Produkcja i oczyszczanie bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej

Ogólnym celem tego protokołu jest wytworzenie bakulowirusa w hodowli komórek owadów, oczyszczenie za pomocą chromatografii powinowactwa heparyny i zagęszczenie za pomocą ultrawirowania. Produkt końcowy może być stosowany do transferu genów in vivo lub jako szczepionka. Ta metoda może pomóc naukowcom, którzy chcą wykorzystać oczyszczonego i skoncentrowanego bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej.

Cząsteczki bakulowirusa mogą zawierać szczątki komórkowe i białka z hodowli Sf9, które mogą wywoływać stan zapalny lub odpowiedź immunologiczną, gdy są stosowane u ludzi. Aby uniknąć toksyczności, bakulowirus jest oczyszczany i oddzielany od cząstek skażających. Niektóre elementy procedury zostaną zademonstrowane przez Marilou Narciso, asystentkę naukową z mojego laboratorium.

Aby ustawić kulturę zawiesinowa, wysiewaj 50 mililitrów komórek Sf9 w pożywce do hodowli owadów do 250-mililitrowej kolby Erlenmeyera z poliwęglanu. I umieścić kolbę w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną. Dodaj dwa mililitry bulionu bakulowirusa P2 do komórek i wstrząsaj z prędkością 135 obr./min, utrzymując stałą temperaturę 28 stopni Celsjusza.

Cztery dni po zakażeniu cała populacja komórek Sf9 wykaże efekt cytopatyczny , co wskazuje na produkcję bakulowirusa o wysokim mianie. Sekwencyjną amplifikację bakulowirusa aż do uzyskania pożądanej objętości, zwiększając objętość hodowli komórkowej w każdej kolejnej infekcji od 10 do 50 razy. Po odwirowaniu końcowego supernatantu bakulowirusa przez 30 minut w temperaturze 1000 g i czterech stopniach Celsjusza w celu oddzielenia szczątków komórkowych kursu, przenieś supernatant do czystego naczynia i potraktuj nukleazą w ilości 50 jednostek na mililitr przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu strawienia genomowego DNA i RNA.

Na koniec przefiltruj supernatant wirusa przez jednostkę filtracyjną o wielkości 0,45 mikrona. Ustawić system chromatograficzny, umieszczając linię buforową przemywania z portu wlotowego A1 w butelce zawierającej co najmniej 500 mililitrów buforu do płukania. Do załadowania buforu elucyjnego należy użyć portu wlotowego bufora A2.

Włóż kilka stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów do kolektora frakcji, aby zebrać supernatant bakulowirusa przechodzącego przez kolumnę, bufor do płukania i bakulowirusa, któremu udało się uniknąć. Zrównoważyć kolumnę heparyny z pięcioma objętościami kolumny o objętości 7,9 mililitra buforu do płukania przy liniowym natężeniu przepływu siedmiu mililitrów na minutę. Załadować 250 mililitrów supernatantu bakulowirusa na kolumnę heparyny za pomocą pompy do pobierania próbek w porcie wlotowym próbki przy liniowym natężeniu przepływu dwóch mililitrów na minutę.

Następnie przepuścić 10 objętości buforu płuczącego przez kolumnę heparyny z liniowym natężeniem przepływu wynoszącym dwa mililitry na minutę, aż krzywa absorbancji ultrafioletu powróci do linii podstawowej i stanie się stabilna. Unikać cząstek bakulowirusa z kolumny heparyny z pięcioma objętościami buforu elucyjnego przy liniowym natężeniu przepływu czterech mililitrów na minutę. Obserwuj ostry pik elucji białka na chromatogramie, gdy cząsteczki bakulowirusa dysocjują od kolumny heparyny.

Po elucji natychmiast rozcieńczyć supernatant bakulowirusa 10-krotnie za pomocą 20-milimetrowego buforu fosforanu sodu, aby zapobiec aktywacji cząstek bakulowirusa w wyniku wstrząsu osmotycznego podczas późniejszego wirowania. Procedurę zatężania należy rozpocząć od dodania równej objętości supernatantu bakulowirusa do autoklawu do probówek ultrawirówek. Zmierzyć masę probówki za pomocą wagi i wyregulować wagę zawartości probówek ultrawirówek za pomocą sterylnego PBS.

Umieść każdą z probówek ultrawirówki w przeciwległym wiadrze wirnika SW 32 Ti i uruchom ultrawirówkę przy 80 000 g przez 90 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu otwórz probówki ultrawirówki w okapie do hodowli tkanek i asepcie zasysaj ciecz bez usuwania osadu bakulowirusa. Dodaj 200 mikrolitrów PBS zawierających 0,5% BSA i ponownie zawieś każdą granulkę, energicznie pipetując w górę iw dół.

Na koniec przenieś od 50 do 100 mikrolitrów podwielokrotności skoncentrowanego bakulowirusa do kriowiali i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Miana bakulowirusa oszacowano na podstawie zakażenia komórkami HT1080. Linia połączona rombami pokazuje całkowitą liczbę jednostek zakaźnych bakulowirusa w każdej frakcji.

Cząsteczki bakulowirusa silnie wiążą się z kolumną heparyny, dlatego w buforze do płukania kolumny nie wykrywa się znaczącej ilości wirusa. Podczas elucji obserwuje się ostry szczyt białka, który odpowiada frakcji bakulowirusa. Parametry zastosowane w tym protokole maksymalizują wydajność i minimalizują inaktywację zakaźnych cząstek bakulowirusa.

Protokół ten może być stosowany do oczyszczania z innych wirusów i białek, które mają powinowactwo do heparyny.