Name: Hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na modelu ex vivo starzejącej się błony błony mięśniowej człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj hodowlę komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na starzejącej się błonie Brucha człowieka. Ta metoda umożliwia badanie funkcji RPE w kontekście zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie jest wspierane przez Research to Prevent Blindness, Nowy Jork, www.rpbusa.org, oraz Greater New York Center for Retinal Degenerative Disease Foundation Fighting Blindness, www.blindness.org. Autorzy pragną podziękować dr Luannie Bartholomew za krytyczną recenzję tego manuskryptu.

Poniższy protokół jest wykonywany zgodnie z założeniami Deklaracji Helsińskiej i wytycznymi Komitetu Etyki Badań Naukowych Uniwersytetu Yale.
1. Pozyskiwanie ludzkich oczu dawcy
<ol>
	<li>Zdobądź ludzkie globy dawców z National Disease Research Interchange (NDRI, Filadelfia, Pensylwania). W zależności od projektu przygotuj nie mniej niż trzy pary oczu dawcy dla każdej grupy eksperymentalnej.</li>
	<li>Wyłuszczyć oczy dawcy w ciągu 10 godzin i wysłać w ciągu 48 godzin po śmierci. Następnie przetransportuj oczy do laboratorium w sterylnej pożywce hodowlanej Eagle (DMEM) firmy Dulbecco na lodzie. Wcześniej opisane badania wykazały, że oczy dawcy pobrane i przetransportowane w ten sposób zachowują biologiczne cechy i aktywność błony Brucha25,26,29.</li>
</ol>
2. Zbieranie eksplantatów błony komórkowej człowieka Brucha
<ol>
	<li>Umieść każde oko na gazie o wymiarach 1,5 x 1,5 cala nasączonej pożywką DMEM niezależną od dwutlenku węgla w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm i użyj nożyczek z cienkimi ostrzami, aby wykonać nacięcie przez twardówkę 3 mm za rąbkiem i obwodowo rozciągając się w dowolnym kierunku.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie obwodowe o pełnej grubości (przenikające do ciała szklistego) 1 mm za orą serrata. Usuń i wyrzuć przedni odcinek (rogówkę, soczewkę i tęczówkę), ciało szkliste i siatkówkę.</li>
	<li>Użyj cienkich nożyczek chirurgicznych, aby wykonać cztery promieniste nacięcia między twardówką a naczyniówką, a następnie oderwij twardówkę od obwodu do nerwu wzrokowego, uważając, aby nie rozerwać kompleksu błonowego naczyniówki/Brucha.</li>
	<li>Następnie wykonaj nacięcie obwodowe przez przestrzeń nadnaczyniówkową wzdłuż ora serrata i oderwij kompleks błonowo-naczyniówkowy RPE-Bruch z tyłu od twardówki.</li>
	<li>Usuń natywne komórki RPE, kąpiąc eksplant w 0,02 M wodorotlenku amonu w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco na polistyrenowej szalce Petriego o wymiarach 60 x 15 mm przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie myjąc go trzykrotnie w DPBS (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Unosić eksplantat kompleksu membranowego Brucha w podłożu wolnym od dwutlenku węgla na nielaminowanej, hydrofobowej membranie politetrafluoroetylenowej o grubości 65 μm z porami 0,2 μm, z podstawową warstwą blaszki każdego eksplantu skierowaną w stronę membrany.</li>
	<li>Umieść membranę politetrafluoroetylenową z eksplantatem membranowym Brucha na podłożu ze spiekanego szkła w szklanym systemie uchwytów próżniowych do mikroanalizy.</li>
	<li>Spłaszcz zwinięte krawędzie od strony naczyniówki drobnymi kleszczami pokrytymi teflonem, uważając, aby nie dotknąć podstawy lamininy błony Brucha.</li>
