Name: Produkcja i oczyszczanie bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Poznaj produkcję i oczyszczanie bakulowirusa w kulturze komórek owadzich Sf9 do zastosowań w terapii genowej. Ta metoda obejmuje chromatografię afinityczną na heparynie i ultrawirówkę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca jest częściowo wspierana przez fundusze Start-Up z Cincinnati Children's Research Foundation (CCRF) dla M.N. oraz Innovative Core Grant (ICG) wspierany przez National Center for Advancing Translational Sciences of the National Institutes of Health w ramach Nagrody Numer UL1 TR001425. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Zobacz Rysunek 1 dla ilustracji podsumowującej protokół.
1. Oczyszczanie DNA plazmidu bakulowirusa
<ol>
	<li>Hoduj kulturę bakteryjną zawierającą plazmidowe DNA plazmidu bakulowirusa (bacmid)14 w 200 ml bulionu LB z antybiotykami; kanamycyną (50 μg/ml), tetracykliną (10 μg/ml) i gentamycyną (7 μg/ml), przez 16 godzin w temperaturze 37 °C na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 300 obr./min.</li>
	<li>Oczyść DNA bakterii z kultury bakteryjnej za pomocą standardowego protokołu lizy alkalicznej15 i rozpuść bakcyd w buforze TE.</li>
</ol>
2. Produkcja bakulowirusa
<ol>
	<li>Hodowla komórek Sf9 w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną przy prędkości 135 obr./min i temperaturze 28 °C w poliwęglanowej kolbie Erlenmeyera zawierającej pożywkę do hodowli owadów bez surowicy1,2,3. 
	nuta: Jeśli komórki Sf9 zostaną rozmrożone z zamrożonego materiału, odczekaj co najmniej dwa tygodnie, aby komórki odzyskały siły i weszły w wykładniczą fazę wzrostu.</li>
	<li>Policz komórki Sf9 zebrane w wykładniczej fazie wzrostu za pomocą hemocytometru po barwieniu błękitem trypanowym. Zasiew 1 x 106 żywotnych komórek Sf9 na studzienkę na 6-dołkowej płytce poddanej działaniu kultur tkankowych w 2 ml pożywki. Pozostawić komórkę do przyczepienia się na 1 godzinę w temperaturze 28 °C w inkubatorze.</li>
	<li>Zastąp pożywkę wzrostową 1 ml niewzbogaconej pożywki do hodowli owadów Grace's bez surowicy.</li>
	<li>Transfekcja DNA bakcydu do komórek Sf9 za pomocą odczynnika do transfekcji komórek owadów.
	<ol>
		<li>Zmieszaj 8 μl odczynnika do transfekcji komórek owadów ze 100 μl pożywki dla owadów Grace's Insects.</li>
		<li>Rozcieńczyć 2 μg bakimidowego DNA w 100 μl niesuplementowanej pożywki dla owadów i delikatnie wymieszać przez wirowanie.</li>
		<li>Połącz rozcieńczone DNA z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji komórek owadów i delikatnie wymieszaj. Inkubować przez 15 do 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodawaj mieszaninę DNA-lipid kroplami do komórek. Inkubować w temperaturze 28 °C w inkubatorze przez około 5 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć mieszaninę transfekcji z komórek i przemyć komórki 2 ml PBS.</li>
	<li>Dodać 2 ml pożywki do hodowli owadów i kontynuować hodowlę w temperaturze 28 °C w inkubatorze bez zmiany pożywki. 
	nuta: Jeśli bakcyd zawiera białko fluorescencyjne, jego ekspresję można wykryć w komórkach 48 godzin po transfekcji. Bakulowirus jest wytwarzany przez transfekowane komórki Sf9 i wydzielany do pożywki hodowlanej, która następnie infekuje nietransfekowane komórki. Cała populacja komórek zostaje zakażona bakulowirusem w ciągu 5 dni i wykazuje oznaki infekcji wirusowej, zwanej również efektem cytopatycznym. Należą do nich zwiększona średnica komórek, wakuole/granulki w cytoplazmie, zatrzymanie wzrostu komórek oraz martwe lub zlizowane komórki są obecne w hodowli komórkowej. Jeśli jednak skuteczność transfekcji lub infekcji nie jest optymalna, hodowla może nie wykazywać oczywistego efektu cytopatycznego. Efekt cytopatyczny można uwidocznić za pomocą mikroskopu z odwróconymi fazami w powiększeniu 200 - 400X. Komórkę zakażoną bakulowirusem można wykryć poprzez barwienie przeciwciałem anty-gp6411.</li>
	<li>Pobrać supernatant bakulowirusa 5 dni po transfekcji i oznaczyć jako zapas wirusa P1.</li>
	<li>Przechowywać supernatant bakulowirusa, który jest wrażliwy na światło, w ciemności z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez krótki czas (do 90 dni) lub w temperaturze -80 °C przez długi czas.</li>
	<li>Nasiona 6 × 106 komórek Sf9 na 10-centymetrowej płytce poddanej działaniu kultur tkankowych w 10 ml pożywki do hodowli owadów. Dodać 1 ml początkowego supernatantu bakulowirusa (P1) do komórek.</li>
	<li>Zebrać supernatant bakulowirusa (P2) w 5dniu po zakażeniu.</li>
	<li>Zasiać 50 ml komórek Sf9 (3 x 106 komórek/ml) w hodowli zawiesinowej w pożywce do hodowli owadów w 250-mililitrowej kolbie Erlenmeyera z poliwęglanu i umieścić kolbę w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną. Dodać 2 ml bulionu P2 do komórek i wstrząsać z prędkością 135 obr./min, utrzymując stałą temperaturę 28 °C. 
	nuta: Trzy lub cztery dni po zakażeniu cała populacja komórek Sf9 wykaże efekt cytopatyczny , co wskazuje na produkcję bakulowirusa o wysokim mianie.</li>
	<li>Sekwencyjnie amplifikować supernatanty bakulowirusa, aż do uzyskania pożądanej objętości (P3, P4, ....) poprzez zwiększanie od 10 do 50 razy objętości hodowli komórkowej w każdej kolejnej infekcji. 
	nuta: P3 totrzecia runda infekcji, w której od 500 ml do 1 l hodowli komórek Sf9 można zainfekować 10 do 20 ml supernatantu bakulowirusa P2; P4 toczwarta runda infekcji, w której 5 do 10 l hodowli komórek Sf9 może zostać zakażonych 100 do 200 ml supernatantu bakulatowirusa P3 i tak dalej. Zazwyczaj komórki Sf9 wysiewa się w ilości 3 × 106 komórek/ml w pożywkach do hodowli owadów bez surowicy.</li>
	<li>Odwirować supernatant bakulowirusa w temperaturze 1 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórkowych i poddać supernatant bakulowirusa działaniu nukleazy w ilości 50 jednostek/ml (250 jednostek/μl podstawy) przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w celu roztrawienia genomowego DNA i RNA. Przefiltrować supernatanty przez jednostkę filtracyjną 0,45 μm.</li>
</ol>
3. Przygotowanie systemu chromatograficznego
<ol>
	<li>Przygotować układ chromatograficzny, kolejno przepłukując próbkę i linie buforowe sterylną wodą, 1 N wodorotlenkiem sodu, wodą i buforem do przemywania (20 mM bufor fosforanu sodu zawierający 150 mM chlorku sodu, pH 7,0) przy liniowym natężeniu przepływu 50 ml/min.</li>
