Name: Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP do analizy stanów chromatyny w tkankach nowotworowych i liniach komórkowych raka. Ta technika umożliwia jednoczesne przetwarzanie wielu próbek i modyfikacji histonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Marcusowi Coyle'owi, Curtisowi Gumbsowi, rdzeniowi SMF w MDACC za wsparcie w sekwencjonowaniu. Praca opisana w tym artykule została wsparta grantami z grantu NIH (CA016672) dla SMF Core i nagród NCI (1K99CA160578 i R00CA160578) dla K. R.

<ol><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li>
<li>Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulated+Neighborhoods%3A+Structural+and+Functional+Units+of+Mammalian+Gene+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control.</a> Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).</li>
<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMARCB1-mediated+SWI%2FSNF+complex+function+is+essential+for+enhancer+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation.</a> Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).</li>
<li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li>
<li>Jäger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+Hi-C+identifies+the+chromatin+interactome+of+colorectal+cancer+risk+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci.</a> Nat Commun. 6, 6178(2015).</li>
<li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).</li>
<li>Mansour, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+regulation.+An+oncogenic+super-enhancer+formed+through+somatic+mutation+of+a+noncoding+intergenic+element%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element.</a> Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).</li>
<li>Weischenfeldt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-cancer+analysis+of+somatic+copy-number+alterations+implicates+IRS4+and+IGF2+in+enhancer+hijacking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking.</a> Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).</li>
<li>Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(14)00205-6">Enhancer malfunction in cancer.</a> Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17320507">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Tan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+67+histone+marks+and+histone+lysine+crotonylation+as+a+new+type+of+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification.</a> Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).</li>
<li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li>
<li>Consortium, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Rivera, C. M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(13)01148-3">Mapping human epigenomes.</a> Cell. 155 (1), 39-55 (2013).</li>
<li>Stergachis, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+fate+and+cellular+maturity+encoded+in+human+regulatory+DNA+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes.</a> Cell. 154 (4), 888-903 (2013).</li>
<li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomic+analysis+of+multilineage+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells.</a> Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+diversity+during+lineage+commitment+of+human+blood+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors.</a> Science. 345 (6204), 1251033(2014).</li>
<li>Saeed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+programming+of+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+trained+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity.</a> Science. 345 (6204), 1251086(2014).</li>
<li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NIH+Roadmap+Epigenomics+Mapping+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium.</a> Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).</li>
<li>Roadmap Epigenomics, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Ernst, J., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChromHMM%3A+automating+chromatin-state+discovery+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization.</a> Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).</li>
<li>Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+ChIP-seq+enrichment+using+MACS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Identifying ChIP-seq enrichment using MACS.</a> Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18798982">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+characterization+of+the+early+embryo+with+a+chromatin+immunoprecipitation+protocol+applicable+to+small+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.</a> Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).</li>
<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q2ChIP%2C+a+quick+and+quantitative+chromatin+immunoprecipitation+assay%2C+unravels+epigenetic+dynamics+of+developmentally+regulated+genes+in+human+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells.</a> Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li>
<li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4me3+epigenomic+landscape+derived+from+ChIP-Seq+of+1%2C000+mouse+early+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells.</a> Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).</li>
<li>Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate-based+chromatin+immunoprecipitation+method%2C+Matrix+ChIP%3A+a+platform+to+study+signaling+of+complex+genomic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events.</a> Nucleic Acids Res. 36 (3), e17(2008).</li>
<li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16397291">Fast chromatin immunoprecipitation assay.</a> Nucleic Acids Res. 34 (1), e2(2006).</li>
<li>Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interactive+environment+for+agile+analysis+and+visualization+of+ChIP-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li>
<li>Blecher-Gonen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).</li>
<li>Tang, M. <a target="_blank" href="https://zenodo.org/record/819971#.WilfHUtrxZ0">pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline.</a> Zenodo. , (2017).</li>
<li>Koster, J., Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakemake--a+scalable+bioinformatics+workflow+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).</li>
<li>Bailey, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+guidelines+for+the+comprehensive+analysis+of+ChIP-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data.</a> PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326(2013).</li>
<li>Fiziev, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Epigenomic+Analysis+Reveals+Chromatin+States+Associated+with+Melanoma+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression.</a> Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+chromosomal+domains+of+histone+modification+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans.</a> Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Rai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Roles+of+RNF2+in+Melanoma+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression.</a> Cancer Discov. , (2015).</li>
<li>Cotney, J. L., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+with+fixed+animal+tissues+and+preparation+for+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing.</a> Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).</li>
<li>Cejas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+from+fixed+clinical+tissues+reveals+tumor-specific+enhancer+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles.</a> Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktów.

