Name: Wykrywanie rzadkiego wariantu transkryptu CDH1 w świeżo mrożonych tkankach raka żołądka za pomocą cyfrowego PCR opartego na chipie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj metodę wykrywania rzadkich wariantów transkryptu CDH1 w tkankach raka żołądka przy użyciu cyfrowego PCR opartego na chipie. Technika ta zwiększa czułość detekcji niskopoziomowych celów w badaniach nad nowotworami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Gráinne Tierney za pomoc redakcyjną.

Protokół jest zgodny z wytycznymi Komitetu Etyki Badań Naukowych na Ludziach IRST.
UWAGA: Ta procedura jest specjalnie zaprojektowana do wykrywania małej liczby cząsteczek cDNA w świeżo zamrożonych tkankach ludzkich. Skrawki tkanek zostały wycięte na suchym lodzie, gdy były jeszcze zamrożone, z wcześniej zwalidowanych próbek guza żołądka lub normalnych tkanek pochodzących od pacjenta.
1. Izolacja i oczyszczanie RNA
<ol>
	<li>Ekstrakcja RNA 
	Uwaga: Izolację RNA przeprowadza się pod maską przy użyciu określonego produktu (patrz Tabela materiałów). Jednak na rynku dostępnych jest wiele zestawów izolacyjnych.
	<ol>
		<li>Homogenizować 50 - 100 mg drobno pokrojonej, świeżo mrożonej próbki tkanki w probówce o pojemności 1,5 ml z 1 ml odczynnika do izolacji RNA i energicznie wirować przez 15 sekund. Inkubować probówki w temperaturze -80 °C przez noc.</li>
		<li>Inkubować probówkę zawierającą próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut i mieszać przez wirowanie przez 15 sekund.</li>
		<li>Trzymaj probówkę na lodzie, dodaj 200 μl chloroformu i energicznie wiruj przez 15 sekund.</li>
		<li>Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 60 s i wirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść fazę wodną do probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 20 μg glikogenu. 
		UWAGA: Ważne jest, aby ostrożnie unikać przenoszenia jakiejkolwiek warstwy międzyfazowej lub organicznej w celu zmniejszenia zanieczyszczenia.</li>
		<li>Dodać 500 μl izopropanolu, odwracając probówkę do wymieszania i inkubować na lodzie przez 10 minut.</li>
		<li>Odwirować probówkę o sile 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu wytrącenia RNA. 
		UWAGA: RNA będzie obecne w żelowym osadku z boku i na dole probówki, często niewidoczne po odwirowaniu.</li>
		<li>Usunąć supernatant bez naruszania osadu i przemyć go 1 ml 75% etanolu przez pipetowanie.</li>
		<li>Odwirować probówkę o stężeniu 7 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant bez naruszania osadu.</li>
		<li>Pozostaw osad do wyschnięcia, aż osad stanie się przezroczysty i rozpuść go w 50 μl wody wolnej od RNaz.</li>
		<li>Próbki należy zamrozić w temperaturze -80 °C co najmniej przez noc przed oznaczaniem ilościowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eliminacja genomowego DNA i oczyszczanie RNA 
	Uwaga: Etap trawienia DNazy, po którym następuje oczyszczanie RNA za pomocą kolumny, jest zalecany do analiz celów o niskiej liczebności w celu strawienia zanieczyszczającego DNA.
	<ol>
		<li>Rozpuścić liofilizowaną DNazę I (1 500 jednostek Kunitza) w 550 μl wody wolnej od RNaz za pomocą strzykawki, delikatnie wymieszać przez odwrócenie fiolki i podzielić odtworzony roztwór podstawowy na podwielokrotności.</li>
		<li>Przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml obliczoną objętość próbki z 15 μg RNA, 10 μl buforu do wytrawiania DNazy z zestawu (wymienionego w tabeli materiałów), 2,5 μl roztworu podstawowego DNazy I i wodą wolną od RNaz do 100 μl. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Dodać 350 μl buforu do lizy tkanek (z zestawu, patrz tabela materiałów) i wymieszać przez pipetowanie.</li>
		<li>Dodać 250 μl 100% etanolu i wymieszać pipetując.</li>