	<li>Przygotować kolumnę o pojemności 50 μm heparyny (10 × 10 cm, 7,9 ml objętości kolumny (CV)) przez sekwencyjnie uruchamiany bufor do czyszczenia kolumny (5 CV sterylny 20 mM bufor fosforanu sodu 5 CV zawierający 2 M chlorek sodu, pH 7,0) i bufor płuczący 5 CV przy liniowym natężeniu przepływu 7 ml/min.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie wektora bakulowirusa
<ol>
	<li>Skonfigurować system chromatograficzny w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Użyj portu wlotowego ładowania próbki do załadowania supernatantu bakulowirusa.</li>
		<li>Użyj portu wlotowego bufora A1 do załadowania bufora myjącego. Przygotuj butelkę z co najmniej 500 ml buforu do płukania i umieść linię buforową do płukania w butelce.</li>
		<li>Użyć portu wlotowego buforu A2 do załadowania buforu elucyjnego (20 mM fosforanu sodu z 1,5 M chlorku sodu, pH 8,0). Przygotować butelkę z co najmniej 500 ml buforu elucyjnego i umieścić w niej przewód buforu elucyjnego.</li>
		<li>Włożyć kilka stożkowych probówek o pojemności 50 ml do kolektora frakcji, aby zebrać supernatant bakulowirusa przechodzącego przez kolumnę, bufor do przemywania i eluowany bakulowirus.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zrównoważyć kolumnę z heparyną z pięcioma objętościami kolumny (CV) o pojemności 7,9 ml buforu do przemywania (40 ml) przy liniowym natężeniu przepływu 7,0 ml/min.</li>
	<li>Załadować 250 ml supernatantu bakulowirusa do kolumny heparyny za pomocą pompy do pobierania próbek (port wlotowy próbki) systemu chromatograficznego przy liniowym natężeniu przepływu 2,0 ml/min.</li>
	<li>Przepuścić 10 CV (80 ml) buforu płuczącego przez kolumnę z heparyną przy liniowym natężeniu przepływu 2,0 ml/min, aż krzywa absorbancji ultrafioletu (UV) (280 nm) powróci do wartości wyjściowej i stanie się stabilna.</li>
	<li>Eluować cząstki bakulowirusa z kolumny heparyny o pojemności 7,9 ml za pomocą 5 CV (40 ml) buforu elucyjnego przy liniowym natężeniu przepływu 4,0 ml/min. Uważaj na ostry pik elucji białka na chromatogramie, gdy cząstki bakulowirusa dysocjują od kolumny heparyny.</li>
	<li>Po elucji natychmiast rozcieńczyć wymyty supernatant bakulowirusa 10-krotnie, używając 20 mM buforu fosforanu sodu w wodzie, aby zapobiec inaktywacji cząstek bakulowirusa w wyniku wstrząsu osmotycznego podczas późniejszego wirowania.</li>
	<li>Przechowywać 100 μl każdej z frakcji, łącznie z przepływem kolumny zebranym podczas ładowania supernatantu bakulowirusa, buforu do przemywania i eluatu. Zakażon te frakcje bakulowirusa HT1080 w celu oceny procesu oczyszczania (patrz punkt 6).</li>
	<li>Oczyść kolumnę za pomocą bufora do czyszczenia kolumny i buforu do mycia. Na koniec przepłukać kolumnę sterylnym 20% etanolem o natężeniu 5 CV w wodzie przy liniowym natężeniu przepływu 7,0 ml/min i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Oczyścić układ chromatograficzny wodą, 1 N wodorotlenkiem sodu, ponownie wodą i 20% etanolem w wodzie przy liniowym natężeniu przepływu 50,0 ml/min i przechowywać system w 20%</li> etanolu.
</ol>
5. Stężenie bakulowirusa
<ol>
	<li>Wstępnie wysterylizuj probówki wirówkowe za pomocą autoklawu. Dodać równą objętość supernatantu bakulowirusa do każdej probówki ultrawirówki w kapturze do hodowli tkankowej. Zmierzyć masę probówki za pomocą wagi i wyregulować wagę zawartości probówek ultrawirówek za pomocą sterylnego PBS.</li>
	<li>Umieść każdą z probówek ultrawirówek w przeciwległym wiadrze wirnika SW 32 Ti.</li>
	<li>Uruchomić ultrawirówkę przy 80 000 × g przez 90 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Otwórz probówki ultrawirówkowe w okapie do hodowli tkanek i asepcie zasysaj płyn bez usuwania osadu bakulowirusa.</li>
	<li>Zawiesić osad z każdej probówki, energicznie pipetując w górę iw dół za pomocą 200 μl PBS zawierającego 0,5% (w/vol) BSA.</li>
	<li>Przenieść skoncentrowany bakulowirus do kriowioliów (50 do 100 μl na fiolkę) i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
6. Miareczkowanie bakulowirusa
<ol>
	<li>Dzień przed zakażeniem należy policzyć komórki HT1080 za pomocą hemocytometru po wybarwieniu komórek błękitem trypanowym. Wysiew 1 x 105 komórek HT1080 na studzienkę na płytce 6-dołkowej w 2 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Wysiewaj kilka dodatkowych dołków, aby móc określić dokładną liczbę komórek obecnych w momencie infekcji. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	nuta: Komórki HT1080 są używane do miareczkowania, ponieważ wyrażają wyższy poziom siarczanu heparanu w porównaniu z innymi liniami komórkowymi16. Ponieważ komórki HT1080 przylegają, miareczkowanie jest prostsze i mniej czasochłonne w porównaniu z tradycyjnym miareczkowaniem opartym na Sf9.</li>
	<li>W dniu infekcji określ liczbę komórek w studzience, licząc komórki z dołków. Zakażone komórki należy dodać rozcieńczonego pierwotnego bakulowirusa, który został odłożony na bok przed oczyszczeniem kolumny, oraz z próbkami z frakcji przepływowej, płuczącej i elucyjnej. Dla każdej próbki należy określić rozcieńczenie i objętość empirycznie na podstawie zakaźnych cząstek bakulowirusa i zainfekować każdą studzienkę w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Dwa dni po zakażeniu przeanalizuj komórki pod kątem ekspresji interesującego genu. Komórki mogą być analizowane za pomocą cytometru przepływowego, jeśli wyrażają białko fluorescencyjne (np. GFP)17.</li>
	<li>Obliczyć miana (jednostka infekcyjna na ml) na podstawie liczby komórek obecnych w czasie zakażenia, współczynnika rozcieńczenia i zawartości procentowej białka fluorescencyjnego w komórkach, stosując wzór: (liczba komórek podczas zakażenia × procent komórek dodatnich × białko fluorescencyjne współczynnik rozcieńczenia)/objętość bakulowirusa w ml. 
	nuta: Na przykład, jeśli całkowita liczba komórek w basenie w momencie infekcji wynosi 1,2 × 105, procent białka fluorescencyjnego wynosi 5%, współczynnik rozcieńczenia wynosi 100, a objętość dodanego rozcieńczonego bakulowirusa wynosi 10 μl, miano wynosi 6 × 107 jednostek zakaźnych (IU)/ml.</li>
</ol>

