Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

Celem tego eksperymentu jest zastąpienie aminokwasu kanonicznego aminokwasem niekanonicznym do produkcji białek rekombinowanych poprzez selektywne włączenie ciśnieniowe w celu wytworzenia nowego białka fluorescencyjnego złota. Metoda selektywnego wprowadzania ciśnienia ma na celu wytworzenie białek o nowych cechach chemicznych. Jest to szczególnie przydatne, gdy próbuje się zrozumieć lub zmodyfikować funkcję białka.

Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona stosunkowo prosta do przeprowadzenia, ponieważ jest podobna do powszechnej produkcji białek rekombinowanych. Fluorescencja skorelowana z czasem i długością fali jest pomocna w badaniu dynamiki stanu wzbudzonego zmodyfikowanego białka, co z kolei ułatwia zrozumienie wpływu niekanonicznego aminokwasu wprowadzonego do chromoforu na właściwości optyczne. SPI można w zasadzie stosować do każdego środowiska produkcji białka, dla którego dostępne są szczepy auksotroficzne i chemicznie zdefiniowane podłoża.

Obejmuje to inne szczepy bakterii, a także hodowle komórek ssaków. Czas i ustawienie warunków ekspresji mają kluczowe znaczenie, ponieważ konieczne jest zahamowanie produkcji niezmodyfikowanego białka typu dzikiego. Dlatego niektóre parametry, takie jak temperatura, czas indukcji lub skład podłoża uprawowego, muszą zostać zoptymalizowane.

Na pomysł tej metody po raz pierwszy wpadł nam do głowy po wstępnych badaniach nad ekstraktem białkowym z aminokwasami zawierającymi metyl, takimi jak selenometionina. Procedurę zademonstruje Almut Pelzer, student z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, przekształć auksotroficzne komórki E. coli tryptofanu w plazmid ekspresyjny dla ECFP.

Użyj pojedynczej kolonii do zaszczepienia prekultury składającej się z pięciu mililitrów pożywki LB uzupełnionej ampicyliną w probówce hodowlanej. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min. Następnego dnia zaszczepić 100 mililitrów uzupełnionej pożywki NMM19 za pomocą jednego mililitra nocnej kultury w litrowej kolbie Erlenmeyera.

Następnie inkubuj kulturę przez noc w wytrząsarce orbitalnej przy 200 obr./min i 30 stopniach Celsjusza. Następnego dnia mierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach co 30 minut, aż wartość zmieni się o mniej niż 0,05 w ciągu 30 minut. Następnie odwiruj kulturę w temperaturze 5 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby zebrać komórki bakteryjne.

Odrzucić supernatant przez dekantację. Ponownie zawiesić komórki w pożywce NMM19 uzupełnionej ampicyliną do całkowitej objętości 100 mililitrów. Przenieść tę zawiesinę z powrotem do tej samej kolby Erlenmeyera.

Dodaj 4-aminoindol do końcowego stężenia jednego milimola. Inkubować w wytrząsarce orbitalnej przez 30 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obr./min. Po 30 minutach dodaj IPTG do kultury do końcowego stężenia 0,5 milimola, aby wywołać ekspresję docelowego genu.

Inkubować przez noc w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obr./min. Następnego dnia zbierz komórki bakteryjne, odwirowując je w temperaturze 5 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Odrzucić supernatant przez dekantację.

Zamroź osad komórkowy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do przeprowadzenia docelowego oczyszczania białka. Najpierw przygotuj lizat komórek bakteryjnych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po przygotowaniu kolumny chromatograficznej zgodnie z instrukcjami producenta, należy użyć buforu wiążącego w celu zrównoważenia kolumny chromatograficznej z immobilizowanym powinowactwem do jonów metali.

Załaduj lizat na kolumnę aż do zakończenia. Zwróć uwagę na białko o złotym kolorze związane z żywicą chromatograficzną. Umyć kolumnę buforem wiążącym.

Następnie eluować białko docelowe za pomocą buforu elucyjnego. Zbierz i połącz wszystkie elucjowane frakcje, które zawierają złoto fluorescencyjne białko, które można zidentyfikować po widocznym złotym kolorze. Następnie należy przygotować membranę do dializy o masie cząsteczkowej odciętej między 5 000 a 10 000 zgodnie z instrukcjami producenta.

Dializować jednomililitrową próbkę w stosunku do co najmniej 100 mililitrów buforu przez co najmniej dwie godziny. Na początek użyj buforu MS, aby rozcieńczyć próbkę białka do 0,1 miligrama na mililitr, tak aby końcowa objętość wynosiła 80 mikrolitrów. Ostrożnie odpipetować do wymieszania.

Przenieść roztwór do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek MS ze szklaną wkładką i zamknąć ją nakrętką. Trzepotać fiolkę, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie należy przygotować ślepą próbę zawierającą bufor MS w drugiej fiolce.

