Oczyszczanie hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka z perfuzji wątroby myszy
February 12th, 2018
Celem tego protokołu jest uzyskanie wysokiej żywotności i wysokiej wydajności hepatocytów i komórek śródbłonka sinusoidalnego z wątroby. Osiąga się to poprzez perfuzję wątroby roztworem kolagenazy typu IV przez żyłę wrotną, a następnie wirowanie różnicowe w celu uzyskania hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka.
Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie udanej perfuzji wątroby myszy, aby ułatwić oczyszczanie określonych populacji komórek wątroby będących przedmiotem zainteresowania. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie hepatologii dotyczące tego, jak wspomagać funkcje określonych populacji komórek wątroby w testach in vitro lub in vivo. Główną zaletą tej techniki jest duża ilość hepatocytów w sinusoidalnych komórkach śródbłonka, które można pozyskać z każdej wątroby.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ ważne jest, aby zobaczyć kolor i kształt optymalnie trawionej wątroby, aby zachować żywotność komórek. Aby umieścić cewnik do żyły wrogiej, najpierw użyj tylnej części kleszczy, aby przesunąć jelita na prawą stronę jamy brzusznej myszy, odsłaniając żyłę wrotną, a następnie użyj zakrzywionych kleszczyków, aby wsunąć 20-centymetrowy kawałek poliestrowej nici do szycia pod żyłę wrotną między wątrobą a żyłą dwunastnicy górną trzustki. Użyj kleszczy, aby ostrożnie przeciągnąć nić na drugą stronę zwierzęcia, tak aby była wyśrodkowana pod żyłą wrotną.
I zawiąż luźny węzeł nad głową wokół żyły wrotnej. Umieść zakrzywione kleszcze pod żyłą i delikatnie pociągnij cały materiał tkankowy w kierunku ogona, aby wyprostować żyłę. Następnie umieść skos igły cewnika skierowany do góry i równolegle do dolnej części żyły wrotnej w pobliżu kleszczy i delikatnie nakłuj żyłę igłą.
Gdy skos znajdzie się w świetle żyły, wycofaj sprężynową igłę i kontynuuj przepychanie cewnika Palmera przez żyłę, aż skos znajdzie się w pobliżu rozgałęzionego obszaru Wenus. Po zamocowaniu węzła wokół cewnika natychmiast ustaw pompę perystaltyczną na cztery milimetry na minutę i podłącz męski koniec rurki do żeńskiego końca cewnika, w którym to momencie powinieneś zacząć widzieć gałąź wątroby. Przetnij aortę brzuszną w celu drenażu.
Użyj taśmy maskującej, aby unieruchomić rurkę na podkładce. Użyj nożyczek, aby przeciąć skórę brzucha pionowo, aby umożliwić drenaż krwi i płynu perfuzyjnego. Następnie ściśnij naczynie krwionośne ścieku kilka razy prostymi kleszczami, aby napompować wątrobę, upewniając się, że cała krew odpłynęła, i perfunduj wątrobę PBS, aż tkanka wątroby zblednie.
Aby zebrać hepatocyty, najpierw zmień rurkę odpływową z jednolitrowej kolby PBS na kolbę o pojemności 125 mililitrów, zawierającą bufor drugi, uzupełnioną kolagenazą-4. Kiedy kolagenaza dotrze do wątroby, krótko, ale mocno ściśnij naczynie krwionośne, aby wytworzyć ciśnienie i pozwolić, aby bufor trawienny wypełnił wszystkie płaty wątroby. Zwolnij naczynie, zanim bufor przebije się przez tkankę łączną otaczającą wątrobę.
I pozwól buforowi przetoczyć się przez wątrobę, aż cała objętość przepłynie przez tkankę. Następnie umieść naczynie krystalizujące zawierające 10 mililitrów buforu obok myszy i użyj prostych kleszczy i nożyczek, aby przenieść wątrobę do naczynia. Przenieś naczynie do sterylnego kaptura do hodowli tkanek i używając sterylnej techniki, chwyć wątrobę, aby oderwać kapsułkę.