<ol><li>Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+cell+culture+for+industrial+production+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).</li>
<li>Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+using+the+baculovirus-insect+cell+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Protein production using the baculovirus-insect cell expression system.</a> Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).</li>
<li>Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+vaccines+produced+in+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein vaccines produced in insect cells.</a> Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).</li>
<li>Boyce, F. M., Bucher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus-mediated+gene+transfer+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).</li>
<li>Airenne, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus%3A+an+insect-derived+vector+for+diverse+gene+transfer+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications.</a> Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).</li>
<li>Sung, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+into+cell+lines+and+stem+cells+using+baculovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).</li>
<li>Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transient+transduction+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neurons+with+baculoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors.</a> Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).</li>
<li>Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculoviral+vector-mediated+transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).</li>
<li>Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-exchange+membrane+chromatography+method+for+rapid+and+efficient+purification+of+recombinant+baculovirus+and+baculovirus+gp64+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein.</a> Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).</li>
<li>Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+recombinant+baculovirus+of+Autographa+californica+M+nucleopolyhedrovirus+by+ion+exchange+membrane+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography.</a> J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).</li>
<li>Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+baculovirus+vectors+using+heparin+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071(2016).</li>
<li>Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6-o-+and+N-sulfated+syndecan-1+promotes+baculovirus+binding+and+entry+into+Mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells.</a> J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).</li>
<li>Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+in+baculovirus+binding+and+entry+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells.</a> J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).</li>
<li>Urabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+generation+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+type+5+in+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells.</a> J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).</li>
<li>Feliciello, I., Chinali, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+alkaline+lysis+method+for+the+preparation+of+highly+purified+plasmid+DNA+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli.</a> Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).</li>
<li>Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Membrane-associated+heparan+sulfate+is+a+receptor+for+prototype+foamy+virus+in+human%2C+monkey%2C+and+rodent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells.</a> Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).</li>
<li>Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+use+of+a+vaccinia+virus+neutralization+assay+based+on+flow+cytometric+detection+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein.</a> J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).</li>
<li>Kim, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+tumor+growth+in+xenograft+model+mice+by+programmed+cell+death+4+gene+delivery+using+folate-PEG-baculovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus.</a> Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).</li>
<li>Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculoviruses+as+vectors+for+gene+therapy+against+human+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer.</a> J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).</li>
<li>Nasimuzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+high-titer+foamy+virus+vector+for+the+treatment+of+leukocyte+adhesion+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004(2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje wytwarzanie bakulowirusa w komórkach Sf9 w hodowli zawiesinowej i oczyszczaniu bakulowirusa za pomocą chromatografii powinowactwa heparyny. Parametry stosowane w tym protokole maksymalizują wydajność i minimalizują inaktywację zakaźnego bakulowirusa. Przedstawiony tutaj protokół wykazuje znacznie lepszy odzysk cząstek bakulowirusa w porównaniu z wyzdrowieniami osiągniętymiprzez inne 9.
Ze względu na szeroki zakres gospodarzy i tropiz...

