Name: Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Poznaj metodę włączania niekanonicznych aminokwasów do białek w komórkach ssaków przy użyciu testu fluorescencyjnego. Technika ta umożliwia mapowanie miejsc wiązania ligandów w receptorach GPCR oraz szybkie, bezkatalizatorowe etykietowanie bioortogonalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została założona przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) w ramach grantów CO822/2-1 (program Emmy-Noether) i CO822/3-1 dla I.C.

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych konfliktów.

Protokół opisuje prosty i wiarygodny test do oceny skuteczności par ortogonalnych do włączania ncAA do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Główną zaletą tej metody w odniesieniu do powszechnie stosowanych testów opartych na FACS jest to, że pozwala na jednoczesne przygotowanie i pomiar większej liczby próbek, a także dostarcza danych, które można łatwo analizować za pomocą zwykłego oprogramowania. Dostępność średnioprzepustowej metody analizy par ortogonalnych w komórkach ssaków jest bardzo ważna dla rozwoju...

Genetyczne włączenie sond chemicznych do białek jest potężną metodą ułatwiającą badanie strukturalnych i dynamicznych aspektów funkcji białek bezpośrednio w natywnym kontekście żywej komórki. Obecnie setki niekanonicznych aminokwasów (ncAA) wyposażonych w najbardziej zróżnicowane grupy chemiczne mogą być specyficznie włączane do białek w procesie biosyntezy1,2,3,4. Pomiędzy nimi znajdują się światłoczułe ncAA, takie jak foto-crosslinkery5, photo-caged6,7,8,9 oraz fotoprzełączalne aminokwasy10,11, aminokwasy zawierające naprężone alkeny i alkiny do bioortogonalnej chemii bez katalizatora2,12,13,14,15,16,17, aminokwasy niosące Dansyl18, coumarin9,19, oraz prodan20,21 Fluorofory i aminokwasy wyposażone w inne sondy biofizyczne, a także w modyfikacje potranslacyjne1,2,3,4,22,23,24,25.
Kodowanie genetyczne ncAA jest możliwe dzięki dedykowanej syntetazie amino-acyl-tRNA (AARS) sparowanej z pokrewnym supresorem tRNA, który włącza ncAA w odpowiedzi na bursztynowy kodon stop podczas regularnej syntezy rybosomalnej. Pary ncAARS/tRNA są zaprojektowane tak, aby były ortogonalne w organizmie gospodarza, tzn. nie przesłuchiwały się z parami endogennymi. Technika ta jest dobrze znana zarówno w przypadku gospodarzy prokariotycznych, jak i eukariotycznych i łatwa do zastosowania w komórkach ssaków. Pary do inkorporacji ncAA w komórkach ssaków opierają się na trzech głównych układach ortogonalnych: systemie tyrozylowym, który łączy TyrRS z E. coli26 z tyrozylobursztynowym supresorem z B. stearothermophilus27 (para EcTyrRS/BstYam), system leucylowy E. coli (para EcLeuRS/tRNALeuCUA)6,18,28 i archeonowy system pirolizylowy (para PylRS/tRNAPyl)3, przy czymtRNA Pyl jest naturalnym bursztynowym supresorem. Ogólnie rzecz biorąc, każdy ncAA jest rozpoznawany przez wyspecjalizowany ncAARS. W zależności od struktury ncAA, ncAARS uzyskuje się poprzez ukierunkowaną ewolucję TyrRS, LeuRS lub PylRS, chociaż niektóre syntetazy mogą akceptować więcej niż jeden ncAA.
Para ortogonalna jest importowana do komórek za pomocą wektora plazmidowego. Najpowszechniejsze i najbardziej wydajne plazmidy są bicystroniczne i kodują zarówno syntetazę, jak i tRNA, tworząc parę ortogonalną29. Drugi plazmid kodujący białko będące przedmiotem zainteresowania, zawierający bursztynowy kodon w miejscu przeznaczonym do modyfikacji, jest kotransfekowany. ncAA jest po prostu dodawany do pożywki do wzrostu komórek. Jednak różne wyspecjalizowane grupy często używają różnych wariantów konstruktów plazmidowych, nawet do włączenia tego samego ncAA. Konstrukty różnią się rozmieszczeniem genów w wektorze, rodzajem syntetazy, zastosowaniem kodonu w genie syntetazy, użyciem promotora, wariantem tRNA i liczbą kaset ekspresyjnych tRNA. Co więcej, wydajność inkorporacji różnych ncAA może się drastycznie różnić ze względu na różną wydajność katalityczną różnych syntetaz, jakość tRNA i inne czynniki30. Dlatego ważne jest, aby mieć pod ręką szybką i niezawodną metodę oceny wydajności pary ortogonalnej, zarówno w celu wyboru najbardziej odpowiedniego systemu do pożądanego zastosowania, jak i wykonania pewnych kroków optymalizacyjnych, które poprawiają ogólną wydajność ekspresji białek.