	<li>Podgrzej 15 ml agarozy (4% w DPBS), a następnie schłodzić do 37 °C. Następnie wlej 15 ml płynnego żelu na kompleks błonowo-naczyniówkowy Brucha od strony naczyniówki, stosując delikatne odsysanie, aby zagwarantować, że eksplant pozostanie płaski. Przechowywać tkankę w temperaturze 4 °C przez 2-3 minuty w celu zestalenia agarozy, a następnie oderwać membranę z politetrafluoroetylenu.</li>
	<li>Umieść eksplant membranowy Brucha (o średnicy 1,5 cala, w zestalonym żelu agarozowym) w naczyniu do hodowli komórek polistyrenowych o wymiarach 60 x 15 mm (z membraną Brucha skierowaną do góry), które zostało wyłożone ciepłą płynną agarozą na dnie naczynia, aby zamocować eksplantat membranowy Brucha na dnie studzienki z warstwą podstawowej lamininy eksplantacji skierowaną do góry.</li>
	<li>Agaroza zestala się w ciągu 2-3 minut w temperaturze pokojowej, aby ustabilizować eksplantaty błony Brucha w naczyniu hodowlanym. Przykryj eksplantaty błony Brucha w naczyniu hodowlanym DPBS i przechowuj naczynie w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości. Rysunek 2A pokazuje izolowane eksplantaty błony Brucha w naczyniu hodowlanym o wymiarach 60 x 15 mm.</li>
	<li>Jeśli pożądany system hodowli znajduje się na 96-dołkowej płytce, umieść eksplant membranowy Brucha (o średnicy 1,5 cala, ze zestalonym żelem agarozowym) na płaskim arkuszu teflonu stroną z lamininą do góry.</li>
	<li>Za pomocą trepanacji wyciąć pięć lub sześć okrągłych guzików o średnicy 6 mm z eksplantatu kompleksu membranowego Brucha i umieścić każdy z nich na 4% agarozie w temperaturze 37 °C w niepoddanym działaniu polistyrenu studzienku na 96-dołkowej płytce. Agaroza zestala się w ciągu 2-3 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić eksplantaty (guziki) błony Brucha na dnie każdej studzienki. 
	UWAGA: Rysunek 2B przedstawia trepanowane guziki membranowe Brucha w 96-dołkowej płytce. Zazwyczaj z każdego oka można zebrać 9 - 11 guzików lub eksplantatów.</li>
</ol>
3. Hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) na eksplantatach błony ludzkiej Brucha
<ol>
	<li>Po otrzymaniu oczu dawcy oczyść tkankę zewnątrzgałkową za pomocą DPBS. Wykonaj nacięcie obwodowe 5 mm poniżej punktu styku tęczówki i twardówki (pars plana) w przestrzeni podsiatkówkowej. Odrzuć przedni odcinek, ciało szkliste i siatkówkę.</li>
	<li>Umyj muszlę oczną, która zawiera membranę Brucha i arkusz RPE, zimnym DPBS. Odciąć komórki RPE za pomocą 5 ml 0,25% trypsyny nie dłużej niż 10 minut dla każdej próbki oka. Ugasić reakcję trypsyny za pomocą 25 ml kompletnej pożywki DMEM z 15% płodową surowicą bydlęcą (FBS) ogrzaną w temperaturze 37 °C w probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 200 × g przez 10 minut w temperaturze 24 °C i ponownie zawiesić osad w 5 ml kompletnej pożywki DMEM (z 15% FBS).</li>
	<li>Policz komórki i wysiej 15 000 żywotnych komórek RPE na blaszce podstawy każdego z różnych starzejących się eksplantatów błonowych Brucha (guzików) na 96-dołkowej płytce w 200 μl minimalnej ilości niezbędnych pożywek (MEM) zawierających antybiotyki (100 j.m./ml penicyliny G, 100 mg/ml streptomycyny, 5 mg/ml gentamycyny i 2,5 mg/ml amfoterycyny B). Zakładając średnicę komórki 20 μm, posiewanie o tej gęstości pozwoli komórkom RPE pokryć około 15% powierzchni posiewu.</li>
	<li>Umieść komórki na przycisku, dzięki czemu gęstość komórek można następnie stopniowo zwiększać do 100% zbieżności, w zależności od wpływu każdego parametru na zachowanie komórki.</li>
	<li>Pozostawić komórki do przyłączenia się do eksplantatu na 24 godziny w wilgotnej atmosferze 95% powietrza/5% CO2 w temperaturze 37 °C. Delikatnie zmienić podłoże za pomocą ciepłego, kompletnego DMEM.</li>
</ol>