Baculovirus jest głównie używany do produkcji rekombinowanych białek i szczepionek w komórkach owadów lepidoptera Spodoptera fugiperda (Sf)9 przy użyciu rekombinowanego wirusa polihedrozy jądrowej Autographa californica multicapsid (AcMNPV)1,2,3,4. Ostatnio staje się obiecującym wektorem do zastosowania w terapii genowej5. Wiadomo, że ma szeroki tropizm gospodarza i tkanki, infekuje zarówno komórki w stanie spoczynku, jak i proliferujące, jest niepatogenny i nie integruje się z chromosomem gospodarza4,5,6. Co więcej, bakulowirus może być wytwarzany w hodowli zawiesinowej bez surowicy, która jest skalowalna i pozwala na przetwarzanie w systemie zamkniętym do przyszłej produkcji klinicznej1.
Czystość cząsteczek bakulowirusa jest ważna dla osiągnięcia skutecznej transdukcji przy jednoczesnym zminimalizowaniu cytotoksyczności7,8,9. Bakulowirus może być zagęszczany przez ultrawirowanie lub filtrację o przepływie stycznym (TFF) przy ograniczonym wpływie na jego zakaźność. Jednak procedury te koncentrują nie tylko cząsteczki wirusa, ale także szczątki komórkowe i białka z hodowli Sf9, które mogą być toksyczne in vitro (osobista obserwacja) i mogą wywoływać stan zapalny lub odpowiedź immunologiczną, gdy są stosowane in vivo. Aby tego uniknąć, zwłaszcza w przypadku stosowania wysoce skoncentrowanych zapasów wirusów, zakaźny bakulowirus musi zostać oczyszczony i oddzielony od cząstek skażających.
Opisano kilka metod oczyszczania i koncentracji wektorów bakulowirusa10,11,12. Spośród dostępnych metod, chromatografia powinowactwa heparyny pozwala na jednoetapowy wysoki poziom oczyszczania przy niskim stężeniu białek zanieczyszczających12. Metoda opiera się na identyfikacji siarczanu heparanu jako receptora dla bakulowirusa13,14. Po załadowaniu supernatantu komórek Sf9 do kolumny i związaniu bakulowirusa, kolumnę można przemyć buforem fizjologicznym (izotonicznym) w celu usunięcia niezwiązanych lub luźno związanych cząstek zanieczyszczających. Ponieważ wiązanie z heparyną jest odwracalne, cząsteczki bakulowirusa mogą być eluowane za pomocą buforu o wysokiej zawartości soli, który jest natychmiast rozcieńczany do fizjologicznego (izotonicznego) stężenia soli, aby zapobiec inaktywacji przez szok osmotyczny12. Co więcej, produkcja bakulowirusa, jak również wychwytywanie i elucja z kolumny chromatograficznej, mogą być prowadzone przy użyciu procesu systemu zamkniętego, który jest zgodny z obecnymi dobrymi praktykami wytwarzania (cGMP).
Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół produkcji, oczyszczania i koncentracji zakaźnego bakulowirusa za pomocą chromatografii powinowactwa i wirowania. Krótko mówiąc, wytwarzamy bakulowirusa przez transfekcję komórek Sf9 z plazmidowym DNA wirusa bakulowirusa w hodowli adherentnej i dalej rozwijamy zakaźnego bakulowirusa w hodowli zawiesinowej bez surowicy. Oczyszczamy bakulowirusa za pomocą chromatografii powinowactwa heparyny i stosujemy ultrawirowanie jako ostatni etap do silnego skoncentrowania wektora do zastosowania terapii genowej.

