Name: Prosta i skuteczna metoda manipulacji genami in vivo specyficznymi dla serca poprzez wstrzyknięcie do mięśnia sercowego u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Poznaj metodę manipulacji genami specyficzną dla serca poprzez wstrzyknięcie adenowirusa do mięśnia sercowego u myszy. Technika ta umożliwia szybką regenerację zwierząt i jest łatwa do odtworzenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Science Fund for Distinguished Young Scholars (81625002), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81470389, 81270282, 81601238), Program of Shanghai Academic Research Leader (18XD1402400), Shanghai Municipal Education Commission Gaofeng Clinical Medicine Grant Support (20152209), Shanghai Shenkang Hospital Development Center (16CR3034A), Shanghai Jiao Tong University (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 i 14XJ10019), Shanghai Sailing Program (18YF1413000) oraz Podyplomowy Program Innowacji Bengbu Medical College (Byycx1722). Dziękujemy dr Erhe Gao za jego wcześniejszą pomoc w naszym laboratorium.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Instytutu. Do wszystkich eksperymentów wykorzystano samce myszy C57BL/6J (w wieku 8 - 10 tygodni). Myszy trzymano w warunkach wolnych od patogenów w temperaturze 24 °C ± 4 °C, w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, ze swobodnym dostępem do wody i pożywienia.
1. Przygotowanie roztworu adenowirusa
<ol>
	<li>Po dostarczeniu oczyszczonego roztworu adenowirusa należy go przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Wstrzyknięcie adenowirusa przeprowadzono u żywych myszy. Aby zapewnić sterylność wektora adenowirusa, adenowirus (kodujący lucyferazę, VDR lub shRNA ukierunkowany na VDR) został przygotowany i oczyszczony komercyjnie9,10.</li>
	<li>W dniu operacji wyjąć oczyszczony roztwór adenowirusa (3 x10 10 jednostek tworzących płytkę nazębną [pfu]/ml) z zamrażarki w temperaturze -80 °C i rozmrozić roztwór wektora adenowirusa na lodzie.</li>
	<li>Załóż maskę na twarz, sterylne rękawiczki i sterylny fartuch.</li>
	<li>Przygotuj strzykawkę Hamilton o pojemności 50 μl, która została wysterylizowana dzień przed operacją. 
	UWAGA: W celu sterylizacji strzykawka Hamilton została owinięta gazą i umieszczona w sterylizatorze wysokotemperaturowym/wysokociśnieniowym. Wybrano tryb "Sterylizacja na ciało stałe" i sterylizacja rozpoczynała się poprzez naciśnięcie przycisku "start".</li>
	<li>Po całkowitym rozmrożeniu oczyszczonego roztworu adenowirusa, spryskaj probówkę zawierającą roztwór adenowirusa 75% etanolem i przenieś roztwór adenowirusa do sterylnego kaptura z przepływem laminarnym.</li>
	<li>W sterylnym kapturze z przepływem laminarnym odessać 50 μl roztworu adenowirusa za pomocą strzykawki Hamilton bez igły, a następnie podłączyć igłę 30 G do strzykawki Hamiltona.</li>
	<li>Trzymać strzykawkę z igłą 30 G skierowaną do góry i delikatnie naciskać tłok strzykawki, aż igła zostanie wypełniona roztworem adenowirusa (potwierdzone pojawieniem się pierwszych kropli roztworu z końcówki igły). 
	UWAGA: Do napełnienia igły 30 G potrzeba około 45 μl roztworu, więc teraz prawie żaden roztwór nie jest widoczny w strzykawce.</li>
	<li>Za pomocą wyżej przygotowanej strzykawki ostrożnie zassać kolejne 30 μl roztworu adenowirusa, a następnie umieścić luźno zakrytą strzykawkę na lodzie w celu późniejszego użycia.</li>
</ol>
2. Znieczulenie i przygotowanie operacyjne
<ol>
	<li>Dodaj 20 ml izofluranu do parownika izofluranu i podłącz parownik izofluranu do butli z tlenem.</li>
	<li>Otwórz zawór i pozwól, aby tlen przepłynął ze zbiornika tlenu do parownika izofluranu. Utrzymuj natężenie przepływu tlenu na poziomie 2 l/min za pomocą monitora przepływu tlenu w parowniku izofluranu.</li>
	<li>Wywołaj znieczulenie myszy 4% izofluranem w 100% tlenu (2 l/min) przez 2 minuty w plastikowej klatce podłączonej do parownika izofluranu.</li>
	<li>Wyjmij znieczuloną mysz z plastikowej klatki i zabezpiecz ją na plastikowej platformie w pozycji leżącej w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym i utrzymuj znieczulenie 2% izofluranem w 100% tlenu (2 l/min) przez stożek nosowy.</li>
	<li>Potwierdź odpowiednie znieczulenie przy braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.</li>
	<li>Nałóż sterylny krem okulistyczny na każde oko, aby chronić rogówki przed wysuszeniem.</li>
	<li>Ogol klatkę piersiową i górną część brzucha. Nałóż dostępny w handlu krem do depilacji na ogolone miejsce na 1 minutę. Usuń krem do depilacji i pozostałą sierść mokrymi gazami.</li>
	<li>Wysterylizuj miejsce operacji (lewa dolna część klatki piersiowej) za pomocą 3 peelingów środka antyseptycznego na bazie jodu i chlorheksydyny (np. entozyny). Przykryj pole operacyjne sterylnym obłożeniem.</li>
</ol>
3. Domięśniowe wstrzyknięcie adenowirusa w serce myszy
<ol>
	<li>Zdejmij rękawiczki i załóż nową parę sterylnych rękawiczek.</li>
	<li>Wysterylizuj kleszcze, hemostat z mikrokomarami, nożyczki chirurgiczne i uchwyt na igłę na dzień przed operacją w sterylizatorze wysokotemperaturowym/wysokociśnieniowym (patrz uwaga dotycząca kroku 1.4).</li>
	<li>Wykonaj 0,5-centymetrowe nacięcie skóry wzdłuż linii łączącej mieczyk mieczykowaty i pachę. Tępo wypreparuj mięśnie piersiowe większe i piersiowe mniejsze za pomocą kleszczy i hemostatu mikrokomarów.</li>
	<li>Odsłoń przestrzenie międzyżebrowe, cofając mięśnie piersiowe większe i piersiowe mniejsze. Przebij i otwórz czwartą przestrzeń międzyżebrową (lub najszerszą przestrzeń międzyżebrową przez obserwację) za pomocą hemostatu mikrokomara.</li>
	<li>Popchnij serce w kierunku nacięcia, aby uzewnętrznić serce palcem wskazującym ręki niedominującej, delikatnie naciskając na prawą stronę ściany klatki piersiowej.</li>
	<li>Delikatnie zabezpiecz uzewnętrznione serce palcem wskazującym i kciukiem ręki niedominującej.</li>
