Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Ogólnym celem tego protokołu jest zwiększenie szybkości inkorporacji aminokwasów niekanonicznych w komórkach ssaków, aby rozwiązać problemy biologiczne w żywych komórkach, w tym mapowanie powierzchni interakcji białko-białko i bioortogonalne znakowanie receptorów powierzchniowych. Wykorzystując tłumienie kodonów bursztynowych, różne niekanoniczne aminokwasy są włączane z różną wydajnością. Opracowaliśmy test fluorescencji, aby łatwo porównać tempo włączania aminokwasów niekanonicznych w komórkach ssaków w krótkim czasie.

Systematyczne wprowadzanie fotosieciujących, niekanonicznych aminokwasów przez nasze powierzchnie GPCR umożliwia mapowanie miejsc wiązania ligandów i dostarcza cennych informacji o receptorze wlotowym bezpośrednio z komórki życiowej. Poprzez włączenie niekanonicznych aminokwasów najnowszej generacji do chemii bioortogonalnej, uzyskujemy specyficzne dla miejsca, super szybkie, wolne od katalizatorów znakowanie GPCR małymi, jasnymi fluoroforami do zaawansowanych zastosowań obrazowania w żywych komórkach ssaków. Najpierw wysiew 600 000 komórek HEK 293 w dwóch mililitrach kompletnej pożywki wzrostowej na dołek na dwie sześciodołkowe płytki.

Przygotować tyle studzienek, ile wynosi liczba próbek, oraz dwie dodatkowe studzienki odpowiednio dla EGFP typu dzikiego i próbkę pozorowaną transfekowaną. Na godzinę przed transfekcją dodać odpowiednią ilość świeżo przygotowanego niekanonicznego roztworu podstawowego aminokwasów do wszystkich studzienek, aby uzyskać końcowe stężenie aminokwasów od 0,25 do 0,5 milimola. Aby transfekować komórki, wymieszaj jeden mikrogram plazmidowego DNA i koduj parę t-RNA syntetazy, która ma być testowana, z jednym mikrogramem reporterowego plazmidowego DNA w probówce do mikrowirówki.

W oddzielnych probówkach przygotuj identyczną transfekcję, używając odniesienia do dzikiego typu EGFP i próbnej transfekcji. Następnie dodaj 100 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej mleczanem do każdej probówki zawierającej DNA. Po krótkim wymieszaniu dodaj sześć mikrolitrów po jednym mikrogramach na mikrolitr PEI i sól fizjologiczną buforowaną mleczanem do każdej probówki.

Natychmiast wirować, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. Przenieś 400 mikrolitrów pożywki komórkowej z każdej studzienki do mieszaniny DNA PEI, aby zneutralizować pH. Następnie wlej mieszaninę DNA na komórki.

Zbierz komórki 48 godzin po transfekcji, odsysając pożywkę i przepłukując komórki raz dwoma mililitrami wstępnie podgrzanego PBS. Dodaj 800 mikrolitrów PBS uzupełnionego 0,5 milimolowym EDTA i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji odłączyć i zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół.

Następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówek mikrowirówek zawierających 200 mikrolitrów PBS uzupełnionych pięcioma milimolowymi chlorkami magnezu. Odwirowywać próbki przez dwie minuty przy 800-krotności grawitacji. Po zakończeniu wyrzucić supernatant.

Teraz dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy Tris do granulek komórek i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Aby ułatwić lizę, wiruj co pięć minut. Obracaj szczątki komórki przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 14 000 razy większej grawitacji.

Przenieść 90 mikrolitrów supernatantu do czarnych 96-dołkowych płytek. Następnie należy zmierzyć fluorescencję EGFP i mCherry za pomocą czytnika płytek wyposażonego w moduł fluorescencji. Wysiewaj 500 000 293 limfocytów T w dwóch mililitrach kompletnej pożywki wzrostowej na studzienkę na dwóch sześciodołkowych płytkach.

