Wizualizacja cytoszkieletów aktyny i mikrotubul w synapsie immunologicznej komórek B przy użyciu mikroskopii wyczerpywania się emisji stymulowanej (STED)
9 kwietnia 2018
Przedstawiamy protokół użycia mikroskopii STED do jednoczesnego obrazowania struktur aktynowych, mikrotubul i białek wiążących mikrotubule plus end w komórkach B, które rozprzestrzeniły się na szkiełkach nakrywkowych pokrytych przeciwciałami przeciwko receptorowi komórek B, modelowi początkowej fazy tworzenia synaps immunologicznych.
Ogólnym celem tego protokołu jest barwienie cytoszkieletów aktynowych i mikrotubul w synapsie immunologicznej komórek B w celu stymulowanego wyczerpania emisji lub mikroskopii STED oraz obrazowanie ich struktury, organizacji w relacjach przestrzennych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące organizacji cytoszkieletu podczas aktywacji komórek B, w tym reorganizacji cytoszkieletów aktyny i mikrotubul podczas tworzenia synaps immunologicznych. Główną zaletą wielokolorowej mikroskopii STED jest to, że umożliwia jednoczesne obrazowanie cytoszkieletu aktynowego, sieci mikrotubul i kluczowych białek związanych z cytoszkieletem w rozdzielczości nanometrowej.
Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat aktywacji komórek B, można ją również zastosować do tworzenia synaps immunologicznych innych typów komórek odpornościowych, takich jak NK i limfocyty T. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie przekonają się, że optymalizacja ustawień mikroskopu dla jednoczesnego obrazowania i wielu fluoroforów przy użyciu STED będzie wymagała pewnej praktyki. Tę procedurę wraz z Jia i Madison zademonstrują Kate Choi i Caitlin Pritchard.
Zacznij od odwirowania 2,5 razy 10 do 6, komórek chłoniaka B A20 na każdą transfekcję i ponownego zawieszenia komórek w 100 mikrolitrach odczynnika do transfekcji uzupełnionego jednym do 2,5 mikrograma interesującego nas DNA osocza. Delikatnie wymieszaj roztwory i przenieś każdą porcję komórek do indywidualnych dołków na płytce sześciodołkowej. Dostosuj objętość w każdym studzience do dwóch mililitrów z kompletną pożywką o temperaturze 37 stopni Celsjusza i umieść komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 18 godzin.
Następnego ranka zanurz 1,5 18-milimetrowego okrągłego szkła nakrywkowego w 100% metanolu i pozostaw szkiełka nakrywkowe do całkowitego wyschnięcia na około 10 minut. Umieść wysuszone szkiełka nakrywkowe w indywidualnych dołkach 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i dodaj 400 mikrolitrów koziego przeciwciała anty-mysiej immunoglobuliny G do środka każdego szkiełka nakrywkowego, tak aby w środku utworzył się pęcherzyk, który rozprzestrzenił się na krawędzie bez kapania do studzienki. Inkubować szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
Następnie przepłukać szkiełka nakrywkowe jednym mililitrem sterylnego PBS na studzienkę, trzy razy, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała. Po ostatnim praniu przechowuj każde szkiełko nakrywkowe w jednym mililitrze świeżego, sterylnego PBS do momentu wysiewu komórek. Gdy transfekowane komórki są gotowe, zbierz je w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów przez odwirowanie i ponownie zawiesij granulki w jednym mililitrze zmodyfikowanego buforu soli fizjologicznej HEPES uzupełnionego FBS.
Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do dwóch na 10 do 5 komórek na mililitr i zmodyfikowaną solą fizjologiczną buforowaną HEPES plus FBS i użyć kleszczy, aby przenieść każde szkiełko nakrywkowe na kawałek folii parafinowej. Dodaj 250 mikrolitrów komórek do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubuj szkiełka nakrywkowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut w ciemności, aby umożliwić komórkom rozprzestrzenienie się po powierzchniach pokrytych antyimmunoglobuliną G. Pod koniec inkubacji usunąć nadmiar soli fizjologicznej z każdego szkiełka i pokryć każde szkiełko nakrywkowe 350 mikrolitrami utrwalacza, uważając, aby pokryć całą powierzchnię.