	<li>Wstrzyknąć łącznie 30 μl roztworu adenowirusa do mięśnia sercowego lewej komory w trzech miejscach (brzusznej, grzbietowej i bocznej ściany lewej komory) za pomocą strzykawki Hamiltona wypełnionej adenowirusem (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C) ręką dominującą.</li>
	<li>Po zakończeniu wstrzykiwania należy natychmiast umieścić serce z powrotem w przestrzeni wewnątrz klatki piersiowej.</li>
	<li>Ręcznie usunąć powietrze z przestrzeni piersiowej, delikatnie naciskając ścianę klatki piersiowej w kierunku miejsca nacięcia skóry. 
	Uwaga: O udanej ewakuacji powietrza może świadczyć trzepotanie mięśni piersiowych większych i piersiowych mniejszych spowodowane wydmuchiwanym powietrzem.</li>
	<li>Zamknij skórę poziomym szwem materacowym za pomocą jedwabnego szwu 5-0. 
	Uwaga: Mięśnie piersiowe większe i piersiowe mniejsze nie powinny być zszywane, ponieważ są one tylko tępo wypreparowane, a ich struktury anatomiczne są nienaruszone przez cały czas operacji.</li>
</ol>
4. Postępowanie pooperacyjne
<ol>
	<li>Podawać buprenorfinę (3 mg/kg) dwa razy dziennie we wstrzyknięciu podskórnym w celu zmniejszenia bólu pooperacyjnego przez pierwsze 48 godzin po operacji11.</li>
	<li>Po zakończeniu pracy myszy należy natychmiast ułożyć na poduszce grzewczej (37 °C), aż do całkowitego wyzdrowienia. Umieść mysz z powrotem w klatce, gdy w pełni wyzdrowieje.</li>
	<li>Wysterylizuj zużytą strzykawkę Hamilton i igłę strzykawki 30 G w sterylizatorze wysokotemperaturowym/wysokociśnieniowym (patrz uwaga w kroku 1.4). Wysterylizowaną igłę strzykawki 30 G należy zebrać do pojemnika na ostre przedmioty.</li>
</ol>
5. Obrazowanie in vivo do pomiaru ekspresji lucyferazy sercowej
<ol>
	<li>W 5 dniu po wstrzyknięciu adenowirusa należy przygotować świeży roztwór podstawowy lucyferyny w stężeniu 15 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,2 μm.</li>
	<li>Dootrzewnowo wstrzyknąć obudzonym myszom roztwór lucyferyny w dawce 150 mg / kg masy ciała.</li>
	<li>Włącz system obrazowania.</li>
	<li>Po automatycznym autoteście systemu obrazowania wybierz tryb obrazowania jako "Luminescencyjny" i wprowadź następujące ustawienia: Ekspozycja: Auto; Podział na kategoryzacje: 8; FStop: 1; Wzbudzenie: Blok; Emisja: otwarta.</li>
	<li>Po 10 minutach od wstrzyknięcia lucyferyny znieczulić myszy przez wstrzyknięcie wodzianu chloralu (300 mg / kg masy ciała). Potwierdź odpowiednie znieczulenie przy braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.</li>
	<li>Zabezpiecz znieczulone myszy na podgrzewanym stoliku do obrazowania w pozycji leżącej, z klatką piersiową skierowaną w stronę kamery.</li>
	<li>Zbierz obrazy (1 obraz dla każdej myszy) i określ ilościowo intensywność sygnałów, rysując identyczne okrągłe obszary pomiarowe zainteresowania (ROI) wokół klatki piersiowej.</li>
	<li>Po zebraniu obrazów poświęć myszy i zbierz tkanki, jak wspomniano w następnej sekcji.</li>
</ol>
6. Zbieranie tkanek
<ol>
	<li>W różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu wirusa (ryc. 1B) znieczulij myszy 4% izofluranem i utrzymuj znieczulenie 2% izofluranem przez stożek nosowy i zabezpiecz go na plastikowej platformie w pozycji leżącej.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie brzuszne w linii środkowej w przedniej części szyi. Odsłoń prawą tętnicę szyjną wspólną, cofając mięśnie omohyoidalne i mostkowo-obojczykowo-sutkowe.</li>
	<li>Poświęć myszy, przecinając prawą tętnicę szyjną wspólną i odprowadzając krew.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie brzuszne w linii środkowej w jamie brzusznej. Przetnij żebra po obu stronach klatki piersiowej wzdłuż linii środkowej obojczyka i przetnij przeponę.</li>
	<li>Odsłoń serce, podnosząc mieczykowaty. Znajdź aortę wstępującą i delikatnie usuń okołonaczyniową tkankę tłuszczową.</li>
	<li>Kankaniulować aortę i wstecznie perfundować serce za pomocą igły 30 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej 0,5 ml roztworu buforu fosforanowego (PBS) o temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po perfuzji wyciąć serce i podzielić je na lewą i prawą komorę. Wytnij wątrobę, płuca i śledzionę.</li>
	<li>Po dwukrotnym przemyciu w zimnym PBS (4 °C) wszystkie zebrane tkanki należy przechowywać oddzielnie w fiolkach kriogenicznych w ciekłym azocie.</li>
</ol>
7. Oznaczanie ekspresji białka
<ol>
	<li>Przygotować bufor homogenizacyjny, dodając koktajl inhibitorów proteazy do dostępnego w handlu buforu do lizy w stosunku 1:100. Obliczyć całkowitą objętość na podstawie liczby próbek do przetworzenia. Przygotowany bufor homogenizacyjny należy przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.</li>
	<li>Wyjmij chusteczki ze zbiornika z ciekłym azotem. Zważ tkankę na precyzyjnej wadze (około 60 mg na każdy fragment tkanki).</li>
	<li>Przenieś tkankę do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Natychmiast dodać 200 μl buforu homogenizacyjnego i wstępnie schłodzone kulki stalowe o średnicy 1,5 mm (4 °C) do probówki mikrowirówkowej.</li>
	<li>Zabezpiecz probówki mikrowirówek we wstępnie schłodzonych (4 °C) metalowych uchwytach w automatycznej maszynie do mielenia tkanek i rozpocznij homogenizację, uruchamiając maszynę z następującymi ustawieniami: Częstotliwość: 70 Hz; czas: 120 s.</li>
	<li>Po homogenizacji odwirować homogenat (16 000 × g, 4 °C) i ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety o pojemności 100 μl.</li>
	<li>Dodać obciążający roztwór buforowy (5x) do supernatantu białkowego w stosunku 1:4 i denaturować białko w temperaturze 100 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Poziomy ekspresji białek w tkankach serca i innych narządów są dodatkowo monitorowane za pomocą analizy Western blot (reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 2C i Rysunek 3) zgodnie z wcześniej opisanym protokołem12.</li>
</ol>