		<li>Przenieść całą objętość (700 μl) do nowej kolumny wirowej i odwirować przy 12 000 x g przez 15 sekund.</li>
		<li>Przenieść filtr do nowej probówki zbiorczej, dodać 500 μl 80% etanolu do kolumny i odwirować przy 12 000 x g przez 2 minuty.</li>
		<li>Otworzyć pokrywę kolumny wirującej i odwirować przy 12 000 x g przez 5 minut z nową probówką zbiorczą w celu wysuszenia filtra, a następnie przenieść filtr do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodać 14 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio do kolumny filtracyjnej i odwirować przy 12 000 x g przez 1 min.</li>
		<li>Próbki należy przechowywać na lodzie i przystąpić do oznaczania ilościowego przy użyciu 2 μl próbki na spektrofotometrze laboratoryjnym lub przechowywać RNA w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Synteza cDNA
<ol>
	<li>Umieść 1,000 ng RNA, 4 μl mieszanki głównej, 1 μl odwrotnej transkryptazy i wodę wolną od RNaz do końcowej objętości 20 μl w sterylnej probówce do PCR. Delikatnie wymieszaj i odwiruj.</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną inkubować w termocyklerze, stosując następujące warunki: 5 minut w temperaturze 25 °C, 30 minut w temperaturze 42 °C, 5 minut w temperaturze 85 °C.</li>
	<li>Odwirować probówki na krótko i przystąpić do analizy dPCR lub przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
</ol>
3. Konfiguracja cyfrowej reakcji PCR
<ol>
	<li> Mieszanie reakcyjne dPCR i przygotowanie próbki
	<ol>
		<li>Rozmrażać mieszankę wzorcową i test w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut.</li>
		<li>Rozcieńczyć próbki cDNA do stężenia 300 ng w 6 μl wody.</li>
		<li>Delikatnie zmieszaj mieszankę wzorcową i przygotuj ją w sterylnej probówce z 8,7 μl mieszanki wzorcowej, 0,87 μl specjalnie zaprojektowanego startera testowego CDH1a i 1,83 μl wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać końcową objętość 11,4 μL. 
		UWAGA: Szczegółowe informacje na temat specjalnie zaprojektowanego startera testowego CDH1a znajdują się w Tabeli materiałów.</li>
		<li>Przenieść 11,4 μl przygotowanej mieszaniny do rozcieńczonej próbki cDNA, delikatnie wymieszać i krótko odwirować. 
		UWAGA: Objętości zawierają 20% nadwyżki, aby skompensować utratę objętości w wyniku pipetowania. Przygotować mieszaninę dla wszystkich próbek i kontroli bez matrycy (NTC).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wiórów 
	Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, załaduj żetony tak szybko, jak to możliwe.
	<ol>
		<li>Podłącz ładowarkę wiórów i poczekaj, aż kontrolka zmieni kolor na zielony.</li>
		<li>Zdjąć nasadkę strzykawki z płynem zanurzeniowym, delikatnie odciągając tłok o 1 - 2 mm i zwalniając go, aby ułatwić ten krok, a następnie zastąpić go końcówką.</li>
		<li>Weź nowy chip i zanotuj kod napisany na pokrywie, aby skojarzyć go z próbką.</li>
		<li>Chwyć ostrożnie pokrywkę za bok, zdejmij folię ochronną i umieść pokrywkę lepką stroną do góry we właściwej orientacji.</li>
		<li>Ostrożnie podnieś wiór, uważając, aby nie dotknąć części wewnętrznej, i załaduj go do gniazda wiórów we właściwej pozycji, naciskając dźwignię, aby otworzyć zacisk.</li>
		<li>Załaduj nowy nóż załadowczy na ładowarkę i delikatnie go popchnij, aby upewnić się, że jest dobrze osadzony.</li>
		<li>Przenieś 14,5 μl mieszaniny reakcyjnej dPCR na ostrze ładujące bez tworzenia pęcherzyków powietrza lub odchylania ostrza, po czym naciśnij przycisk ładowania, aby rozprowadzić objętość na chipie.</li>
		<li>Użyj strzykawki z płynem zanurzeniowym, aby przenieść około 20 kropli na powierzchnię wióra, uważając, aby nie dotknąć powierzchni końcówką. 
		UWAGA: Ważne jest, aby pokryć całą powierzchnię bez rozlewania płynu na krawędzie.</li>
		<li>Obróć ramię ładowarki, aby pokrywa zetknęła się z wiórem i dociśnij przez 15 sekund.</li>