Po 10 minutach w ciemności w temperaturze pokojowej za pomocą mikropipety ostrożnie zassać utrwalacz z krawędzi każdego szkiełka nakrywkowego i umyć szkiełka nakrywkowe 500 mikrolitrami buforu przepuszczalnego i blokującego. Następnie przepuszczaj i blokuj komórki za pomocą 250 mikrolitrów świeżej przepuszczalności i buforu blokującego przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie usuń nadmiar buforu i oznacz komórki 50 mikrolitrami podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji przemyć szkiełko nakrywkowe trzykrotnie 500 mikrolitrami buforu barwiącego na jedno przemycie i dodać 50 mikrolitrów odpowiedniego przeciwciała wtórnego do każdego szkiełka nakrywkowego przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po umyciu przeciwciała wtórnego dodać 10 mikrolitrów odczynnika montażowego do szkiełka mikroskopowego i zamontować szkiełka nakrywkowe na poszczególnych szkiełkach mikroskopowych, stroną z komórką do dołu. Następnie pozostaw szkiełka do wyschnięcia przez noc w ciemności do obrazowania następnego dnia.
Aby zobrazować komórki za pomocą mikroskopii STED, najpierw włącz mikroskop STED. Aktywuj lasery w lampie oświetlenia epifluorescencyjnego i otwórz oprogramowanie mikroskopu. Ustaw parametry laserów zubożających STED i załaduj pierwszą próbkę do mikroskopu.
Za pomocą okularu ręcznie ustaw ostrość na próbce, aby wybrać komórkę o umiarkowanym wyrażeniu GFP. Powiększ zaznaczoną komórkę i wybierz obszar zainteresowania, który ma zostać zobrazowany. Dostosuj ostrość tak, aby wyostrzona była płaszczyzna XY komórki znajdującej się najbliżej szkiełka nakrywkowego.
Następnie na karcie Pobieranie w oprogramowaniu zaznacz opcję Między klatkami w panelu Skanowanie sekwencyjne, aby ustawić akwizycję obrazu na sekwencyjną akwizycję klatek. Ustaw moc lasera STED dla każdego fluoroforu i użyj suwaka, aby dostosować moce lasera zgodnie z fluoroforami użytymi w eksperymencie. Aby zwiększyć rozdzielczość i zmniejszyć sygnał tła, otwórz Ustawienia akwizycji i użyj menu rozwijanego, aby wybrać wartość większą niż jeden, aby zwiększyć uśrednianie linii i/lub klatek.
Sprawdź opcję wzmacniania dla każdego fluoroforu i konkretne wartości dla przyrostu czasu, aby uzyskać odpowiedni sygnał fluorescencyjny dla bramkowanego czasowo STED i zwiększyć moc lasera STED w celu zwiększenia rozdzielczości. Bardzo ważne jest, aby zoptymalizować czas pozyskiwania próbki mikroskopowej i używanych fluoroforów, aby poprawić rozdzielczość bez utraty zbyt dużej ilości sygnału fluorescencyjnego. Następnie ręcznie uzyskaj wiele obrazów, aby zapewnić odtwarzalność i zdekonwolucjonizuj obrazy za pomocą pakietu oprogramowania do dekonwolucji zgodnie z instrukcjami producenta.
W przypadku komórek chłoniaka B A20 rozprzestrzenia się na unieruchomionych przeciwciałach immunoglobuliny NT. Mikroskopia STED stosowana w połączeniu z oprogramowaniem do dekonwolucji zapewnia obrazy struktur cytoszkieletu o wyższej rozdzielczości niż sama mikroskopia konfokalna. Chociaż dekonwolucja obrazów konfokalnych daje znaczną poprawę rozdzielczości obrazu, zdekonwolucyjne obrazy STED dostarczają bardziej szczegółowych informacji strukturalnych niż zdekonwolucyjne obrazy konfokalne.