<ol><li>Yancy, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2017+ACC%2FAHA%2FHFSA+Focused+Update+of+the+2013+ACCF%2FAHA+Guideline+for+the+Management+of+Heart+Failure%3A+A+Report+of+the+American+College+of+Cardiology%2FAmerican+Heart+Association+Task+Force+on+Clinical+Practice+Guidelines+and+the+Heart+Failure+Society+of+America%5BTitle%5D)+AND+%22J+Card+Fail%22%5BJournal%5D)">2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America.</a> J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).</li>
<li>Pu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte-expressed+farnesoid-X-receptor+is+a+novel+apoptosis+mediator+and+contributes+to+myocardial+ischaemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury.</a> Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).</li>
<li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+melatonin+receptor+ROR%CE%B1+is+a+novel+endogenous+defender+against+myocardial+ischemia_reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury.</a> J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).</li>
<li>Yao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D+receptor+activation+protects+against+myocardial+reperfusion+injury+through+inhibition+of+apoptosis+and+modulation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy.</a> Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).</li>
<li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+liver-X-receptor+alpha+but+not+liver-X-receptor+beta+protects+against+myocardial+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Heart+Fail%22%5BJournal%5D)">Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).</li>
<li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rAAV9+to+Overexpress+or+Knockdown+Genes+in+Mouse+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts.</a> J Vis Exp. (118), (2016).</li>
<li>Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+delivery+to+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector delivery to the heart.</a> Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).</li>
<li>Michael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+gene+delivery+with+cardiopulmonary+bypass%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass.</a> Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).</li>
<li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Hepatic+Fatty+Acids+Uptake+and+Oxidation+by+LRPPRC-Driven+Oxidative+Phosphorylation+Reduces+Blood+Lipid+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels.</a> Front Physiol. 7, 270(2016).</li>
<li>Zhang, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+the+contractile+phenotype+in+corpus+cavernosum+smooth+muscle+cells+by+Myocardin+gene+therapy+ameliorates+erectile+dysfunction+in+bilateral+cavernous+nerve+injury+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Andrology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats.</a> Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).</li>
<li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> J Vis Exp. (52), (2011).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22N+Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Gao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+efficient+model+of+coronary+artery+ligation+and+myocardial+infarction+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse.</a> Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+protective+role+of+nuclear+melatonin+receptor+ROR%CE%B1+in+diabetic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Novel protective role of nuclear melatonin receptor RORα in diabetic cardiomyopathy.</a> J Pineal Res. 62 (3), (2017).</li>
<li>Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+toll-like+receptor+4+in+melatonin-induced+cardioprotection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection.</a> J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).</li>
<li>Wu, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK-TLR9+signal+pathway+mediates+allergic+airway+inflammation+through+suppressing+melatonin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis.</a> J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).</li>
<li>de Luxan-Delgado, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+reduces+endoplasmic+reticulum+stress+and+autophagy+in+liver+of+leptin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice.</a> J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).</li>
<li>Scofield, S. L., Singh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+Myocardial+Ischemia+and+Reperfusion+Injury+in+Mice+Using+Surface+Pad+Electrocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Cai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+H19+mediates+melatonin+inhibition+of+premature+senescence+of+c-kit%28%2B%29+cardiac+progenitor+cells+by+promoting+miR-675%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675.</a> J Pineal Res. 61 (1), (2016).</li>
<li>Chua, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardioprotective+effect+of+melatonin+and+exendin-4+treatment+in+a+rat+model+of+cardiorenal+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome.</a> J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).</li>
<li>Pei, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+attenuates+postmyocardial+infarction+injury+via+increasing+Tom70+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression.</a> J Pineal Res. 62 (1), (2017).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+receptor-dependent+Notch1_Hes1+activation+by+melatonin+protects+against+myocardial+ischemia-reperfusion+injury_+in+vivo+and+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies.</a> J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+rescues+cardiac+thioredoxin+system+during+ischemia-reperfusion+injury+in+acute+hyperglycemic+state+by+restoring+Notch1%2FHes1%2FAkt+signaling+in+a+membrane+receptor-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner.</a> J Pineal Res. 62 (1), (2017).</li>
<li>Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramyocardial+cell+delivery%3A+observations+in+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts.</a> J Vis Exp. (83), e851064(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy raport przedstawia zmodyfikowaną technikę wstrzykiwania do mięśnia sercowego wektorów wirusowych w celu manipulacji genami sercowymi, która została zmodyfikowana z metody indukcji zawału mięśnia sercowego przez Gao i wsp.13 Obecnie charakterystyka in vivo określonych funkcji genów najczęściej wiąże się z generacją myszy nokautujących lub transgenicznych 3,14,15,16,17...

