Name: Odzyskiwanie fluorescencji zygotycznej po analizie fotowybielania pod kątem luźności chromatyny, która umożliwia pełny rozwój (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Poznaj metodę zFRAP do oceny luźności chromatyny w zygotach, umożliwiającą pełny rozwój embrionalny. Technika ta pozwala badać dynamikę chromatyny bez uszkadzania potencjału rozwojowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura i Kana Kishida za krytyczne komentarze i wsparcie techniczne. Praca ta została częściowo sfinansowana przez program Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii mający na celu promowanie reformy krajowych uniwersytetów do M.O.; Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (16H02593), Fundacja Naukowa Asada oraz Fundacja Naukowa Takeda do T.W. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

To badanie zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Yamanashi. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach Uniwersytetu Yamanashi (numer zezwolenia: A24-50). Wszystkie operacje przeprowadzano w znieczuleniu tribromoetanolowym i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie. Ilustrowany przegląd procedur i harmonogram są pokazane odpowiednio w Rysunek 1 i Tabela 1.
1. Przygotowanie informacyjnego RNA (transkrypcja in vitro mRNA eGFP-H2B)
<ol>
	<li>Linearyzuj 5 μg matrycy DNA pTOPO-eGFP-H2B3,7 z 30 U Not I w 50 μL w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Zbierz 1,5 μl strawionego DNA, aby potwierdzić, czy zostało całkowicie strawione przez elektroforezę.
	<ol>
		<li>Nanieść odpowiednio 1,5 μl i 3 - 5 μl niestrawionego DNA z barwnikiem ładującym do dołka 2% żelu agarozowego i poddać elektroforezie. 
		UWAGA: W przypadku całkowitego strawienia obserwuje się pojedyncze prążko (ok. 5 kb). Niestrawione DNA jest używane jako kontrola, która pojawia się w innej pozycji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 151,5 μl ddH2O i 200 μl fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1) do pozostałego strawionego DNA.
	<ol>
		<li>Wymieszać energicznie za pomocą wiru.</li>
		<li>Wirować z maksymalną prędkością przez 15 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odzyskać sklarowany osad, a następnie dodać 200 μl chloroformu.
	<ol>
		<li>Wymieszać energicznie za pomocą wiru.</li>
		<li>Wirować z maksymalną prędkością przez 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odzyskać supernatant, a następnie dodać 20 μl octanu sodu 3M i 1,5 μl echaminwięźniu.
	<ol>
		<li>Wymieszać energicznie za pomocą wiru.</li>
		<li>Dodać 550 μl 100% etanolu, a następnie energicznie wymieszać wirowo.</li>
		<li>Wirować z maksymalną prędkością przez 15 minut.</li>
		<li>Wyrzucić supernatant, a następnie przemyć osad 70% etanolem.</li>
		<li>Suszyć granulki przez odparowanie przez 5 - 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuść wytrącone plazmidowe DNA w 8 μl wody wolnej od nukleaz</li>.
	<li>Oceń stężenie plazmidu (oczekiwane stężenie to około 300 - 500 ng/μL) za pomocą nanokropli, postępując zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Przeprowadzić transkrypcję in vitro mRNA kodującego eGFP-H2B z 1 μg oczyszczonego DNA jako matrycy w 20 μl całkowitej objętości reakcji, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Po transkrypcji in vitro dodaj 36 μl wody, a następnie odzyskaj 1,5 μl z 56 μl zsyntetyzowanego mRNA do analizy za pomocą elektroforezy (jak bez poli A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj ogonowanie poli A dla zsyntetyzowanego mRNA w objętości reakcyjnej 100 μl, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Dodaj 60 μl roztworu wytrącającego chlorek litu do mRNA z poli A ogoniastym eGFP-H2B, a następnie energicznie wymieszaj.
	<ol>
		<li>Schłodzić w temperaturze -30 °C przez 30 min.</li>
		<li>Wirować z maksymalną prędkością przez 15 minut.</li>
		<li>Wyrzucić supernatant, a następnie przemyć osad 70% etanolem.</li>
		<li>Suszyć granulki przez odparowanie przez 5 - 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuścić osad w 20 μl wody wolnej od nukleaz, ogrzewając w temperaturze 55 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Oceń stężenie wytrąconego mRNA za pomocą nanokropli. Rozcieńczyć do 500 ng/μl wodą wolną od nukleaz i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Potwierdź preferowaną produkcję mRNA; poddaj 1 μl mRNA z/bez (uzyskane odpowiednio w krokach 1.8.1 i 1,12) ogona poli A zmieszanego z 1,5 μl 0,1 mg/ml bromku etydyny i 3 μl barwnika ładującego próbkę do analizy elektroforetycznej. Zastosowana objętość wynosiła 5,5 μL. 
	UWAGA: Jeśli ogonowanie Poly A zakończyło się sukcesem, należy zaobserwować przesunięte prążki w porównaniu z mRNA bez ogona poli A (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A).</li>
</ol>
2. Przygotowanie samców myszy poddanych wazektomii
<ol>
	<li>Zważ samce myszy ICR w wieku 8 - 12 miesięcy za pomocą wagi.</li>
	<li>Wstrzyknąć dootrzewnowo samcom myszy 0,7 - 0,9 ml 1,2% znieczulenia tribromoetanolowego. 
	UWAGA: Ilość znieczulenia zależy od wielkości myszy. Na przykład myszy o wadze 40 g wstrzykuje się 0,8 ml znieczulenia tribromoetanolowego.</li>
	<li>Zwilż jagodę 70% etanolem.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie (3 - 5 mm) na jagodzie, a następnie wykonaj nacięcie na ścianie mięśniowej za pomocą nożyczek. 
	UWAGA: Nożyczki i kleszcze należy oczyścić 70% etanolem przed rozpoczęciem zabiegu.</li>
	<li>Chwyć poduszeczkę tłuszczową kleszczami i delikatnie ją wyciągnij. Następnie pojawiają się jądra i nasieniowody. 
	UWAGA: Vas deferens to rurka w kształcie litery U z czerwonym naczyniem krwionośnym.</li>
	<li>Zwiąż nasieniowody w dwóch punktach szwami chirurgicznymi, a następnie wytnij środkową część między związanymi punktami.</li>
	<li>Delikatnie wepchnij poduszeczkę tłuszczową i jądro do jagody.
	<ol>
		<li>Powtórz operację z pozostałym jądrem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zszyj ścianę mięśniową dwoma szwami ze szwem chirurgicznym.</li>
</ol>
3. Zapłodnienie in vitro
<ol>
	<li>Wstrzyknąć 8 - 10-tygodniowym samicom myszy B6D2F1 (BDF1) dootrzewnowo 7,5 j.m. końskiej gonadotropiny kosmówkowej (eCG) i ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG) w odstępie 46 - 50 godzin.</li>
	<li>Przygotuj krople 300 μl ludzkiego płynu jajowodowego (HTF)8 pożywki do kapacytacji i inseminacji 1 dzień przed zapłodnieniem in vitro w naczyniu o średnicy 30 mm, przykryj te krople olejem mineralnym na stole laboratoryjnym, a następnie wstępnie inkubuj w inkubatorze przez noc.</li>
	<li>Ofiaruj dojrzałe samce myszy ICR przez zwichnięcie szyjki macicy. Wypreparuj ogon najądrza za pomocą igły 27-G i zbierz plemniki. Hodować je w celu uzyskania pojemności w 300 μl pożywki HTF przez 1 - 2 godziny w temperaturze 38 °C.</li>
	<li>16 godzin po wstrzyknięciu hCG poświęć super owulowane samice myszy przez zwichnięcie szyjki macicy. Przenieś bańkę jajowodu do oleju mineralnego obok pożywki HTF, a następnie wyciągnij kompleks komórek wzgórka i oocytów z tej bańki jajowodu za pomocą igły 30-G do preinkubowanej pożywki do inseminacji-HTF. 
	nuta: Niektóre samice myszy często nie wykazują owulacji pomimo leczenia super owulacją. Powiększona bańka jajowodu jest oznaką owulacji.</li>
	<li>Po kapacytacji przenieść 2 - 3 μL zpojemnościonego plemnika do pożywki inseminacyjnej HTF, w której pobrano owulowane oocyty.</li>
	<li>1 godzinę po inseminacji zebrać zapłodnione zygoty i potraktować je hialuronidazą w stężeniu 100 μg/ml przez 10 minut w CZB9 media. 
	nuta: Gdy inseminacja zostanie wykonana prawidłowo, 1 godzinę po inseminacji, obserwuje się zapłodnione zygoty z 2ciałem polarnym. Jeśli używa się plemników o mniejszej lub niskiej jakości, obserwuje się tylko małe zygoty z 2.ciałem biegunowym. Ponadto, jeśli do inseminacji używa się wielu plemników, dochodzi do polispermii. Prawidłowa inseminacja prowadzi do powstania zygot z przedjądrzami męskimi i żeńskimi. Korzystając z tych kryteriów, można stwierdzić, czy inseminacja jest przeprowadzona dobrze, czy nie.
	<ol>
		<li>Po umyciu w pożywce CZB zygoty z drugim ciałem polarnym poddać mikroiniekcji mRNA eGFP-H2B.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie pipet komorowych i mikroiniekcyjnej
<ol>
	<li>Rozcieńczyć RNA kodujące eGFP-H2B za pomocą wody wolnej od nukleaz w celu uzyskania stężenia 250 ng/μL.</li>
	<li>Przygotuj 2 - 3 krople PVP-HTF i eGFP-H2B mRNA i 5 - 6 kropli Hepes buforowanych CZB (H-CZB) na 60-milimetrowej szalce. Przykryj te krople olejem mineralnym. 
	UWAGA: Preparaty te można wykonywać na stole laboratoryjnym. Nie ma wymogu stosowania szafy z laminarnym przepływem powietrza.</li>
	<li>Pociągnij szkło borokrzemianowe za pomocą ściągacza do mikropipet (np. P = 500, ciepło = 825, ciągnięcie = 30, vel = 120 i czas = 200)</li>
	<li>Po złamaniu końcówki pipety należy zegnąć wyciągniętą szklaną pipetę do mikroiniekcji blisko końcówki (−300 μm do tyłu) pod kątem około 30° za pomocą mikrokuźni.</li>
</ol>
5. Mikroiniekcja
<ol>
	<li>Wyłącz grzałkę płytkową na stoliku mikromanipulatora, aby zapobiec zabiciu zygot piezoelektrycznym podczas wstrzykiwania mRNA.</li>
	<li>Umyć i pokryć wnętrze igieł iniekcyjnych preparatem HEPES-buffered-HTF zawierającym 10% PVP (PVP-HTF).</li>
	Zbierz zapłodnione zygoty za pomocą drugiego ciała polarnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B) i przenieś 20 - 25 zygot do komory stolika mikroskopowego przymocowanego za pomocą mikromanipulatora.<li></li>