		<li>Naciśnij przycisk pokrywy, aby zwolnić chip i przywrócić ramię do pozycji.</li>
		<li>Przytrzymaj zmontowany chip pod kątem 45° i ostrożnie dozuj płyn zanurzeniowy za pomocą strzykawki przez otwór napełniania, lekko obróć chip, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza, i usuń nadmiar płynu sterylną chusteczką.</li>
		<li>Uszczelnij pojemnik na wióry, delikatnie odklejając etykietę na górze pokrywy chipsów i dociśnij port napełniania przez co najmniej 5 sekund.</li>
		<li>Przechowuj chip w ciemności, aż będzie gotowy do załadowania do termocyklera. 
		UWAGA: Przygotowane chipsy należy zużyć w ciągu 2 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reakcja dPCR
	<ol>
		<li>Otwórz pokrywę i zainstaluj adaptery do obu bloków, nawet jeśli używany jest jeden blok.</li>
		<li>Umieść wióry na bloku próbki we właściwej pozycji. 
		UWAGA: Port napełniania musi być skierowany w stronę przodu termocyklera w pozycji podwyższonej, aby pęcherzyki powietrza mogły unosić się do góry bez naruszania okienka chipa. Użyj pustych żetonów, aby zrównoważyć dwa bloki.</li>
		<li>Połóż podkładkę termiczną na bloku próbki, aby całkowicie zakryć wióry.</li>
		<li>Zamknąć pokrywę i rozpocząć przebieg PCR, stosując następujące warunki: utrzymać w temperaturze 96 °C przez 10 minut; 45 cykli po 60 °C przez 2 minuty i 98 °C przez 30 s; utrzymać w temperaturze 60 °C przez 2 minuty; utrzymać w temperaturze 4 °C. Wyłączyć termocykler i rozmrażać wióry w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut. 
		UWAGA: Analizę wiórów należy przeprowadzić w ciągu jednej godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza wiórów
	<ol>
		<li>Otwórz pokrywę instrumentu i wyjmij podkładki termiczne, a następnie wyjmij wióry z adapterów. 
		UWAGA: Przechowuj wióry w ciemnym, czystym miejscu do czasu analizy.</li>
		<li>Oczyść powierzchnię wióra izopropanolem i sterylną chusteczką. 
		UWAGA: Sprawdź każdy chip pod kątem wycieków lub potencjalnych problemów.</li>
		<li>Podłącz USB do systemu detektora, aby zapisać dane.</li>
		<li>Otwórz tackę na wióry w systemie detektora, załaduj chip stroną zadrukowaną do góry we właściwej pozycji, a następnie zamknij tackę.</li>
		<li>Poczekaj 30 sekund na przetworzenie, a następnie wyjmij chip i włóż następny.</li>
		<li>Poczekaj na zakończenie analizy dla wszystkich przetworzonych chipów, a następnie włóż USB do komputera, aby przesłać pliki. 
		UWAGA: Całkowity czas analizy wynosi około 2 do 3 minut/chip.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza i interpretacja danych
<ol>
	<li>Połącz się z platformą oprogramowania opartą na chmurze, która jest niezbędna do przeprowadzenia wszystkich dalszych analiz.</li>
	<li>Utwórz projekt i zaimportuj wszystkie pliki danych interesujących Cię chipów.</li>
	<li>Wprowadź nazwę próbki, wybierz barwnik i test użyte w zakładce "Zdefiniuj wióry".</li>
	<li>Określ, czy chip jest akceptowalny, wizualizując go w zakładce "Review Data", sprawdzając, jak dokładnie próbka została załadowana do chipa i ile punktów danych jest możliwych do oceny. 
	UWAGA: Odrzuć chipy z mniej niż 13 000 punktów danych podlegających ocenie.</li>
	<li>Przejdź do wykresu punktowego wybranego chipa po prawej stronie ekranu; zastosuj próg 6,000 dla sygnałów barwnika reporterowego amidytu fluoresceiny (FAM) (oś Y) do wszystkich chipów. 
	UWAGA: Ustalony próg może się różnić w zależności od zastosowanych testów.</li>
	<li>Usuń wszelkie wątpliwe sygnały pozytywne, aby zapobiec fałszywie dodatnim wynikom, wybierając względne miejsce na wykresie punktowym za pomocą narzędzia lasso i naciskając "nieokreślone". Wszystkie pozostałe dodatnie plamy wskazują na obecność kopii cDNA rzadkiego analizowanego celu.</li>
</ol>