Choroby serca są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie1,2. Brak skutecznych strategii terapeutycznych w przypadku zagrażających życiu chorób serca, w tym zawału mięśnia sercowego i niewydolności serca, przyciąga intensywne badania leżących u ich podstaw patomechanizmów i identyfikację nowych opcji terapeutycznych3. Do tych badań naukowych szeroko stosowana jest manipulacja genami specyficznymi dla serca4,5. Manipulację genami serca można osiągnąć poprzez edycję genomu przy użyciu potężnej nukleazy efektorowej podobnej do aktywatora transkrypcji (TALEN) i narzędzi do regularnego interspaced krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)/białka związanego z CRISPR 9 (Cas9) lub poprzez dostarczanie ektopowego materiału genetycznego (np. wektorów wirusowych przenoszących geny kodujące białka będące przedmiotem zainteresowania)6. Chociaż edycja genomu pozwala na precyzyjne i czasoprzestrzenne modyfikacje genomu u żywych myszy, nadal jest to czasochłonna i pracochłonna praktyka6. Alternatywnie, rutynowo przeprowadza się manipulację genami specyficznymi dla serca za pomocą wektora wirusa lub dostarczania małego interferującego kompleksu RNA (siRNA)6.
Dostarczanie wektora wirusa do serca dorosłej myszy odbywa się za pomocą mniej więcej dwóch strategii: wstrzyknięcia ogólnoustrojowego lub miejscowego. Ogólnoustrojowe wstrzykiwanie kardiotropowego serotypu AAV, takiego jak AAV9, jest nieinwazyjne w przypadku manipulacji genami specyficznymi dla serca7. Jednak ta metoda wymaga stosunkowo dużej ilości wektora niezbędnego do efektywnej transdukcji i ekspresji genów i może skutkować znaczną transdukcją narządów niedocelowych, takich jak mięśnie i wątroba7. Miejscowe wstrzyknięcie wirusa odbywa się poprzez wstrzyknięcie do mięśnia sercowego lub podanie dowieńcowe7. Dostarczenie dowieńcowe prowadzi do bardziej równomiernego rozmieszczenia wirusa w sercu w porównaniu z wstrzyknięciem domięśniowym mięśnia sercowego. Jednak wadą tej techniki jest szybkie wypłukiwanie wektorów wirusowych do krążenia ogólnoustrojowego i transdukcji w narządach niedocelowych8, oraz wymaganie urządzeń do pomiaru ciśnienia podczas operacji. W przeciwieństwie do tego, wstrzyknięcie do mięśnia sercowego umożliwia lepsze zatrzymywanie wirusa w mięśniu sercowym, a także dostarczanie specyficzne dla miejsca, ale nie zapewnia równomiernej dystrybucji wektora wirusowego7. W przypadku małych zwierząt poród wewnątrzwieńcowy jest technicznie trudny do wykonania, podczas gdy częściej praktykuje się ogólnoustrojowe wstrzyknięcie AAV9 i wstrzyknięcie domięśniowe mięśnia sercowego4,5,7. Chociaż wstrzyknięcie ogólnoustrojowe jest łatwe do wykonania, konwencjonalne wstrzyknięcie do mięśnia sercowego wymaga wentylacji mechanicznej i torakotomii, powoduje rozległe uszkodzenie tkanek i jest czasochłonne.
W tym raporcie opisaliśmy łatwą, oszczędzającą czas i wysoce efektywną metodę wstrzykiwania do mięśnia sercowego. Adenowirus kodujący lucyferazy i VDR, czyli shRNA ukierunkowany na VDR, został wstrzyknięty w celu manipulowania ekspresją genów sercowych. Po opanowaniu metoda ta może być stosowana do manipulacji genami, a także do wstrzykiwania komórek lub innych materiałów do serca myszy.

