowe dane mogą być wykorzystane do badania architektury genomowej w wielu skalach: wstępne wyniki pozwoliły zidentyfikować takie cechy jak terytoria chromosomowe, segregacja chromatyny otwartej i zamkniętej oraz struktura chromatyny w skali megabazy.

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

Analiza oddziaływań chromatyny za pomocą sekwencjonowania parowanych końców (ChIA-PET) jest metodą detekcji oddziaływań chromatyny de novo, służącą lepszemu zrozumieniu kontroli transkrypcyjnej.

Analiza oddziaływań chromatyny z sekwencjonowaniem parowanych końców (ChIA-PET) w celu mapowania oddziaływań chromatyny i zrozumienia regulacji transkrypcji

Połączenie immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania ultra-wysokoprzepustowego (ChIP-seq) może zidentyfikować i zmapować interakcje białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości szablonu ChIP do późniejszego sekwencjonowania, na przykładzie doświadczenia z czynnikiem transkrypcyjnym TCF7L2.

Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Opisujemy tutaj platformę, która pozwala na wykrywanie uszkodzeń DNA metodą testów komet z niespotykaną dotąd wydajnością. Urządzenie tworzy modele komórek ssaków w mikromacierz i umożliwia równoległe przetwarzanie 96 próbek. Podejście to ułatwia analizę uszkodzeń DNA na poziomie podstawowym, uszkodzeń DNA wywołanych ekspozycją oraz kinetyki naprawy DNA.

CometChip: wysokowydajna, 96-dołkowa platforma do pomiaru uszkodzeń DNA w mikromacierzowanych komórkach ludzkich

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Precyzyjne określenie miejsc wiązania białek w całym genomie jest ważne dla zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisujemy metodę mapowania genomu, która traktuje DNA immunoprecypitowane chromatyną za pomocą trawienia egzonukleazą (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Metoda ta wykrywa interakcje białko-DNA z rozdzielczością mapowania par zasad bliską i wysokim stosunkiem sygnału do szumu w neuronach ssaków.

Mapowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i egzonukleazy (ChIP-Exo)

Ten artykuł opisuje półautomatyczny, mikroskalowany protokół ChIP-Seq regionów DNA związanych z specyficzną modyfikacją histonu (H3K27ac) przy użyciu platformy ChIP do obsługi cieczy, a następnie przygotowanie biblioteki za pomocą tagmentacji. Procedura obejmuje ocenę kontrolną pod względem jakościowym i ilościowym i może być dostosowana do innych modyfikacji histonów lub czynników transkrypcyjnych.

Półautomatyczna procedura ChIP-Seq do badań epigenetycznych na dużą skalę

ATAC-seq to metoda sekwencjonowania DNA, która wykorzystuje nadpobudliwą zmutowaną transpozazę, Tn5, do mapowania zmian w dostępności chromatyny, w których pośredniczą czynniki transkrypcyjne. ATAC-seq umożliwia odkrycie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zmian fenotypowych w komórkach nowotworowych. Protokół ten określa procedury optymalizacyjne dla sekwencji ATAC w typach komórek nabłonkowych, w tym komórkach nowotworowych.

Optymalizacja ATAC-Seq do badań epigenetycznych nowotworów

Ekspresja genów jest regulowana przez interakcje promotorów genów z dystalnymi elementami regulatorowymi. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób niski poziom wejściowy Capture Hi-C (liCHi-C) pozwala na identyfikację tych interakcji w rzadkich typach komórek, które wcześniej były niemierzalne.

Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek

Opisano zoptymalizowany protokół rozszczepienia pod celami i uwalnianie z użyciem nukleazy, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (CUT&amp;RUN-seq) dla neuroendokrynnych linii komórkowych raka płuc z drobnymi komórkami. Umożliwia mapowanie różnych modyfikacji histonów oraz miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych (np. E2F7) na poziomie genomu w celu badania deregulacji epigenetycznej i transkrypcyjnej w patobiologii SCLC.

Mapowanie modyfikacji histonów i miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych w neuroendokrynnych liniach komórkowych raka płuc z wykorzystaniem CUT&RUN

Poznaj zoptymalizowaną metodę wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP do analizy stanów chromatyny w tkankach nowotworowych i liniach komórkowych raka. Ta technika umożliwia jednoczesne przetwarzanie wielu próbek i modyfikacji histonowych.

Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal

Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych

Przeglądaj więcej filmów