<ol><li>Murdaugh, L. S., Wang, Z., Del Priore, L. V., Dillon, J., Gaillard, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+accumulation+of+3-nitrotyrosine+and+nitro-A2E+in+human+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Age-related accumulation of 3-nitrotyrosine and nitro-A2E in human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 90 (5), 564-571 (2010).</li>
<li>Wiradjaja, F., DiTommaso, T., Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membranes+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Basement membranes in development and disease.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (1), 8-31 (2010).</li>
<li>Nystrom, A., Bornert, O., Kuhl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+for+basement+membrane-linked+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell therapy for basement membrane-linked diseases.</a> Matrix Biol. , (2016).</li>
<li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+changes+in+Bruch%27s+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li>
<li>Marshall, G. E., Konstas, A. G., Reid, G. G., Edwards, J. G., Lee, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+collagen+and+laminin+in+Bruch%27s+membrane+and+basal+linear+deposit+in+the+human+macula%5BTitle%5D)+AND+%22Brit.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Type IV collagen and laminin in Bruch's membrane and basal linear deposit in the human macula.</a> Brit. J. Ophthalmol. 76 (10), 607-614 (1992).</li>
<li>Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+drusen+formation+in+the+normal+and+aging+eye+and+their+relation+to+age+related+maculopathy%3A+a+clinicopathological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brit.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study.</a> Brit. J. Ophthalmol. 83 (3), 358-368 (1999).</li>
<li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid%2C+Bruch%27s+membrane%2C+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (Suppl 1), S10-S32 (1999).</li>
<li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drusen+in+age-related+macular+degeneration%3A+pathogenesis%2C+natural+course%2C+and+laser+photocoagulation-induced+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li>
<li>Mullins, R. F., Aptsiauri, N., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+composition+of+drusen+associated+with+glomerulonephritis%3A+implications+for+the+role+of+complement+activation+in+drusen+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Structure and composition of drusen associated with glomerulonephritis: implications for the role of complement activation in drusen biogenesis.</a> Eye. 15 (Pt 3), 390-395 (2001).</li>
<li>Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+alterations+precede+vascularization+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+dystrophic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix alterations precede vascularization of the retinal pigment epithelium in dystrophic rats.</a> Curr. Eye Res. 8 (9), 907-921 (1989).</li>
<li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+changes+in+Bruch%27s+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li>
<li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drusen+in+age-related+macular+degeneration%3A+pathogenesis%2C+natural+course%2C+and+laser+photocoagulation-induced+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li>
<li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid%2C+Bruch%27s+membrane%2C+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv Ophthalmol. 44, Suppl 1. S10-S32 (1999).</li>
<li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li>
<li>Ho, T. C., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reattachment+of+cultured+human+retinal+pigment+epithelium+to+extracellular+matrix+and+human+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophth.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).</li>
<li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reattachment+to+a+substrate+prevents+apoptosis+of+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).</li>
<li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF+beta+secretion+modulates+the+density-dependent+growth+of+pig+retinal+pigment+epithelium+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">TGF beta secretion modulates the density-dependent growth of pig retinal pigment epithelium in vitro.</a> Ophthalmic Res. 31 (3), 192-202 (1999).</li>
<li>Gullapalli, V. K., Sugino, I. K., Van Patten, Y., Shah, S., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+RPE+survival+on+aged+submacular+human+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 80 (2), 235-248 (2005).</li>
<li>Wang, H., Yagi, F., Cheewatrakoolpong, N., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+study+of+retinal+pigment+epithelium+sheet+transplants+onto+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Short-term study of retinal pigment epithelium sheet transplants onto Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 78 (1), 53-65 (2004).</li>
<li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repopulation+of+different+layers+of+host+human+Bruch%27s+membrane+by+retinal+pigment+epithelial+cell+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophth.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (3), 767-774 (1999).</li>
<li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reengineering+of+aged+Bruch%27s+membrane+to+enhance+retinal+pigment+epithelium+repopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophth.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 (9), 3337-3348 (2004).</li>
<li>Castellarin, A. A., Sugino, I. K., Vargas, J. A., Parolini, B., Lui, G. M., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+transplantation+of+fetal+human+retinal+pigment+epithelial+cells+onto+human+cadaver+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).</li>
<li>Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+iPSC-derived+RPE+for+modeling+of+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases.</a> J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).</li>
<li>Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Optometry+Vision+Sci%22%5BJournal%5D)">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry Vision Sci. 91 (8), 878-886 (2014).</li>
<li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li>
<li>Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+seeded+onto+layers+of+human+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophth.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (2), 467-476 (1999).</li>
<li>Cai, H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruch+membrane+aging+alters+the+gene+expression+profile+of+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Bruch membrane aging alters the gene expression profile of human retinal pigment epithelium.</a> Curr. Eye Res. 31 (2), 181-189 (2006).</li>
<li>Moreira, E. F., Cai, H., Tezel, T. H., Fields, M. A., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reengineering+human+Bruch%27s+membrane+increases+rod+outer+segment+phagocytosis+by+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Vis.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Reengineering human Bruch's membrane increases rod outer segment phagocytosis by human retinal pigment epithelium.</a> Transl. Vis. Sci. Technol. 4 (5), 10(2015).</li>
<li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruch%27s+membrane+aging+decreases+phagocytosis+of+outer+segments+by+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Bruch's membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium.</a> Mol. Vis. 13, 2310-2319 (2007).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma żadnych ujawnień komercyjnych do zadeklarowania.