	<li>Wypełnij rozcieńczone mRNA eGFP-H2B do kapilar ze szkła borokrzemianowego z końcówek.</li>
	<li>Przytrzymaj zygotę pipetą podtrzymującą, a następnie rozbij osłonkę przejrzystą i błonę cytozolową za pomocą napędu piezoelektrycznego.</li>
	<li>Wstrzyknij około 10 pL mRNA do cytoplazmy zygot. Zakończ wstrzykiwanie mRNA w ciągu 10 minut, aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym dłuższą hodowlą zygot poza inkubatorem. 
	nuta: Objętość wstrzyknięcia powinna być tak duża, jak 2.korpus biegunowy. Jeśli ilość wstrzykniętego mRNA jest zbyt duża, możliwe jest spowodowanie powstania wolnej frakcji eGFP-H2B, co może wpływać na frakcję ruchomą.</li>
	<li>10 minut po mikroiniekcji przemyć co najmniej 3 krople, a następnie wyhodować wstrzyknięte zygoty w CZB w temperaturze 38 °C do czasu analizy zFRAP.</li>
</ol>
6. Analiza zFRAP
<ol>
	<li>Na 1 godzinę przed analizą zFRAP należy włączyć laser i płytę grzejną przymocowane do stolika mikroskopu konfokalnego. Ustaw temperaturę na 38 °C.</li>
	<li>Umieść 6 - 10 μl buforowanej przez HEPES pożywki CZB pokrytej olejem mineralnym na szklanym naczyniu o średnicy 60 mm i podgrzej na grzejniku do momentu zebrania zygoty. </li>
	<li>8 - 12 godzin po inseminacji zebrać 5-10 zygot eksprymujących eGFP-H2B i przenieść do 6 - 10 μl wstępnie podgrzanej pożywki CZB buforowanej przez HEPES, kropli. 
	UWAGA: Aby uniknąć dłuższej hodowli poza inkubatorem, przy każdej analizie użyto 5 - 10 zygot wykazujących ekspresję eGFP-H2B. W ciągu 1 godziny można przeanalizować od 5 do 10 zygot.</li>
	<li>Ustaw warunki wybielania i obrazowania zgodnie z instrukcjami producenta. Przypadek konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (tabela materiałów) pokazano poniżej:
	<ol>
		<li>Użyj obiektywu olejowego 60X (60X 60X/1.35 oleju). 
		UWAGA: Obiektywy o większym powiększeniu (większa przysłona numeryczna) wykazują wyższą czułość.</li>
		<li>Ustaw szybkość skanowania na 4,0 μs/piksel, a rozmiar na "512" w "Ustawieniach akwizycji" (rysunek uzupełniający 1).</li>
		<li>Zwiększ zoom cyfrowy do "5" (rysunek uzupełniający 1). 
		UWAGA: Większy zoom jest wymagany, aby rozpoznać, czy występuje przesunięcie ostrości, czy nie.</li>
		<li>Otwórz listę barwników (rysunek uzupełniający 1), a następnie wybierz "EGFP". Ustaw czas obserwacji na 1,6 s (interwał jest ustawiony jako ustawienie "swobodnego biegu") (Rysunek uzupełniający 1) 
		UWAGA: Więcej punktów obserwacyjnych może spowodować bardziej szczegółowe dane, ale może również spowodować fototoksyczność. W analizie zFRAP czas obserwacji wynoszący 1,6 s wydaje się być wystarczający do wykrycia rodzicielskiej asymetrii luzu chromatyny.</li>
		<li>Ustaw łączną liczbę zdjęć na 12 (Rysunek uzupełniający 1).</li>
		<li>Uruchom panel "Ustawienie bodźca", a następnie kliknij "Główny" na UseScanner. Ustaw szybkość skanowania na 10,0 μs/piksel. Kliknij "Aktywacja w serii", a następnie ustaw Wstępna aktywacja jako "3 klatki", a Czas aktywacji jako "5 sekund" (Rysunek uzupełniający 1).</li>
		<li>Kliknij "Ostrość x 2" i ustaw ostrość, a następnie "Zatrzymaj".</li>
		<li>Ustaw moc lasera do wybielania i obrazowania (477 nm) odpowiednio na 110 i 15 μW, dostosowując "moc lasera" (rysunek uzupełniający 1). 
		UWAGA: Bardzo silne wybielanie może spowodować większe wybielone obszary, co powoduje trudności w analizie ilościowej. Do pomiaru mocy lasera należy użyć miernika mocy. Ważne jest, aby potwierdzić moc lasera, aby uniknąć efektu pogorszenia mocy lasera związanego z czasem.</li>
		<li>Kliknij "Clip Rect" (Rysunek uzupełniający 1) w panelu Ustawienia bodźca. Ustaw obszar zainteresowania (ROI; czerwony; ROI #1B) jako 40 x 40 pikseli (7,6 μm2). Przygotuj region odniesienia (REF; zielony; ROI #2) i tło (BG; niebieskie; ROI #3) za pomocą "kopiuj ROI" i "wklej ROI" (przycisk prawego przycisku myszy myszy). 
		UWAGA: Rozmiar piksela można ustawić za pomocą "Menedżera ROI", który można wywołać, klikając prawy przycisk myszy, gdy kursor znajduje się na ROI. Uważa się, że większe zwroty z inwestycji są lepsze, ponieważ mogą ustandaryzować rozproszenie wyniku zFRAP. Jednak zbyt duży zwrot z inwestycji nie może być użyty do tej analizy, ponieważ utrudnia to uniknięcie ciała prekursorowego jąderka (NPB). Uważano, że eGFP-H2B w tym przedziale jest wolny od chromatyny i wykazywał znacznie wyższą mobilność3. Obszary ROI i REF powinny być od siebie oddzielone w jak największym stopniu. Jeśli te dwa regiony są blisko, wybielanie może również wpływać na obszar REF.</li>
		<li>Kliknij "Na żywo" na pasku narzędzi, a następnie uruchom "Wykres na żywo" (rysunek uzupełniający 1). 
		UWAGA: Wykres na żywo wskazuje intensywność sygnału fluorescencji w każdym ROI i służy do regulacji mocy lasera za pomocą HV. Należy pamiętać, że jeśli ROI nie zostanie wybrane, intensywność nie zostanie wykryta na panelu Wykres na żywo.</li>
		<li>Określanie pozycji ROI 
		UWAGA: ROI można przesunąć, przeciągając do żądanej pozycji w przedjądrzach. (1) Upewnij się, że unikasz jąderka i (2) dopasuj cały ROI do nukleoplazmy. Nie zawierają obszaru poza obszarem błony jądrowej (cytoplazmy) w ROI. Lokalizacja eGFP-H2B jest wysoce ograniczona w nukleoplazmie, dzięki czemu łatwo jest stwierdzić, czy ROI zawiera cytoplazmę, czy nie, na podstawie fluorescencji eGFP-H2B. Przedjądrza męskie są zwykle większe niż u samic, które często są zlokalizowane w pobliżu 2.ciała biegunowego. Korzystając z tych kryteriów, oceń przedjądrza męskie lub żeńskie.</li>
		<li>Kliknij "Ostrość x 2" (rysunek uzupełniający 1), a następnie dostosuj miernik mocy WN kanału dla EGFP do intensywności fluorescencji na około 2000 (intensywność fluorescencji można zobaczyć w oknie "wykres na żywo").</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij "Czas", a następnie "XY" (Rysunek uzupełniający 1), aby rozpocząć analizę zFRAP. 
	UWAGA: Jeśli przycisk "Czas" jest odpowiednio wybrany, na przycisku "XY" pojawia się "t".
	<ol>
		<li>Kliknij "Series Done" (Rysunek uzupełniający 1), który pojawia się po obrazowaniu FRAP w pobliżu "przycisku XY", a następnie uzyskaj dane przeanalizowane przez FRAP.</li>
		<li>Zapisz plik "2D View-Image XXXXX" jako preferowany plik nazwany (oib. format pliku) za pomocą "zapisz jako" (można również użyć Ctrl + Shift + S).</li>
		<li>Wybierz ROI, REF i BG, a następnie kliknij (można również użyć Ctrl+A) "Analiza serii" w oknie "Obraz widoku 2D".</li>
		<li>Uzyskaj dane FRAP wiersza, a następnie kliknij przycisk "zapisz" w oknie wykresu na żywo. 
		UWAGA: Dane ilościowe FRAP wiersza są zapisywane jako plik csv.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby nie kontrolować zFRAP, umieść niektóre zygoty, którym wstrzyknięto mRNA, na kropli, która znajduje się blisko krawędzi naczyń ze szklanym dnem, aby uniknąć efektu obserwacji fluorescencji.</li>
</ol>
7. Obliczanie danych
<ol>
	<li>Korzystając z uzyskanych danych ilościowych, należy wykonać wykres "krzywej odzysku" i "frakcji ruchomej" w programie Excel, jak pokazano w referencji3,7 z pewnymi modyfikacjami (patrz poniżej i uzupełniający plik Excel).</li>
	<li>Oblicz względną intensywność, odejmując wartość BG od wartości ROI i REF na 12 obrazkach dla każdego punktu czasowego.</li>
	<li>Podziel wartość ROI przez wartość REF. W rezultacie można uzyskać 12 standaryzowanych wyników intensywności względnej w każdym punkcie czasowym.</li>
	<li>Oblicz średnią względnego wyniku dla ROI na 3 zdjęciach wykonanych przed wybielaniem zdjęć.</li>
	<li>Oblicz wskaźnik odzysku. Podziel 12 uzyskanych względnych wyników zwrotu z inwestycji na zdjęciach wykonanych w każdym punkcie czasowym (uzyskanych w 7.1.2.) przez średnią względnego wyniku przed wybielaniem zdjęć (uzyskanego w 7.1.3.). Narysuj krzywą odzysku, korzystając z tych wyników (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Oblicz szybkość bielenia. 
	UWAGA: Szybkość wybielania (%) = 100 - szybkość regeneracji 4. obrazu.</li>
	<li>Oblicz ułamek ruchomy (MF), korzystając z następującego wzoru10,11,12 
	MF (%) = 12th recovery rate (w punkcie końcowym) - 4th recovery rate / bielenie × 100.</li>
</ol>
8. Transfer zarodków
<ol>
	<li>Partneruj dojrzałe samice ICR w wieku 8-12 miesięcy z samcami myszy ICR poddanych wazektomii w noc przed transferem zarodków, pozwalając im przebywać w tej samej klatce na noc.</li>
	<li>Zbierz zarodki, które zostały przeanalizowane za pomocą zFRAP i określone do rozwoju do stadium dwukomórkowego.</li>
	<li>Samicom myszy wstrzyknąć dootrzewnowo 0,7 - 0,9 ml 1,2% znieczulenia tribromoetanolowego lub 0,35 - 0,45 ml mieszaniny 0,75/4/5 mg/kg medetomidyny/midazolamu/butorfanolu przed transferem zarodków. 
	UWAGA: Objętość znieczulenia zależy od masy ciała myszy. Tribromoetanol: 0,2 ml/10 g masy ciała; Mieszanina medetomidyny/midazolamu/butorfanolu: 0,1 ml/ 10 g masy ciała.
	<ol>
		<li>Przenieś te dwukomórkowe zarodki do jajowodów samic myszy ICR w ciąży rzekomej za pomocą czopa dopochwowego w 0,5 dnia po stosunku (dpc).</li>
		<li>Po transferze zarodków umieść samice myszy na grzejniku ustawionym na 37 °C, aż się obudzą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 18,5 dpc poświęć matkę zastępczą przez zwichnięcie szyjki macicy i odzyskaj młode pochodzące z zygot analizowanych przez zFRAP przez cesarskie cięcie. Niektóre z odzyskanych szczeniąt zostały dostarczone do matki zastępczej, a ich masa ciała była oceniana co tydzień.</li>
</ol>

