Name: Profilowanie izotopologu kwasów tłuszczowych 13C zapewnia wgląd w troficzny transfer węgla i metabolizm lipidów u konsumentów bezkręgowców (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Odkryj profilowanie izotopologu kwasów tłuszczowych 13C do badania troficznego transferu węgla i metabolizmu lipidów u bezkręgowców glebowych. Ta metoda pozwala śledzić przepływ pokarmowy w skrytych ekosystemach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe R. Menzela i L. Ruessa przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (RU RU780/11-1). R. Nehring został ufundowany przez RU 780/10-1. Na koniec jesteśmy niezmiernie wdzięczni dr Hazel Ruvimbo Maboreke za korektę naszego rękopisu.

<ol><li>Ruess, L., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1890/04-1399/abstract">Application of lipid analysis to understand trophic interactions in soil.</a> Ecology. 86 (8), 2075-2082 (2005).</li>
<li>Ruess, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071707001046">Lipid composition of Collembola and their food resources in deciduous forest stands - Implications for feeding strategies.</a> Soil Biology and Biochemistry. 39 (8), 1990-2000 (1990).</li>
<li>Chamberlain, P. M., Bull, I. D., Black, H. I. J., Ineson, P., Evershed, R. P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071705000477">Fatty acid composition and change in Collembola fed differing diets: identification of trophic biomarkers.</a> Soil Biology and Biochemistry. 37 (9), 1608-1624 (2005).</li>
<li>Stott, A. W., Davies, E., Evershed, R. P., Tuross, N. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s001140050354">Monitoring the routing of dietary and biosynthesised lipids through compound-specific stable isotope (delta C-13) measurements at natural abundance.</a> Naturwissenschaften. 84 (2), 82-86 (1997).</li>
<li>Ruess, L., Haggblom, M. M., Langel, R., Scheu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+isotope+ratios+and+fatty+acid+composition+as+indicators+of+animal+diets+in+belowground+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Nitrogen isotope ratios and fatty acid composition as indicators of animal diets in belowground systems.</a> Oecologia. 139 (3), 336-346 (2004).</li>
<li>Pollierer, M. M., Scheu, S., Haubert, D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071710000611">Taking it to the next level: Trophic transfer of marker fatty acids from basal resource to predators.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42 (6), 919-925 (2010).</li>
<li>Ferlian, O., Scheu, S., Pollierer, M. M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071712001575">Trophic interactions in centipedes (Chilopoda, Myriapoda) as indicated by fatty acid patterns: Variations with life stage, forest age and season.</a> Soil Biology and Biochemistry. 52, 33-42 (2012).</li>
<li>Ruess, L., Chamberlain, P. M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071710002683">The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42 (11), 1898-1910 (2010).</li>
<li>Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780124200029000032">Empirically characterising trophic networks: What emerging DNA-based methods, stable isotope and fatty acid analyses can offer.</a> Adv Ecol Res. 49, 177-224 (2013).</li>
<li>Hammer, B. T., Fogel, M. L., Hoering, T. C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009254198000941">Stable carbon isotope ratios of fatty acids in seagrass and redhead ducks.</a> Chemical Geology. 152 (1-2), 29-41 (1998).</li>
<li>Budge, S. M., Iverson, S. J., Koopman, H. N. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1748-7692.2006.00079.x/abstract">Studying trophic ecology in marine ecosystems using fatty acids: A primer on analysis and interpretation.</a> Marine Mammal Science. 22 (4), 759-801 (2006).</li>
<li>Haubert, D., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1600-0706.2009.17587.x/full">Trophic structure and major trophic links in conventional versus organic farming systems as indicated by carbon stable isotope ratios of fatty acids.</a> Oikos. 118 (10), 1579-1589 (2009).</li>
<li>Ngosong, C., Raupp, J., Richnow, H. H., Ruess, L. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003140561100028X">Tracking Collembola feeding strategies by the natural 13C signal of fatty acids in an arable soil with different fertilizer regimes.</a> Pedobiologia. 54 (4), 225-233 (2011).</li>
<li>Bec, A., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.2041-210X.2011.00111.x/abstract">Assessing the reliability of fatty acid-specific stable isotope analysis for trophic studies.</a> Methods in Ecology and Evolution. 2 (6), 651-659 (2011).</li>
<li>Gladyshev, M. I., Makhutova, O. N., Kravchuk, E. S., Anishchenko, O. V., Sushchik, N. N. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0075951115001243">Stable isotope fractionation of fatty acids of Daphnia fed laboratory cultures of microalgae.</a> Limnologica. 56 (Supplement C. 56 (Supplement C), 23-29 (2016).</li>
<li>Gladyshev, M. I., Sushchik, N. N., Kalachova, G. S., Makhutova, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+composition+of+fatty+acids+in+organisms+of+different+trophic+levels+in+the+Yenisei+river%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Stable isotope composition of fatty acids in organisms of different trophic levels in the Yenisei river.</a> PLoS One. 7 (3), e34059(2012).</li>
<li>Eisenreich, W., Dandekar, T., Heesemann, J., Goebel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+metabolism+of+intracellular+bacterial+pathogens+and+possible+links+to+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Carbon metabolism of intracellular bacterial pathogens and possible links to virulence.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 401-412 (2010).</li>