Starzejąca się ludzka błona Brucha (macierz zewnątrzkomórkowa) przyczynia się do postępu choroby AMD, a zatem istnieje potrzeba zrozumienia, w jaki sposób ta zmieniona matryca przyczynia się do dysfunkcji komórek RPE. Biorąc pod uwagę brak wystarczającej liczby modeli zwierzęcych do badania zmian związanych z wiekiem w AMD, systemy modelowe ex vivo , które naśladują skutki choroby, mogą służyć jako cenne narzędzie do zrozumienia patofizjologii. Metodologia opisana w tym manuskrypcie może być stosowana do konsekwentnego izolowania eksplantatów błonowych ludzkiego Brucha i hodowli komórek RPE, w tym pierwotnych, unieśmiertelnionych lub pochodzących z komórek macierzystych linii komórkowych RPE.
Jak wspomniano wcześniej, eksplantaty błonowe ludzkiego Brucha pochodzą z NDRI. Z NDRI ustala się protokół, który określa kryteria określone dla akceptowalnych oczu dawcy. Na przykład dawcy nie mogą mieć stwierdzonych chorób siatkówki oka, oczy/kule są pobierane w ciągu 10 godzin po śmierci, a kule docierają do laboratorium w ciągu 48 godzin po śmierci (w postaci nocnej dostawy paczki na lodzie). Należy określić odpowiedni przedział wiekowy i liczbę oczu potrzebnych do analizy statystycznej badania, np. pięć par globusów od dawców w wieku od 20 do 49 lat oraz pięć par globusów od dawców w wieku od 50 do 89 lat.
Dostępność kulek ocznych jest różna, zazwyczaj każdego miesiąca dostępnych jest średnio dziesięć par globlerów. Do zestawu okulistów dołączone są podstawowe, zanonimizowane informacje o dawcy: wiek, rasa, godzina zgonu, przyczyna zgonu i krótka historia medyczna (lista chorób lub chorób współistniejących).
Co najważniejsze, zbieranie eksplantatów błony Brucha u człowieka wymaga usunięcia przedniego odcinka oka i ciała szklistego, co pozwala na wyizolowanie kompleksu błonowo-naczyniówkowego RPE-Bruch. Po wyizolowaniu błony Brucha komórki RPE można wysiać na bezkomórkowe eksplantaty w różnych stężeniach i hodować do dalszych eksperymentów. Przygotowanie i postępowanie proceduralne opisane w niniejszym dokumencie ma kluczowe znaczenie, zwracając uwagę na orientację izolowanej błony Brucha, aby upewnić się, że powierzchnia laminalna jest skierowana do góry, jednocześnie nie dotykając powierzchni mechanicznie, aby uniknąć uszkodzenia struktury powierzchni macierzy zewnątrzkomórkowej.
Należy również zauważyć, że w przypadku korzystania z systemów eksplantacji błonowych Brucha istnieją pewne zmienne, które mogą wpływać na wyniki dalszych eksperymentów, takie jak tło genomowe indywidualnego dawcy, wiek błony Brucha lub czas pośmiertny błony Brucha oraz lokalizacja błony Brucha, tj. centralna lub obwodowa część eksplantatów błonowych Brucha. Podobnie jak w przypadku każdego innego badania tkanek ludzkich, należy zrekrutować odpowiednią liczbę próbek oka dawcy, aby uzyskać niezbędną moc statystyczną i w razie potrzeby dopasować wiek oka dawcy. Ustalenie ścisłych kryteriów przyjmowania oczu z banków oczu jest krytycznym parametrem. Przyjmuj tylko oczy, które są wyłuszczone w czasie krótszym niż 10 godzin po śmierci i które można pobrać za pomocą błony Brucha w ciągu 24 - 48 godzin po śmierci. Miejsce nerwu wzrokowego może być używane jako marker orientacji i używać tych samych lokalizacji dla grup eksperymentalnych i kontrolnych. Podejmując te środki, można zminimalizować zmienność eksperymentalną.
Podsumowując, zrozumienie kompleksu błona-naczyniówka RPE-Bruch i tego, jak wpływa na niego wiek i choroba, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia jego wkładu w patofizjologię AMD. Systemy modelowe, które wykorzystują techniki ex vivo, są cennym narzędziem do badania tych efektów przy użyciu tkanki ludzkiej. W niniejszym artykule opisujemy metodologię, która wykorzystuje eksplantaty ludzkiego dawcy jako odpowiedni model ex vivo starzejącej się błony Brucha. Technika ta pozwala na wykorzystanie starzejącej się i / lub chorej ludzkiej błony Brucha jako narzędzia badawczego do zbadania, w jaki sposób zmiany strukturalne w macierzy mogą wpływać na nakładanie się komórek RPE, w tym przyczepianie, proliferację i ekspresję genów25,27. Pomyślne opracowanie podobnych systemów modelowych ex vivo pogłębi naszą wiedzę na temat AMD i ułatwi opracowanie nowych opcji terapeutycznych.