Jednokolorowy STED może być również używany do uzyskiwania trójwymiarowych obrazów o wysokiej rozdzielczości całej sieci cytoszkieletu komórek B. Na tych wielobarwnych obrazach STED można zaobserwować barwienie obwodowego pierścienia aktyny dendrytycznej w połączeniu z barwieniem mikrotubulami. W przypadku stosowania komórek transfekowanych fluorescencyjnymi białkami fuzyjnymi, osiągnięcie optymalnych poziomów ekspresji i unikanie artefaktów z powodu nadmiernej ekspresji jest istotnym czynnikiem, podczas gdy zbyt niska ekspresja fluorescencyjnego białka fuzyjnego również skutkuje niską jakością obrazów.
Niezbędne jest również staranne skupienie się, aby objąć cały obszar zainteresowania. Na przykład na tym obrazie tylko części sieci mikrotubul znajdowały się w płaszczyźnie ogniskowej najbliższej szkiełku nakrywkowemu, co uniemożliwiało pełną analizę próbki. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni.
Jeden dzień na przygotowanie próbki i barwienie oraz jeden dzień na obrazowanie STED. Ważne jest, aby pamiętać o miareczkowaniu ilości osocza, która ma być użyta do transfekcji komórek, aby uzyskać wystarczającą ekspresję białka fluorescencyjnego do wykrycia podczas obrazowania, unikając jednocześnie artefaktów wynikających z nadmiernej ekspresji. Po tej procedurze można indukować ekspresję różnych fluorescencyjnych białek fuzyjnych, aby ułatwić lokalizację innych białek, które regulują dynamikę i organizację cytoszkieletu lub uwidocznić subkomórkową dystrybucję białek zaangażowanych w inne procesy komórkowe.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać mikroskopii STED do obrazowania struktur cytoszkieletu i białek, które są zaangażowane w tworzenie synaps immunologicznych. Nie zapominaj, że praca z utrwalaczami, takimi jak aldehyd glutarowy, może być bardzo niebezpieczna i że podczas używania tego rodzaju odczynników należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca w dygestoriach chemicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroskopii STED do wizualizacji struktur aktynowych, mikrotubul oraz białek wiążących końce plus mikrotubul w limfocytach B. Służy on jako model do badania początkowej fazy formowania się synapsy immunologicznej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Immunologia
Wprowadzenie
- Zrozumienie organizacji cytoszkieletu ma kluczowe znaczenie podczas aktywacji limfocytów B.
- Tworzenie synapsy immunologicznej jest kluczowym procesem w odpowiedzi odpornościowej.
- Mikroskopia STED umożliwia obrazowanie struktur komórkowych z wysoką rozdzielczością.
- Metoda ta może zostać zastosowana również do innych typów komórek odpornościowych.
Cel badania
- Barwienie i wizualizacja cytoszkieletu aktynowego oraz mikrotubul w synapsie immunologicznej limfocytów B.
- Badanie reorganizacji cytoszkieletu podczas tworzenia się synapsy immunologicznej.
- Pogłębienie zrozumienia mechanizmów aktywacji limfocytów B.
Zastosowane metody
- Wielokolorowa mikroskopia STED do jednoczesnego obrazowania.
- Protokoły barwienia struktur aktynowych i mikrotubul.
- Optymalizacja ustawień mikroskopu dla wielu fluoroforów.
- Zastosowanie do limfocytów B rozprzestrzenionych na szkiełkach podstawowych powlekanych przeciwciałami.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie sieci aktynowych i mikrotubul z rozdzielczością nanometryczną.
- Wgląd w organizację przestrzenną cytoszkieletów podczas tworzenia synapsy immunologicznej.
- Wykazanie możliwości zastosowania tej metody w przypadku innych komórek odpornościowych.
- Identyfikacja kluczowych białek związanych z cytoszkieletem, uczestniczących w aktywacji limfocytów B.
Wnioski
- Mikroskopia STED jest potężnym narzędziem do badania dynamiki cytoszkieletu.