<table><tbody><tr><td>< mocny>Wyposażenie< / silny></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>sterylny kaptur z przepływem laminarnym</td><td>Fengshi Animal Experimental&nbsp; Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, Chiny)</td><td>Wirówka FS-CJ-2F</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>75005282</td><td></td></tr><tr><td>Szlifierka do tkanek</td><td>Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, Chiny)</td><td>Scientz-48</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator wysokotemperaturowy/wysokociśnieniowy</td><td>Hirayama (Saitama, Japonia)</td><td>HVE-50</td><td></td></tr><tr><td>Waporyzator izofluranowy&nbsp;</td><td>Matrix (Orchard Park, Stany Zjednoczone)</td><td>VIP3000</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&nbsp; System obrazowania Lumina III</td><td>PerkinElmer (Waltham, USA)</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>Precision&nbsp; równowaga</td><td>Sartoriusa (G&ouml; ttingen, Niemcy)</td><td>28091873</td><td></td></tr><tr><td>Instruments&nbsp; Pipeta </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf (100 &mikro; L)</td><td>Eppendorf (Westbury, Stany Zjednoczone)</td><td>&nbsp; </td><td></td>4920000059</tr><tr><td>pipeta Eppendorf (10 &mikro; L)</td><td>Eppendorf (Westbury, Stany Zjednoczone)</td><td>&nbsp; </td><td></td>4920000113</tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.&nbsp;</td><td>JD4020</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td> z zakrzywioną końcówką <td>Hamilton (Nevada, USA)</td><td>80501</td><td>Objętość 50 &mu; L</td></tr><tr><td>Hemostat Micro-mosquito</td><td>FST (Foster City, USA)</td><td>13011-12</td><td>Zakrzywiony, szerokość końcówki 1,3 mm</td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę&nbsp;</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Szanghaj, Chiny)</td><td>J32110</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>FST (Foster City, USA)</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>1-mL Strzykawka</td><td>WeiGao Group Medical Polymer Co., Ltd. (ShangDong, Chiny)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiały i odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>przeciwciało CST (Danvers,&nbsp; USA)</td><td>#2118</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-lucyferazy</td><td>Abcam (Cambridge, Wielka Brytania)</td><td>ab187340</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-królicze IgG</td><td>CST (Danvers,&nbsp; USA)</td><td>&nbsp;#7074</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-VDR</td><td>Abcam (Cambridge, Wielka Brytania)</td><td>&nbsp; ab109234</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>PA175056</td><td></td></tr><tr><td>Hydry chloralowe</td><td>LingFeng Chemical (ShangHai, Chiny)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>375418</td><td>1,8 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Veet (Szanghaj, Chiny)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco&nbsp;</td><td>Gibco (Wielka Wyspa,&nbsp; USA)</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Entoiod</td><td>LiKang (Szanghaj, Chiny)</td><td>310132</td><td></td></tr><tr><td>Rurka EP</td><td>Sarstedt (Newton, USA)</td><td>PCR001</td><td></td></tr><tr><td>Filtr</td><td>Millipore (Bedford, USA)</td><td></td><td>Wielkość porów 0,2 i mikro; m&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, Chiny)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Promega (Madison, USA)</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy zachodniej&nbsp; blot</td><td>Beyotime (Szanghaj, Chiny)</td><td>P0013J</td><td>Bez inhibitorów</td></tr><tr><td>Krem okulistyczny</td><td>Apex Laboratories ( Melbourne, Australia))</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco (Grand Island,&nbsp; USA)</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>78438</td><td></td></tr><tr><td>5-0 jedwabny szew</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Szanghaj, Chiny)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stalowa kula</td><td>Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, Chiny)</td><td></td><td>Szerokość 1,5 mm</td></tr><tr><td>Igła strzykawkowa</td><td>Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, Chiny)</td><td></td><td>Miernik 30&nbsp;</td></tr><tr><td>Ciepła mata</td><td>Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, Chiny)</td> <td>NF-GNCW</td><td></td></tr></tbody></table>