Związane z wiekiem zmiany strukturalne w błonie Brucha u człowieka, które są spowodowane wieloma czynnikami, w tym stresem nitrozacyjnym i oksydacyjnym, wywierają wiele szkodliwych skutków na funkcję komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) i przyczyniają się do patologii zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9. Rozważając terapię zastępczą komórek w przypadku zaawansowanego zaniku AMD lub atrofii geograficznej, leczenie prawdopodobnie będzie wymagało przeszczepu komórek na podłoże atrofii komórek RPE. Zmiany związane z wiekiem w błonie Brucha u człowieka mogą niekorzystnie wpływać na powodzenie przeszczepionych przeszczepów komórek RPE, biorąc pod uwagę uszkodzenie macierzy zewnątrzkomórkowej6,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Badanie biologii błony Brucha u człowieka i tego, w jaki sposób zmiany strukturalne w obrębie macierzy przyczyniają się do progresji do AMD, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patologii choroby. W związku z tym istnieje pilna potrzeba, aby badacze zajmujący się obszarem oczu związanym z wiekiem opracowali protokoły opisujące pobieranie ex vivo od starzejącej się i/lub chorej ludzkiej błony Brucha.
Historycznie rzecz biorąc, trudno było modelować zaburzenia związane z wiekiem, takie jak atrofia geograficzna i błona Brucha u starzejącego się człowieka U zwierząt23. Trudność ta wynika z wielu czynników, w tym długowieczności ludzi w porównaniu z gryzoniami i innymi gatunkami często wykorzystywanymi do modelowania chorób, a także z braku plamki żółtej u większości kręgowców24. Zaletą opisanej w niniejszym dokumencie metody jest to, że komórki mogą być testowane bezpośrednio na błonie Brucha pobranej z oczu pośmiertnych osób w podeszłym wieku i/lub chorych. Ogólnym celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowej metodologii dla modelu ex vivo starzejącej się i/lub chorej ludzkiej błony Brucha, w tym izolacji eksplantatów błony Brucha od ludzkich dawców oraz wysiewu komórek RPE do dalszych eksperymentów. Model ten może służyć jako odpowiedni model do badania wpływu uszkodzenia macierzy zewnątrzkomórkowej na funkcję i patologię komórek RPE20,25,26,27,28.