<ol><li>Burton, A., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+and+development%3A+a+unique+heterochromatin+organization+in+the+preimplantation+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo.</a> Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).</li>
<li>Okada, Y., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+modifications+and+reprogramming+in+paternal+pronucleus%3A+sperm%2C+preimplantation+embryo%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond.</a> Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).</li>
<li>Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+chromatin+structure+in+mouse+preimplantation+embryos+by+fluorescent+recovery+after+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching.</a> Epigenetics. 11, 85-94 (2016).</li>
<li>Meshorer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperdynamic+plasticity+of+chromatin+proteins+in+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells.</a> Dev Cell. 10, 105-116 (2006).</li>
<li>Boskovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+chromatin+mobility+supports+totipotency+and+precedes+pluripotency+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo.</a> Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).</li>
<li>Yamagata, K., Ueda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live-cell+imaging+of+mammalian+preimplantation+development+and+derivation+process+of+pluripotent+stem+cells+from+the+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos.</a> Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).</li>
<li>Ooga, M., Wakayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+analysis+of+chromatin+looseness+in+mouse+zygotes+that+allows+full-term+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development.</a> PLoS One. 12, e0178255(2017).</li>
<li>Quinn, P., Begley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+human+seminal+plasma+and+mouse+accessory+gland+extracts+on+mouse+fertilization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+journal+of+biological+sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro.</a> Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).</li>
<li>Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+1-cell+embryos+from+different+strains+of+mice+in+CZB+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+reproduction%22%5BJournal%5D)">Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium.</a> Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).</li>
<li>Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-actin-dependent+regulation+of+NESH+dynamics+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons.</a> PLoS One. 7, e34514(2012).</li>
<li>Dieteren, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+mitochondrial+translation+differently+affects+the+live+cell+dynamics+of+complex+I+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits.</a> Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).</li>
<li>Subramanian, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2A.Z+acidic+patch+couples+chromatin+dynamics+to+regulation+of+gene+expression+programs+during+ESC+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation.</a> PLoS Genet. 9, e1003725(2013).</li>
<li>Hayashi-Takanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+epigenetic+histone+modifications+in+single+cells+using+Fab-based+live+endogenous+modification+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling.</a> Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).</li>
<li>Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+and+retrospective+analysis+of+DNA+methylation+in+mouse+preimplantation+embryos+by+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging.</a> Dev Biol. 304, 409-419 (2007).</li>
<li>Puschendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC1+and+Suv39h+specify+parental+asymmetry+at+constitutive+heterochromatin+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos.</a> Nat Genet. 40, 411-420 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jak ujawniono w tym badaniu, analiza zFRAP nie powoduje krytycznych uszkodzeń dla pełnego rozwoju, co sugeruje, że metoda ta jest bardzo użytecznym narzędziem do ujawnienia związku między zdarzeniami molekularnymi a embrionalnym potencjałem rozwojowym. Podczas przeprogramowania, do stanu dwukomórkowego komórek ES, w wyniku którego potencjał różnicowy tych komórek staje się tak wysoki, jak w przypadku zarodków w stadium dwukomórkowym, rozluźnienie chromatyny zmienia się na porównywalne z zarodkami w stadium<sup class="xre...