<table><tbody><tr><td>Akta Avant 150</td><td>GE Healthcare</td><td>28976337</td><td>System chromatograficzny</td></tr><tr><td>POROS Heparyna 50 &mikro; m Kolumna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4333414</td><td>Kolumna heparyny</td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Pozycja niekatalogowa</td><td>Koncentrat wirusa z dużą prędkością</td></tr><tr><td>Poliallomer Probówka do ultrawirówki</td><td>Beckman-Coulter</td><td>326823</td><td>Koncentratuje wirusa przy dużej prędkości</td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsarką orbitalną MaxQ 8000&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific pozycja</td><td>niekatalogowa</td><td>Shaker do hodowli zawiesinowych</td></tr><tr><td>250 ml Kolby Erlenmeyera</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>238071</td><td>Kolba do hodowli zawiesinowych</td></tr><tr><td>1 L Kolby Erlenmeyera</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>238072</td><td>Kolba do hodowli zawiesinowych</td></tr><tr><td>Mikroskop (Olympus CKX41)</td><td>Olympus</td><td>Pozycja niekatalogowa</td><td>Monitorowanie i liczenie komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75253839/433607</td><td>Do klarowania supernatantu Baculovirus</td></tr><tr><td>50 ml Probówka stożkowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td>Do pobierania 6-dołkowej płytki supernatantu Baculovirus</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>07-200-80</td><td>Płytka 10 cm poddana działaniu kultur tkankowych</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-772E</td><td>Płytka poddana hodowli tkankowej</td></tr><tr><td>Stericup-HV, 0,45&nbsp; &mikro; m, PVDF</td><td>EMD-Millipore</td><td>SCHVU05RE</td><td>Jednostka filtracyjna</td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15160-054</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw wektorów Bac-to-Bac</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10360-014</td><td>System ekspresji bakulowirusa</td></tr><tr><td>DH10B-T1R&nbsp; Właściwa komórka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12331-013</td><td>Właściwa komórka dla buforu bacmid</td></tr><tr><td>TE</td><td>In-house</td><td>Pozycja niekatalogowa</td><td>10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0.</td></tr><tr><td>Zestaw do plazmidu Maxiprep</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K2100-06</td><td>Do oczyszczania bakterii</td></tr><tr><td>Komórki Sf9</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11496-015</td><td>Komórki owadzie</td></tr><tr><td>Grace' s Pożywka do hodowli komórek owadów</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11605-094</td><td>Pożywka do transfekcji</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20012227</td><td>Mycie komórek, rozcieńczanie próbek</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Pożywka komórkowa owadów</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30278.02</td><td>Pożywka do wzrostu komórek owadów bez surowicy</td></tr><tr><td>Nukleaza benzonazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Enzym do degradacji DNA i RNA</td></tr><tr><td>Plazmid bakulowirusa (bacmid) DNA</td><td>Pozycja</td><td>niekatalogowa</td><td>Bacmid do produkcji bakulowirusa</td></tr><tr><td>Cellfectin II&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10362</td><td>Odczynnik do transfekcji komórek owadów</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4737</td><td>Stabilizuje Baculovirus</td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Thomas Scientific</td><td>1222C24</td><td>Do przechowywania Baculovirus</td></tr><tr><td>HT1080 linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td>Linia komórkowa fibroblastów</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td>Wzrost Pożywka dla linii komórkowych</td></tr><tr><td>Bufor do płukania</td><td>Pozycja</td><td>niekatalogowa</td> wewnętrzna <td>20 mmol/l Bufor fosforanowy zawierający 150 mmol/l chlorku sodu</td></tr><tr><td>Bufor elucyjny</td><td>Pozycja niekatalogowa</td><td></td><td>20 mmol/l Bufor fosforanowy zawierający 1,5 mol/l chlorku sodu</td></tr><tr><td>Bufor do czyszczenia kolumny</td><td>Pozycja</td><td>niekatalogowa</td><td>20 mmol/l Bufor fosforanowy zawierający 2,0 mol/l chlorku</td></tr> <tr><td>soduSterylna woda</td><td>In-house</td><td>Pozycja pozakatalogowa</td><td>Do czyszczenia Akta Avant</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.09137</td><td>Do czyszczenia Akta Avant</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7073</td><td>Do czyszczenia Akta Avant</td></tr></tbody></table>