<li>Eylert, E., Bacher, A., Eisenreich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR-based+isotopologue+profiling+of+microbial+carotenoids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">NMR-based isotopologue profiling of microbial carotenoids.</a> Methods Mol Biol. 892, 315-333 (2012).</li>
<li>Garton, N. J., O'Hare, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis%3A+feeding+the+enemy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis: feeding the enemy.</a> Chemical Biology. 20 (8), 971-972 (2013).</li>
<li>Rosenblatt, J., Chinkes, D., Wolfe, M., Wolfe, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+tracer+analysis+by+GC-MS%2C+including+quantification+of+isotopomer+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope tracer analysis by GC-MS, including quantification of isotopomer effects.</a> Am J Physiol. 263 (3), E584-E596 (1992).</li>
<li>Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+13C+mass+isotopomer+distributions+for+natural+stable+isotope+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance.</a> J Mass Spectrom. 31 (3), 255-262 (1996).</li>
<li>Heuner, K., Eisenreich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intracellular+metabolism+of+legionella+by+isotopologue+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The intracellular metabolism of legionella by isotopologue profiling.</a> Methods Mol Biol. 954, 163-181 (2013).</li>
<li>Willenborg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+pivotal+carbon+metabolism+of+Streptococcus+suis+serotype+2+under+ex+vivo+and+chemically+defined+in+vitro+conditions+by+isotopologue+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of the pivotal carbon metabolism of Streptococcus suis serotype 2 under ex vivo and chemically defined in vitro conditions by isotopologue profiling.</a> J Biol Chem. 290 (9), 5840-5854 (2015).</li>
<li>Menzel, R., Ngosong, C., Ruess, L. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00049-017-0236-2">Isotopologue profiling enables insights into dietary routing and metabolism of trophic biomarker fatty acids.</a> Chemoecology. 27 (3), 101-114 (2017).</li>
<li>Buse, T., Ruess, L., Filser, J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0031405613000231">New trophic biomarkers for Collembola reared on algal diets.</a> Pedobiologia. 56 (3), 153-159 (2013).</li>
<li>Hutson, B. R. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201302427834">Effects of variations of the plaster-charcoal culture method on a Collembolan, Folsomia candida.</a> Pedobiologia. 18, 138-144 (1978).</li>
<li>Fountain, M. T., Hopkin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folsomia+candida+%28Collembola%29%3A+a+%26%2334%3Bstandard%26%2334%3B+soil+arthropod%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Folsomia candida (Collembola): a &#34;standard&#34; soil arthropod.</a> Annu Rev Entomol. 50, 201-222 (2005).</li>
<li>ISO, I. O. fS. <a target="_blank" href="https://www.iso.org/standard/19245.html">Soil Quality-Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants</a>. , ISO 11267:1999 (1999).</li>
<li>Welch, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+cellular+fatty+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Applications of cellular fatty acid analysis.</a> Clin Microbiol Rev. 4 (4), 422-438 (1991).</li>
<li>Dodds, E. D., McCoy, M. R., Rea, L. D., Kennish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatographic+quantification+of+fatty+acid+methyl+esters%3A+flame+ionization+detection+vs.+electron+impact+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Gas chromatographic quantification of fatty acid methyl esters: flame ionization detection vs. electron impact mass spectrometry.</a> Lipids. 40 (4), 419-428 (2005).</li>
<li>Kuppardt, S., Chatzinotas, A., Kastner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+fatty+acid+and+RNA+stable+isotope+probing-based+method+for+tracking+protist+grazing+on+bacteria+in+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a fatty acid and RNA stable isotope probing-based method for tracking protist grazing on bacteria in wastewater.</a> Appl Environ Microbiol. 76 (24), 8222-8230 (2010).</li>
<li>Zhang, X., He, H., Amelung, W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071707002489">A GC/MS method for the assessment of 15N and 13C incorporation into soil amino acid enantiomers.</a> Soil Biology and Biochemistry. 39 (11), 2785-2796 (2007).</li>
<li>Vetter, W., Thurnhofer, S. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/lite.200700062/abstract">Analysis of fatty acids by mass spectrometry in the selected ion monitoring mode.</a> Lipid Technol. 19 (8), 184-186 (2007).</li>
<li>Thurnhofer, S., Vetter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gas+chromatography%2Felectron+ionization-mass+spectrometry-selected+ion+monitoring+method+for+determining+the+fatty+acid+pattern+in+food+after+formation+of+fatty+acid+methyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">A gas chromatography/electron ionization-mass spectrometry-selected ion monitoring method for determining the fatty acid pattern in food after formation of fatty acid methyl esters.</a> J Agric Food Chem. 53 (23), 8896-8903 (2005).</li>
<li>Haubert, D., Haggblom, M. M., Scheu, S., Ruess, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fungal+food+quality+and+starvation+on+the+fatty+acid+composition+of+Protaphorura+fimata+%28Collembola%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+B-Biochemistry+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of fungal food quality and starvation on the fatty acid composition of Protaphorura fimata (Collembola).</a> Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology. 138 (1), 41-52 (2004).</li>
</ol>