Po zapłodnieniu, struktura chromatyny zmienia się dynamicznie, a struktura chromatyny zygotycznej jest ostatecznie ustalana1,2. W tym okresie w ojcowskich przedjądrzach dominujące białko chromatyny zmienia się z protaminy w histon. Otrzymana chromatyna jest skrajnie różna od chromatyny plemników i oocytów żeńskich w kilku punktach (np. skład wariantu histonu, modyfikacja histonów). W związku z tym uważa się, że utworzona chromatyna zygotyczna jest ważna dla późniejszego rozwoju embrionalnego. Jednak pomimo wysiłków zmierzających do ujawnienia szczegółów struktury chromatyny zygotycznej w długich okresach, nigdy nie ustalono metod oceny jakości zygot lub przewidywania ich pełnego rozwoju w stadium jednokomórkowym poprzez analizę ich struktury chromatyny.
W poprzednim badaniu odkryto, że zygoty mają bardzo rozluźnioną strukturę chromatyny3. Obecnie uważa się, że luźność lub otwartość chromatyny jest ważnym czynnikiem wpływającym na potencjał różnicowania komórkowego w embrionalnych komórkach macierzystych (ES)4. Komórki ES nie wykazują jednorodności w naturze, ale są raczej niejednorodne; w koloniach komórek ES niektóre przejściowo uzyskują wyższy potencjał różnicowania porównywalny z blastomerami zarodków w stadium dwukomórkowym. Podczas tego przejścia do stanu podobnego do dwukomórkowego, luźność chromatyny w komórkach ES zmienia się w to, co jest porównywalne z zarodkami w stadium dwukomórkowym5. Tak więc luźność chromatyny wydaje się być ważna dla potencjału różnicowania komórkowego i możliwe, że szeroko otwarta chromatyna w zygotach jest przydatna do oceny potencjału rozwojowego zygoty.
Obrazowanie na żywo jest potężnym narzędziem, które pozwala na analizę zdarzeń molekularnych podczas ontogenezy, ponieważ ta metoda pozwala na późniejszy rozwój, a nawet na pełny rozwój6. Jako jedna z metod obrazowania na żywo, analiza FRAP została wykorzystana do zbadania luźności chromatyny w zarodkach preimplantacyjnych i komórkach ES3,4,5. Jeśli luźność chromatyny zygotycznej może być analizowana bez szkodliwego wpływu na rozwój w pełnym okresie za pomocą analizy FRAP, może to być cenne narzędzie do oceny jakości zarodków w stadium jednokomórkowym. Nie zbadano jednak wpływu tej metody eksperymentalnej na rozwój w pełnym okresie. Niedawno opracowano eksperymentalny system wykorzystujący FRAP do oceny luźności chromatyny zygotycznej. Ponieważ był to nowy system obserwacji zygot, został on nazwany zygotycznym FRAP (zFRAP). zFRAP nie miał krytycznego wpływu na rozwój w pełnym okresie i został opisany gdzie indziej7. W niniejszym raporcie opisano protokół tej metody eksperymentalnej.