<table><tbody><tr><td>Ludzkie kule dawcy</td><td>National Disease Research Interchange, NDRI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Media niezależne od dwutlenku węgla</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>60-milimetrowa polistyrenowa szalka Petriego</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>351007</tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco, PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofobowa 65 &mikro; membrana politetrafluoroetylenowa o grubości M i 0,2 &mikro; m pores</td><td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand szklany system uchwytów filtrów próżniowych do mikroanalizy&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-753-102</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576-5G</td><td></td></tr><tr><td>35 & razy; 10mm naczynie hodowlane</td><td>VWR International</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Accutome</td><td>AM0570 60</td><td></td></tr><tr><td>96 dołków</td><td>Corning Inc.</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Minimalne niezbędne nośniki (MEM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11095-080&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1336-21-6 &nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na modelu ex vivo starzejącej się błony błony mięśniowej człowieka

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Oprócz witamin i przeciwutleniaczy zalecanych przez Age-Related Eye Disease Study, nie ma skutecznej terapii na "suche" lub zanikowe zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), które stanowi 90% przypadków. Potrzebne są terapie, aby spowolnić lub opóźnić rozwój atrofii geograficznej (GA), a zrozumienie patologii błony Brucha jest częścią tego procesu. Zmiany w błonie Brucha u człowieka poprzedzają postęp AMD, przyczyniając się do uszkodzenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Biorąc pod uwagę brak wystarczającej liczby modeli zwierzęcych do badania AMD, modele ex vivo starzejącej się ludzkiej błony Brucha służą jako użyteczne narzędzie do badania zachowania komórek RPE z unieśmiertelnionych i pierwotnych linii komórkowych, a także linii RPE pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodę, która pozwala określić wpływ zachowania komórek RPE wysianych na pobranych eksplantatach błony Brucha od ludzkich dawców, w tym przyczepienie, apoptozę i proliferację, zdolność do fagocytyzacji zewnętrznych segmentów fotoreceptorów, ustalenie polaryzacji i ekspresję genów. Test ten zapewnia model ex vivo starzejącej się błony Brucha w celu oceny cech funkcjonalnych komórek RPE po wysiewie na starej/uszkodzonej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Po prawidłowym wykonaniu niniejszego protokołu można określić wpływ starzejącej się i/lub chorobowo zmienionej ludzkiej błony Brucha na funkcje komórek RPE poprzez ocenę ustanowienia polarności i zewnętrznej bariery krew-siatkówka, spolaryzowanej sekrecji czynników wzrostu i cytokin oraz fagocytozy zewnętrznych odcinków pręcików fotoreceptorów.
Wygenerowaliśmy dane, które wykazują fenotyp chorobowy w przypadku starzejącej się ludzkiej błonyrusa. Na przykład hodowla komórek RPE na eksplantach starzejącej się ludzkiej błonyrusa zmniejsza ponowną adhezję komórek RPE (Rycina 3). Hodowla komórek RPE na starzejącej się ludzkiej błonierusa obniża zdolność tych komórek do fagocytozy zewnętrznych segmentów pręcików (ROS), co stanowi krytyczną funkcję RPE (Rycina 4). Ponadto, komórki apoptotyczne można zidentyfikować i porównać na tych eksplantach przy użyciu metody TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end-labeling), zgodnie z opisem w poprzednich pracach26. Wpływ starzejącej się i/lub chorobowo zmienionej ludzkiej błonyrusa na profil ekspresji genów w komórkach RPE można określić za pomocą technologii mikromacierzy. Wykazaliśmy, że ekspresja genów w komórkach RPE ulega zmianie podczas hodowli na ludzkiej błonierusa pochodzącej od osób starszych w porównaniu do eksplantów od osób młodszych (Rycina 5)27. Do analizy statystycznej w każdej grupie wykorzystuje się eksplanty pochodzące od co najmniej 3 - 5 ludzkich dawców.
<img alt="Schemat procesu sekcji gałki ocznej; etapy przygotowania kompleksu RPE-błona Brucha-naczyniówki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczne przedstawienie izolacji ludzkiej błony Brucha z oczu dawców. Ludzkie błony Brucha są pozyskiwane poprzez usunięcie twardówki, segmentu przedniego, siatkówki, ciała szklistego oraz natywnych komórek nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Błona Brucha w agarozie, układ hodowli komórkowej, schemat eksperymentalny badania tkanki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Izolowana ludzka błona Brucha (BM) w naczyniu hodowlanym. (A) Schemat eksplantów ludzkiej błony Brucha (każdy o średnicy 1,5 cala, z zastygłym żelem agarozowym) umieszczonych w polistyrenowym naczyniu do hodowli komórkowej 60 × 15 mm (BM skierowana stroną górną do góry), wypełnionym na dnie ciepłą płynną agarozą. (B) Eksplant ludzkiej błony Brucha, który został wycięty trepanem na kilka okrągłych fragmentów (eksplantów) o średnicy 6 mm, z których każdy został następnie umieszczony na 4% agarozie w temperaturze 37 °C w niepowlekanej polistyrenowej studzience płytki 96-dołkowej. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy porównujący względną szybkość przywierania komórek RPE do młodej i starszej błony Brucha (BM), wykazujący istotną różnicę." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Szybkość ponownego przywierania komórek nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE) do młodej i starszej ludzkiej błony Brucha (BM). Pierwotne komórki RPE wysiano na eksplantaty ludzkiej błony Brucha pochodzące z oczu dawców młodych (&lt;50 lat, n = 3) lub starszych (&gt;70 lat, n = 5) na trzy tygodnie. Szybkość przywierania komórek zmierzono za pomocą testu żywotności komórek MTT. Starsze ludzkie błony Brucha obniżyły szybkość przywierania komórek RPE o 24% (młoda BM 100 +/-8,54 S.E. vs starsza BM 76,65 +/-1,44 S.E.). **p &lt;0,05, S.E. = błąd standardowy.
<img alt="Wykres słupkowy fagocytozy FITC-ROS porównujący poziomy fluorescencji komórek BM młodych i starszych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Fagocytoza komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) zależy od wieku ludzkiej błony Blocha (BM). Pierwotne komórki RPE hodowane na starszych eksplantach ludzkiej błony Blocha wykazywały obniżoną zdolność do fagocytozy zewnętrznych odcinków pręcików (ROS) (młoda BM 873 +/-9,3 S.E., n = 5 vs starsza BM 608 +/-25,4 S.E., n = 5). ***p &lt;0,01, S.E. = błąd standardowy.
<img alt="Porównanie liczby genów w błonie Brucha; analiza wykresu rozrzutu w badaniach nad starzeniem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Liczba genów komórek nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE) wykazujących ekspresję w każdej próbce hodowanej na eksplantach młodej lub starszej ludzkiej błony Brucha. Odnotowano większy rozrzut liczby genów wykazujących ekspresję w pierwotnych komórkach RPE wysianych na starszą w porównaniu z młodszą ludzką błoną Brucha (odpowiednio 6201 ± 388 vs. 6439 ± 80); w każdej grupie wiekowej przebadano pięć eksplantów. Przedstawiono za pełną zgodą wszystkich autorów pracy Cai, H et al.27. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Celem tego protokołu jest pokazanie hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) na starzejącej się i/lub chorej ludzkiej błonie Brucha. Ta metoda jest odpowiednia do badania zachowania komórek RPE na uszkodzonej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na modelu ex vivo starzejącej się błony błony mięśniowej człowieka

