Wizualizacja cytoszkieletów aktyny i mikrotubul w synapsie immunologicznej komórek B przy użyciu mikroskopii wyczerpywania się emisji stymulowanej (STED)

Ogólnym celem tego protokołu jest barwienie cytoszkieletów aktynowych i mikrotubul w synapsie immunologicznej komórek B w celu stymulowanego wyczerpania emisji lub mikroskopii STED oraz obrazowanie ich struktury, organizacji w relacjach przestrzennych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące organizacji cytoszkieletu podczas aktywacji komórek B, w tym reorganizacji cytoszkieletów aktyny i mikrotubul podczas tworzenia synaps immunologicznych. Główną zaletą wielokolorowej mikroskopii STED jest to, że umożliwia jednoczesne obrazowanie cytoszkieletu aktynowego, sieci mikrotubul i kluczowych białek związanych z cytoszkieletem w rozdzielczości nanometrowej.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat aktywacji komórek B, można ją również zastosować do tworzenia synaps immunologicznych innych typów komórek odpornościowych, takich jak NK i limfocyty T. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie przekonają się, że optymalizacja ustawień mikroskopu dla jednoczesnego obrazowania i wielu fluoroforów przy użyciu STED będzie wymagała pewnej praktyki. Tę procedurę wraz z Jia i Madison zademonstrują Kate Choi i Caitlin Pritchard.

Zacznij od odwirowania 2,5 razy 10 do 6, komórek chłoniaka B A20 na każdą transfekcję i ponownego zawieszenia komórek w 100 mikrolitrach odczynnika do transfekcji uzupełnionego jednym do 2,5 mikrograma interesującego nas DNA osocza. Delikatnie wymieszaj roztwory i przenieś każdą porcję komórek do indywidualnych dołków na płytce sześciodołkowej. Dostosuj objętość w każdym studzience do dwóch mililitrów z kompletną pożywką o temperaturze 37 stopni Celsjusza i umieść komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 18 godzin.

Następnego ranka zanurz 1,5 18-milimetrowego okrągłego szkła nakrywkowego w 100% metanolu i pozostaw szkiełka nakrywkowe do całkowitego wyschnięcia na około 10 minut. Umieść wysuszone szkiełka nakrywkowe w indywidualnych dołkach 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i dodaj 400 mikrolitrów koziego przeciwciała anty-mysiej immunoglobuliny G do środka każdego szkiełka nakrywkowego, tak aby w środku utworzył się pęcherzyk, który rozprzestrzenił się na krawędzie bez kapania do studzienki. Inkubować szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Następnie przepłukać szkiełka nakrywkowe jednym mililitrem sterylnego PBS na studzienkę, trzy razy, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała. Po ostatnim praniu przechowuj każde szkiełko nakrywkowe w jednym mililitrze świeżego, sterylnego PBS do momentu wysiewu komórek. Gdy transfekowane komórki są gotowe, zbierz je w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów przez odwirowanie i ponownie zawiesij granulki w jednym mililitrze zmodyfikowanego buforu soli fizjologicznej HEPES uzupełnionego FBS.

Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do dwóch na 10 do 5 komórek na mililitr i zmodyfikowaną solą fizjologiczną buforowaną HEPES plus FBS i użyć kleszczy, aby przenieść każde szkiełko nakrywkowe na kawałek folii parafinowej. Dodaj 250 mikrolitrów komórek do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubuj szkiełka nakrywkowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut w ciemności, aby umożliwić komórkom rozprzestrzenienie się po powierzchniach pokrytych antyimmunoglobuliną G. Pod koniec inkubacji usunąć nadmiar soli fizjologicznej z każdego szkiełka i pokryć każde szkiełko nakrywkowe 350 mikrolitrami utrwalacza, uważając, aby pokryć całą powierzchnię.

Po 10 minutach w ciemności w temperaturze pokojowej za pomocą mikropipety ostrożnie zassać utrwalacz z krawędzi każdego szkiełka nakrywkowego i umyć szkiełka nakrywkowe 500 mikrolitrami buforu przepuszczalnego i blokującego. Następnie przepuszczaj i blokuj komórki za pomocą 250 mikrolitrów świeżej przepuszczalności i buforu blokującego przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie usuń nadmiar buforu i oznacz komórki 50 mikrolitrami podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji przemyć szkiełko nakrywkowe trzykrotnie 500 mikrolitrami buforu barwiącego na jedno przemycie i dodać 50 mikrolitrów odpowiedniego przeciwciała wtórnego do każdego szkiełka nakrywkowego przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po umyciu przeciwciała wtórnego dodać 10 mikrolitrów odczynnika montażowego do szkiełka mikroskopowego i zamontować szkiełka nakrywkowe na poszczególnych szkiełkach mikroskopowych, stroną z komórką do dołu. Następnie pozostaw szkiełka do wyschnięcia przez noc w ciemności do obrazowania następnego dnia.