prosta i skuteczna metoda manipulacji genami in vivo specyficznymi dla serca poprzez wstrzyknięcie do mięśnia sercowego u myszy

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Manipulacja genami, szczególnie w sercu, znacznie intensyfikuje badania nad patomechanizmami chorób serca i ich potencjałem terapeutycznym. Dostarczanie genów in vivo specyficzne dla serca jest zwykle osiągane przez dostarczanie ogólnoustrojowe lub miejscowe. Wstrzyknięcie ogólnoustrojowe przez żyłę ogonową jest łatwe i skuteczne w manipulowaniu ekspresją genów serca przy użyciu rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem 9 (AAV9). Jednak ta metoda wymaga stosunkowo dużej ilości wektora do efektywnej transdukcji i może skutkować transdukcją genów w narządach niedocelowych. Tutaj opisujemy prostą, wydajną i oszczędzającą czas metodę wstrzykiwania do mięśnia sercowego w celu manipulacji genami in vivo specyficznymi dla serca u myszy. W znieczuleniu (bez wentylacji) mięśnie piersiowe większe i mniejsze zostały tępo wypreparowane, a serce myszy zostało szybko odsłonięte przez ręczną eksternalizację przez małe nacięcie w czwartej przestrzeni międzyżebrowej. Następnie adenowirus kodujący lucyferazy (Luc) i receptor witaminy D (VDR) lub krótki RNA spinki do włosów (shRNA) ukierunkowany na VDR, wstrzyknięto za pomocą strzykawki Hamiltona do mięśnia sercowego. Późniejsze obrazowanie in vivo wykazało, że lucyferazy udało się uzyskać nadekspresję specyficznie w sercu. Co więcej, analiza Western blot potwierdziła udaną nadekspresję lub wyciszenie VDR w sercu myszy. Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do manipulacji genami, a także do wstrzykiwania komórek lub innych materiałów, takich jak nanożele, do serca myszy.