<table><tbody><tr><td>Konfokalny mikroskop skaningowy</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td>FV1000 może być również używany do analizy FRAP (odniesienie #7)</td></tr><tr><td>Płyta termiczna</td><td>Tokai Hit</td><td>TP-110RH26</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Mikro manupilator</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator Pieze</td><td>Prime tech</td><td>PMAS-CT150</td><td></td></tr><tr><td>35 mm naczynie hodowlane</td><td>Falcom</td><td>351008</td><td>styl 35 x 100 mm; do IVF</td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane 60 mm</td><td>Falcom</td><td>351007</td><td>styl 60 x 15 mm; do hodowli zarodków</td></tr><tr><td>Naczynie</td><td>hodowlane Falcom</td><td>351006</td><td>50 mm 50 x 9 mm; do manipulacji na stoliku</td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem 50 mm</td><td>Matsunami</td><td>D910400</td><td>Szalka 50 mm, 27 mm & rozmiar otworu; do analizy FRAP</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Organiczne chemikalia specjalistyczne</td><td>625071</td><td>Do analizy FRAP na szklanych naczyniach dennych</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M8410-1L</td><td>Do zapłodnienia in vitro i hodowli zarodków</td></tr><tr><td>szklana kapilarna</td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>Do obsługi zygot mysich</td></tr><tr><td>Szkło borokrzemianowe</td><td>Prime tech</td><td>B100-75-10-PT</td><td>Do mikroiniekcji mRNA</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Przyrząd Sutter</td><td>P-97/IVF</td><td>Do przygotowania iniekcji lub trzymania w pozycji gładkiej (średnica strony zewnętrznej: 80 &mikro; m, średnica wewnętrzna: 10 &micro; m)&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrokuźnia</td><td>&nbsp; Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE MACHINE SP6 Zestaw do transkrypcji</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do usuwania części polimerowych (A)</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór PVP 10% (PVP-HTF)</td><td>IrvineSceientific</td><td>99311</td><td>HEPES buforowany HTF zawierający 10% PVP</td></tr><tr><td>Sód HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>pTOPO eGFP-H2B</td><td></td><td></td><td>Matryca plazmidu dla mRNA eGFP-H2B (odniesienie #6)</td></tr><tr><td>NorthernMax Gly Ładowanie próbki Barwnik&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM8551</td><td>Do elektroforezy transkrybowanego mRNA in vitro</td></tr><tr><td>Fenol chloroform alkohol izamylowy</td><td>nacalai tesque</td><td>25970-14</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>nacalai tesque</td><td>&nbsp; 08401-65</td><td></td></tr><tr><td>Nie</td><td>I TOYOBO</td><td>NOT-111X</td><td></td></tr><tr><td>Więzień Ethachinmate</td><td>WAKO</td><td>318-01793</td><td></td></tr><tr><td>3664 Miernik mocy Otical</td><td>Hioki</td><td>3664</td><td>&nbsp; Miernik mocy lasera</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr></tbody></table>