Profilowanie izotopologów
Szczegółowa analiza aspektów ilościowych rozkładu 13C w FA wymaga zastosowania najnowocześniejszych technologii w celu określenia podziału węgla w sieciach troficznych. W niniejszej pracy wykorzystano profilowanie izotopologów do oceny stosunków 13C/12C w powszechnych biomarkerach FA w interakcjach troficznych. Metoda ta jest dobrze ugruntowana w analizie aminokwasów za pomocą chromatografii cieczowej (LC-MS) i była st...

W tajemniczym środowisku, takim jak gleba, relacje troficzne są trudne do rozwiązania i dodatkowo ograniczane przez mały rozmiar fauny. W ciągu ostatniej dekady nastąpił postęp w ekologii biochemicznej, w szczególności w wykorzystaniu kwasów tłuszczowych jako biomarkerów do określania strategii żywieniowych fauny glebowej w warunkach polowych1,2,3. Opiera się to na fakcie, że kwasy tłuszczowe z zasobów mogą być włączane do tkanek konsumentów jako całe cząsteczki, proces ten określa się mianem routingu dietetycznego4. Przenoszenie kwasów tłuszczowych zostało zgłoszone na trzech poziomach troficznych, tj. z grzybów na nicienie do Collembola5. Ostatnio fauna drapieżna była brana pod uwagę6,7 i opublikowano pierwsze opinie na temat kwasów tłuszczowych jako markerów troficznych w glebowych sieciach pokarmowych8,9.
Bardziej szczegółowe informacje na temat oddziaływań troficznych uzyskuje się za pomocą sondowania stabilnych izotopów kwasów tłuszczowych (FA-SIP). Określenie proporcji 13C/12C w kwasach tłuszczowych w diecie i konsumentach może przypisać powiązania binarne i oszacować związany z tym przepływ węgla, a także zostało zastosowane w lądowych, słodkowodnych i morskich sieciach pokarmowych10,11,12,13. Podstawowym założeniem jest to, że kwasy tłuszczowe kierowane w diecie nie podlegają procesom enzymatycznym; w związku z tym ich sygnał 13C, tj. stosunek 13C do 12C kwasu tłuszczowego u konsumenta jest podobny do tego w diecie1. Jednak w systemach wodnych odnotowano stopniowe zubożenie sygnatury 13C w górę łańcucha pokarmowego, co utrudnia szerokie zastosowanie FA-SIP w badaniach troficznych14,15,16. Co więcej, wiedza na temat metabolizmu lipidów u większości bezkręgowców w lądowych sieciach pokarmowych jest nadal ograniczona.
Zrozumienie szlaków metabolizmu lipidów u konsumentów jest niezbędne do wykorzystania markerów troficznych kwasów tłuszczowych jako środków do określenia ilościowego przepływu węgla w ekologii sieci pokarmowej. Mając to na uwadze, obiecującą metodą jest profilowanie izotopologii 13C, które w zasadzie może być stosowane do badania metabolizmu węgla w dowolnym systemie biologicznym17. Po wprowadzeniu substratu węglowego znakowanego 13C, rozkład 13C w sieci metabolicznej jest możliwy do prześledzenia, ponieważ produkty przemiany materii wytwarzane u konsumenta wykazują specyficzny rozkład izotopologów. Można to ocenić za pomocą ilościowej spektroskopii rezonansu metabolizmu jądrowego18,19 lub spektrometrii mas20,21, przy czym ta ostatnia jest preferowana w próbkach biologicznych o niskiej biomasie ze względu na wyższą czułość.
Chociaż profilowanie izotopologiczne zostało z powodzeniem zastosowane do aminokwasów i dostarczyło wglądu w metabolizm węgla in vivo patogenów bakteryjnych17,22,23, jego implementacja w kwasach tłuszczowych pozostaje w tyle. Pierwszą szczegółową analizę losu stabilnego izotopu znakowanego prekursorem kwasu tłuszczowego, jego trasowania w diecie lub degradacji poprzez β-utlenianie u konsumentów bezkręgowców glebowych przeprowadzili niedawno Menzel i wsp.24. Tutaj przedstawiono podstawy metodologiczne eksperymentów z inkorporacją z kwasami tłuszczowymi znakowanymi 13C, a następnie analizę izotopologiczną kluczowych potomków częstych bezkręgowców glebowych, Collembola. Te mikrostawonogi są dobrą grupą modelową, ponieważ stanowią ważne składniki sieci pokarmowej gleby i są dobrze zbadane pod kątem ich markerów troficznych kwasów tłuszczowych8,25.
Zrozumienie szlaków metabolizmu lipidów u konsumentów jest niezbędne do wykorzystania markerów troficznych kwasów tłuszczowych jako środków do określenia ilościowego przepływu węgla w ekologii sieci pokarmowej. Niniejszy protokół zawiera projekt i konfigurację laboratoryjnego eksperymentu żywieniowego oraz procedury biochemiczne ekstrakcji i metylacji dominujących frakcji lipidów (obojętnych lipidów, fosfolipidów) z Collembola. Pokazano, w jaki sposób skład izotopologiczny kwasów tłuszczowych jest analizowany za pomocą spektrometrii mas oraz opisano powiązany wzór i obliczenia. Procedura ta powoduje: (i) stosunek izotopologiów przekraczających masę jonu macierzystego (tj. jonu cząsteczkowego kwasu tłuszczowego M+) o jedną lub więcej jednostek masowych (M+1, M+2, M+3 itd.) oraz (ii) całkowite wzbogacenie 13C w kwasy tłuszczowe pochodzące z prekursora znakowanego 13C. Chociaż podejście to jest stosowane w przypadku Collembola, można je ogólnie zastosować do każdej innej interakcji drapieżnik-ofiara, zakładając, że są one zdolne do hodowli w wystarczającej ilości w kontrolowanych warunkach, aby zapewnić pomyślne przyjęcie etykiety i późniejszą weryfikację.