Delikatnie potrząśnij komórkami z tkanki wątroby i przelej powstały roztwór komórkowy przez filtr o średnicy 100 mikronów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Następnie wypłucz resztki wątroby z filtra większą ilością buforu. Kiedy wątroba wydaje się być pozbawiona komórek, przecedź wciągnięty filtrat przez 40-mikronowy filtr do drugiej 50-mililitrowej probówki i zbierz komórki przez odwirowanie.
Wylej komórkę niemiąższową i martwy hepatocyt zawierający supernatant do nowej 50-mililitrowej probówki na lodzie jednym ruchem, aby zachować osad i ponownie zawiesić osad w 40 mililitrach świeżego buforu do następnego wirowania. Aby wyizolować sinusoidalne komórki śródbłonka, odwirować supernatanty zawierające komórki niemiąższowe. Wyciągnij zawiesiny ogniw do jednej nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i zwiększ całkowitą objętość do 35 mililitrów.
Zebrać pobrane komórki przez odwirowanie i za pomocą pipety o pojemności 25 mililitrów ostrożnie przenieść górne 25 mililitrów komórki niemiąższowej zawierającej supernatant do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki na lodzie. Dodaj 25 mililitrów świeżej pożywki do probówki i ponownie zawiesić osad do drugiego odwirowania i usunięcia sklarowanego osadu. Następnie odwirować supernatant i dodać 15 mililitrów 50% roztworu Percollu do nowej 50-mililitrowej probówki.
Używając pipetera ustawionego na najniższą prędkość wyrzutu, nałóż 20 mililitrów 25% Percollu na 50% roztwór Percollu i ponownie zawieś komórki niemiąższowe w 10 mililitrach podłoża o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie ułóż komórki na roztworze Percollu. I oddziel komórki przez wirowanie w gradiacji gęstości.
Następnie odessaj pierwsze 30 mililitrów roztworu i użyj plastikowej pięciomililitrowej pipety transferowej, aby zebrać sinusoidalny śródbłonek i komórki Kupffera znajdujące się na interfazie roztworu gradientu gęstości od 25 do 50% do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki. Umyj komórki 50 mililitrami pożywki i ponownie zawiesić granulkę, jednocześnie płucząc boki dna probówki w 12 mililitrach ciepłego podłoża. Aby oddzielić sinusoidalne komórki śródbłonka od komórek Kupffera, przenieś zawiesinę komórkową na polistyrenową szalkę Petriego w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych na osiem minut.
Pod koniec inkubacji użyć pipety o pojemności 25 mililitrów do odessania supernatantu i użyć supernatantu do przepłukania naczynia pipetą ustawioną na najniższą prędkość, aby zebrać pozostałe sinusoidalne komórki śródbłonka. Następnie przenieś sinusoidalne komórki śródbłonka do nowej 50-mililitrowej probówki. Następnie zbierz komórki przez odwirowanie w celu ich ponownego zawieszenia i posiewu w naczyniach do hodowli komórkowych pokrytych kolagenem.
Skaningowa mikroskopia elektronowa wątroby myszy po perfuzji niefiksywnej PBS w sposób podobny do tego, jak właśnie pokazano, ujawnia wyraźny obraz mikroanatomii wątroby i mikrokosmków między hepatocytami. Hepatocyty pobrane podczas wirowania z niską prędkością na początku procedury wykazują wysoką czystość po czterech płukaniach w zawierających albuminę surowicy bydlęcej. Oddzielenie sinusoidalnych komórek śródbłonka przez selektywną adhezję na pokrytej kolagenem polistyrenowej szalce Petriego skutkuje czystością od 83 do 90%, która w dużej mierze zależy od ogólnej skuteczności trawienia kolagenazy.
Pomiary ilościowe przy użyciu mikroskopii świetlnej z reprezentatywnej procedury separacji, jak właśnie zademonstrowano, ujawniają typowe wyniki izolacji prawie 100% czystej populacji hepatocytów. I nieco ponad 89% czystej populacji sinusoidalnych komórek śródbłonka. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak kateizować żyłę wrotną myszy i jak oczyścić zarówno hepatocyty, jak i sinusoidalne komórki śródbłonka z wątroby myszy.
Procedura ta może być również stosowana do oczyszczania komórek satelitarnych z frakcji niemiąższowej po izolacji hepatocytów przy użyciu różnych gradientów gęstości i prędkości wirowania.