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Ogólnym celem tej eksperymentalnej procedury jest stworzenie ex vivo macierzy zewnątrzkomórkowej znanej jako system hodowli błonowej Brucha, która obserwuje wpływ błony Brucha na nakładanie się komórek nabłonka barwnikowego siatkówki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu subbiologii RPE w dziedzinie etiologii AMD, takie jak to, czy zmiany na starzejących się błonach Brucha przyczyniają się do nieprawidłowego działania nakładających się komórek RPE. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona naukowcom wyizolować natywną błonę Brucha od oka dawcy ludzkiego w różnym wieku i wykorzystać je do badań proteomicznych w hodowlach komórek RPE.Wyizolowanie błony Brucha i stworzenie rzeczywistego systemu hodowli vivo przy minimalnym uszkodzeniu natywnej błony Brucha jest wyzwaniem, ale w tym filmie pokażę Ci, jak to zrobić. Na początek umieść gazę o powierzchni 1,5 cala kwadratowego nasączoną niezależnym od CO2 DMEM w 100-milimetrowym naczyniu. Następnie załaduj gałkę oczną na gazę.Następnie za pomocą ostrza chirurgicznego wykonaj nacięcie przez twardówkę trzy milimetry za rąbkiem. Następnie użyj nożyczek o cienkim ostrzu, aby wykonać nacięcie o pełnej grubości i rozciągnąć nacięcie obwodowo w dowolnym kierunku wokół oka. Następnie usuń i wyrzuć przedni segment, w tym rogówkę, soczewkę i tęczówkę.Wyrzuć również ciało szkliste i siatkówkę. Następnie ostrożnie oderwij kompleks błony naczyniówkowej RPE Brucha od twardówki od obwodu do nerwu wzrokowego za pomocą szpatułki pokrytej teflonem. Należy to zrobić bardzo ostrożnie, aby nie rozerwać kompleksu membranowego.Teraz użyj cienkich nożyczek chirurgicznych, aby wykonać cztery promieniowe nacięcia w twardówce i oderwać twardówkę. Następnie odetnij błonowy eksplant naczyniówki Brucha od nerwu wzrokowego i przenieś ten eksplant do 60-milimetrowej naczynia zawierającej 0,02 molowego wodorotlenku amonu w DPBS. Aby usunąć natywne komórki RPE, inkubuj ten eksplant przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Po inkubacji przemyj eksplant trzykrotnie za pomocą DPBS, zabezpieczając miejsce nerwu wzrokowego na błonie Brucha kleszczami pokrytymi teflonem, jednocześnie opływając tkankę roztworem. Następnie unieś eksplantat, stroną z lamininą skierowaną do góry w pożywce wolnej od dwutlenku węgla. Wykonaj cztery nacięcia na membranie Brucha, a następnie przenieś nielaminowaną hydrofobową membranę PTFE o grubości 65 mikronów z porami 0,2 mikrona na eksplantat.Ustaw to za pomocą blaszki podstawowej przylegającej do membrany PTFE. Usuń nadmiar płynu z naczynia, a następnie przenieś zestaw do szklanego systemu uchwytów filtrów próżniowych do mikroanalizy, gdzie powinien być osadzony na wsporniku ze spiekanego szkła. Następnie, ostrożnie unikając kontaktu z blaszką podstawną, spłaszcz zwinięte krawędzie strony naczyniówki za pomocą kleszczy pokrytych teflonem.Teraz upłynnij 15 mililitrów 4% agarozy w DPBS i ostudź do 37 stopni Celsjusza. Następnie powoli wylej agarozę na naczyniówkową stronę eksplantatu, delikatnie odsysając, aby utrzymać go płasko. Gdy żel zacznie krzepnąć, przenieś go wraz z membraną do 60-milimetrowego naczynia na lodzie.Pozwól żelowi zestalić się przez dwie do trzech minut, a następnie oderwij membranę PTFE. Następnie zanurz eksplant w DPBS i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie potrzebny. Podczas hodowli eksplantatu na 60-milimetrowym naczyniu wyłożonym płynem 4% agarozy, ułóż błonę Brucha skierowaną do góry.Podczas hodowli przy użyciu 96-dołkowej płytki wyłożonej polistyrenem, umieść pokryty żelem eksplant membranowy Brucha na płaskim arkuszu teflonu stroną z lamininą do góry. Następnie, za pomocą trepanacji, wytnij od sześciu do ośmiu sześciomilimetrowych guzików z eksplantatu i przenieś guziki tkankowe do studzienek wypełnionych płynną agarozą. Aby rozpocząć, ustaw gałkę oczną na gazie nasączonej DPBS, tak jak poprzednio.Następnie wykonaj nacięcie obwodowe pięć milimetrów poniżej punktu styku tęczówki i twardówki, pars plana, w przestrzeni podsiatkówkowej. Odrzuć segment wewnętrzny, ciało szkliste i siatkówkę. Następnie za pomocą pipety transferowej umyj muszlę oczną dwoma do trzech mililitrów zimnego DPBS.W sumie umyj muszlę oczną trzy razy. Następnie, aby zdysocjować komórki RPE, potraktuj muszlę oczną trypsyną przez okres do 10 minut. Następnie przenieś trypsynizowane komórki RPE do 50-mililitrowej probówki, a aby wygasić reakcję, dodaj 25 mililitrów pożywki z FBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Teraz odwiruj tkankę i roztwór w ilości 200 g przez 10 minut w temperaturze 24 stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach kompletnego podłoża DMEM z 15% FBS. Teraz policz komórki i umieść 15 000 żywotnych komórek RPE w 200 mikrolitrach minimalnej niezbędnej pożywki zawierającej antybiotyki bez surowicy na każdym guziku błony Brucha na 96-dołkowej płytce.Hoduj komórki przez co najmniej 24 godziny w celu przyłączenia się. Później delikatnie zmień pożywkę na ogrzany kompletny DMEM i kontynuuj hodowlę komórek. Korzystając z tego protokołu, starzejące się i chore błony Brucha mogą być badane poprzez hodowanie na nich komórek RPE.Zazwyczaj starzejące się eksplantaty zmniejszają ponowne przyczepianie się komórek RPE. Komórki RPE hodowane na starzejącej się ludzkiej błonie Brucha są również mniej zdolne do fagocytyzacji zewnętrznych segmentów pręcików, co jest krytyczną funkcją RPE. Korzystając z mikromacierzy, stwierdzono, że ekspresja genów komórek RPE jest inna, gdy komórki są hodowane na błonie Brucha u starszych osobników w porównaniu z komórkami hodowanymi na błonie od młodszych osobników.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak odizolować błonę Brucha od oczu ludzkiego dawcy i zrobić eksplantaty, w których można hodować komórki RPE. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około trzy godziny, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby nie dotykać strony lamininy eksplantatu membrany Brucha narzędziami preparacyjnymi, aby uniknąć uszkodzenia powierzchni.Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak fagocytoza RPE i badania ekspresji genów komórek RPE, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy błona Brucha od dawcy w różnym wieku lub dawców ze zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem wpłynie na nakładanie funkcji komórek RPE. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem do zbadania mechanizmu etiologii AMD w systemie modelowym ex vivo błony Brucha.