Stworzyliśmy prosty i solidny test oparty na fluorescencji, aby ocenić efektywność par ortogonalnych29 (Rysunek 1). W teście komórki są kotransfekowane z plazmidem kodującym parę ortogonalną, wraz z bicystronicznym plazmidem reporterowym kodującym zarówno białko zielonej fluorescencji z bursztynowym kodonem stop w pozycji permisywnej (EGFPTAG), jak i gen mCherry. Czerwona i zielona fluorescencja lizatów całokomórkowych są odczytywane w oddzielnych kanałach na czytniku płytkowym w płytce 96-dołkowej. Intensywność zielonej fluorescencji bezpośrednio koreluje ze skutecznością tłumienia bursztynu, podczas gdy intensywność czerwonej fluorescencji daje bezpośrednie oszacowanie wielkości mierzonej próbki i skuteczności transfekcji. W odniesieniu do podobnych testów opartych na sortowaniu komórek wspomaganym fluorescencją (FACS) read out31,32, test daje natychmiastową i kompleksową ocenę ekspresji białka w całej populacji komórek, która jest bardziej reprezentatywna dla zwykłych warunków eksperymentalnych i oferuje łatwiejsze pozyskiwanie i przetwarzanie danych za pomocą standardowego oprogramowania. Ogólnie rzecz biorąc, główną zaletą testu jest to, że równolegle można analizować średnią lub dużą liczbę próbek. Korzystając z tego testu, przeprowadziliśmy badania przesiewowe racjonalnie zaprojektowanej biblioteki supresorów-tRNA, aby poprawić wydajność systemu ortogonalnego Pyl30. W niniejszej pracy opisano eksperymentalny protokół przeprowadzenia tego testu i przedstawiono przykłady jego zastosowania, w tym optymalizację pary ortogonalnej do włączenia fotosieciującej ncAA p-azydo-L-fenyloalaniny (Azi) oraz porównanie wydajności inkorporacji różnych aminokwasów (ryc. 2).
W ciągu ostatnich lat narzędzia ncAA okazały się bardzo skuteczne w badaniu strukturalnych i funkcjonalnych aspektów receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR)33,34,35,36,37,38. U ludzi GPCR tworzą dużą rodzinę receptorów błonowych (800 członków) i stanowią główne cele dla leków terapeutycznych. Bezpośrednia charakterystyka strukturalna GPCR jest nadal trudna, a do ich badań bardzo potrzebne są uzupełniające metody biochemiczne. Jesteśmy pionierami w wykorzystaniu fotosieciowania ncAA do mapowania powierzchni GPCR i odkrywania kieszeni wiążących ligandy34. Korzystając z naszego zoptymalizowanego systemu do inkorporacji Azi, systematycznie wprowadzaliśmy Azi w całej domenie błonowej GPCR bezpośrednio do żywych komórek ssaków. Po napromieniowaniu UV Azi tworzy wysoce reaktywny rodzaj azotenu, który kowalencyjnie wychwytuje sąsiednie cząsteczki. Kiedy ligand jest dodawany do systemu, Azi służy jako sonda zbliżeniowa, aby ujawnić, które pozycje receptora zbliżają się do związanego liganda. W ten sposób po raz pierwszy ujawniono sposób wiązania hormonu neuropeptydowego Urokortyny I (Ucn1) z receptorem czynnika uwalniającego kortykotropinę klasy B klasy B typu 1 (CRF1R)33. Ostatnio ujawniliśmy różne wzorce wiązania agonistów i antagonistów na tym samym receptorze38. Podobne podejście zostało zastosowane przez innych w celu ujawnienia ortosterycznych i allosterycznych miejsc wiązania innych peptydów i ligandów drobnocząsteczkowych na innych GPCRs39,40,41,42. Niniejszy manuskrypt opisuje protokół eksperymentalny zastosowany w naszym laboratorium do fotosieciowania powierzchni powierzchni GPCR. Metoda jest stosunkowo szybka, prosta i nie wymaga specjalnego sprzętu, dzięki czemu znajduje zastosowanie w standardowych laboratoriach biochemicznych. Co ważne, podejście to stanowi cenne narzędzie nie tylko do identyfikacji miejsc wiązania ligandów, w których dane strukturalne 3D są rzadkie, ale także do uzupełniania istniejących danych in vitro o informacje z w pełni zmodyfikowanych posttranslacyjnie receptorów w środowisku fizjologicznym żywej komórki.
Niedawny rozwój nowych grup chemicznych ncAA o łańcuchu bocznym, odpowiednich dla ultraszybkiej, bezkatalitycznej bioortogonalnej chemii, otworzył możliwość instalacji fluoroforów ostatniej generacji do obrazowania w superrozdzielczości w białkach bezpośrednio na żywych komórkach2,43. Do takich kotwic chemicznych należą odkształcony cyklooktyn w SCOK14, bicyclo[6.1.0]nonyne w BCNK12,17 oraz transcyklookteny w TCO*K13,15,17 wśród innych ncAA zawierających norbornen16,17,44 lub cyklopropen45,46 ugrupowania. Masywne ncAA do chemii bioortogonalnej są włączane przez wariant PylRS zwykle oznaczany jako PylRSAF (wskazujący na mutację Y271A i Y349F w M. barkeri PylRS), a także przez inne wyewoluowane ad hoc ncAARSs17,44. Kotwice bioortogonalne reagują z odczynnikami tetrazynowymi47 poprzez cykloaddycję Dielsa-Aldera z odwrotnym zapotrzebowaniem elektronów, aby uzyskać wysoką wydajność znakowania w ciągu kilku minut43,48. Jednak zastosowanie tego potężnego podejścia do oznaczania GPCR było wyzwaniem ze względu na niską ogólną wydajność ortogonalnego systemu inkorporacji ncAA. Korzystając z naszego ulepszonego systemu Pyl, niedawno wykazaliśmy wysoką wydajność włączania takich aminokwasów do GPCR i ultraszybkie znakowanie GPCR na powierzchni żywych komórek ssaków30. Znakowane receptory były nadal funkcjonalne, ponieważ fizjologicznie internalizowały się po aktywacji receptora za pomocą agonisty. Eksperymentalny protokół włączania kotew bioortogonalnych do GPCR oraz następujące etapy znakowania są opisane tutaj. Wyposażenie GPCR w małe, jasne fluorofory jest pierwszym fundamentalnym krokiem w kierunku badania dynamiki strukturalnej GPCR w żywej komórce za pomocą zaawansowanych technik mikroskopowych.