Test kopania/tunelowania w celu wykrycia niedotlenienia u larw Drosophila melanogaster

Ogólnym celem tego testu jest identyfikacja larw drosophila cierpiących na niedotlenienie tkanek, mimo że znajdują się w normalnym poziomie tlenu. U drosophila występuje wiele mutacji, które powodują powolny, słaby wzrost larw i ospałość niektórych larw. Test ten identyfikuje w tej klasie larw te, które cierpią na niedotlenienie tkanek.

Ostatecznie test ten pomoże zidentyfikować więcej mutacji, które powodują niedobór tlenu w tkankach poprzez różne procesy fizjologiczne. Pomysł na ten test zrodził się z obserwacji, że larwy z uszkodzonymi drogami oddechowymi lub tchawicą wykazywały dwa dziwne zachowania. Te nienormalne zachowania to niemożność zakopania się w pożywieniu we wczesnym okresie życia larwy i niemożność zagłębienia się w bardziej miękkie podłoże podczas fazy wędrówki.

Ustawić kontrolne i eksperymentalne krzyżówki genetyczne w naczyniach do składania jaj zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Trzymaj muchy w ciemności przez co najmniej dwa dni przed rozpoczęciem zbierania jaj o określonej porę. W celu zbierania jaj na czas przenieś dorosłe osobniki na nowe talerze z agarem winogronowym ozdobione świeżym rozmazem pasty drożdżowej wcześnie rano i pozwól dorosłym osobnikom złożyć jaja na talerzach przez cztery godziny.

Po czterech godzinach przenieś dorosłe osobniki na świeże talerze z agarem winogronowym. Następnie inkubuj czterogodzinne płytki zbiorcze przez noc w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Do następnego popołudnia większość larw zdąży się wykluć.

Zaplanuj, aby mieć co najmniej 50 osób w każdej grupie eksperymentalnej. Dla pojedynczej serii testu należy przygotować co najmniej pięć płytek testowych na grupę doświadczalną. Dodaj 16 gramów agaru muchowego i 700 mililitrów wody dejonizowanej przez ogrzewanie.

Przygotuj 17,5 mililitra Nipagen w 95% etanolu. Podgrzej roztwór agaru, aż prawie całkowicie się rozpuści. Następnie dodaj roztwór Nipagen do roztworu agaru i podgrzewaj, aż agar całkowicie się rozpuści.

Krótko ostudzić roztwór agaru, a następnie załadować 10-centymetrowe płytki 15 mililitrami roztworu agaru. Gdy agar się zżeluje, nałóż pokrywki na płytki i pozostaw je do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na kilka godzin lub na noc. Utwardzony agar musi być twardy w dotyku i odporny na kruszenie się po wycięciu z niego kawałków.

Gdy agar utwardzi się, użyj 1,5-centymetrowej tablicy korkowej, aby zrobić centralny otwór w żelu agarowym w każdej płytce. Następnie starannie wypełnij otwory świeżą pastą drożdżową. Aby przenieść larwy na płytkę testową, wykonaj proste narzędzie.

Zegnij krzywą w końcówce plastikowej mikroszpatułki i zanurz końcówkę w paście drożdżowej, aby przykleiła się do larw. Teraz podnieś pojedynczo pierwsze larwy w stadium rozwojowym i umieść je na talerzu agarowym w pobliżu kopca żywności. Dla każdej grupy doświadczalnej przygotuj co najmniej pięć płytek, każda z 10 larwami.

Aby zapewnić odtwarzalność między powtórzeniami testów, niezwykle ważne jest, aby na każdej płytce testowej umieścić tylko 10 larw. Pamiętaj, aby dokładnie sprawdzić tabliczkę testową, aby ustalić, że jedna i tylko jedna larwa jest przenoszona za każdym razem, gdy dostarczasz larwę za pomocą końcówki mikroszpatułki. Po załadowaniu talerza oznacz go, przykryj, a następnie umieść w ciemności pokrywką do góry w temperaturze pokojowej.

Sprawdzaj każdą płytkę codziennie, aż wszystkie larwy obumrą lub przepoczwarzą się. Poniżej znajdują się przykłady płytek dla szczepu typu dzikiego dla drugiego do ósmego dnia testu. Drugiego dnia larwy są zakopywane w pożywieniu i nie dochodzi do tunelowania.

Drążenie tuneli rozpoczyna się trzeciego dnia i osiąga maksimum między piątym a ósmym dniem, gdy larwy przestają wędrować i przepoczwarzają się w swoich tunelach. Ostrożnie przenieś poczwarki za pomocą wygiętej igły do drażnienia na talerz winogronowy i, jeśli chcesz, policz, ile poczwarek zawiera. Zwróć uwagę na tworzenie się poczwarek i oceń je pod kątem nieprawidłowości.