Protokół ten opisuje kompletny i wszechstronny moduł ChIP-seq o wysokiej przepustowości do mapowania stanów chromatyny w całym genomie w ludzkich tkankach nowotworowych i liniach komórkowych. W każdym protokole ChIP-seq jednym z najważniejszych etapów jest swoistość przeciwciał. W tym przypadku metoda ta ilustruje warunki immunoprecypitacji dla opisanych sześciu modyfikacji histonów, z których wszystkie są klasy ChIP i zostały wcześniej zwalidowane w naszych i innych laboratoriach 42,44,45.</...

Większość genomów ssaków (98 - 99%) składa się z sekwencji niekodującej, a te regiony kodowania zawierają elementy regulatorowe, o których wiadomo, że uczestniczą w kontrolowaniu ekspresji genów i organizacji chromatyny1,2. W normalnej komórce specyficzne złożenie genomowego DNA w zagęszczoną strukturę chromatyny ma kluczowe znaczenie dla organizacji przestrzennej, regulacji i precyzyjnego czasu różnych procesów związanych z DNA3,4,5. Jednak w komórce nowotworowej modyfikacje chromatyny przez nieprawidłowe mechanizmy epigenetyczne mogą prowadzić do niewłaściwej organizacji struktury chromatyny, w tym dostępu do elementów regulatorowych, systemów pętli chromosomowych i wzorców ekspresji genów6,7,8,9,10.
Pomimo ostatnich osiągnięć, mamy ograniczoną wiedzę na temat zmian epigenetycznych, które są związane z progresją guza lub odpowiedzią terapeutyczną. Epigenom składa się z szeregu modyfikacji, w tym znaczników histonowych i metylacji DNA, które wspólnie tworzą stan dynamiczny (określany jako stan chromatyny), który wpływa na sieci ekspresji genów i inne procesy krytyczne dla utrzymania tożsamości komórkowej. Ostatnio wykazano zmiany w wzmacniaczach w wielu nowotworach złośliwych, badając profile H3K27Ac11. Chociaż takie badania dają wgląd w korelację izolowanych znaczników epigenetycznych, zidentyfikowano ponad 100 modyfikacji epigenetycznych12,13 bez jasnego zrozumienia ich ról biologicznych i współzależności. Co więcej, istnieje jeszcze większa liczba możliwych wzorców kombinatorycznych tych modyfikacji histonów i DNA, i to właśnie te wzorce kombinatoryczne - a nie indywidualne modyfikacje - dyktują stany epigenetyczne14. W związku z tym istnieje ogromna potrzeba zidentyfikowania zmian w tych stanach chromatyny podczas progresji raka lub odpowiedzi na terapię. Kompleksowa wiedza na temat zmian epigenomu w nowotworach pozostaje w tyle częściowo ze względu na wyzwania techniczne (np. generowanie danych na dużą skalę z niewielkiej ilości materiału klinicznego/pojedynczych komórek) i analityczne (np. algorytmy do definiowania stanów kombinatorycznych). W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na solidne, wysokoprzepustowe metody profilowania dużej liczby znaczników modyfikacji histonów z materiału klinicznego oraz łatwe do wdrożenia podejścia obliczeniowe do przewidywania wzorców kombinatorycznych, które ułatwią określenie stanów epigenetycznych związanych z różnymi etapami nowotworzenia i opornością terapeutyczną. Ponadto dostępne są dane z ostatnich badań profilowania epigenomu15,16,17,18,19,20,21,22,23 W normalnych tkankach i liniach komórkowych można zintegrować z profilami chromatyny guzów w celu uzyskania dalszych informacji na temat wkładu epigenomu w biologię nowotworu.