<ol><li>van Roy, F., Berx, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell-cell+adhesion+molecule+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The cell-cell adhesion molecule E-cadherin.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).</li>
<li>Carneiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+dysfunction+in+gastric+cancer%3A+cellular+consequences%2C+clinical+applications+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">E-cadherin dysfunction in gastric cancer: cellular consequences, clinical applications and open questions.</a> FEBS Lett. 586 (18), 2981-2989 (2012).</li>
<li>Corso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+and+deletions+of+the+E-cadherin+gene+predict+poor+survival+of+patients+with+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations and deletions of the E-cadherin gene predict poor survival of patients with gastric cancer.</a> J Clin Oncol. 31 (7), 868-875 (2013).</li>
<li>Pinheiro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+initiation+arising+from+E-cadherin%2FCDH1+intron2%3A+a+novel+protein+isoform+that+increases+gastric+cancer+cell+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcription initiation arising from E-cadherin/CDH1 intron2: a novel protein isoform that increases gastric cancer cell invasion and angiogenesis.</a> Hum Mol Genet. 21 (19), 4253-4269 (2012).</li>
<li>Abou Khouzam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+identifies+changes+in+CDH1+%28E-cadherin%29+transcription+pattern+in+intestinal-type+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Digital PCR identifies changes in CDH1 (E-cadherin) transcription pattern in intestinal-type gastric cancer.</a> Oncotarget. 8 (12), 18811-18820 (2017).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Sci Rep. 7 (1), (2017).</li>
<li>Basu, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Assays+Part+I%3A+Partitioning+statistics+and+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Technol%22%5BJournal%5D)">Digital Assays Part I: Partitioning statistics and digital PCR.</a> SLAS Technol. 22 (4), 369-386 (2017).</li>
<li>Huggett, J. F., Whale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+as+a+novel+technology+and+its+potential+implications+for+molecular+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Digital PCR as a novel technology and its potential implications for molecular diagnostics.</a> Clin Chem. 59 (12), 1691-1693 (2013).</li>
<li>Alikian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-qPCR+and+RT-Digital+PCR%3A+A+comparison+of+different+platforms+for+the+evaluation+of+residual+disease+in+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">RT-qPCR and RT-Digital PCR: A comparison of different platforms for the evaluation of residual disease in chronic myeloid leukemia.</a> Clin Chem. 63 (2), 525-531 (2017).</li>
<li>Hoshino, T., Inagaki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+quantification+of+environmental+DNA+using+microfluidics+and+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Syst+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular quantification of environmental DNA using microfluidics and digital PCR.</a> Syst Appl Microbiol. 35 (6), 390-395 (2012).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li>
<li>Tessitore, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+by+digital+PCR+in+blood+stored+dry+on+nylon+flocked+swabs%5BTitle%5D)+AND+%22J.Transl.Med%22%5BJournal%5D)">Detection of newly produced T and B lymphocytes by digital PCR in blood stored dry on nylon flocked swabs.</a> J.Transl.Med. 15 (1), (2017).</li>
<li>Sho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+Improves+mutation+analysis+in+pancreas+fine+needle+aspiration+biopsy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Digital PCR Improves mutation analysis in pancreas fine needle aspiration biopsy specimens.</a> PLoS One. 12 (1), e0170897(2017).</li>
<li>Conte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+to+detect+microRNAs+using+chip-based+QuantStudio+3D+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Novel method to detect microRNAs using chip-based QuantStudio 3D digital PCR.</a> BMC Genomics. 16, 849(2015).</li>
<li>Sanders, R., Mason, D. J., Foy, C. A., Huggett, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+digital+PCR+for+absolute+RNA+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of digital PCR for absolute RNA quantification.</a> PLoS One. 8 (9), e75296(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów w odniesieniu do tej pracy.