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid/Bisakryloamid 30% (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.2</td><td></td></tr><tr><td>p-Azydofenyloalanina (Azi)</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Carl Roth</td><td>8076.2</td><td></td></tr><tr><td>Karbobenzyloksy-L-lizyna (Lys(Z))</td><td>NovaBiochem</td><td>8540430100</td><td></td></tr><tr><td>Cyklooktyno-L-lizyna (SCOK)</td><td>Sichem</td><td>SC-8000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td></td></tr><tr><td>wzmocniony odczynnik chemiluminescencyjny (ECL)&nbsp;</td><td>domowy</td><td></td><td>luminol 10 mg/l w 0,1 M Tris-HCl pH 8,6 ; 1100 mg/l&nbsp; kwas p-kumarowy w DMSO ; 30&nbsp;% H2O2 (1,000 : 100 : 0,3)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.1</td><td></td></tr><tr><td>endo-bicyklo[6.1.0]nonyno-L-lizyna (BCNK)</td><td>Sichem</td><td>SC-8014</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher ( Gibco)</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Carl Roth</td><td>7533.1</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Carl Roth</td><td>3908.3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.3</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamina 2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Applichem</td><td>A2185,0005</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>0082.3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-Lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71718-10G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>121551000</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>kwas p-kumarowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9008-1G</td><td></td></tr><tr><td>bromowodorek poli-D-lizyny</td><td>Corning</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>11548876 (15140-122)</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Carl Roth</td><td>6367.1</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>NEB</td><td>P0704L</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>membrana PVDF Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.2</td><td></td></tr><tr><td>Tetrazyna-Cy3</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-014-05</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>trans-cyklookten-L-lizyna (TCO*K)</td><td>Sichem</td><td>SC-8008</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 2.5%</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.2</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid (30%)</td><td>Merck</td><td>1.07210.0250</td><td></td></tr><tr><td>Cell lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 komórki</td><td>Niemiecka kolekcja Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td><td>ACC-305</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cells</td><td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td><td>ACC-635</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td><td>Bio-Budget Technologies GmbH</td><td>40-BLX-E365</td> 5 <td>x 8 Watt Lamps</td></tr><tr><td>Czytnik płytek BMG LABTECH FLUOstar Omega&nbsp;</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid E2AziRS</td><td>Zhuminizowany gen dla E2AziRS został zsyntetyzowany przez plazmid Geneart (Life Technologies)</td><td></td> <td>zawierający 4 tandemowe kopie supresorowego tRNA Bst-Yam sterowanego przez ludzki promotor U6 i jedną kopię humanizowanego genu dla ulepszonego wariantu syntetazy Azi-tRNA (EAziRS) napędzanego przez promotor</td></tr> <tr><td>PGKZmutowane plazmidy</td><td></td><td></td> POI-TAG <td>Plazmid kodujący POI sterowany przez promotor CMV, C-końcowy połączony ze znacznikiem FLAG, opatrzony kodonem TAG w żądanej pozycji&nbsp;</td></tr><tr><td>CRF1R-95TAG-EGFP</td><td></td><td></td><td>Sklonowany w MCS pcDNA3.1</td></tr><tr><td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td><td></td><td></td><td>Sklonowany w MCS pcDNA3.1</td></tr><tr><td>Arrestin3-FLAG</td><td>Zsyntetyzowany przez Genart (Life Technologies)</td><td></td><td>Sklonowany w MCS pcDNA3.1</td></tr><tr><td>przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG-HRP M2 koniugat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592&nbsp;</td><td>monoklonalny, wytwarzany w mysim klonie M2</td></tr><tr><td>Przeciwciało kozie przeciwko królikowi HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-CRF</td><td>domowej roboty</td><td>PBL #rC69</td><td>poliklonalne Turnbull, AV, Vaughan, J., Rivier, J.E. i Vale, WW Endokrynologia, 140, (1), 71-78 (1999)</td></tr><tr><td>Domowe przeciwciało króliczo-anty-Ucn1</td><td></td><td>PBL # 5779</td><td>poliklonalne Turnbull, AV, Vaughan, J., Rivier, J.E. i Vale, WW Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)</td></tr></tbody></table>

optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do gpcr w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

Genetyczna inkorporacja niekanonicznych aminokwasów (ncAA) poprzez tłumienie kodonu bursztynowego stop jest potężną techniką instalowania sztucznych sond i reaktywnych ugrupowań na białkach bezpośrednio w żywej komórce. Każdy ncAA jest włączany przez dedykowaną ortogonalną parę supresora-tRNA/amino-acylo-tRNA-syntetazy (AARS), która jest importowana do organizmu gospodarza. Skuteczność inkorporacji różnych ncAA może się znacznie różnić, a w niektórych przypadkach być niezadowalająca. Pary ortogonalne można poprawić, manipulując AARS lub tRNA. Jednak ukierunkowana ewolucja tRNA lub AARS przy użyciu dużych bibliotek i metod selekcji martwe/żywe nie jest możliwa w komórkach ssaków. W tym artykule przedstawiono łatwy i solidny test oparty na fluorescencji do oceny skuteczności par ortogonalnych w komórkach ssaków. Test umożliwia badanie przesiewowe od dziesiątek do setek wariantów AARS/tRNA przy umiarkowanym wysiłku i w rozsądnym czasie. Opisano zastosowanie tego testu do generowania nowych tRNA, które znacznie poprawiają wydajność ortogonalnego układu pirolizyny, wraz z zastosowaniem ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), które są trudnymi obiektami dla mutagenezy ncAA. Po pierwsze, poprzez systematyczne wprowadzanie fotosieciującego ncAA na zewnątrzkomórkowej powierzchni receptora, miejsca wiązania różnych ligandów na nienaruszonym receptorze są mapowane bezpośrednio w żywej komórce. Po drugie, poprzez włączenie ncAA ostatniej generacji do GPCR, zademonstrowano ultraszybkie znakowanie receptorów wolnych od katalizatorów za pomocą barwnika fluorescencyjnego, które wykorzystuje bioortogonalną, promowaną przez szczep odwrotną cykloaddycję Dielsa Aldera (SPIEDAC) na żywej komórce. Ze względu na to, że ncAA mogą być ogólnie stosowane do dowolnego białka niezależnie od jego wielkości, metoda ta ma ogólne znaczenie dla wielu zastosowań. Ponadto inkorporacja ncAA nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu i jest łatwa do przeprowadzenia w standardowych laboratoriach biochemicznych.