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę przeprowadzania Perfusji Wątroby Myszy w celu izolacji wysokich wydajności hepatocytów i komórek śródbłonka sinusoidalnego. Technika polega na perfuzji wątroby roztworem kolagenazy i wykorzystaniu dyferencyjnej centryfugacji do oczyszczenia określonych populacji komórek wątrobowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hepatologia
- Biologia komórki
- Testy in vitro
Tło
- Zrozumienie funkcji komórek wątroby jest kluczowe dla badań hepatologicznych.
- Izolacja określonych komórek wątroby pomaga w badaniu ich ról w różnych testach.
- Wysoka żywotność i wydajność komórek są niezbędne dla sukcesu eksperymentu.
- Ocenie wizualnej trawienia wątroby jest ważne dla zachowania integralności komórek.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody izolacji hepatocytów i komórek śródbłonka sinusoidalnego.
- Poprawa zrozumienia funkcji komórek wątroby w badaniach.
- Dostarczenie szczegółowego protokołu dla badaczy w tej dziedzinie.
Stosowane metody
- Perfuzja wątroby roztworem kolagenazy przez żyłę wrotną.
- Dyferencyjna centryfugacja do oddzielenia populacji komórek.
- Centryfugacja w gradientzie gęstości dla dalszej oczyszczenia komórek śródbłonka sinusoidalnego.
- Ocenie wizualnej i ostrożne postępowanie, aby zapewnić żywotność komórek.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja hepatocytów i komórek śródbłonka sinusoidalnego.
- Wysoka żywotność i wydajność komórek osiągnięta opisanym metodą.
- Wyraźna wizualizacja mikroanatomii wątroby za pomocą skaningowej mikroskopii elektronownej.
- Protokół zapewnia ramy dla przyszłych badań hepatologicznych.
Wnioski
- Protokół jest skuteczny w izolacji populacji komórek wątrobowych.
- Wysoka wydajność i żywotność komórek wspierają ich zastosowanie w badaniach.
- Metoda może ułatwić postęp w rozumieniu biologii wątroby.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables reliable isolation of primary hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver, providing a physiologically relevant system for studying liver-specific drug metabolism and toxicity. The method supports early discovery by delivering high-yield, viable cells for in vitro assays that inform target validation and lead optimization. By minimizing ischemia-reperfusion injury through portal vein catheterization, it enhances data reproducibility across discovery and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for interrogating hepatic target engagement and pathway modulation in vitro.
- Operational Value: Delivers consistent hepatocyte yields for functional assays that de-risk mechanistic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Enables preparation of purified sinusoidal endothelial cells for co-culture models that improve assay predictability.
- Operational Value: Supports standardized cell isolation for scalable screening platforms assessing compound effects on liver sinusoidal signaling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers a translational biomarker-aligned system for studying liver-specific drug responses prior to in vivo testing.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical evaluation by supplying well-characterized primary liver cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting early biology through lead identification by supplying validated primary hepatocytes for ADME/Tox screening and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of liver targets using primary cells that retain in vivo-like functionality.
- Screening: Delivers reproducible hepatocyte and SEC preparations for quantitative compound screening in metabolic and inflammatory pathways.
- Analytics: Generates viable cell lysates and cultured cells for biochemical readouts such as enzyme activity, cytokine release, and barrier integrity.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by providing cells that reflect murine liver biology for target validation studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation workflow for generating consistent liver cell preparations across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in liver-related target validation through use of primary, physiologically relevant cells.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via a well-defined perfusion and centrifugation protocol.
- Strategic Value: Reduces late-stage attrition by improving early detection of liver-mediated liabilities.
- Portfolio Impact: Enables risk-informed prioritization of compounds based on hepatic cell-based assay outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse surgery and vascular catheterization for successful portal vein access.
- Depends on perfusion pumps, centrifuges, and sterile tissue culture facilities for cell processing.
- Necessitates standardization of collagenase digestion times and buffer conditions across operators.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different mouse strains or ages.
- Limited by the technical challenge of portal vein catheterization in smaller mice (18–25 g), which may affect throughput.