produkcja i oczyszczanie bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Bakulowirus był tradycyjnie używany do produkcji rekombinowanego białka i szczepionki. Jednak ostatnio bakulowirus staje się obiecującym wektorem do zastosowania w terapii genowej. W tym przypadku bakulowirus jest wytwarzany przez przejściową transfekcję plazmidowego DNA bakulowirusa (bakidu) w przylegającej hodowli komórek Sf9. Bakulowirus jest następnie namnażany w komórkach Sf9 w kulturze zawiesinowej bez surowicy, aż do uzyskania pożądanej objętości. Następnie oczyszcza się go z supernatantu hodowli za pomocą chromatografii powinowactwa do heparyny. Supernatant wirusa jest ładowany do kolumny heparyny, która wiąże cząsteczki bakulowirusa w supernatancie ze względu na powinowactwo heparyny do glikoproteiny otaczającej bakulowirusa. Kolumnę przemywa się buforem w celu usunięcia zanieczyszczeń, a bakulowirus jest eluowany z kolumny za pomocą buforu o wysokiej zawartości soli. Eluat rozcieńcza się do stężenia soli izotonicznej, a cząsteczki bakulowirusa zagęszcza się dalej za pomocą ultrawirowania. Stosując tę metodę, bakulowirus może być skoncentrowany do 500-krotnie z 25% odzyskiem zakaźnych cząstek. Chociaż opisany tutaj protokół demonstruje produkcję i oczyszczanie bakulowirusa z kultur o objętości do 1 l, metodę tę można rozszerzyć w hodowli zawiesinowej w układzie zamkniętym w celu wytworzenia wektora klasy klinicznej do zastosowania w terapii genowej.