Aby zobrazować tunele w płytce testowej, najpierw ostrożnie usuń i wyrzuć cały pokarm drożdżowy z centralnej studzienki każdej płytki. Następnie delikatnie zalej każdą płytkę wodą z kranu i za pomocą miękkiego pędzla ostrożnie zetrzyj wszelkie zanieczyszczenia, które zostały wytarte na powierzchni agaru. Niektóre kawałki agaru mogą się kruszyć w miejscach, w których tunelowanie jest najbardziej intensywne.

Można to później poprawić. Kontynuuj kilkakrotną wymianę wody i delikatnie zetrzyj zanieczyszczenia, aż płyta będzie całkowicie czysta. Następnie należy ponownie spłukać płytkę wodą dejonizowaną, przykryć i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na noc.

Ważne jest, aby używać delikatnego strumienia wody i delikatnych pociągnięć pędzlem do czyszczenia płytek agarowych, aby nie odłamać ani nie uszkodzić części żelu agarowego. Następnego dnia przygotuj obraz płyty w formacie tiff, używając czarnego tła, aby pokazać tunele jako jasne białe linie. Na tym etapie dobrze sprawdzają się systemy dokumentacji żelowej.

Następnie określ ilościowo tunelowanie na obrazie za pomocą obrazu J za pomocą narzędzia Owal, zdefiniuj żel agarowy aż do plastikowej krawędzi płytki Petriego, ale nie włączając jej. Następnie zastosuj automatyczny próg, aby uzyskać odwrócony obraz płyty, tak aby tunele wyglądały jak czarne linie. Aby skorygować ciemne obszary, które nie zawierają tuneli, użyj narzędzi Próbnik kolorów i Pędzel w celu wybielenia tych obszarów.

Następnie w menu rozwijanym Analizuj wybierz opcję Ustaw skalę i kliknij, aby usunąć skalę. Następnie przejdź do okna Ustaw pomiary w obszarze Analizuj i zaznacz opcję Obszar oraz Ogranicz do progu. Teraz naciśnij Control z M, aby uzyskać pomiar czarnego obszaru na obrazie w jednostce pikseli, która reprezentuje tunelowany obszar.

Aby określić ilościowo tunelowanie utracone w wyniku erozji agaru wokół środkowego otworu, usuń zaznaczenie opcji Ogranicz do progu. Użyj narzędzia Różdżka, aby zdefiniować środkowy otwór i naciśnij Control plus M, aby zmierzyć jego wartość w pikselach. Odejmij od tej wartości wartość piksela otworu o średnicy 1,5 centymetra.

Dodaj różnicę do uzyskanej wcześniej wartości pikseli, aby uzyskać całkowitą wartość pikseli tunelowania. W przypadku płytek, w których brakujący agar wykracza poza centralny pierścień tunelowania, konieczny jest dodatkowy krok, aby zapobiec obejmowaniu przez oznaczanie ilościowe obszarów poza obszarem centralnym. Użyj narzędzi Próbnik kolorów i Pędzel, aby dodać pasek, jak pokazano, aby ograniczyć obszar określony ilościowo.

Opisany test wykorzystano do zbadania potencjalnego niedotlenienia u larw z upośledzoną funkcją genu nienadmuchiwanego w tchawicy. Gen został stłumiony RNAi przez Gal4 UAS. Użyto dwóch linii Gal4.

Bezdech Gal4, który wyraża się poprzez cały rozwój w całym systemie tchawicy. Lub cięty Gal4, który ulega silnej ekspresji w małym fragmencie tchawicy podczas życia larw. Larwy kontrolne zawierały jedną z linii Gal4, ale nie zawierały nienadmuchiwanego RNAi.

Larwy z odciętym Gal4 napędzającym nienadmuchiwane RNAi były nie do odróżnienia od kontrolnych przez cały okres rozwoju, zarówno pod względem wzrostu, jak i zachowania. Jednak silne tłumienie nienadmuchiwanego RNAi w tchawicy za pomocą blt-Gal4 spowodowało niepowodzenie w zakopaniu się w fazie żerowania i spowodowało wysoką śmiertelność. Larwy te wykazywały również całkowity brak drążenia tuneli podczas fazy wędrówki.

Co więcej, eksperymentalne larwy Gal4 były mniejsze, cieńsze i bardziej ociężałe niż kontrolne i pozostały larwami długo po przepoczwarzeniu się wszystkich innych grup. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak testować larwy Drosophila pod kątem niedotlenienia tkanek, monitorując stopień, w jakim zakopują się w swoich kopcach pokarmowych lub drążą tunele w miękkim podłożu. Całkowity brak tunelowania jest silnym wskaźnikiem niedotlenienia tkanek.