Aby zobrazować komórki za pomocą mikroskopii STED, najpierw włącz mikroskop STED. Aktywuj lasery w lampie oświetlenia epifluorescencyjnego i otwórz oprogramowanie mikroskopu. Ustaw parametry laserów zubożających STED i załaduj pierwszą próbkę do mikroskopu.

Za pomocą okularu ręcznie ustaw ostrość na próbce, aby wybrać komórkę o umiarkowanym wyrażeniu GFP. Powiększ zaznaczoną komórkę i wybierz obszar zainteresowania, który ma zostać zobrazowany. Dostosuj ostrość tak, aby wyostrzona była płaszczyzna XY komórki znajdującej się najbliżej szkiełka nakrywkowego.

Następnie na karcie Pobieranie w oprogramowaniu zaznacz opcję Między klatkami w panelu Skanowanie sekwencyjne, aby ustawić akwizycję obrazu na sekwencyjną akwizycję klatek. Ustaw moc lasera STED dla każdego fluoroforu i użyj suwaka, aby dostosować moce lasera zgodnie z fluoroforami użytymi w eksperymencie. Aby zwiększyć rozdzielczość i zmniejszyć sygnał tła, otwórz Ustawienia akwizycji i użyj menu rozwijanego, aby wybrać wartość większą niż jeden, aby zwiększyć uśrednianie linii i/lub klatek.

Sprawdź opcję wzmacniania dla każdego fluoroforu i konkretne wartości dla przyrostu czasu, aby uzyskać odpowiedni sygnał fluorescencyjny dla bramkowanego czasowo STED i zwiększyć moc lasera STED w celu zwiększenia rozdzielczości. Bardzo ważne jest, aby zoptymalizować czas pozyskiwania próbki mikroskopowej i używanych fluoroforów, aby poprawić rozdzielczość bez utraty zbyt dużej ilości sygnału fluorescencyjnego. Następnie ręcznie uzyskaj wiele obrazów, aby zapewnić odtwarzalność i zdekonwolucjonizuj obrazy za pomocą pakietu oprogramowania do dekonwolucji zgodnie z instrukcjami producenta.

W przypadku komórek chłoniaka B A20 rozprzestrzenia się na unieruchomionych przeciwciałach immunoglobuliny NT. Mikroskopia STED stosowana w połączeniu z oprogramowaniem do dekonwolucji zapewnia obrazy struktur cytoszkieletu o wyższej rozdzielczości niż sama mikroskopia konfokalna. Chociaż dekonwolucja obrazów konfokalnych daje znaczną poprawę rozdzielczości obrazu, zdekonwolucyjne obrazy STED dostarczają bardziej szczegółowych informacji strukturalnych niż zdekonwolucyjne obrazy konfokalne.

Jednokolorowy STED może być również używany do uzyskiwania trójwymiarowych obrazów o wysokiej rozdzielczości całej sieci cytoszkieletu komórek B. Na tych wielobarwnych obrazach STED można zaobserwować barwienie obwodowego pierścienia aktyny dendrytycznej w połączeniu z barwieniem mikrotubulami. W przypadku stosowania komórek transfekowanych fluorescencyjnymi białkami fuzyjnymi, osiągnięcie optymalnych poziomów ekspresji i unikanie artefaktów z powodu nadmiernej ekspresji jest istotnym czynnikiem, podczas gdy zbyt niska ekspresja fluorescencyjnego białka fuzyjnego również skutkuje niską jakością obrazów.

Niezbędne jest również staranne skupienie się, aby objąć cały obszar zainteresowania. Na przykład na tym obrazie tylko części sieci mikrotubul znajdowały się w płaszczyźnie ogniskowej najbliższej szkiełku nakrywkowemu, co uniemożliwiało pełną analizę próbki. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni.

Jeden dzień na przygotowanie próbki i barwienie oraz jeden dzień na obrazowanie STED. Ważne jest, aby pamiętać o miareczkowaniu ilości osocza, która ma być użyta do transfekcji komórek, aby uzyskać wystarczającą ekspresję białka fluorescencyjnego do wykrycia podczas obrazowania, unikając jednocześnie artefaktów wynikających z nadmiernej ekspresji. Po tej procedurze można indukować ekspresję różnych fluorescencyjnych białek fuzyjnych, aby ułatwić lokalizację innych białek, które regulują dynamikę i organizację cytoszkieletu lub uwidocznić subkomórkową dystrybucję białek zaangażowanych w inne procesy komórkowe.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać mikroskopii STED do obrazowania struktur cytoszkieletu i białek, które są zaangażowane w tworzenie synaps immunologicznych. Nie zapominaj, że praca z utrwalaczami, takimi jak aldehyd glutarowy, może być bardzo niebezpieczna i że podczas używania tego rodzaju odczynników należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca w dygestoriach chemicznych.