Schemat badania fluorescencyjnego przedstawiono na Rycina 1Test ten znajduje zastosowanie w trzech obszarach. Po pierwsze, przesiewowi poddawana jest liczba wariantów tRNA w celu inkorporacji Lys(Boc) przez ortogonalną parę Pyl. Lys(Boc) jest aminokwasem o podobnej strukturze sterycznej do Pyl. Ponieważ Pyl nie jest dostępny w sprzedaży, Lys(Boc) jest powszechnie stosowany jako standardowy substrat dla PylRS. Przesiewowe tRNA oparto na tRNAPylKażdy...

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

Ogólnym celem tego protokołu jest zwiększenie szybkości inkorporacji aminokwasów niekanonicznych w komórkach ssaków, aby rozwiązać problemy biologiczne w żywych komórkach, w tym mapowanie powierzchni interakcji białko-białko i bioortogonalne znakowanie receptorów powierzchniowych. Wykorzystując tłumienie kodonów bursztynowych, różne niekanoniczne aminokwasy są włączane z różną wydajnością. Opracowaliśmy test fluorescencji, aby łatwo porównać tempo włączania aminokwasów niekanonicznych w komórkach ssaków w krótkim czasie.Systematyczne wprowadzanie fotosieciujących, niekanonicznych aminokwasów przez nasze powierzchnie GPCR umożliwia mapowanie miejsc wiązania ligandów i dostarcza cennych informacji o receptorze wlotowym bezpośrednio z komórki życiowej. Poprzez włączenie niekanonicznych aminokwasów najnowszej generacji do chemii bioortogonalnej, uzyskujemy specyficzne dla miejsca, super szybkie, wolne od katalizatorów znakowanie GPCR małymi, jasnymi fluoroforami do zaawansowanych zastosowań obrazowania w żywych komórkach ssaków. Najpierw wysiew 600 000 komórek HEK 293 w dwóch mililitrach kompletnej pożywki wzrostowej na dołek na dwie sześciodołkowe płytki.Przygotować tyle studzienek, i