Protokół eksperymentalny oraz niektóre kluczowe kroki opisanej metody przedstawiono na Rysunku 1. W 5. dniu po domięśniowym wstrzyknięciu adenowirusa kodującego lucyferazę (Adv-luc), obrazowanie in vivo u myszy z wstrzykniętym Adv-luc wykazało silną nadekspresję lucyferazy specyficznie w sercu (Rysunek 2A, B), co potwierdzono analizą Western blot (Rysunek 2C), sugerując brak...

Tutaj prezentujemy protokół manipulacji genami specyficznymi dla serca u myszy. W znieczuleniu serca myszy zostały uzewnętrznione przez czwartą przestrzeń międzyżebrową. Następnie adenowirusy kodujące określone geny wstrzyknięto za pomocą strzykawki do mięśnia sercowego, a następnie dokonano pomiaru ekspresji białka za pomocą obrazowania in vivo i analizy Western blot.

Prosta i skuteczna metoda manipulacji genami in vivo specyficznymi dla serca poprzez wstrzyknięcie do mięśnia sercowego u myszy

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

Ogólnym celem tej procedury jest osiągnięcie manipulacji genami specyficznymi dla serca in vivo, poprzez wstrzyknięcie adenowirusa do mięśnia sercowego u dorosłych myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań sercowo-naczyniowych dotyczące mechanizmów molekularnych i dostosowania uszkodzenia serca do skuteczności terapii genowej. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest wolna od wentylacji, że myszy szybko wracają do zdrowia po operacji oraz że jest powtarzalna i łatwa do wykonania.Więc teraz zacznijmy. W dniu zabiegu oczyściony roztwór wektora adenowirusa należy ogrzać od ujemnej temperatury 80 stopni Celsjusza, przechowując na lodzie. Po rozmrożeniu adenowirusa załóż maskę na twarz, sterylny fartuch i sterylne rękawiczki.I spryskaj probówkę adenowirusa 75% etanolem. Przenieś wirusa do sterylnego okapu z przepływem laminarnym i odessaj 50 mikrolitrów roztworu wirusa do 50-mikrolitrowej, wysterylizowanej strzykawki Hamiltona. Podłączyć igłę o rozmiarze 30 do strzykawki.Obrócić strzykawkę do pozycji pionowej. Delikatnie wcisnąć tłok, aż na końcu igły pojawi się kropla roztworu, aby wypełnić końcówkę igły wirusem. Następnie ostrożnie zassać k

a-simple-efficient-method-for-vivo-cardiac-specific-gene-manipulation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W badaniach nad ostrym uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym oraz przewlekłym przebudowywaniem serca u myszy, w wymiarze czasowym nanosi się liczne manipulacje genetyczne i/lub wewnątrzmięśniowe iniekcje genów, białek, komórek i/lub biomateriałów. Niniejsze wideo ilustruje mikrosurgicalne procedury stosowane w badaniach nad niedokrwieniem/reperfuzją, trwałą ligacją tętnicy wieńcowej oraz iniekcjami wewnątrzmięśniowymi.

Podwiązanie tętnicy wieńcowej i wtryskiwanie domięśniowe w mysim modelu zawału

Opisano metodę śledzenia fuzji komórek w żywych organizmach w czasie. Podejście to wykorzystuje rekombinację Cre-LoxP do indukcji ekspresji lucyferazy po fuzji komórek. Wygenerowany sygnał luminescencyjny może być wykrywany w żywych organizmach przy użyciu systemów obrazowania biofotonicznego z czułością detekcji na poziomie ˜1,000 komórek w tkankach obwodowych.

