Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych

Ogólnym celem tego protokołu jest bezstronna identyfikacja kombinatorycznych wzorców stanu chromatyny w tkankach nowotworowych i liniach komórek rakowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki nowotworów, takie jak to, w jaki sposób jałowe stany modyfikacji histonów mogą przyczynić się do genezy guza. Główną zaletą tej techniki jest to, że wiele modyfikacji histonów, a także wiele próbek może być przetwarzanych zarówno jednocześnie, jak i wydajnie.

Najpierw ręcznie oddziel 50 miligramów tkanki czerniaka i dwa mililitry Hank's Balanced Salt Solution lub HBSS za pomocą sterylnej żyletki. Zmielić tkankę na trzy lub cztery milimetrowe kawałki przez około pięć minut w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowych. Przenieś roztwór tkankowy do probówki dysocjacyjnej i dodaj kolejne osiem mililitrów HBSS.

Dalej dysocjuj tkankę za pomocą dysocjatora, aż do homogenizacji. Następnie usieciuj tkankę, dodając 200 mikrolitrów 16% formaldehydu na trzy mililitry HBSS. Za pomocą miksera potrząsaj mieszaniną z prędkością 10 obr./min dokładnie przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po wyjęciu próbki z inkubatora dodaj 200 mikrolitrów glicyny nowotworowej na trzy mililitry próbki i potrząsaj mieszaniną z prędkością 10 obr./min przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wirować próbkę pod ciśnieniem 934 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą wirówki stołowej. Po zakończeniu usuń supernatant i dodaj pięć mililitrów lodowatego PBS.

Następnie ponownie odwirować próbkę pod ciśnieniem 934 razy g, a następnie usunąć supernatant. Dodać 300 mikrolitrów buforu do zbierania ChIP z inhibitorami proteazy na 50 miligramów tkanki i lizować próbki przez 30 minut na lodzie. Podczas lizy komórek włącz zakłócacz kąpieli wodnej i związany z nim system chłodzenia i pozwól, aby temperatura osiągnęła cztery stopnie Celsjusza.

Umieść rurkę sonikatora w substancji zakłócającej kąpiel wodną i poddaj sonifikację tkanki czerniaka przez 60 cykli po 30 sekundach włączenia i 30 sekund przerwy, aby uzyskać fragmenty chromatyny o długości od 200 do 600 par zasad. Na osiem miligramów tkanki czerniaka inkubować trzy mikrogramy każdego przeciwciała histonowego z 20 mikrolitrami kulek magnetycznych białka g i 100 mikrolitrami buforu blokującego wiązanie przez dwie godziny w czterech stopniach Celsjusza z rotacją, za pomocą rewolweru rurowego. Po sonikacji rozcieńczyć próbkę pięciokrotnie za pomocą buforu rozcieńczającego ChIP, aby obniżyć stężenie SDS do 0,1%Po zakończeniu inkubacji przeciwciała i kulek magnetycznych g należy usunąć bufor rozcieńczający ChIP i ponownie zawiesić kulki w 240 mikrolitrach świeżego buforu.

Następnie umieść 20 mikrolitrów porcji kulek w 12 oddzielnych probówkach, z których każda zostanie użyta do oddzielnej próbki tkanki. Podwielokrotność sonikowanego materiału równomiernie do kulek białkowych g ze specyficznym przeciwciałem i obracać probówki za pomocą rewolweru rurowego przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka po odwrotnym sieciowaniu przenieś roztwór białka przeciwciała na 96-dołkową płytkę i umieść go na stojaku magnetycznym.

Po pozostawieniu kulek do przylegania przez co najmniej 30 sekund, usuń supernatant. Umyj kulki pięciokrotnie 150 mikrolitrami lodowatego buforu myjącego RIPA za pomocą pipety wielokanałowej. Przesuwaj magnes w sposób ciągły przez 30 sekund na pranie, a następnie usuń supernatant.

Po etapach przemywania dodać główną mieszankę buforu elucyjnego, zawierającą 44 mikrolitry buforu do bezpośredniej elucji, jeden mikrolitr Rnazy i pięć mikrolitrów protenazy k na chip i wprowadzić próbkę do odwrotnego sieciowania. Próbki należy inkubować za pomocą termocyklera PCR przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, cztery godziny w temperaturze 50 stopni Celsjusza i od ośmiu do 16 godzin w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Następnego ranka umieść próbki z powrotem na magnesie i przenieś supernatant na nową 96-dołkową płytkę PCR, która zawiera wytrącone aminokwasami DNA.

Dodaj 2,3 x kulki paramagnetyczne do roztworu i ostrożnie pipetuj w górę i w dół 25 razy za pomocą pipety wielokanałowej. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Następnie umieść próbki z powrotem na magnesie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez kolejne cztery minuty.