Przedstawiony protokół znajduje się w schemacie blokowym (Rysunek 1). Etapy obejmują przejściową transfekcję komórek Sf9 DNA bacmidu w celu produkcji bakulowirusa w hodowli adherentnej na płytce, następującą amplifikację w bezserwatkowej hodowli zawiesinowej, traktowanie nukleazą oraz klarowanie poprzez wirowanie i filtrację, a następnie oczyszczanie przy użyciu chromatografii powinowactwa do heparyny, a następnie zagęszczanie metodą ultrawirowania.
<p cl...

W tym protokole, bakulowirus jest wytwarzany przez przejściową transfekcję plazmidu bakulowirusa do komórek Sf9 i amplifikowany w kulturze zawiesinowej bez surowicy. Supernatant jest oczyszczany przez chromatografię powinowactwa heparyny i dalej zagęszczany przez ultrawirowanie. Protokół ten jest przydatny do produkcji i oczyszczania bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej.

Produkcja i oczyszczanie bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest produkcja bakulowirusa w hodowli komórek owadów, jego oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa z heparyną oraz zagęszczanie poprzez ultrawirowanie. Produkt końcowy może być wykorzystany do transferu genów in vivo lub jako szczepionka. Metoda ta może pomóc badaczom, którzy chcą wykorzystać oczyszczonego i zagęszczonego bakulowirusa w zastosowaniach związanych z terapią genową.Cząsteczki bakulowirusów mogą zawierać resztki komórkowe oraz białka z hodowli Sf9, które po zastosowaniu u ludzi mogą wywołać stan zapalny lub odpowiedź immunologiczną. Aby uniknąć toksyczności, bakulowirus jest oczyszczany i oddzielany od zanieczyszczających go cząsteczek. Niektóre etapy procedury zostaną zaprezentowane przez Marilou Narciso, asystentkę badawczą z mojego laboratorium.Aby przygotować kulturę zawiesinową, przenieś 50 mililitrów komórek Sf9 w pożywce do hodowli owadziej do 250-mililitrowej poliwęglanowej kolby Erlenmeyera. Następnie umieść kolbę w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną. Dodaj do komórek dwa mililitry zapasu baculowirusa P2 i wytrząsaj z prędkością 135 rpm, utrzymując stałą temperaturę 28 stopni Celsjusza.Cztery dni po infekcji cała

production-purification-baculovirus-for-gene-therapy

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W tym filmie demonstrujemy technikę izolacji bakulowirusa z supernatantu komórek owadów za pomocą chromatografii powinowactwa heparyny. Izolację ułatwia powinowactwo heparyny w kolumnie do glikoproteiny otoczki bakulowirusa.