- Metoda ta dostarcza cennych informacji na temat procesów aktywacji komórek odpornościowych.
- Nowi użytkownicy tej techniki mogą wymagać dalszej optymalizacji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie o superrozdzielczości dynamiki cytoszkieletu w synapsie immunologicznej limfocytów B umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka we wczesnej fazie odkryć immunologicznych. Wysokorozdzielcza wizualizacja reorganizacji aktyny i mikrotubul dostarcza informacji niezbędnych do walidacji celu i zwiększa pewność predykcyjną w zakresie szlaków sygnalizacji immunologicznej. Możliwość ta wzmacnia ciągłość translacyjną od etapu odkryć po przedkliniczne programy modulacji odporności.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację przebudowy cytoszkieletu podczas aktywacji limfocytów B w celu weryfikacji hipotez mechanistycznych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ujawnienie relacji przestrzennych między aktyną, mikrotubulami a białkami regulatorowymi.
- Ułatwia redukcję ryzyka biologicznego poprzez wyjaśnienie sekwencji i koordynacji zdarzeń prowadzących do tworzenia synapsy immunologicznej.
- Zwiększa pewność predykcyjną w strategiach modulacji szlaków ukierunkowanych na komórki odpornościowe.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowane protokoły obrazowania do ilościowego oznaczania zmian w cytoszkielecie w odpowiedzi na kandydackie modulatory.
- Umożliwia powtarzalną, ilościową ocenę organizacji aktyny i mikrotubul w celu standaryzacji testu.
- Wspiera przygotowanie do screeningu, umożliwiając multipleksową detekcję białek cytoszkieletu i białek sygnałowych.
- Ułatwia ponowne wykorzystanie platformy w różnych typach komórek odpornościowych, w tym w limfocytach T i komórkach NK, w celu szerszego opracowania testów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki obrazowania cytoszkieletu z modelami aktywacji immunologicznej istotnymi dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od odkryć in vitro do walidacji przedklinicznej modulatorów synapsy immunologicznej.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, dostarczając mechanistycznych dowodów na zaangażowanie celu molekularnego.
- Usprawnia predykcyjną redukcję ryzyka w strategiach modulacji immunologicznej w badaniach translacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół mikroskopii STED wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając wysokorozdzielczą analizę formowania się synaps immunologicznych oraz dynamiki cytoszkieletu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących koordynacji cytoszkieletu podczas aktywacji limfocytów B i montażu synapsy immunologicznej.
- Screening: Dostarcza ilościowe i powtarzalne wyniki obrazowania do oceny wpływu związków na organizację cytoszkieletu.
- Analityka: Umożliwia pomiary przestrzenne w skali nanometrów w celu porównania układu aktyny i mikrotubul w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy przebudowę cytoszkieletu in vitro z modelami aktywacji immunologicznej istotnymi dla przebiegu chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zestandaryzowany protokół obrazowania, który można dostosować do wielu typów komórek odpornościowych i programów badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów immunologicznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły obrazowania o wysokiej rozdzielczości w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w różnych zespołach.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez wyjaśnienie mechanizmów synapsy immunologicznej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów modulacji odpornościowej z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o spostrzeżenia mechanistyczne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej oraz biologii cytoszkieletu.
- Wymaga dostępu do aparatury mikroskopii STED oraz kompatybilnego oprogramowania do dekonwolucji.
- Konieczna jest standaryzacja przygotowania próbek i parametrów obrazowania pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Należy zoptymalizować protokoły transfekcji i barwienia dla każdego typu komórek oraz badanego białka.
- Krytyczna jest staranna kontrola poziomów ekspresji białek fluorescencyjnych, aby uniknąć artefaktów obrazowania.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:18
GFP-Fusion Protein Expression and Anti-IgG Antibody Glass Coverslip Coating
3:14
Cell Spreading, Fixing, and Immunostaining
5:44
Stimulated Emission Depletion Microscope Imaging
8:02
Results: Representative STED Imaging
9:50
Conclusion