Podejście oparte na rekombinacji Cre-Lox P do detekcji fuzji komórek in vivo

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego w mysich modelach chorób sercowo-naczyniowych, takich jak nadciśnienie czy zawał mięśnia sercowego, jest szeroko stosowane do testowania potencjału terapeutycznego różnych typów komórek w badaniach regeneracyjnych. Dlatego szczegółowy opis i przejrzysta wizualizacja tego zabiegu chirurgicznego pomogą określić ograniczenia i zalety analiz terapeutycznych komórek sercowo-naczyniowych u małych gryzoni.

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego: obserwacje w mysich sercach

Opisujemy szereg metod wstrzykiwania barwników, wektorów DNA, wirusów i komórek w celu monitorowania zarówno losu komórek, jak i fenotypu endogennych i szczepionych komórek pochodzących z komórek embrionalnych lub pluripotencjalnych w embrionalnych zarodkach myszy w dniu embrionalnym (E)9.5 i późniejszych etapach rozwoju.

Znakowanie i wstrzykiwanie komórek w rozwijających się embrionalnych sercach myszy

Przezskórne wstrzyknięcie do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii stanowi efektywną, niezawodną i celowaną metodę dostarczania czynników transferu genów lub komórek do mysiego serca. Postępując zgodnie z krokami opisanymi w tym protokole, operator może szybko stać się kompetentny w tej wszechstronnej, minimalnie inwazyjnej technice.

Iniekcja przezklatkowa domięśniowa pod kontrolą USG u myszy

Nowatorskie strategie terapeutyczne w medycynie regeneracyjnej serca wymagają obszernych i szczegółowych badań na dużych przedklinicznych modelach zwierzęcych, zanim będą mogły być rozważane do zastosowania u ludzi. W tym miejscu demonstrujemy technikę przezskórnego wstrzykiwania domięśniowego do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii kontrastowej u królików, która jest cenna dla hipotezy testującej skuteczność takich nowatorskich terapii.

Przezskórna iniekcja domięśniowa pod kontrolą echokardiografii z kontrastem i dostarczanie komórek w dużym modelu przedklinicznym

W tej metodzie, embrionalne tkanki serca są chirurgicznie mikropreparowane, dysocjowane, znakowane fluorescencyjnie i wszczepiane do tkanek embrionalnych gospodarza. Stanowi to platformę do badania indywidualnej lub tkankowej organizacji rozwoju w ektopowych warunkach hemodynamicznych i/lub zmienionym środowisku parakrynnym/juktakrynowym.

System mikroiniekcji do implantacji in vivo kardiomiocytów zarodkowych w zarodku ptaków

Ten protokół przedstawia prosty i spójny sposób na przejściowe zwiększenie wartości interesującego genu za pomocą modRNA po zawale mięśnia sercowego u myszy.

Dostarczanie zmodyfikowanego mRNA w mysim modelu zawału mięśnia sercowego

Obecny protokół opisuje metody ekspresji transgenu w sercach szczurów i myszy poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie wirusa do mięśnia sercowego pod kierunkiem echokardiografii. Wyjaśniono również metody oceny podatności serca na komorowe zaburzenia rytmu serca poprzez programowaną stymulację elektryczną izolowanych serc z perfuzją Langendorffa.

Ekspresja transgenu wirusa w sercach gryzoni i ocena ryzyka arytmii serca

Ten protokół przedstawia szczegółowe ramy metodologiczne dla opartej na elektroporacji transgenezy komórek serca w rozwijających się sercach myszy. Udostępnione tutaj materiały wideo ułatwią naukę tej wszechstronnej techniki.

Skuteczne podejście do transgenezy w dostarczaniu genów w embrionalnym sercu myszy

Ten artykuł zawiera szczegółowe informacje na temat zoptymalizowanego protokołu wstrzykiwań domięśniowych pod kontrolą echokardiografii w szczurzych modelach zawału mięśnia sercowego przy użyciu igły 29 G x 88 mm. Technika ta zapewnia solidne, precyzyjne i powtarzalne dostarczanie środków terapeutycznych bezpośrednio do strefy okołozawałowej.

Iniekcja pod kontrolą echokardiografii w celu ukierunkowanego i niezawodnego dostarczania komórek macierzystych do mięśnia sercowego w szczurzym modelu zawału mięśnia sercowego

Poznaj metodę manipulacji genami specyficzną dla serca poprzez wstrzyknięcie adenowirusa do mięśnia sercowego u myszy. Technika ta umożliwia szybką regenerację zwierząt i jest łatwa do odtworzenia.

Prosta i skuteczna metoda manipulacji genami in vivo specyficznymi dla serca poprzez wstrzyknięcie do mięśnia sercowego u myszy

Przeglądaj więcej filmów