Profilowanie chromatyny stało się potężnym narzędziem do identyfikacji globalnych wzorców wiązania różnych modyfikacji chromatyny15,24. W ostatnich latach ChIP-seq stał się "złotym standardem" w badaniu interakcji DNA-białko na skalę globalną25,26,27. W przypadku każdego eksperymentu ChIP-seq istnieją kluczowe etapy niezbędne do jego powodzenia, w tym przetwarzanie i dysocjacja tkanek, określanie optymalnych warunków sonikacji, określanie optymalnego stężenia przeciwciał do wytrącania, przygotowanie biblioteki, przetwarzanie danych po sekwencjonowaniu i dalsza analiza. Każdy z tych kroków zawiera kluczowe punkty kontrolne kontroli jakości, a gdy są rozpatrywane razem, mają kluczowe znaczenie dla prawidłowej identyfikacji potencjalnych celów walidacji funkcjonalnej. Dzięki innowacjom na tych etapach, w kilku wcześniejszych badaniach opracowano metodologie wykonywania ChIP lub ChIP-Seq z niewielkiej ilości tkanek28,29,30,31,32. Co więcej, niektóre badania sugerują protokoły dla wysokoprzepustowych eksperymentów ChIP, a następnie kwantyfikację opartą na PCR33,34. Wreszcie, niektóre publicznie dostępne platformy analityczne dla danych ChIP-Seq są już dostępne, takie jak Easeq35 i Galaxy36. Brakowało jednak zintegrowanej platformy do wykonywania ChIP-Seq w sposób wysokoprzepustowy w połączeniu z potokiem obliczeniowym do wykonywania analiz pojedynczych znaczników oraz stanu chromatyny.
Ten protokół opisuje kompletny i wszechstronny przepływ pracy ChIP-seq do mapowania całego genomu stanów chromatyny w tkankach nowotworowych i liniach komórkowych, z łatwymi do naśladowania wytycznymi obejmującymi wszystkie kroki niezbędne do udanego eksperymentu. Przyjmując metodę wysokoprzepustową opisaną wcześniej przez Blechera-Gonena i wsp.37, ten protokół może być wykonywany na dziesiątkach próbek równolegle i został z powodzeniem zastosowany na liniach komórek rakowych i nowotworach ludzkich, takich jak czerniak, okrężnica, prostata i glejak wielopostaciowy. Pokazujemy metodologię sześciu podstawowych modyfikacji histonów, które reprezentują kluczowe elementy epigenetycznego krajobrazu regulacyjnego w ludzkich liniach komórkowych czerniaka i próbkach guza. Modyfikacje te obejmują H3K27ac (wzmacniacze), H3K4me1 (aktywne i zrównoważone wzmacniacze), H3K4me3 (promotory), H3K79me2 (transkrybowane regiony), H3K27me3 (represja polycomb) i H3K9me3 (represja heterochromatyczna). Znaczniki te mogą być używane samodzielnie lub w połączeniu do identyfikacji funkcjonalnie odrębnych stanów chromatyny reprezentujących zarówno domeny represyjne, jak i aktywne.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało H3K4me1 klasy ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab8895</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało H3K27ac klasy ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało H3K4me3 klasy ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało H3K79me2 klasy ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab3594</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało H3K27me3 klasy ChIP</td><td>Abcam</td><td>ab6002</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało H3K9me3 klasy ChIP H3K9me3 przeciwciało</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris HCl, pH 8,0</td><td>Teknova</td><td>T1080</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma - Życie Sciences</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746460</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1% TWEEN-20</td><td>Bioodczynniki Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA - Sigma bez IgG</td><td>- Życie