Prosta i skuteczna metoda manipulacji genami in vivo specyficznymi dla serca poprzez wstrzyknięcie do mięśnia sercowego u myszy
16 kwietnia 2018
Tutaj prezentujemy protokół manipulacji genami specyficznymi dla serca u myszy. W znieczuleniu serca myszy zostały uzewnętrznione przez czwartą przestrzeń międzyżebrową. Następnie adenowirusy kodujące określone geny wstrzyknięto za pomocą strzykawki do mięśnia sercowego, a następnie dokonano pomiaru ekspresji białka za pomocą obrazowania in vivo i analizy Western blot.
Ogólnym celem tej procedury jest osiągnięcie manipulacji genami specyficznymi dla serca in vivo, poprzez wstrzyknięcie adenowirusa do mięśnia sercowego u dorosłych myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań sercowo-naczyniowych dotyczące mechanizmów molekularnych i dostosowania uszkodzenia serca do skuteczności terapii genowej. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest wolna od wentylacji, że myszy szybko wracają do zdrowia po operacji oraz że jest powtarzalna i łatwa do wykonania.
Więc teraz zacznijmy. W dniu zabiegu oczyściony roztwór wektora adenowirusa należy ogrzać od ujemnej temperatury 80 stopni Celsjusza, przechowując na lodzie. Po rozmrożeniu adenowirusa załóż maskę na twarz, sterylny fartuch i sterylne rękawiczki.
I spryskaj probówkę adenowirusa 75% etanolem. Przenieś wirusa do sterylnego okapu z przepływem laminarnym i odessaj 50 mikrolitrów roztworu wirusa do 50-mikrolitrowej, wysterylizowanej strzykawki Hamiltona. Podłączyć igłę o rozmiarze 30 do strzykawki.
Obrócić strzykawkę do pozycji pionowej. Delikatnie wcisnąć tłok, aż na końcu igły pojawi się kropla roztworu, aby wypełnić końcówkę igły wirusem. Następnie ostrożnie zassać kolejne 30 mikrolitrów roztworu adenowirusa do strzykawki i umieścić strzykawkę na lodzie.
Aby wstrzyknąć adenowirusa do serca myszy, należy potwierdzić odpowiedni poziom sedacji poprzez brak reakcji na szczypanie palca u nogi i nałożyć maść na oczy zwierzęcia. Ogol górną część klatki piersiowej i brzuch zwierzęcia. Nałóż dostępny w handlu krem do depilacji na odsłoniętą skórę.
Za pomocą mokrej gazy usuń krem i wszelkie pozostałe włosy po jednej minucie. Używając trzech peelingów antyseptycznych na bazie jodu i chlorheksydyny, wysteruj dolną lewą stronę klatki piersiowej. Następnie przykryj zwierzę obłożeniem chirurgicznym z otworem wyciętym nad obszarem operacyjnym i załóż nową parę sterylnych rękawiczek.
Następnie, za pomocą sterylnej techniki i narzędzi, wykonaj 0,5-centymetrowe nacięcie skóry od mieczykowatej części mieczykowatej do pachy i użyj kleszczy oraz hemostatu Micro Mosquito, aby tępo wyciąć mięśnie piersiowe większe i mniejsze. Cofnij główne i mniejsze mięśnie piersiowe, aby odsłonić przestrzeń międzyżebrową. I użyj hemostatu Micro Mosquito, aby przebić i otworzyć czwartą przestrzeń międzyżebrową.
Delikatnie dociśnij prawą stronę ściany klatki piersiowej palcem wskazującym ręki niedominującej, aby przesunąć serce w kierunku nacięcia. Następnie ostrożnie zabezpiecz uzewnętrznione serce palcem wskazującym i kciukiem tej samej ręki i użyj dominującej ręki, aby wstrzyknąć 10 mikrolitrów roztworu adenowirusa do mięśnia sercowego każdej brzusznej, grzbietowej i bocznej ściany lewej komory. Po ostatnim wstrzyknięciu należy natychmiast przywrócić serce do przestrzeni wewnątrzklatki piersiowej.
I delikatnie dociśnij ścianę klatki piersiowej w kierunku miejsca nacięcia, aby ręcznie usunąć powietrze z przestrzeni wewnątrz klatki piersiowej. Zamknij skórę jedwabnym szwem z pięciu stopni, w poziomy wzór materaca i umieść mysz na poduszce grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Następnie wysterylizuj zużytą strzykawkę Hamiltona i igłę o rozmiarze 30 w wysokotemperaturowym sterylizatorze wysokociśnieniowym, a wysterylizowaną igłę wyrzuć do odpowiedniego pojemnika na ostre przedmioty.
Pięć dni po wstrzyknięciu do mięśnia sercowego adenowirusa otaczającego lucyferazę, obrazowanie in vivo wskazuje na silną nadekspresję lucyferazy, szczególnie w sercu, którą można potwierdzić za pomocą analizy Western blot, co sugeruje brak transdukcji narządu innego niż docelowa. Analiza Western blot wskazuje również na znacznie zwiększoną ekspresję receptora witaminy D. I lewa komora myszy, którym wstrzyknięto adenowirusa kodującego receptor witaminy D.
Ze zmniejszoną ekspresją receptora widoczną u zwierząt, którym wstrzyknięto adenowirusa kodującego krótką spinkę do włosów, celującą w receptor witaminy D RNA. W przeciwieństwie do tego, ekspresja receptora witaminy D nie jest znacząco zmieniona w prawej komorze zwierzęcia, któremu wstrzyknięto lewą komorę. Po opanowaniu tej metody można zakończyć w ciągu dwóch minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak wstrzyknięcie komórek serca, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak skuteczność określonych terapii komórkowych w zawałach mięśnia sercowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę manipulacji genem specyficznym dla serca u dorosłych myszy poprzez podaanie do mięśnia sercowego iniekcji adenowirusa. Technika ta pozwala na szybki powrót do zdrowia i jest dobrze odtwarzalna, co sprawia, że jest odpowiednia do badań nad układem krążenia.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Badania nad układem krążeniem
- Terapia genowa
- Biologia serca
Tło
- Zrozumienie mechanizmów molekularnych w uszkodzeniu serca.
- Ocena skuteczności terapii genowej w chorobach serca.
- Znaczenie technik manipulacji genami in vivo.
- Zalety procedur bez wentylacji w modelach zwierzęcych.
Cel badania
- Osiągnięcie manipulacji genem specyficznym dla serca.
- Zbadanie wpływu określonych genów na działanie serca.
- Zapewnienie niezawodnej metody dla przyszłych badań nad układem krążeniem.
Zastosowane metody
- Eksternalizacja serc myszy przez czwartą przestrzeń międzyżebrową.
- Podanie adenowirusów kodujących określone geny do mięśnia sercowego.
- Pomiar ekspresji białek poprzez obrazowanie in vivo.
- Analiza Western blot w celu oceny ekspresji genów.
Główne wyniki
- Skuteczne manipulowanie genami w tkankach sercowych.
- Szybki powrót do zdrowia myszy po zabiegu.
- Odtwarzalność techniki w różnych próbach.
- Skuteczna pomiar poziomów ekspresji białek.
Wnioski
- Protokół jest cennym narzędziem do badania funkcji genów serca.
- Faciliuje on eksplorację zastosowań terapii genowej w chorobach serca.
- Metoda zwiększa zrozumienie molekularnych mechanizmów serca.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables precise cardiac-specific gene manipulation in mice, supporting target validation and mechanistic de-risking in cardiovascular drug discovery. By minimizing off-target transduction and enabling rapid recovery, it improves predictive confidence in preclinical models. The technique aligns with early discovery workflows requiring reproducible, scalable, and physiologically relevant gene modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through cardiac-specific overexpression or silencing of target genes like VDR.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating cardiac effects from systemic confounders.
- Strategic Value: Supports target confidence assessment prior to lead identification campaigns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable cardiac-specific readouts via luciferase imaging and Western blot for assay validation.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for consistent compound or vector screening in disease-relevant systems.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by enabling standardized myocardial delivery across studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by modeling cardiac-specific gene modulation in vivo.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation with minimal procedural variability.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by confirming on-target cardiac effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, enabling reliable cardiac gene modulation before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through precise cardiac gene manipulation.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with quantitative, heart-specific outputs.
- Analytics: Provides measurable endpoints via in vivo imaging and Western blot for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through disease-relevant cardiac targeting without off-target effects.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for cardiac gene, cell, or material delivery across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through target-specific modulation and reduced biological noise.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across cardiac studies.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by isolating cardiac mechanisms and reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on confirmed cardiac target engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine cardiac surgery and sterile technique.
- Necessitates Hamilton syringes, 30-gauge needles, and sterile laminar flow hoods.
- Demands cross-team standardization for consistent myocardial injection volumes and depths.
- Involves adaptation considerations when scaling to different cardiac disease models.
- Limited by manual externalization technique, which may require training for reproducibility.