Dla każdej pozycji, która ma być poddana badaniom przesiewowym, należy przygotować jedną studzienkę na ligand oraz jedną studzienkę do kontroli wiązania. Na godzinę przed transfekcją dodać foto-środek sieciujący, p-azydofenyloalaninę lub Azi, do wszystkich studzienek do końcowego stężenia 0,5 milimola. Transfekować całkowitą ilość dwóch mikrogramów DNA na studzienkę, używając jednego mikrograma plazmidu i kodowania dla oznaczonego flagą GPCR z kodonem znacznika w pożądanej pozycji oraz jednego mikrograma plazmidu i kodowania dla pary ortogonalnej dedykowanej Azi.

Po 48 godzinach od transfekcji przygotować 1 000-krotny roztwór podstawowy liganda, rozpuszczając ligand peptydowy w stężeniu 100 mikromolów w DMSO. Rozcieńczyć roztwór podstawowy liganda w ilości 1 do 1 000 w buforze wiążącym. Zastąp pożywkę komórkową jednym mililitrem roztworu liganda i inkubuj próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji naświetlać komórki przez 20 minut w sieciowniku UV w odległości 365 nanometrów i pięciu centymetrów od komórek. Po zakończeniu odłącz komórki przez pipetowanie i przenieś je do probówki do mikrowirówki. Granuluj komórki przez trzy minuty przy 800-krotności grawitacji.

Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawieś osady komórek w 50 mikrolitrach buforu dysocjacyjnego HEPES lub HDB, zawierającego koktajl inhibitorów proteazy. Następnie błyskawicznie zamroź komórki w ciekłym azocie. Następnie rozmrażaj komórki w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 45 sekund, a następnie krótko wiruj.

Granuluj membrany przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 2500 razy grawitacji. Po zakończeniu wyrzucić supernatant, który zawiera większość białek cytozolowych. Dokładnie zawiesić granulki w 50 mikrolitrach buforu do lizy HEPES za pomocą pipety.

Następnie liza komórek przez 30 minut na lodzie, wirując co pięć minut. Następnie wiruj szczątki komórki przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 14 000 razy większej grawitacji. Natychmiast przenieść każdy supernatant do świeżej probówki reakcyjnej w celu analizy western blot.

Gdy GPCR jest glikozylowany, a słabe lub rozmazane prążki stanowią problem w analizie western blot, należy zdeglikozylować próbki za pomocą PNGazy F, aby zwiększyć intensywność sygnału i wyostrzyć prążki. Następnie rozpuść próbki na standardowej stronie SDS i osusz białka przenoszące do membrany PVDF. Po zablokowaniu błony należy ją zbadać przeciwciałem anty-ligandowym, aby wykryć występowanie sieciowania.

Aby wykryć poziom ekspresji Azi-GPCR, należy zbadać membranę za pomocą komercyjnego przeciwciała antyflagowego. Po umyciu membrany zanurz ją w roztworze o wzmocnionej chemiluminescencji i wizualizuj sygnały w ciemności. Zasiaj 100 000 limfocytów T HEK 293 w 600 mikrolitrach bezbarwnego, kompletnego DMEM na dołek szkiełka mikroskopowego wyposażonego w cztery dołki.

Na godzinę przed transfekcją należy przygotować świeży 100-milimolowy roztwór podstawowy TCOK i 0,2 molowego wodorotlenku sodu oraz 15% DMSO. Zmieszać trzy mikrolitry roztworu podstawowego TCOK z 12 mikrolitrami jednego molowego buforu HEPES o pH 7,4. Delikatnie dodaj roztwór do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie TCOK 0,5 milimola.