dPCR został pierwotnie opracowany do pomiarów molekularnych DNA 10,11,12,13, a z czasem technologia ta została zaadaptowana do kwantyfikacji mikroRNA i transkryptów RNA 5,14,15. W tym protokole rozszerzyliśmy listę zastosowań o wykrywanie rzadkich transkryptów pochodzących ze świeżo mrożonych próbek tk...

Gen CDH1 koduje E-kadherynę, kluczowy czynnik zaangażowany w utrzymanie prawidłowego nabłonka żołądka poprzez regulację adhezji, przeżycia, proliferacji i migracji komórek1. Utrata białka E-kadheryny w wyniku szkodliwych zmian germinalnych lub somatycznych CDH1 jest związana z rozwojem GC2,3. Przypuszcza się również, że niekanoniczne transkrypty powstające z intronu 2 genu odgrywają rolę w kancerogenezie żołądka4,5. W szczególności wykazano, że jeden z takich transkryptów, CDH1a, ulega ekspresji w liniach komórkowych GC, ale nie występuje w normalnym żołądku4. Niedawno wykryliśmy CDH1a w próbkach tkanek GC od pacjentów z GC za pomocą dPCR5 opartego na chipie. dPCR wykorzystano po raz pierwszy do oceny obecności transkryptu genu CDH1a w GC jelitowym i w prawidłowej tkance.
Złotym standardem do określania ekspresji genów jest ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR). Jednak uzyskane dane mogą być czasami zmienne i niskiej jakości, zwłaszcza gdy poziom celu w próbie jest niski. Ta zmienność może być spowodowana zanieczyszczeniami, które hamują aktywność polimerazy i wyżarzanie starterów, prowadząc do niespecyficznej amplifikacji i konkurencyjnych reakcji ubocznych6.
Chociaż podstawowe zasady biochemiczne dPCR są podobne do tych z qPCR, dPCR wykazuje pewne zalety, pozwalając na bardzo precyzyjne pomiary cząsteczek genomowego DNA (gDNA)/komplementarnego DNA (cDNA). Rzeczywiście, dPCR jest reakcją punktu końcowego, która opiera się na skalibrowanym podziale próbki na tysiące studzienek, tak aby każda studzienka zawierała zero lub pojedynczą cząsteczkę docelową. Wzmocnienie zachodzi wtedy tylko w studzienkach zawierających kopię tarczy i jest sygnalizowane sygnałem fluorescencyjnym. Bezwzględną liczbę cząsteczek docelowych w oryginalnej próbce można następnie obliczyć, określając stosunek dodatnich do całkowitych partycji za pomocą dwumianowej statystyki Poissona7.
Ponadto, technika dPCR eliminuje potrzebę prowadzenia standardowej krzywej, a co za tym idzie, związane z nią odchylenie i zmienność, pozwalając na bezpośrednią kwantyfikację celów8,9; daje bardziej precyzyjne i powtarzalne wyniki niezależnie od zanieczyszczeń i wydajności dzięki wysokiej tolerancji na inhibitory10; jest bardziej czuła i specyficzna niż qPCR, a zatem jest niezawodną metodą wykrywania rzadkiego celu. Wreszcie, podział próbki na wiele reakcji zmniejsza konkurencję z cząsteczkami tła i poprawia granicę wykrywania celu, umożliwiając amplifikację i ułatwiając wykrywanie pojedynczych cząsteczek gDNA/cDNA6. Wykrywanie i kwantyfikacja kwasów nukleinowych za pomocą dPCR opartego na chipach jest coraz częściej stosowana do zmienności liczby kopii, kwantyfikacji fragmentów DNA i analiz mutacji11,12,13, biorąc pod uwagę precyzję i niskie wymagania dotyczące wkładu materiałowego metody. Ponadto dPCR został niedawno włączony do analizy zarówno mikroRNAs14, jak i transkryptów genów5,15.

<table><tbody><tr><td>TRIazol</td><td>Odczynnik Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen 20 mg/ml</td><td>ROCHE</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Zestaw do czyszczenia</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>iScript Zestaw do syntezy cDNA</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26358</td><td></td></tr><tr><td>CDH1a IDT specjalnie zaprojektowany test</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td><td>NA</td><td>F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [stężenia w teście zoptymalizowanym pod kątem dPCR: 900 nM (F),&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 900 nM (R), 250 nM (P)]</td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26316</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Biofuge Fresco</td><td>Thermo&nbsp; Scientific</td><td>75002402</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler (Labcycler)</td><td>Sensoquest</td><td>011-103</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N805-0200</td><td></td></tr><tr><td>Podwójny płaski blokowy moduł próbki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4425757</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio Podstawa uchylna 3D do podwójnego płaskiego bloku GeneAmp PCR System 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4486414</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Adapter do płaskiego termocyklera</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485513</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>4482592</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy instrument PCR QuantStudio 3D z przewodem zasilającym</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4489084</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie rzadkiego wariantu transkryptu cdh1 w świeżo mrożonych tkankach raka żołądka za pomocą cyfrowego pcr opartego na chipie

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, niekanoniczny transkrypt genu CDH1, został uznany za wyrażony w niektórych liniach komórkowych raka żołądka (GC), podczas gdy nie występuje w normalnej błonie śluzowej żołądka. Ostatnio wykryliśmy wariant transkryptu CDH1a w świeżo mrożonych tkankach nowotworowych uzyskanych od pacjentów z GC. Ekspresję tego wariantu w próbkach tkanek badano za pomocą przedstawionego tutaj podejścia digital PCR (dPCR) opartego na chipie. dPCR oferuje potencjał dokładnego, solidnego i bardzo czułego pomiaru kwasów nukleinowych i jest coraz częściej wykorzystywany do wielu zastosowań w różnych dziedzinach. dPCR jest w stanie wykryć rzadkie cele; Ponadto dPCR oferuje możliwość bezwzględnej i precyzyjnej kwantyfikacji kwasów nukleinowych bez konieczności stosowania kalibratorów i krzywych wzorcowych. W rzeczywistości partycjonowanie reakcji wzbogaca cel od tła, co poprawia wydajność amplifikacji i tolerancję na inhibitory. Takie cechy sprawiają, że dPCR jest optymalnym narzędziem do wykrywania rzadkiego transkryptu CDH1a.

Stosując przedstawioną tutaj procedurę, sprawdzono ekspresję rzadkiego wariantu transkryptu CDH1a w świeżo zamrożonych tkankach żołądka. Analiza metodą dPCR została przeprowadzona na 21 parach próbek tkanek prawidłowych i nowotworowych oraz w 1 dodatkowych próbkach guza. CDH1a wykryto w 15 z 32 (47%) guzów, podczas gdy w żadnych próbkach tkanek prawidłowych nie stwierdzono obecności tego rzadkiego transkryptu5W naszej analizie odrzucono chipy z li...

Rękopis opisuje cyfrowy test PCR oparty na chipie, który wykrywa rzadki wariant transkryptu CDH1 (CDH1a) w świeżo zamrożonych tkankach normalnych i nowotworowych pobranych od pacjentów z rakiem żołądka.

Wykrywanie rzadkiego wariantu transkryptu CDH1 w świeżo mrożonych tkankach raka żołądka za pomocą cyfrowego PCR opartego na chipie

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Ogólnym celem tej metody jest wykrycie rzadkich wariantów transkryptu w świeżo zamrożonych tkankach za pomocą cyfrowego PCR opartego na chipie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem, takie jak wykrywanie rzadkich wariantów transkryptu, które mogą być zaangażowane w kancerogenezę. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona wykrywanie celów o niskiej liczebności, poprawiając precyzję i odtwarzalność w odniesieniu do złotego standardu ilościowego PCR.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w wykrywanie niewielkiej liczby cząsteczek cDNA w świeżo zamrożonych tkankach ludzkich, można ją również zastosować do innych rodzajów próbek biologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ konieczne jest nabycie pewnych umiejętności w przygotowywaniu chipów i definiowaniu parametrów do analizy. Na początek pozwól wzorcowi wymieszać i test rozmrozić w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut.Następnie załaduj probówki o pojemności 0,5 mililitra sześcioma mikrolitrowymi porcjami próbek cDNA. Zrób również rurkę kontrolną bez szablonu. Następnie delikatnie zmieszać mieszankę wzorcową i podwielokrotność 8,7 mikrolitra na reakcję do sterylnej probówki.Następnie do każdej reakcji dodaj 0,87 mikrolitra niestandardowego startera testowego i dodaj 1,83 mikrolitra wody wolnej od nukleaz. Delikatnie wymieszaj kombinację i przenieś 11,4 mikrolitra do każdej probówki zawierającej cDNA i do kontroli bez matrycy. Następnie delikatnie wymieszaj probówki i połącz zawartość probówki za pomocą wirowania impulsowego.Aby uzyskać optymalne wyniki, załaduj frytki tak szybko, jak to możliwe. Podłącz ładowarkę wiórów i poczekaj, aż kontrolka zmieni kolor na zielony. Następnie przygotuj strzykawkę z płynem zanurzeniowym, delikatnie pociągając tłok na jeden do dwóch milimetrów, a następnie zdejmij nasadkę i dodaj końcówkę.Następnie zwróć uwagę na kod napisany na pokrywie nowego chipa. Następnie ostrożnie przytrzymaj pokrywkę z boku, odklej folię ochronną i umieść ją w gnieździe pokrywy lepką stroną do góry. Teraz naciśnij dźwignię, aby otworzyć zacisk i ostrożnie załaduj wiór do gniazda wiórów.Następnie włóż nowe ostrze załadowcze do ładowarki. Dociśnij go delikatnie, aby upewnić się, że jest mocno na swoim miejscu. Teraz przenieś 14,5 mikrolitra mieszanki reakcyjnej na ostrze ładujące.Nie twórz pęcherzyków powietrza i nie odchylaj ostrza. Następnie naciśnij przycisk ładowania, aby rozprowadzić wolumin na chipie. Ważne jest, aby upewnić się, że ostrze ładujące jest na swoim miejscu.Następnie, podczas napełniania ostrza, nie należy wciskać pipety do drugiego oporu, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków. Nie odchylaj również ostrza końcówką. Kontynuuj, używając strzykawki, aby przenieść około 20 kropli płynu zanurzeniowego na powierzchnię chipa.Uważaj, aby nie dotknąć powierzchni końcówką i całkowicie zakryj powierzchnię, nie przelewając jej. Następnie obróć ramię ładowarki, aby pokrywa zetknęła się z wiórem i dociśnij przez 15 sekund. Następnie naciśnij przycisk pokrywy, aby zwolnić wiór i przywróć ramię ładowarki do pozycji spoczynkowej.Teraz otwórz zacisk i przytrzymaj zmontowany chip pod kątem 45 stopni, aby ostrożnie dozować płyn zanurzeniowy przez port napełniania za pomocą strzykawki. Następnie lekko obróć chip, aby usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie usuń nadmiar płynu sterylną chusteczką. Unikaj rozlewania płynu zanurzeniowego na brzeg chipa.Jeśli tak się stanie, ostrożnie usuń nadmiar przed uszczelnieniem. Na koniec zamknij pojemnik na wióry, delikatnie odklejając etykietę na pokrywie, a następnie blokując port napełniania na co najmniej pięć sekund. Teraz użyj chipa w ciągu dwóch godzin, a do tego czasu przechowuj go w ciemności.Aby skonfigurować reakcję, otwórz pokrywę i zainstaluj adaptery na obu blokach, nawet jeśli używany jest jeden blok. Następnie umieść chip na blokach próbki i skieruj jego porty napełniania w kierunku przodu termocyklera i lekko podnieś port. Użyj pustych żetonów, aby zrównoważyć dwa bloki.Następnie połóż podkładkę termiczną na konfiguracji, aby całkowicie zakryć wióry. Następnie zaprogramuj cykle, zamknij pokrywę i rozpocznij reakcję. Po zakończeniu reakcji wyłącz termocykler, wyjmij podkładki termiczne, a następnie wyjmij wióry.Pozwól frytkom rozmrozić się do temperatury pokojowej przez co najmniej 10 minut w ciemności i przeanalizuj je w ciągu godziny. Oczyść powierzchnię wiórów izopropanolem, sprawdzając je pod kątem wycieków lub innych problemów. Aby zapisać dane, włóż pamięć USB do systemu detektora, w której można zapisać dane.Następnie otwórz tackę na wióry systemu detektora i załaduj chip stroną zadrukowaną do góry. Zamknij tacę i odczekaj 30 sekund na przetworzenie danych. Następnie wyjmij chip i powtórz proces dla następnego chipa.Następnie przenieś pamięć USB z detektora do komputera i przenieś files. Otwórz oprogramowanie oparte na chmurze, a następnie utwórz projekt i zaimportuj wszystkie pliki danych dla interesujących Cię chipów. Następnie na karcie Zdefiniuj wióry wybierz użyty barwnik i test.Określ, czy chip jest akceptowalny, wizualizując go na karcie Review Data (Przejrzyj dane). Jeśli próbka została dobrze załadowana, co najmniej 13 000 punktów powinno być użytecznych. Następnie spójrz na wykres punktowy dla wybranego żetonu.Tam zastosuj próg zdefiniowany przez typ testu. W przypadku sygnału barwnika reporterowego amidytu fluoresceiny należy przyjąć próg 6 000. Teraz usuń wszelkie podejrzane sygnały, które mogą powodować fałszywe alarmy.Zaznacz wątpliwe miejsce na wykresie rozrzutu za pomocą narzędzia lasso i wybierz opcję Nieokreślone. Wszystkie pozostałe dodatnie plamy wskazują na obecność kopii cDNA rzadkiego analizowanego celu. Korzystając z przedstawionej tutaj procedury, sprawdziliśmy ekspresję rzadkiego wariantu transkryptu CDH1a w świeżo zamrożonych tkankach żołądka.Jeśli chip zawierał wiele pęcherzyków, jeden duży bąbelek lub mniej niż 13 000 punktów danych, był pomijany w analizie. W kontrolce bez szablonu nie występowały żadne pozytywne sygnały powyżej wybranego progu 6 000 dla kanału FAM. Żółte punkty oznaczają brak wzmocnienia.Precyzyjna analiza wiórów przefiltrowała punkty danych o niskiej jakości i wyeliminowała ryzyko niejednoznacznych wyników. Gdy znajdował się niebieski sygnał, wskazujący na wzmocnienie, jeśli znajdował się na samych granicach chipa lub wokół bąbelków, sygnał był pomijany. Podobnie, aby jeszcze bardziej zapobiec ryzyku fałszywych alarmów, sygnały powyżej wybranego progu FAM i po prawej stronie wykresu były prawdopodobnie specyficzne i również były odfiltrowywane.Przeanalizowano 21 sparowanych próbek tkanek normalnych i nowotworowych oraz 11 dodatkowych próbek guza. Ogólnie rzecz biorąc, rzadki transkrypt CDH1a był wykrywalny w 15 z 32 guzów. Natomiast żadna z 21 próbek tkanek kontrolnych nie wykazała obecności tego rzadkiego transkryptu.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykryć rzadki wariant transkryptu w świeżo zamrożonej tkance za pomocą cyfrowego PCR opartego na chipie. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu sześciu do ośmiu godzin, w zależności od liczby próbek, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dokładnym załadowaniu próbki do ostrza.Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się diagnostyką molekularną do badania rzadkich wariantów sekwencji u pacjentów z rakiem.