optimizing-genetic-incorporation-chemical-probes-into-gpcrs-for-photo

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Wykorzystując system obrazowania z dwufotonową mikroskopią o rozdzielczości spektralnej, uzyskano mapy wydajności transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) na poziomie pikseli dla komórek ekspresujących receptory błonowe, w których przypuszcza się tworzenie kompleksów homo-oligomerycznych. Na podstawie map wydajności FRET możliwe jest oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanego kompleksu oligomeru.

In vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji białek wiążących małe cząsteczki za pomocą znakowania fotopowinowactwa. Zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i znakowanie kowalencyjne białek docelowych zachodzi w żywym środowisku komórkowym, co eliminuje ryzyko zakłócenia natywnej struktury białka i warunków wiązania podczas lizy komórki.

Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Tutaj prezentujemy protokół do analizy transferu informacji oscylacyjnych między komórkami za pomocą kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Podejście to stanowi unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia programów dynamicznej ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

Interakcje GPCR-β-aresztin to nowa dziedzina w odkrywaniu leków GPCR. Dokładne, precyzyjne i łatwe do skonfigurowania metody są niezbędne do monitorowania takich interakcji w żywych systemach. Pokazujemy test komplementacji strukturalnej do monitorowania interakcji GPCR-β-arrestin w żywych komórkach w czasie rzeczywistym i można go rozszerzyć na dowolny GPCR.

Monitorowanie interakcji GPCR-β-arrestin1/2 w żywych systemach w czasie rzeczywistym w celu przyspieszenia odkrywania leków

Kinetyczne sieciowanie i analiza cDNA to metoda, która pozwala badać dynamikę interakcji białko-RNA w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej. Tutaj protokół jest szczegółowo opisany, w tym wzrost komórek drożdży, sieciowanie UV, zbieranie, oczyszczanie białek i etapy przygotowania biblioteki sekwencjonowania nowej generacji.

Monitorowanie dynamiki interakcji białko-RNA in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χCRAC

Niezawodna kontrola komórek ssaków reagujących na światło wymaga standaryzacji metod optogenetycznych. Aby osiągnąć ten cel, badanie to nakreśla linię budowy obwodów genowych, inżynierii komórkowej, obsługi sprzętu optogenetycznego i testów weryfikacyjnych w celu standaryzacji badania ekspresji genów indukowanej światłem przy użyciu optogenetycznego obwodu genowego o ujemnym sprzężeniu zwrotnym jako studium przypadku.

Niezawodna inżynieria i kontrola stabilnych optogenetycznych obwodów genowych w komórkach ssaków

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Ten artykuł zawiera prosty i przejrzysty protokół oznaczania efektorów wydzielanych przez Salmonellę za pomocą rozszerzenia kodu genetycznego (GCE) specyficznie dla miejsca i obrazowania subkomórkowej lokalizacji wydzielanych białek w komórkach HeLa za pomocą bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (dSTORM)...

Obrazowanie w superrozdzielczości białek wydzielanych przez bakterie za pomocą ekspansji kodu genetycznego

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Badanie opisuje metodę eksperymentów o wysokiej przepustowości z wykorzystą matrycę LED drukowaną w 3D, aby zoptymalizować ekspresję genów indukowanych światłem w HEK293T komórkach.

Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

Poznaj metodę włączania niekanonicznych aminokwasów do białek w komórkach ssaków przy użyciu testu fluorescencyjnego. Technika ta umożliwia mapowanie miejsc wiązania ligandów w receptorach GPCR oraz szybkie, bezkatalizatorowe etykietowanie bioortogonalne.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów