Hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na modelu ex vivo starzejącej się błony błony mięśniowej człowieka

Ogólnym celem tej eksperymentalnej procedury jest stworzenie ex vivo macierzy zewnątrzkomórkowej znanej jako system hodowli błonowej Brucha, która obserwuje wpływ błony Brucha na nakładanie się komórek nabłonka barwnikowego siatkówki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu subbiologii RPE w dziedzinie etiologii AMD, takie jak to, czy zmiany na starzejących się błonach Brucha przyczyniają się do nieprawidłowego działania nakładających się komórek RPE. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona naukowcom wyizolować natywną błonę Brucha od oka dawcy ludzkiego w różnym wieku i wykorzystać je do badań proteomicznych w hodowlach komórek RPE.

Wyizolowanie błony Brucha i stworzenie rzeczywistego systemu hodowli vivo przy minimalnym uszkodzeniu natywnej błony Brucha jest wyzwaniem, ale w tym filmie pokażę Ci, jak to zrobić. Na początek umieść gazę o powierzchni 1,5 cala kwadratowego nasączoną niezależnym od CO2 DMEM w 100-milimetrowym naczyniu. Następnie załaduj gałkę oczną na gazę.

Następnie za pomocą ostrza chirurgicznego wykonaj nacięcie przez twardówkę trzy milimetry za rąbkiem. Następnie użyj nożyczek o cienkim ostrzu, aby wykonać nacięcie o pełnej grubości i rozciągnąć nacięcie obwodowo w dowolnym kierunku wokół oka. Następnie usuń i wyrzuć przedni segment, w tym rogówkę, soczewkę i tęczówkę.

Wyrzuć również ciało szkliste i siatkówkę. Następnie ostrożnie oderwij kompleks błony naczyniówkowej RPE Brucha od twardówki od obwodu do nerwu wzrokowego za pomocą szpatułki pokrytej teflonem. Należy to zrobić bardzo ostrożnie, aby nie rozerwać kompleksu membranowego.

Teraz użyj cienkich nożyczek chirurgicznych, aby wykonać cztery promieniowe nacięcia w twardówce i oderwać twardówkę. Następnie odetnij błonowy eksplant naczyniówki Brucha od nerwu wzrokowego i przenieś ten eksplant do 60-milimetrowej naczynia zawierającej 0,02 molowego wodorotlenku amonu w DPBS. Aby usunąć natywne komórki RPE, inkubuj ten eksplant przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji przemyj eksplant trzykrotnie za pomocą DPBS, zabezpieczając miejsce nerwu wzrokowego na błonie Brucha kleszczami pokrytymi teflonem, jednocześnie opływając tkankę roztworem. Następnie unieś eksplantat, stroną z lamininą skierowaną do góry w pożywce wolnej od dwutlenku węgla. Wykonaj cztery nacięcia na membranie Brucha, a następnie przenieś nielaminowaną hydrofobową membranę PTFE o grubości 65 mikronów z porami 0,2 mikrona na eksplantat.

Ustaw to za pomocą blaszki podstawowej przylegającej do membrany PTFE. Usuń nadmiar płynu z naczynia, a następnie przenieś zestaw do szklanego systemu uchwytów filtrów próżniowych do mikroanalizy, gdzie powinien być osadzony na wsporniku ze spiekanego szkła. Następnie, ostrożnie unikając kontaktu z blaszką podstawną, spłaszcz zwinięte krawędzie strony naczyniówki za pomocą kleszczy pokrytych teflonem.

Teraz upłynnij 15 mililitrów 4% agarozy w DPBS i ostudź do 37 stopni Celsjusza. Następnie powoli wylej agarozę na naczyniówkową stronę eksplantatu, delikatnie odsysając, aby utrzymać go płasko. Gdy żel zacznie krzepnąć, przenieś go wraz z membraną do 60-milimetrowego naczynia na lodzie.

Pozwól żelowi zestalić się przez dwie do trzech minut, a następnie oderwij membranę PTFE. Następnie zanurz eksplant w DPBS i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie potrzebny. Podczas hodowli eksplantatu na 60-milimetrowym naczyniu wyłożonym płynem 4% agarozy, ułóż błonę Brucha skierowaną do góry.

Podczas hodowli przy użyciu 96-dołkowej płytki wyłożonej polistyrenem, umieść pokryty żelem eksplant membranowy Brucha na płaskim arkuszu teflonu stroną z lamininą do góry. Następnie, za pomocą trepanacji, wytnij od sześciu do ośmiu sześciomilimetrowych guzików z eksplantatu i przenieś guziki tkankowe do studzienek wypełnionych płynną agarozą. Aby rozpocząć, ustaw gałkę oczną na gazie nasączonej DPBS, tak jak poprzednio.

Następnie wykonaj nacięcie obwodowe pięć milimetrów poniżej punktu styku tęczówki i twardówki, pars plana, w przestrzeni podsiatkówkowej. Odrzuć segment wewnętrzny, ciało szkliste i siatkówkę. Następnie za pomocą pipety transferowej umyj muszlę oczną dwoma do trzech mililitrów zimnego DPBS.

W sumie umyj muszlę oczną trzy razy. Następnie, aby zdysocjować komórki RPE, potraktuj muszlę oczną trypsyną przez okres do 10 minut. Następnie przenieś trypsynizowane komórki RPE do 50-mililitrowej probówki, a aby wygasić reakcję, dodaj 25 mililitrów pożywki z FBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Teraz odwiruj tkankę i roztwór w ilości 200 g przez 10 minut w temperaturze 24 stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach kompletnego podłoża DMEM z 15% FBS. Teraz policz komórki i umieść 15 000 żywotnych komórek RPE w 200 mikrolitrach minimalnej niezbędnej pożywki zawierającej antybiotyki bez surowicy na każdym guziku błony Brucha na 96-dołkowej płytce.

Hoduj komórki przez co najmniej 24 godziny w celu przyłączenia się. Później delikatnie zmień pożywkę na ogrzany kompletny DMEM i kontynuuj hodowlę komórek. Korzystając z tego protokołu, starzejące się i chore błony Brucha mogą być badane poprzez hodowanie na nich komórek RPE.

Zazwyczaj starzejące się eksplantaty zmniejszają ponowne przyczepianie się komórek RPE. Komórki RPE hodowane na starzejącej się ludzkiej błonie Brucha są również mniej zdolne do fagocytyzacji zewnętrznych segmentów pręcików, co jest krytyczną funkcją RPE. Korzystając z mikromacierzy, stwierdzono, że ekspresja genów komórek RPE jest inna, gdy komórki są hodowane na błonie Brucha u starszych osobników w porównaniu z komórkami hodowanymi na błonie od młodszych osobników.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak odizolować błonę Brucha od oczu ludzkiego dawcy i zrobić eksplantaty, w których można hodować komórki RPE. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około trzy godziny, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby nie dotykać strony lamininy eksplantatu membrany Brucha narzędziami preparacyjnymi, aby uniknąć uszkodzenia powierzchni.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak fagocytoza RPE i badania ekspresji genów komórek RPE, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy błona Brucha od dawcy w różnym wieku lub dawców ze zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem wpłynie na nakładanie funkcji komórek RPE. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem do zbadania mechanizmu etiologii AMD w systemie modelowym ex vivo błony Brucha.