culturing-retinal-pigment-epithelial-cells-on-an-ex-vivo-model-aged

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przedstawiamy powtarzalną metodę hodowli konfluentnych monowarstw ludzkich płodowych komórek nabłonka pigmentowego siatkówki (hfRPE), które wykazują morfologię, fizjologię, polarność oraz wzorce ekspresji białek i genów charakterystyczne dla natywnej tkanki dorosłego organizmu. Praca ta została rozszerzona o model zwierzęcy kilku chorób oczu.

Modele eksperymentalne do badania fizjologii i patofizjologii nabłonka pigmentowego siatkówki

Identyfikacja białek specyficznie związanych z błoną Brucha w ludzkich oczach jest ważnym krokiem w zrozumieniu biochemicznych mechanizmów stojących za chorobami oczu, takimi jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wzbogacić ten arkusz macierzy zewnątrzkomórkowej do dalszej analizy biochemicznej.

Wzbogacenie błony Brucha z ludzkich oczu dawcy

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Protokół opisuje organotypowe eksplantaty myszy neuroretina, hodowana razem z nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE), w pożywce zdefiniowanej przez R16, wolna od surowicy i antybiotyków. Metoda ta jest stosunkowo prosta do wykonania, tańsza i bardziej czasochłonna w porównaniu z eksperymentami in vivo i może być dostosowana do wielu zastosowań eksperymentalnych.

Długotrwała, pozbawiona surowicy hodowla organtypowych eksplantatów siatkówki myszy z nienaruszonym nabłonkiem barwnikowym siatkówki

To badanie ma na celu opracowanie nowego modelu ludzkiej organotypowej hodowli siatkówki (HORC), który zapobiega naruszeniu integralności siatkówki podczas obchodzenia się z eksplantatem. Osiąga się to poprzez hodowlę siatkówki z leżącym nad nią ciałem szklistym i leżącym pod nim barwnikiem siatkówki: nabłonkiem-naczyniówką (RPE-naczyniówką) i twardówką.

Charakterystyka nowatorskiej techniki organotypowej hodowli siatkówki u ludzi

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i transfekcji pierwotnych komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki od różnych ssaków (myszy, szczury, króliki, świnie i bydło). Metoda ta idealnie nadaje się do badania podejść do ocznej terapii genowej w różnych konfiguracjach do analiz ex vivo i badań in vivo, które można przenieść na ludzi.

Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej

Ten protokół, który pierwotnie został zgłoszony przez Fernandez-Godino et al. w 2016 roku1, opisuje metodę efektywnego izolowania i hodowli mysich komórek RPE, które tworzą funkcjonalną i spolaryzowaną monowarstwę RPE w ciągu jednego tygodnia na płytkach Transwell. Zabieg trwa około 3 godzin.

Skuteczna dyssekcja i hodowla pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Ten manuskrypt opisuje uproszczony protokół stopniowej izolacji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z oczu myszy. Protokół obejmuje wyłuszczenie i sekcję oczu myszy, a następnie izolację, wysiew i hodowlę komórek RPE.

Izolacja pierwotnych komórek barwnikowego nabłonka siatkówki myszy

Tutaj prezentowana jest łatwa do naśladowania metoda hodowli pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świni in vitro.

Pierwotna hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świń

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Poznaj hodowlę komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na starzejącej się błonie Brucha człowieka. Ta metoda umożliwia badanie funkcji RPE w kontekście zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem.

Hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na modelu ex vivo starzejącej się błony błony mięśniowej człowieka

Przeglądaj więcej filmów