Po odrzuceniu supernatantu dodać do próbek 150 mikrolitrów 70% etanolu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 sekund bez naruszania kulek. Po pozostawieniu kulek do wyschnięcia, usuń próbki z magnesu i dodaj 30 mikrolitrów 10-milimolowego śladu. Wymieszać pipetując 25 razy.

Po inkubacji próbek w temperaturze pokojowej umieść je z powrotem na magnesie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez kolejne cztery minuty. Przenieś 20 mikrolitrów każdej próbki na nową 96-dołkową płytkę w celu przygotowania biblioteki. Po amplifikacji PCR usuń próbki i doprowadź całkowitą objętość do 100 mikrolitrów za pomocą wody wolnej od jądra.

Dokonaj dwustronnego wyboru wielkości paramagnetycznej, najpierw dodając 55 mikrolitrów kulek do każdej próbki i mieszając 25 razy za pomocą pipety. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Umieść próbki z powrotem na magnesie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez kolejne cztery minuty, aby uzyskać duże fragmenty na kulkach, które nie nadają się do sekwencjonowania.

Po inkubacji przenieść supernatant na nową 96-dołkową płytkę do PCR. Dodaj kolejne 25 mikrolitrów kulek paramagnetycznych i wymieszaj pipetując 25 razy i inkubuj w temperaturze pokojowej z magnesu przez cztery minuty. Po inkubacji w temperaturze pokojowej umieść próbki z powrotem na magnesie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez cztery minuty.

Następnie odrzucić supernatant. Pozostawiając próbki na magnesie, dodaj 150 mikrolitrów 70% etanolu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 sekund bez naruszania kulek. Usuń etanol i powtórz pranie.

Po pozostawieniu kulek do wyschnięcia, usuń próbki z magnesu i dodaj 25 mikrolitrów 10 milimolowych śladowych pH 8,0. Wymieszać pipetując 25 razy i inkubować w temperaturze pokojowej, z dala od magnesu przez cztery minuty. Po inkubacji w temperaturze pokojowej umieść próbki z powrotem na magnesie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez cztery minuty.

Teraz określ ilościowo biblioteki za pomocą elektroferogramu DNA o wysokiej czułości przed multipleksowaniem, aby upewnić się, że rozmiary są odpowiednie do sekwencjonowania. Protokół ten umożliwia immunoprecypitację zamrożonych tkanek nowotworowych i linii komórkowych, którą można przeprowadzić na dziesiątkach próbek i równolegle przy użyciu metody wysokoprzepustowej. Fragmenty chromatyny powinny mieścić się w zakresie od 200 do 1000 par zasad dla optymalnej immunoprecypitacji.

Oczyszczone DNA ChIP należy określić ilościowo przed przystąpieniem do przygotowania biblioteki. Ukończone biblioteki nadające się do multipleksowania i sekwencjonowania nowej generacji powinny zawierać od 200 do 600 par zasad i być pozbawione jakichkolwiek dimerów starterów. Po sekwencjonowaniu końcowym istnieje wiele wskaźników kontroli jakości, które powinny zostać spełnione przed przejściem do dalszych kroków potoku, takich jak wywołania szczytowe macs i analiza chromHmm.

Próbki ChIP powinny być wzbogacone o wejściowe DNA, a każda modyfikacja histonów powinna wykazywać odrębny profil reprezentujący określony składnik krajobrazu epigenetycznego. Chromowy algorytm HMM wykorzystuje wielowymiarowy ukryty model Markowa do identyfikacji najbardziej widocznych powtarzających się kombinatorycznych i przestrzennych wzorców chromatyny w oparciu o badane modyfikacje histonów. Korzystając z tych sześciu modyfikacji, chrom HMM identyfikuje funkcjonalnie odrębne stany chromatyny reprezentujące zarówno domeny represyjne, jak i aktywne, takie jak represja polycomb, represja heterochromatyczna, aktywna transkrypcja i aktywne wzmacniacze.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby określić optymalne warunki sonikacji i specyfikację przeciwciał przed kontynuowaniem przygotowywania biblioteki i analizy danych. Aby nauczyć się tej procedury, można wykonać inne metody, takie jak sekwencjonowanie RRS i przechwytywanie potwierdzenia chromosomu, aby określić koalicję części stanu chromatyny z ekspresją genu i wyższą strukturą chromatyny.

Po eksperymencie technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się epigenetyką nowotworów do zbadania wzorców stanu chromatyny w próbkach guza pacjenta. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przetwarzać i oddzielać tkanki nowotworowe, przeprowadzać immunoprecypitację chromatyny, przygotowywać biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji, przetwarzać dane po sekwencjonowaniu i uzyskać wgląd w początkowe etapy dalszej analizy. Nie zapominaj, że podczas pracy z formaldehydem może to być bardzo niebezpieczne i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak odpowiedni wyciąg.