W probówce do mikrowirówek rozcieńczyć 200 nanogramów plazmidu i kodowania receptora zawierającego bursztynowy kodon oraz 200 nanogramów plazmidu i kodowania pary ortogonalnej w 50 mikrolitrach pożywki. Rozcieńczyć 1,25 mikrolitra lipofektaminy 2 000 w 50 mikrolitrach pożywki bez barwników, surowicy i antybiotyków i dodać roztwór do roztworu DNA. Natychmiast wirować i inkubować przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj kompleksy lipidowe DNA do komórek. Po 24 godzinach od transfekcji przenieść 100 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki do 1,5 mililitrowej probówki reakcyjnej. Dodaj 1,8 mikrolitra roztworu podstawowego tetrazyny z pomarańczowym barwnikiem fluorescencyjnym i 0,3 mikrolitra roztworu podstawowego barwnika barwiącego DNA.

Przenieś pożywkę zawierającą barwniki z powrotem do studzienki i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odessać pożywkę i delikatnie przepłukać komórki dwukrotnie PBS, aby usunąć nadmiar barwnika. Następnie dodaj do komórek 600 mikrolitrów wstępnie podgrzanej, kompletnej, bezbarwnej pożywki wzrostowej.

Teraz wizualizuj znakowane receptory w 63-krotnym powiększeniu za pomocą filtrów odpowiednich dla pomarańczowego barwnika fluorescencyjnego GFP i barwnika barwiącego DNA. Po dodaniu do komórek podstawowego roztworu agonisty peptydów, obserwuj internalizację pod mikroskopem za pomocą wyżej wymienionych filtrów i rób zdjęcia po wyraźnie wykrywalnym wystąpieniu internalizacji. Różne tRNA dają różną skuteczność tłumienia, co wyraźnie znajduje odzwierciedlenie w ilości mierzonej fluorescencji.

Włączenie Azi do CRF1R było znacznie wzmocnione przy użyciu zoptymalizowanego pod kątem kodonów genu syntetazy Azi-tRNA w porównaniu z genem natywnym, co pokazuje, że nawet umiarkowana poprawa w przypadku rozpuszczalnego białka może mieć większy wpływ na poziom ekspresji trudniejszych białek błonowych. Zoptymalizowany system do inkorporacji Azi, w tym humanizowany gen E2 Azi RS, został wdrożony do mapowania kieszeni wiążącej CRF1R i znalezienia ścieżek wiązania pięciu ligandów. Prążek o odpowiedniej wielkości produktu sieciującego w western blot ujawnia, że pozycja leży w pobliżu liganda w kompleksie receptora liganda.

Wielokrotne sieciowanie wszystkimi testowanymi ligandami ujawniło wyraźne wzorce wiązania dla agonistów i antagonistów peptydów. Zarówno dane dotyczące fluorescencji, jak i western blot sugerują, że TCOK jest niekanonicznym aminokwasem dla chemii bioortogonalnej, który zostaje włączony z najwyższą wydajnością wariantu AF syntetazy tRNA paraliżyny. TCOK został włączony do białka fuzyjnego CRF1R EGFP i umożliwił zainstalowanie małego, jasnego fluoroforu na receptorze.

Po dodaniu peptydu Agaonist zaobserwowano fluorescencyjne kompartmenty w całym cytozolu, ujawniając fizjologiczny proces internalizacji GPCR. Aby wykonać test fluorescencji, przedstawiliśmy tutaj proste i skuteczne narzędzie do oceny i optymalizacji wydajności syntetazy TI i API w komórkach ssaków. Wysokie wskaźniki inkorporacji mają kluczowe znaczenie dla stosowania aminokwasów niekanonicznych do badania trudnych kwestii biologicznych.

Wysoce wydajna inkorporacja sieciujących aminokwasów niekanonicznych umożliwia rozległe mapowanie powierzchni praktycznie każdego białka, w tym receptorów błonowych lub białek o niskich pasmach. Metoda ujawnia topologię interfejsów interakcji, które mogą być dalej analizowane w celu uzyskania dokładnych modeli molekularnych. Wysoka wydajność inkorporacji niekanonicznych aminokwasów najnowszej generacji do chemii bioortogonalnej pozwala nam wyposażyć GPCR w małe, jasne fluorofory, torując w ten sposób drogę do badania dynamiki strukturalnej GPCR w żywych komórkach za pomocą zaawansowanych technik mikroskopowych.