odzyskiwanie fluorescencji zygotycznej po analizie fotowybielania pod kątem luźności chromatyny, która umożliwia pełny rozwój

Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development

Obrazowanie na żywo to potężne narzędzie, które pozwala na analizę zdarzeń molekularnych podczas ontogenezy. Ostatnio wykazano, że rozluźnienie lub otwartość chromatyny jest zaangażowana w potencjał różnicowania komórkowego pluripotencjalnych embrionalnych komórek macierzystych. Wcześniej informowano, że w porównaniu z embrionalnymi komórkami macierzystymi, zygoty mają niezwykle rozluźnioną strukturę chromatyny, co sugeruje jej związek z ich totipotencją. Jednak do tej pory nie zajęto się kwestią, czy ta niezwykle rozluźniona/otwarta struktura chromatyny jest ważna dla potencjału rozwojowego embrionalnego. W niniejszym badaniu, aby zbadać tę hipotezę, opracowano system eksperymentalny, w którym zygoty, które analizowano przez regenerację fluorescencji po fotowybielaniu, mogą rozwijać się do terminu bez żadnych znaczących uszkodzeń. Co ważne, ten eksperymentalny system wymaga jedynie grzałki termosowej oprócz konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Wyniki tego badania sugerują, że odzyskiwanie fluorescencji po analizie fotowybielania (FRAP) można wykorzystać do zbadania, czy zdarzenia molekularne w chromatynie zygotycznej są ważne dla długoterminowego rozwoju.

Analiza zFRAP z użyciem eGFP-H2B
Prawidłowo otrzymane mRNA kodujące eGFP-H2B, widoczne jako przesunięty prążek spowodowany poliadenylacją (Ryc. 2A), wstrzyknięto do cytoplazmy zygot z drugim ciałkiem polarnym w czasie od 1 do 3 h po inseminacji (Ryc. 2B). Od ośmiu do dwunastu godzin po inseminacji zebrano zygoty z dwoma jąderkami wykazujące ekspresję eGFP-H2B i poddano je ...

Luźność chromatyny wydaje się być związana z potencjałem rozwojowym blastomerów. Nie wiadomo jednak, czy luźność chromatyny może być stosowana jako wiarygodny wskaźnik potencjału rozwojowego zarodków. W tym miejscu opisano system eksperymentalny, w którym zygoty oceniane pod kątem luźności chromatyny mogą rozwinąć się do pełnego terminu.

Odzyskiwanie fluorescencji zygotycznej po analizie fotowybielania pod kątem luźności chromatyny, która umożliwia pełny rozwój

Live imaging is a powerful tool that allows for the analysis of molecular events during ontogenesis. Recently, chromatin looseness or openness has been ...

Ogólnym celem tego zygotycznego FRAP lub zFRAP jest zbadanie związku między luźnością chromatyny zygotycznej a potencjałem rozwoju embrionalnego do terminu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwoju, takie jak rozwój embrionalny. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona analizowanej zygocie rozwinąć się do pełnego okresu bez znacznych uszkodzeń.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy analizy zFRAP są trudne do nauczenia, ponieważ ustawienie warunków eksperymentalnych i działanie tej analizy są bardzo złożone. Po przygotowaniu RNA eGFP-H2B zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć wody wolnej od nukleaz, aby rozcieńczyć go do 250 nanogramów na mikrolitr. W 60-milimetrowej naczyniu umieść po dwie do trzech kropli PVP-HTF, pięć do sześciu kropli CZB buforowanego przez Hepes i mRNA eGFP-H2B.Następnie użyj oleju mineralnego, aby przykryć krople. Za pomocą ściągacza do pipet wyciągnij szkło borokrzemianowe. Po złamaniu końcówki za pomocą mikrokuźni zgnij szklaną pipetę pod kątem około 30 stopni.Przed mikroiniekcją upewnij się, że grzałka płytkowa na stoliku mikromanipulatora jest wyłączona, aby zapobiec zabiciu zygot podczas wstrzykiwania mRNA. Następnie, używając 10% PVP-HTF, umyj i pokryj wnętrze igieł iniekcyjnych. Następnie z końcówek wypełnij szklane naczynia włosowate rozcieńczonym mRNA eGFP-H2B.Zbierz zapłodnione zygoty z drugim ciałem polarnym i przenieś 20 do 25 z nich do komory stolika mikroskopu. Następnie za pomocą pipety podtrzymującej przytrzymaj zygotę i rozbij osłonkę przejrzystą i błonę cytozolową za pomocą napędu piezoelektrycznego. Wstrzyknij około 10 pikolitrów mRNA do cytoplazmy każdej zygoty.Wykonaj zastrzyki w ciągu 10 minut, aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym hodowlą zygot poza inkubatorem. 10 minut po mikroiniekcji umyj zygoty w co najmniej trzech kroplach CZB i hoduj je w temperaturze 38 stopni Celsjusza do czasu analizy FRAP. Na godzinę przed analizą zFRAP włącz laser i płytę grzejną przymocowane do stolika mikroskopu konfokalnego.Ustaw temperaturę na 38 stopni Celsjusza. Na 60-milimetrowym naczyniu ze szklanym dnem odpipetuj od sześciu do 10 mikrolitrów pożywki CZB buforowanej przez Hepes i przykryj ją olejem mineralnym. Następnie podgrzej naczynie na grzejniku, aż do zebrania zygoty.Aby ułatwić znalezienie zygoty za pomocą mikroskopu konfokalnego, ważne jest, aby umieścić krople w środku naczynia. Osiem do 12 godzin po inseminacji zbierz od pięciu do 10 zygot wyrażających eGFP-H2B i przenieś je do 6 do 10 mikrolitrów kropli wstępnie podgrzanej pożywki CZB buforowanej przez Hepes. Aby przeprowadzić precyzyjną analizę ilościową, ważne jest, aby umieścić zygotę w kierunku środka kropli CZB buforowanych przez Hepes.Ustaw warunki wybielania i obrazowania zgodnie z instrukcjami producenta. Na przykład w obszarze Ustawienie akwizycji ustaw szybkość skanowania na cztery mikrosekundy na piksel, a rozmiar na pięćset dwanaście pikseli. Zwiększ zoom cyfrowy do pięciu, otwórz DyeList"i wybierz eGFP"Następnie ustaw czas obserwacji na jeden punkt sześć sekund, a liczbę zdjęć na 12.Następnie uruchom Ustawienie bodźca"panel i włącz UseScanner"kliknij Główny"Ustaw prędkość skanowania na 10 mikrosekund na piksel. Kliknij Aktywacja w serii"Ustaw wstępną aktywację"na trzy ramki, a czas aktywacji na pięć sekund. Następnie kliknij Focus x2"i kliknij Zatrzymaj"Pod panelem ustawień bodźca kliknij Clip Rect"Ustaw ROI na 40 na 40 pikseli.Kliknij Czas"i XY"Następnie użyj miernika mocy optycznej, aby uzyskać dostęp do mocy lasera. Ważne jest, aby światła były wyłączone podczas pomiaru lasera. Po wyregulowaniu przyrządu laserowego w celu ustawienia mocy lasera wybielającego i obrazowego, na pasku narzędzi kliknij Na żywo", a następnie uruchom Live Plot"Umieść olej na soczewce obiektywu.Ustaw komnatę na scenie, a następnie znajdź zygoty w kroplach. Po znalezieniu zygot określ pozycję ROI, klikając Focus x2"A następnie w Live Plot"okno dostosuj miernik mocy HV dla eGFP"intensywność fluorescencji kanału na około 2,000. Aby rozpocząć analizę zFRAP, kliknij XY"Po analizie FRAP kliknij Seria Gotowe"Uzyskaj dane analizowane przez FRAP, a następnie kliknij Zapisz jako"aby zapisać plik Obraz widoku 2D"jako preferowany nazwany plik.Użyj opcji Kopiuj "ROI i Wklej" ROI, aby przygotować odpowiednio region referencyjny i tło. Następnie należy wybrać ROI, REF i BG, a następnie w oknie obrazu Widok 2D kliknąć Analiza serii "Uzyskaj dane RoFRAP", a następnie w oknie Wykres na żywo kliknąć przycisk Zapisz". Przeprowadzaj obliczenia danych zgodnie z protokołem tekstowym.Osiem do 12 godzin po inseminacji pobrano zygoty z dwoma przedjądrzkami wykazującymi ekspresję eGFP-H2B i poddano analizie zFRAP. Po bieleniu intensywność sygnału fluorescencyjnego eGFP-H2B nieznacznie się poprawiła z powodu napływu eGFP-H2B do ROI z niebielonego obszaru w nukleoplazmie. Krzywe rekonwalescencji pokazują, że męskie przedjądrza regenerowały się szybciej i z bardziej ruchliwymi frakcjami niż przedjądrze żeńskie.Jak pokazano na tych obrazach i wykresie, po analizie zFRAP, przemyte i wyhodowane zygoty w pożywce CZB rozwinęły się do stadium blastocysty bez znacznych uszkodzeń. Aby przeanalizować pełny rozwój donoszony, zarodki w stadium dwukomórkowym przeniesiono do woduktów matek pseudociężarnych. Jak podano w tej tabeli, wskaźnik urodzeń zarodków analizowanych za pomocą zFRAP był nieznacznie, ale znacznie niższy niż w przypadku zarodków nienaruszonych, ale był taki sam jak w grupie kontrolnej bez zFRAP.Ponadto młode pochodzące z analizowanych zygot zFRAP wydawały się zdrowe i w pełni rozwinięte. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby poczekać na inne rozszerzenie. Cały obiektywizm budżetowy, aby uniknąć dryfu ostrości.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować luźność chromatyny w zygotach.