Oczyszczanie bakulowirusa oparte na chromatografii powinowactwa heparyny: technika izolowania bakulowirusa z supernatantu komórek owadów

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

W obecnym protokole demonstrujemy wysoce efektywną i opłacalną metodę oczyszczania białek na małą skalę, która pozwala na oczyszczanie rekombinowanych białek poprzez unikalne połączenie rozszczepialnego znacznika GST i małego znacznika His.

Oczyszczanie GST-His : Dwuetapowy protokół oczyszczania powinowactwa dający oczyszczone białka o pełnej długości

Kindliny mają fundamentalne znaczenie dla adhezji komórek poprzez integryny, ale badania nad nimi były utrudnione z powodu trudności napotkanych podczas ich rekombinacyjnej ekspresji u gospodarzy bakteryjnych. Opisujemy tutaj metody ich efektywnej produkcji w komórkach owadów zakażonych bakulowirusem.

Wydajna produkcja i oczyszczanie rekombinowanego mysiego Kindlin-3 z komórek owadów do badań biofizycznych

Tutaj prezentujemy protokół syntezy cząsteczek wirusopodobnych za pomocą systemów ekspresji bakulowirusa lub ssaków oraz oczyszczania przez ultrawirowanie. To wysoce konfigurowalne podejście służy do identyfikacji antygenów wirusowych jako celów szczepionek w bezpieczny i elastyczny sposób.

Ekspresja i oczyszczanie cząstek wirusopodobnych do szczepienia

Ten protokół opisuje system ekspresji białek wywołany szokiem cieplnym (system komórkowy pDHsp/V5-His/sf9), który może być używany zarówno do ekspresji obcych białek, jak i oceny antyapoptotycznej aktywności potencjalnych obcych białek i ich skróconych aminokwasów w komórkach owadów.

Przejściowa ekspresja obcych genów w komórkach owadów (sf9) do testu funkcjonalnego białka

Oczyszczanie kanałów jonowych jest często wyzwaniem, ale gdy już zostanie osiągnięte, może potencjalnie umożliwić badania in vitro funkcji i struktur kanałów. W tym miejscu opisujemy etapowe procedury ekspresji i oczyszczania białek bestrofiny ssaków, rodziny kanałów Cl- aktywowanych przezCa2+.

Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

Tutaj prezentujemy protokoły wykorzystania systemu ekspresji białek komórek owadów i bakulowirusa do produkcji dużych ilości białek wydzielanych przez rośliny do krystalizacji białek. Wektor ekspresyjny bakulowirusa został zmodyfikowany za pomocą GP67 lub peptydu sygnałowego hemoliny owadów w celu ekspresji wydzielania białek roślinnych w komórkach owadów.

Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

System wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS) to solidna platforma do badania ekspresji i produkcji białkowych metylotransferaz argininowych (PRMT) do wykorzystania w badaniach biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych. Miligramowe ilości materiału mogą być produkowane dla większości PRMT i innych białek będących przedmiotem zainteresowania, wymagających eukariotycznej platformy ekspresyjnej.

Produkcja rekombinowanych białek PRMT przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa

W tym protokole, wektor AAV2 jest wytwarzany przez kokulturację komórek owadów Spodoptera frugiperda (Sf9) z białkiem zielonej fluorescencji (GFP) wirusa bakulowirusa (BV)-AAV2-AAV2 lub genem terapeutycznym oraz komórkami Sf9 zakażonymi BV-AAV2-rep-cap w hodowli zawiesinowej. Cząsteczki AAV są uwalniane z komórek za pomocą detergentu, klarowane, oczyszczane za pomocą chromatografii kolumnowej powinowactwa i zagęszczane przez filtrację o przepływie stycznym.

Opracowanie procesu produkcji i oczyszczania wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV)2 przy użyciu systemu hodowli komórek bakulowirusa i owadów

Badania strukturalne i biochemiczne ludzkich transporterów błonowych wymagają miligramowych ilości stabilnego, nienaruszonego i jednorodnego białka. W tym miejscu opisujemy skalowalne metody badań przesiewowych, ekspresji i oczyszczania ludzkich transporterów nośników substancji rozpuszczonych przy użyciu genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów.

Wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych

Poznaj produkcję i oczyszczanie bakulowirusa w kulturze komórek owadzich Sf9 do zastosowań w terapii genowej. Ta metoda obejmuje chromatografię afinityczną na heparynie i ultrawirówkę.

Produkcja i oczyszczanie bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej

Przeglądaj więcej filmów