Sciences</td><td>A2058-5G</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibo</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Rurka GentleMACS C</td><td>GentleMACS</td><td>120-008-466</td><td>rurka dysocjująca</td></tr><tr><td>16% Formaldehyd</td><td>Peierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>inhibitor miniproteazy&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836153001</td><td>tabletki z inhibitorem proteazy</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G&nbsp;</td><td>Probówki Invitrogen</td><td>10009D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor NGS 0,65 ml</td><td>Probówki do sonikacji</td><td>Diagenode</td><td>C30010011</td></tr><tr><td>DynaMag - 96 Boczne listwy</td><td>Invitrogen</td><td>120.27</td><td>96-dołkowy stojak magnetyczny</td></tr><tr><td>Bufor</td><td>TE Promega</td><td>V6231</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Invitrogen</td><td>100005393</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki AMPure XP Koraliki</td><td>paramagnetyczne</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania wysokiej czułości Qubit ds DNA</td><td>Odczynniki DNA o wysokiej czułości</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania biblioteki DNA NEBNext Ultra II Zestaw do przygotowania</td><td>biblioteki DNA</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td></tr><tr><td>Woda</td> <td>wolna od nukleazAmbion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Taśma ScreenTape o wysokiej czułości D1000</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td>odczynniki DNA o wysokiej czułości</td></tr><tr><td>Odczynniki D1000 o wysokiej czułości</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td>odczynniki DNA o wysokiej czułości</td></tr><tr><td>Multiplex Oligos (Startery indeksowe - Zestaw 1)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7335L</td><td>Multiplex Oligos&nbsp;</td></tr><tr><td>Multipleksy Oligonukleotyda (Startery indeksowe - Zestaw 2)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7500L</td><td>Multiplex Oligos&nbsp;</td></tr><tr><td>TapeStation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td>instrument do elektroferogramu DNA o wysokiej czułości</td></tr><tr><td>Urządzenie do sonikacji Bioruptor Pico&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>B01060001</td><td>łaźnia wodna Disruputor</td></tr><tr><td>Mikser</td><td>Nutator</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad C1000 Dotykowy termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>PCR Termocykler</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>2322</td><td></td></tr><tr><td>Wielokanałowa pipeta</td><td>Denville</td><td>1003123</td><td></td></tr><tr><td>Tube Rewolwer</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td>88881001</tr><tr><td>96-dołkowa płytka przypodłogowa</td><td>Eppendorf</td><td>47744-110</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Allegra X-12R&nbsp;</td><td>Wirówka stołowa</td> <td>Beckman Coulter</td><td>A99464</td></tr> Wirówka stołowa <tr><td>5424</td><td>Wirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>22620461</td></tr><tr><td>Paski tub optycznych (8x pasek)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Nasadki do tub optycznych (8x pasek)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki ładowania, 10 szt</td>. <td>Agilent Technologies</td><td>5067-5599</td><td></td></tr><tr><td>Wir IKA MS3</td><td>Wir</td> <td>IKA</td><td>3617000</td></tr></tbody></table>

zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania chip w tkankach nowotworowych

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Modyfikacje histonów stanowią główny składnik epigenomu i odgrywają ważną rolę regulacyjną w określaniu statusu transkrypcyjnego powiązanych loci. Ponadto obecność określonych modyfikacji została wykorzystana do określenia pozycji i tożsamości niekodujących elementów funkcjonalnych, takich jak wzmacniacze. W ostatnich latach immunoprecypitacja chromatyny, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (ChIP-seq) stało się potężnym narzędziem do określania profili poszczególnych modyfikacji histonów w całym genomie. Jednak staje się coraz bardziej jasne, że kombinatoryczne wzorce modyfikacji chromatyny, określane jako stany chromatyny, określają tożsamość i charakter powiązanego locus genomu. W związku z tym do kompleksowego określania stanów epigenomicznych w dużej liczbie próbek potrzebne są przepływy pracy składające się z solidnych metodologii o wysokiej przepustowości (HT) do profilowania wielu znaczników modyfikacji histonów, a także potoków analiz obliczeniowych zdolnych do obsługi niezliczonych zestawów danych profilowania ChIP-Seq. Przedstawiony tutaj przepływ pracy HT-ChIP-Seq składa się z dwóch modułów: 1) eksperymentalnego protokołu profilowania kilku modyfikacji histonów z niewielkich ilości próbek guza i linii komórkowych w formacie 96-dołkowym; oraz 2) potok obliczeniowej analizy danych, który łączy istniejące narzędzia do obliczania zarówno indywidualnego zajętości znaczników, jak i kombinatorycznych wzorców stanu chromatyny. Razem te dwa moduły ułatwiają łatwe przetwarzanie setek próbek ChIP-Seq w szybki i wydajny sposób. Przedstawiony tutaj przepływ pracy służy do wyprowadzania wzorców stanu chromatyny z 6 profili znaczników histonów w guzach czerniaka i liniach komórkowych. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiamy kompleksowy przepływ pracy ChIP-seq, który można zastosować do dziesiątek próbek ludzkich guzów i linii komórek rakowych w celu określenia aberracji epigenomicznych w różnych nowotworach złośliwych.

Niniejszy protokół umożliwia immunoprecypitację z zamrożonych tkanek nowotworowych oraz linii komórkowych, którą można przeprowadzić równolegle dla kilkudziesięciu próbek przy użyciu metody wysokoprzepustowej (Rysunek 1A). Fragmenty chromatyny powinny mieć długość od ~200 do 1000 bps dla optymalnej immunoprecypitacji. Zauważono, że czas potrzebny do uzyskania tej samej długości fragmentów po sonicacji różni się w zależności od rodzaju tkanki ...

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół sekwencjonowania ChIP o wysokiej przepustowości oraz potok analiz obliczeniowych do określania wzorców stanu chromatyny w całym genomie z zamrożonych tkanek nowotworowych i linii komórkowych.

Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Ogólnym celem tego protokołu jest bezstronna identyfikacja kombinatorycznych wzorców stanu chromatyny w tkankach nowotworowych i liniach komórek rakowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki nowotworów, takie jak to, w jaki sposób jałowe stany modyfikacji histonów mogą przyczynić się do genezy guza. Główną zaletą tej techniki jest to, że wiele modyfikacji histonów, a także wiele próbek może być przetwarzanych zarówno jednocześnie, jak i wydajnie.Najpierw ręcznie oddziel 50 miligramów tkanki czerniaka i dwa mililitry Hank's Balanced Salt Solution lub HBSS za pomocą sterylnej żyletki. Zmielić tkankę na trzy lub cztery milimetrowe kawałki przez około pięć minut w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowych. Przenieś roztwór tkankowy do probówki dysocjacyjnej i dodaj kolejne osiem mililitrów HBSS.Dalej dysocjuj tkankę za pomocą dysocjatora, aż do homogenizacji. Następnie usieciuj tkankę, dodając 200 mikrolitrów 16% formaldehydu na trzy mililitry HBSS. Za pomocą miksera potrząsaj mieszaniną z prędkością 10 obr./min dokładnie przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po wyjęciu próbki z inkubatora dodaj 200 mikrolitrów glicyny nowotworowej

an-integrated-platform-for-genome-wide-mapping-chromatin-states-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Metoda Hi-C umożliwia bezstronną, genomową identyfikację oddziaływań chromatyny (1). Hi-C łączy ligację bliskościową z sekwencjonowaniem masowo równoległym. Wynikowe dane mogą być wykorzystane do badania architektury genomowej w wielu skalach: wstępne wyniki pozwoliły zidentyfikować takie cechy jak terytoria chromosomowe, segregacja chromatyny otwartej i zamkniętej oraz struktura chromatyny w skali megabazy.

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

Analiza oddziaływań chromatyny za pomocą sekwencjonowania parowanych końców (ChIA-PET) jest metodą detekcji oddziaływań chromatyny de novo, służącą lepszemu zrozumieniu kontroli transkrypcyjnej.