<table><tbody><tr><td>neoLab-Słoiki okrągłe</td><td>neoLab</td><td>2-1506</td><td>69 x 40 mm, 10 op./opakowanie</td></tr><tr><td>Aktywowany węglem drzewnym</td><td>Carl Roth</td><td>X865.1</td><td>p.a., proszek, nr CAS 7440-44-0</td></tr><tr><td>Alabaster Dental</td><td>R&Ouml; HRICH-GIPSE</td><td></td><td>---http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Carl Roth</td><td>7331.1</td><td>HPLC &ge; 99,9 %</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>P717.1</td><td>HPLC &ge; 99,9 %</td></tr><tr><td>Hexan</td><td>Carl Roth</td><td>7339.1</td><td>HPLC &ge; 98 %</td></tr><tr><td>tert-butylowy eter metylowy (MTBE)</td><td>Carl Roth</td><td>T175.1</td><td>HPLC &ge; 99,5 % </td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Carl Roth</td><td>7328.2</td><td>HPLC &ge; 99,9 %</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Carl Roth</td><td>6771.1</td><td>rocznie &ge; 99 %, w granulkach</td></tr><tr><td>di-Natriumhydrogenphosphat</td><td>Carl Roth</td><td>P030.1</td><td>p.a. &ge; 99 % , bezwodny</td></tr><tr><td>dihydrat fosforanu Na-dihydrogenu</td><td>Carl Roth</td><td>T879.1</td><td>rocznie &ge; 99 %</td></tr><tr><td>Kwas podchlorowy (6 N)</td><td>VWR International</td><td>26,115,000</td><td>AVS TITRINORM vol. roztwór</td></tr><tr><td>Bond Elut (kolumny)</td><td>Agilent Tech.</td><td>14102037</td><td>HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK</td></tr><tr><td>Pr&auml; paratengl&auml; ser Duran</td><td>Glasger&auml; tebau Ochs</td><td>135215</td><td>&Oslash; 16 x 100 mm, z nakrętką z radełkowanym radełkowaniem i zintegrowaną uszczelką PTFE/silikonową</td></tr><tr><td>Supelco 37 Składnik FAME Mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47885-U Supelco</td><td>10&nbsp; mg/ml w chlorku metylenu, wzorzec analityczny</td></tr><tr><td>FlowMesh</td><td>Carl Roth</td><td>2796.1</td><td>Siatka polipropylenowa o grubości około 0,3 mm, z odstępem między pasmami 1 mm</td></tr><tr><td>Mieszanka estrów metylowych kwasów bakteryjnych (BAME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47080-U Supelco</td><td>10&nbsp; mg/ml w kapronianu metylu, wzorzec analityczny</td></tr><tr><td>Nonadekanian metylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74208</td><td>wzorzec analityczny &ge; 98,0 %</td></tr><tr><td>Kwas heksadekanowy-1-13C (palmitynowy)</td><td>Larodan Chemikalia wysokowartościowe</td><td>78-1600</td><td>GC &ge; 98,0 % (13C: 99,0 %)</td></tr><tr><td>RVC 2-25 CDplus</td><td>Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen</td><td></td><td>Kompaktowy koncentrator</td></tr> <tr><td>midiAlpha 2-4 LDplus</td><td>Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen</td><td></td><td>Kolektor suszący</td></tr><tr><td>MZ 2C NT</td><td>Vacuubrand GMBH</td><td></td><td>Pompa próżniowa</td></tr><tr><td>Roto-Shake Genie</td><td>Scientific Industries</td><td></td><td>Połączone urządzenie kołyszące i obrotowe</td></tr><tr><td>XP64 Mikrokomparator</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Super precyzyjna waga</td></tr><tr><td>GC-System 7890A</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>Chromatograf gazowy</td></tr><tr><td>7000 GC/MS Triple Quad</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>Potrójny spektrometr masowy Quad</td></tr><tr><td>Wtryskiwacz serii 7683B</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>Nastrzykuje próbki</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3SR+Thermo</td> <td>Scientific</td><td></td><td>Wirówka z rotorem probówki 10 ml</td></tr></tbody></table>