zygotic-fluorescence-recovery-after-photo-bleaching-analysis-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy metody fotowybielania, w tym Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) oraz Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP), służące do monitorowania dynamiki białek chromatyny w embrionalnych komórkach macierzystych (ES). Dynamika białek chromatyny, uznawana za jeden ze sposobów badania plastyczności chromatyny, jest zwiększona w komórkach pluripotencjalnych.

Analizy fotoblaknięcia (FRAP i FLIP) do pomiaru dynamiki białek chromatyny w żywych embrionalnych komórkach macierzystych

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Poziomy białka w komórkach i tkankach są często ściśle regulowane przez równowagę produkcji białka i jego usuwania. Korzystając z rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP), kinetykę klirensu białek można eksperymentalnie zmierzyć in vivo.

Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)

Molekularne mechanizmy dekondensacji wysoce zagęszczonej chromatyny mitotycznej są źle zdefiniowane. Przedstawiamy bezkomórkowy test oparty na mitotycznych klastrach chromatyny wyizolowanych z komórek HeLa i ekstraktu z jaj Xenopus laevis, który wiernie odtwarza proces dekondensacji in vitro.

Test bezkomórkowy do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy

Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

Wiadomo, że oogeneza u ssaków jest podatna na błędy, szczególnie z powodu błędnej segregacji chromosomów. W tym manuskrypcie opisano metody przygotowania rozprzestrzeniania się chromatyny dla mysich oocytów z profazą, metafazą I i II stopnia. Te podstawowe techniki pozwalają na badanie białek związanych z chromatyną i morfologii chromosomów w trakcie oogenezy ssaków.

Preparaty do rozprzestrzeniania chromatyny do analizy progresji oocytów myszy od profazy do metafazy II

Ten manuskrypt przedstawia szczegółową metodę generowania sond ramienia chromosomu X i przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu zbadania stanu kohezji chromatydy siostrzanej w oocytach Drosophila zatrzymanych w prometafazie i metafazie I. Protokół ten jest odpowiedni do określenia, czy spójność ramienia mejotycznego jest nienaruszona, czy zakłócona w różnych genotypach.

Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Ten protokół hybrydyzacji fluorescencji in situ jest zoptymalizowany do ilościowego określenia liczby cząsteczek RNA w pączkujących drożdżach podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy.

Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie

Mikroskopia poklatkowa jest cennym narzędziem do badania mejozy u pączkujących drożdży. Protokół ten opisuje metodę, która łączy synchronizację cyklu komórkowego, mikroskopię poklatkową i warunkowe wyczerpanie białka docelowego, aby zademonstrować, jak badać funkcję określonego białka podczas segregacji chromosomów mejotycznych.

Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Poznaj metodę zFRAP do oceny luźności chromatyny w zygotach, umożliwiającą pełny rozwój embrionalny. Technika ta pozwala badać dynamikę chromatyny bez uszkadzania potencjału rozwojowego.

Odzyskiwanie fluorescencji zygotycznej po analizie fotowybielania pod kątem luźności chromatyny, która umożliwia pełny rozwój

Przeglądaj więcej filmów