Umieścić obie fiolki w automatycznym podajniku próbek HPLC. Następnie przygotuj i skalibruj przyrząd MS zgodnie z instrukcjami producenta. Ustaw objętość wtrysku automatycznego podajnika próbek na pięć mikrolitrów dla wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z metodą spektrometrii mas czasu przelotu z jonizacją elektrorozpylania.

Utwórz listę roboczą dla pustego przebiegu, a następnie przykładowy przebieg GdFP. Przypisz objętość iniekcji, odpowiednie pozycje fiolek automatycznego podajnika próbek i uruchom listę roboczą. Na początek przygotuj roztwór białka fluorescencyjnego złota i detektor do zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych z czasem i długością fali, jak opisano w protokole tekstowym.

Za pomocą oprogramowania do liczenia pojedynczych fotonów uzyskaj emisję fluorescencji z szybkością zliczania około 200 000 fotonów na sekundę, aż około 10 000 zliczeń zostanie skumulowanych w maksimum akwizycji krzywych rozpadu fluorescencji. Następnie zastąp kuwetę próbki jednocentymetrową kuwetą kwarcową wypełnioną krzemionką koloidalną w buforze PBS. Wyjmij filtr laserowy i dostosuj siatkę do akwizycji fotonów o długości 470 nanometrów w centralnym kanale detektora.

Następnie uzyskuj funkcję odpowiedzi instrumentalnej, aż około 10 000 zliczeń zostanie skumulowanych w maksimum emisji. Przekształć, dopasować i wykreślić wynikowe dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym, aby uzyskać widma związane z rozpadem, które reprezentują zależność czasów rozpadu fluorescencji od długości fali emisji. W tym badaniu spektrometria mas jest stosowana w celu potwierdzenia, że wariant fluoroforu typu białka fluorescencyjnego z przesunięciem ku czerwieni z przesunięciem ku czerwieni, zwany białkiem fluorescencyjnym złota, jest pomyślnie wytwarzany.

Podczas gdy ECFP typu dzikiego ma obliczoną masę białka 28 283,9 daltonów po dojrzewaniu chromoforu, odpowiadająca jej masa białka fluorescencyjnego złota wynosi 28 313,9 daltonów. Zdekonwolucyjne widmo ESI-MS białka fluorescencyjnego złota wykazuje główny pik masy na poziomie około 28 314,1 daltonów, odbiegając od wartości teoretycznej o mniej niż 10 części na milion. Potwierdza to włączenie niekanonicznego aminokwasu przez selektywne włączenie ciśnieniowe.

Widmo absorpcyjne ECFP ma dwa charakterystyczne maksima przy 434 nanometrach i 452 nanometrach. Natomiast złoto fluorescencyjne białko charakteryzuje się jednym szerokim, przesuniętym ku czerwieni pasmem absorpcyjnym, z maksimum przy 466 nanometrach. Podczas gdy maksimum absorpcji EGFP jest dalej przesunięte ku czerwieni do 488 nanometrów, widmo emisji fluorescencji fluorescencji złota i odpowiadające mu przesunięcie Stokesa GdFP oznacza, że jest to najbardziej przesunięta ku czerwieni ze wszystkich pochodnych zielonego białka fluorescencyjnego Aequorea victoria.

Czasowo-rozdzielcza emisja fluorescencji monitorowana za pomocą zliczania pojedynczych fotonów jest pokazana tutaj. Krzywe rozpadu wykazują nieco szybszy rozpad fluorescencji przy 600 nanometrach niż przy 550 nanometrach. Emisja fluorescencji złota silnie zależy od pH, co jest typowe dla wielu wariantów białka zielonej fluorescencji.

Jak widać tutaj, następuje wyraźny spadek fluorescencji przy niższym pH, chociaż charakterystyka widmowa pozostaje stała. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech dni, zaczynając od kolonii z przekształconych komórek bakteryjnych lub z zamrożonych zapasów glicerolu. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że docelowy aminokwas jest wyczerpany.

ncAA musi zostać wychwycony przez komórkę, biokompatybilny i włączony do białek przez wybrany szczep auksotroficzny. Po tej procedurze można wygenerować dużą różnorodność białek do celów inżynieryjnych. W zależności od docelowego białka metody takie jak analizatory stabilności białek, testy aktywności enzymatycznej, spektroskopia fluorescencyjna lub krystalizacja białek, mogą być używane do opisania wpływu niekanonicznego aminokwasu na właściwości funkcjonalne i strukturalne.

Po opracowaniu technika ta okazała się bardzo przydatna w dziedzinie biologii syntetycznej, dostarczając jej nowych w naturze białek i proteomów. Zwiększa to możliwości chemiczne inżynierii białek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak włączyć niekanoniczne aminokwasy do rekombinowanych białek poprzez selektywne włączenie ciśnieniowe, jak zweryfikować wprowadzenie sztucznego aminokwasu za pomocą spektrometrii mas i jak analizować białko fluorescencyjne za pomocą fluorescencji rozdzielczej w czasie.