profilowanie izotopologu kwasów tłuszczowych 13c zapewnia wgląd w troficzny transfer węgla i metabolizm lipidów u konsumentów bezkręgowców

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Kwasy tłuszczowe (FA) są użytecznymi biomarkerami w ekologii sieci pokarmowej, ponieważ są zazwyczaj asymilowane jako kompletna cząsteczka i przenoszone do tkanek konsumenckich z niewielkimi lub żadnymi modyfikacjami, co pozwala na dietetyczne przekierowywanie między różnymi poziomami troficznymi. Jednak podejście oparte na markerach troficznych FA jest nadal utrudnione ze względu na ograniczoną wiedzę na temat metabolizmu lipidów w faunie glebowej. W badaniu tym wykorzystano całkowicie znakowany kwas palmitynowy (13C16:0, 99 atomów%) jako znacznik w szlakach metabolizmu kwasów tłuszczowych dwóch szeroko rozpowszechnionych glebowych Collembola, Protaphorura fimata i Heteromurus nitidus. W celu zbadania losów i modyfikacji metabolicznych tego prekursora przedstawiono metodę profilowania izotopologicznego, realizowaną za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem monitorowania pojedynczych jonów. Ponadto opisano eksperyment żywienia laboratoryjnego na wcześniejszym etapie, jak również ekstrakcję i metylację dominujących frakcji lipidowych (lipidy obojętne, fosfolipidy) oraz związany z tym wzór i obliczenia. Profilowanie izotopologiczne nie tylko pozwala na ogólne wzbogacenie 13C w kwasy tłuszczowe pochodzące z prekursora znakowanego 13C, ale także wytwarza wzór izotopologów przekraczających masę jonu macierzystego (tj. jonu cząsteczkowego FA M+) każdego znakowanego FA o jedną lub więcej jednostek masowych (M+1, M+2, M+3, itp.). Wiedza ta pozwala na wyciągnięcie wniosków na temat stosunku trasowania w diecie całkowicie zużytego FA w porównaniu z biosyntezą de novo. Profilowanie izotopologiczne sugeruje się jako użyteczne narzędzie do oceny metabolizmu kwasów tłuszczowych u zwierząt glebowych w celu rozwikłania interakcji troficznych.

Masa świeża i zawartość lipidów Collembola 
W przebiegu opisanego eksperymentu zawartość NLFAs i PLFAs nie uległa znaczącej zmianie w czasie, natomiast masa świeża osobników wzrosła nieznacznie, lecz nieistotnie statystycznie24. Oba parametry wskazują na dobry poziom kondycji fizycznej osobników Collembola. Należy pamiętać o badaniu masy świeżej i zawartości lipidów Collembola w trakcie całego eksperymentu, zgodnie z dniami pobierania próbek do ...

Podejście markerów troficznych kwasów tłuszczowych, tj. asymilacja kwasów tłuszczowych jako całej cząsteczki i transfer do tkanki konsumenckiej bez lub z niewielkimi modyfikacjami, jest utrudnione przez luki w wiedzy na temat metabolizmu kwasów tłuszczowych u małych bezkręgowców glebowych. Profilowanie izotopologiczne jest cennym narzędziem do rozplątywania oddziaływań troficznych.

Profilowanie izotopologu kwasów tłuszczowych 13C zapewnia wgląd w troficzny transfer węgla i metabolizm lipidów u konsumentów bezkręgowców