detection-cdh1-rare-transcript-variant-fresh-frozen-gastric-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film pokazuje użyteczność cyfrowego PCR w formacie chip-in-a-tube do wykrywania zmian pojedynczych nukleotydów w próbkach DNA. Pojedyncza reakcja PCR jest dzielona na komory, które działają jako niezależne reakcje PCR, a wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych ze amplifikowanych celów w komorach służy do obliczenia częstotliwości wariantu allelu w próbce.

Cyfrowy PCR oparty na chip-in-a-tube do ilościowego oznaczania wariantów pojedynczych nukleotydów

Ten film demonstruje cyfrowy PCR oparty na chipie — odmianę techniki cyfrowego PCR, która jest przydatna w wykrywaniu rzadkich wariantów transkryptu. Reakcja PCR jest podzielona na komory nanofluidycznego chipa, z których każdy działa jak niezależna reakcja. Detekcja sygnałów fluorescencyjnych z komór ze wzmocnionymi celami potwierdza obecność w próbce rzadkich wariantów transkryptu.

Cyfrowy PCR oparty na chipie do wykrywania rzadkich wariantów transkryptu za pomocą chipa nanofluidycznego

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Wykrywanie krążącego kwasu rybonukleinowego (cRNA) we krwi jest niezaspokojoną potrzebą w diagnostyce klinicznej. W tym miejscu opisujemy metody charakteryzujące cRNA od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca przy użyciu czułej i specyficznej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Testy spełniają wymagania projektowe, aby wykryć warianty fuzji w ciągu 72 godzin.

Test krwi do wykrywania transkryptów fuzji ROS1 i RET z krążącego kwasu rybonukleinowego przy użyciu cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest użytecznym narzędziem do bardzo czułego wykrywania wariantów pojedynczych nukleotydów i wariantów liczby kopii DNA. W tym miejscu przedstawiamy kluczowe zagadnienia dotyczące pomiaru rzadkich wariantów w ludzkim genomie za pomocą cyfrowego PCR w formacie chip-in-a-tube.

Cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy pod kątem zmienności genetycznej u pacjenta ze sporadyczną rodzinną polipowatością gruczolakowatą przy użyciu formatu chip-in-a-tube

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Tutaj prezentowany jest protokół, w którym wiele narzędzi bioinformatycznych jest połączonych w celu zbadania biologicznych funkcji TMEM200A w raku. Ponadto eksperymentalnie weryfikujemy również przewidywania bioinformatyczne.

Analiza multiomiczna TMEM200A jako biomarkera raka

Ten protokół proponuje całościowe procedury laboratoryjne wymagane do wykrywania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu w próbkach raka żołądka w oparciu o platformę sekwencjonowania półprzewodników jonowych. Szczegółowo opisano również sekwencje docelowe, adaptery ligaturujące, wzmacnianie i oczyszczanie biblioteki oraz kryteria kontroli jakości.

Wykrywanie wielogenowego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w raku żołądka w oparciu o platformę sekwencjonowania półprzewodników jonowych

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Ten protokół opisuje rozwój przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro z monocytów krwi obwodowej hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi w celu naśladowania interakcji komórka rakowa - osteoklast. Model ten może zostać wykorzystany do pogłębienia naszej wiedzy na temat powstawania przerzutów do kości i poprawy opcji terapeutycznych.

Opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi

Poznaj metodę wykrywania rzadkich wariantów transkryptu CDH1 w tkankach raka żołądka przy użyciu cyfrowego PCR opartego na chipie. Technika ta zwiększa czułość detekcji niskopoziomowych celów w badaniach nad nowotworami.

Wykrywanie rzadkiego wariantu transkryptu CDH1 w świeżo mrożonych tkankach raka żołądka za pomocą cyfrowego PCR opartego na chipie (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie rzadkiego wariantu transkryptu CDH1 w świeżo mrożonych tkankach raka żołądka za pomocą cyfrowego PCR opartego na chipie

Przeglądaj więcej filmów