Analiza oddziaływań chromatyny z sekwencjonowaniem parowanych końców (ChIA-PET) w celu mapowania oddziaływań chromatyny i zrozumienia regulacji transkrypcji

Połączenie immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania ultra-wysokoprzepustowego (ChIP-seq) może zidentyfikować i zmapować interakcje białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości szablonu ChIP do późniejszego sekwencjonowania, na przykładzie doświadczenia z czynnikiem transkrypcyjnym TCF7L2.

Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Opisujemy tutaj platformę, która pozwala na wykrywanie uszkodzeń DNA metodą testów komet z niespotykaną dotąd wydajnością. Urządzenie tworzy modele komórek ssaków w mikromacierz i umożliwia równoległe przetwarzanie 96 próbek. Podejście to ułatwia analizę uszkodzeń DNA na poziomie podstawowym, uszkodzeń DNA wywołanych ekspozycją oraz kinetyki naprawy DNA.

CometChip: wysokowydajna, 96-dołkowa platforma do pomiaru uszkodzeń DNA w mikromacierzowanych komórkach ludzkich

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Precyzyjne określenie miejsc wiązania białek w całym genomie jest ważne dla zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisujemy metodę mapowania genomu, która traktuje DNA immunoprecypitowane chromatyną za pomocą trawienia egzonukleazą (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Metoda ta wykrywa interakcje białko-DNA z rozdzielczością mapowania par zasad bliską i wysokim stosunkiem sygnału do szumu w neuronach ssaków.

Mapowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i egzonukleazy (ChIP-Exo)

Ten artykuł opisuje półautomatyczny, mikroskalowany protokół ChIP-Seq regionów DNA związanych z specyficzną modyfikacją histonu (H3K27ac) przy użyciu platformy ChIP do obsługi cieczy, a następnie przygotowanie biblioteki za pomocą tagmentacji. Procedura obejmuje ocenę kontrolną pod względem jakościowym i ilościowym i może być dostosowana do innych modyfikacji histonów lub czynników transkrypcyjnych.

Półautomatyczna procedura ChIP-Seq do badań epigenetycznych na dużą skalę

ATAC-seq to metoda sekwencjonowania DNA, która wykorzystuje nadpobudliwą zmutowaną transpozazę, Tn5, do mapowania zmian w dostępności chromatyny, w których pośredniczą czynniki transkrypcyjne. ATAC-seq umożliwia odkrycie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zmian fenotypowych w komórkach nowotworowych. Protokół ten określa procedury optymalizacyjne dla sekwencji ATAC w typach komórek nabłonkowych, w tym komórkach nowotworowych.

Optymalizacja ATAC-Seq do badań epigenetycznych nowotworów

Ekspresja genów jest regulowana przez interakcje promotorów genów z dystalnymi elementami regulatorowymi. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób niski poziom wejściowy Capture Hi-C (liCHi-C) pozwala na identyfikację tych interakcji w rzadkich typach komórek, które wcześniej były niemierzalne.

Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek

Opisano zoptymalizowany protokół rozszczepienia pod celami i uwalnianie z użyciem nukleazy, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (CUT&amp;RUN-seq) dla neuroendokrynnych linii komórkowych raka płuc z drobnymi komórkami. Umożliwia mapowanie różnych modyfikacji histonów oraz miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych (np. E2F7) na poziomie genomu w celu badania deregulacji epigenetycznej i transkrypcyjnej w patobiologii SCLC.

Mapowanie modyfikacji histonów i miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych w neuroendokrynnych liniach komórkowych raka płuc z wykorzystaniem CUT&RUN

Poznaj zoptymalizowaną metodę wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP do analizy stanów chromatyny w tkankach nowotworowych i liniach komórkowych raka. Ta technika umożliwia jednoczesne przetwarzanie wielu próbek i modyfikacji histonowych.

Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal

Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych

Przeglądaj więcej filmów