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Ogólnym celem tego profilowania izotopologicznego jest śledzenie troficznego transferu kwasów tłuszczowych w diecie u bezkręgowców, w tym ich przetwarzania i metabolizmu lipidów, takiego jak wydłużanie łańcuchów lub utlenianie beta. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w ekologii sieci żywnościowej, takie jak to, kto kogo je, pytanie, na które nie jest łatwo odpowiedzieć w tajemniczym ekosystemie, takim jak gleba. Technikę zademonstruje Dilara Simsek, mistrzyni z laboratorium profesor Liliane Ruess.Aby przygotować plastikowe mikrokosmosy z ciasno przylegającymi pokrywkami, w gipsowym garnku wymieszaj dziewięć części gipsu paryskiego i jedną część suchego węgla aktywnego. Dodaj 10 części wody destylowanej i pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej bez mieszania przez pięć minut. Użyj łyżki laboratoryjnej, aby wymieszać mieszaninę w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara z umiarkowaną prędkością, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, aż do uzyskania gęstej, zupowej konsystencji.Następnie wlej mieszaninę do mikrokosmosów na wysokość około jednego centymetra. Wygładź tynk, delikatnie stukając w ławkę i obracając. Należy pamiętać, że po pęcherzykach powietrza i bruzdach, dodane sterylną szpatułką, mogą zachęcić płodne Collembola do złożenia tam jaj.Jednak w tym badaniu uniknięto i bruzd na rzecz tych samych powtarzalnych warunków. Po pozostawieniu mikrokosmosów do wyschnięcia, a następnie zwilżeniu ich, użyj rurki ssącej wyposażonej w mały kawałek siatki, aby przenieść 30 świeżo wyklutych Collembola na gipsową podstawę mikrokosmosów. Dostarczaj jako pokarm granulowane suche drożdże piekarskie o wartości około końcówki noża i odnawiaj je co najmniej dwa razy w tygodniu.Zaplanuj trzy niezależne powtórzenia prób w każdym dniu pobierania próbek. W tym badaniu badano próbki od dnia od zera do siódmego i 14. Inkubuj mikrokosmosy w ciemności w temperaturze 15 stopni Celsjusza i utrzymuj stałą temperaturę, ponieważ kwasy tłuszczowe są zmieniane przez metabolizm zwierząt, aby spełnić wymagania dotyczące płynności błony.Aby zebrać zwierzęta, bezpośrednio po zważeniu zgodnie z protokołem tekstowym, ostrożnie przenieś zwierzęta z szalek wagowych do 10-mililitrowych szklanych probówek. Użyj jednego mililitra metanolu klasy HPLC do napełnienia probówek i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu analizy. Po przygotowaniu trzech szklanych probówek dla każdej partii próbek i zmniejszeniu ilości metanolu nałożonego na próbki do przechowywania, dodaj pięć mililitrów jednofazowego rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do każdej próbki, w tym ślepych próbek, i wyekstrahuj lipidy Collembolan w temperaturze pokojowej, wstrząsając z prędkością 200 obr./min przez noc.Po ekstrakcji próbek zgodnie z protokołem tekstowym, w celu przeprowadzenia analizy wzorca kwasów tłuszczowych, należy przygotować kolumnę kwasu krzemionkowego dla każdej próbki, dodając dwa mililitry chloroformu do każdej kolumny. Po przejściu chloroformu przez kolumny, należy użyć szklanej pipety Pasteura, aby usunąć dolną fazę chloroformu z próbek. Następnie przenieś go do pojedynczej kolumny.Użyj pięciu mililitrów chloroformu, aby wymyć obojętne lipidy lub NLFA we frakcjach do pojedynczych szklanych naczyń. Następnie użyj 10 mililitrów acetonu do elucji glikolipidów i pięciu mililitrów metanolu do elucji fosfolipidowych kwasów tłuszczowych lub PLFA. Po ekstrakcji przenieść otwarte probówki NLFA i PLFA do rotacyjnego koncentratora próżniowego lub RVC i odparować próbki w temperaturze 60 stopni Celsjusza w próżni 24 hPa przez około 90 minut lub do wyschnięcia.Po wyizolowaniu i umyciu estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieść górną fazę zawierającą lipidy do szklanej fiolki z próbką chromatograficzną wyposażonej w przegrodę teflonową. Kapsułkować fiolkę i przechowywać ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu analizy. Aby zidentyfikować FAME w próbkach NFLA i PLFA, na GC-FID należy skonfigurować sekwencję z odpowiednim oprogramowaniem urządzenia zgodnie z instrukcjami producenta.Rozpocznij sekwencję od zewnętrznych mieszanin wzorcowych, a następnie próbek. Z każdym przebiegiem występuje niewielkie opóźnienie w czasie elucji kwasów tłuszczowych z kolumny GC. Albo należy włączyć wzorzec co 10 przebieg do sekwencji próbki, albo zastosować blokadę czasu retencji dla kwasu palmitynowego.Ustaw program i oblicz nmol kwasu tłuszczowego zgodnie z protokołem tekstowym. Aby przeprowadzić analizę węgla-13 za pomocą profilowania izotopologicznego, należy użyć polarnej kolumny kapilarnej, ponieważ dodatkowo umożliwia ona separację nienasyconych kwasów tłuszczowych, nawet przy tej samej liczbie wiązań podwójnych. Wybór kolumny GC ma kluczowe znaczenie dla wyników, ponieważ decyduje o dobrej reprezentacji jonu cząsteczkowego w kwasach tłuszczowych.W przypadku kolumny DB-23 uruchom temperaturę piekarnika na 130 stopni Celsjusza i zwiększ ją o 6,5 stopnia Celsjusza na minutę do 170 stopni Celsjusza. Następnie zwiększaj temperaturę o trzy stopnie Celsjusza na minutę do 203 stopni Celsjusza i przytrzymaj przez 1,9 minuty. Następnie zwiększ temperaturę o 40 stopni Celsjusza na minutę do 230 stopni Celsjusza i przytrzymaj przez 8,3 minuty.Ustaw temperaturę linii przesyłowej na 280 stopni Celsjusza. Po zakończeniu konfiguracji programu zgodnie z protokołem tekstowym, określ włączenie węgla-13 do jonu molekularnego kwasów tłuszczowych, najpierw uruchamiając wstępne skanowanie, aby zobaczyć, co jest obecne. Następnie uruchom monitorowanie wybranych jonów lub SIM na odpowiednich jonach i uzyskaj dane o interesujących masach cząsteczkowych, wybierając okna skanowania m/z lub grupy SIM, obejmujące chromatograficzny czas piku odpowiedniego kwasu tłuszczowego.Zazwyczaj monitoruje się od dwóch do czterech jonów na analit i okno czasowe. Do rozwoju masy używamy całkowitej liczby jonów z zewnętrznymi wzorcami kwasów tłuszczowych. Na podstawie czasu retencji i jonów fragmentacyjnych wybierane są segmenty czasowe.Wykryj jon molekularny, M plus, odpowiedniego kwasu tłuszczowego i wszystkich jego izotopologów, M plus jeden, M plus dwa i tak dalej. Przypisz troficzny strumień węgla, pozycję włączenia węgla-13 i oblicz wzbogacenie węgla-13 zgodnie z protokołem tekstowym. Ten rysunek przedstawia widmo SIM-MS czystego kwasu palmitynowego od 16 do zera.Naturalna obfitość węgla-13 w tym związku staje się wykrywalna przez obecność M plus jeden i M plus dwóch izotopologów oprócz jonu molekularnego M plus. Dla porównania, ten spektrogram reprezentuje cały znakowany kwas palmitynowy. W tym przypadku samo wystąpienie jonu M plus 16 odzwierciedla wysoką czystość syntetycznie znakowanego związku.Poniższe skany SIM pochodzą z czterech dominujących kwasów tłuszczowych we frakcji PLFA Heteromurus nitidus w pierwszym dniu pobierania próbek po znakowaniu. Asymilacja znakowanej cząsteczki markerowej do kwasu palmitynowego staje się widoczna dzięki obfitości izotopologu M plus 16, ponieważ reprezentuje on cały znakowany kwas tłuszczowy. Ponadto można przypisać desaturację od 16 do zera lub wydłużenie plus desaturację.W ten sposób detekcja izotopologów większych niż M plus 16, na przykład M plus 17 i M plus 18, wykazuje wydłużenie łańcucha znakowanego prekursora 16 do zera przy użyciu fragmentów C2-13. Przedstawione tutaj są względne porcje jonów M plus jeden do M plus trzy i M plus 16 do M plus 20 z pięciu najsilniej znakowanych NLFA i PLFA z Protaphorura fimata, oszacowane w dniu zero i dniu pierwszym. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że konsumenci naturalnie zawierają pewne izotopy C.Ilość ta musi być określona w doświadczeniach kontrolnych bez diety oznaczonej. Ten naturalny sygnał C wysyłany jest odejmowany jako tło od szablonów etykiet. Nie zapominaj, że praca z rozpuszczalnikiem może być bardzo niebezpieczna i należy podjąć środki ostrożności.

fatty-acid-13c-isotopologue-profiling-provides-insight-into-trophic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano profilowanie stabilnych izotopów za pomocą analizy chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas w celu badania przepływu metabolitów pośrednich u nicienia Caenorhabditis elegans. Szczegółowo przedstawiono metody oceny wzbogacenia izotopowego w dwutlenku węgla, kwasach organicznych i aminokwasach po ekspozycji na izotopy, zarówno podczas rozwoju na płytkach agarowych, jak i w okresie dorosłości w hodowli ciekłej.

Stabilne profilowanie izotopowe strumieni metabolicznych produktów pośrednich u Caenorhabditis elegans w stadium rozwojowym i dorosłym

Ten protokół pokaże ekstrakcję i analizę wolnych i estryfikowanych bioaktywnych kwasów tłuszczowych z komórek. Kwasy tłuszczowe są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą rozcieńczania stabilnych izotopów, chiralnej chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, atmosferycznej jonizacji chemicznej, wielokrotnego monitorowania spektrometrii mas (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

Prezentujemy solidne metody biochemiczne i mikroskopowe do badania zapasów lipidów Caenorhabditis elegans. Szybka, prosta procedura barwienia utrwalającego do fluorescencyjnego obrazowania kropelek lipidów wykorzystuje właściwości spektralne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej. Następnie przedstawiono pomiar biochemiczny triglicerydów i fosfolipidów z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Biochemiczna i wysokoprzepustowa ocena mikroskopowa masy tłuszczowej w Caenorhabditis elegans

Powłoka ssaków zawiera lipidy ekstrahowane rozpuszczalnikiem, które mogą dostarczyć składu chemicznego charakterystycznego dla poszczególnych gatunków.  W pracy przedstawiono rutynową metodę rozdzielania szerokich klas lipidów izolowanych z tkanek powłokowych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej i oznaczania profilu triacyloglicerydów za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą.

Profilowanie zawartości triacyloglicerydów w lipidach powłokowych nietoperzy za pomocą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej i spektrometrii mas MALDI-TOF

Fosfolipidowe kwasy tłuszczowe dostarczają informacji o strukturze zbiorowisk mikroorganizmów glebowych. Przedstawiono metody ekstrakcji z próbek glebowych za pomocą jednofazowej mieszaniny chloroformu, frakcjonowania wyekstrahowanych lipidów za pomocą kolumn ekstrakcyjnych do fazy stałej oraz metalizy do produkcji estrów metylowych kwasów tłuszczowych, które są analizowane za pomocą kapilarnej chromatografii gazowej.

Ekstrakcja i analiza mikrobiologicznych fosfolipidowych kwasów tłuszczowych w glebie

Danio pręgowany staje się cennym modelem przetwarzania lipidów w diecie i chorób metabolicznych. Opisano protokoły żywienia larw bogatych w lipidy, obrazowanie na żywo fluorescencyjnych analogów lipidów w diecie oraz ilościowe oznaczanie spożycia pokarmu. Techniki te można zastosować do różnych technik badań przesiewowych, obrazowania i dociekań opartych na hipotezach.

Paradygmat żywienia wysokotłuszczowego dla larw danio pręgowanego: karmienie, obrazowanie na żywo i kwantyfikacja spożycia pokarmu

Artykuł opisuje metodę, która zwiększa przepustowość, jednocześnie równoważąc wysiłek i dokładność ekstrakcji lipidów z błon komórkowych mikroorganizmów do wykorzystania w charakterystyce zarówno lipidów całkowitych, jak i względnej obfitości lipidów wskaźnikowych w celu określenia struktury społeczności mikroorganizmów glebowych w badaniach z wieloma próbkami.

Metoda ekstrakcji i analizy lipidów do charakteryzowania mikroorganizmów glebowych w eksperymentach z wieloma próbkami

Tutaj spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) o wysokiej rozdzielczości 1H i 13C została użyta jako szybkie i niezawodne narzędzie do ilościowej i jakościowej analizy kapsułkowanych suplementów oleju rybnego.

Spektroskopia NMR jako solidne narzędzie do szybkiej oceny profilu lipidowego suplementów oleju rybnego

Ten protokół służy do oznaczania lipidów w wodzie morskiej i próbkach biologicznych. Lipidy w filtratach ekstrahuje się chloroformem lub mieszaninami chloroformu i metanolu w przypadku ciał stałych. Klasy lipidów mierzy się za pomocą pręcikowej chromatografii cienkowarstwowej z detekcją płomieniowo-jonizacyjną, a ich suma daje całkowitą zawartość lipidów.

Oznaczanie całkowitej zawartości lipidów i klas lipidów w próbkach morskich

Tutaj prezentujemy tanią metodę ilościową wykorzystującą spektrometrię mas z tlenkiem deuteru i chromatografią gazową (GCMS) do analizy całkowitej lipogenezy de novo kwasów tłuszczowych w brunatnej tkance tłuszczowej in vivo.

Ilościowe oznaczanie syntezy kwasów tłuszczowych de novo w brunatnej tkance tłuszczowej przy użyciu tlenku deuteru

Przedstawiona tutaj jest metoda badania struktur lipidowych poprzez znakowanie stabilnych izotopów przy użyciu czasu ich retencji, mobilności i fragmentacji.

Śledzenie lipidów de novo przy użyciu znakowania stabilnych izotopów LC-TIMS-TOF MS/MS

Odkryj profilowanie izotopologu kwasów tłuszczowych 13C do badania troficznego transferu węgla i metabolizmu lipidów u bezkręgowców glebowych. Ta metoda pozwala śledzić przepływ pokarmowy w skrytych ekosystemach.

Profilowanie izotopologu kwasów tłuszczowych 13C zapewnia wgląd w troficzny transfer węgla i metabolizm lipidów u konsumentów bezkręgowców (Wideo) | JoVE Journal

Profilowanie izotopologu kwasów tłuszczowych ¹³C zapewnia wgląd w troficzny transfer węgla i metabolizm lipidów u konsumentów bezkręgowców

Przeglądaj więcej filmów