Ocena in vivo przerwania bariery krew-mózg w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie wysoce powtarzalnej techniki oceny in vivo naruszenia bariery krew-mózg w szczurzych modelach udaru niedokrwiennego.

Ogólnym celem tej procedury jest przedstawienie wysoce powtarzalnej metody oceny in vivo zaburzenia bariery krew-mózg w reakcyjnym modelu udaru niedokrwiennego. Osiąga się to poprzez indukcję udaru niedokrwiennego za pomocą włókna śródświetlnego do niedrożności tętnicy środkowej mózgu po lewej stronie mózgu. Kolejnym etapem zabiegu jest kaniulacja zewnętrznej gałęzi żyły szyjnej i wstrzyknięcie barwnika Evans Blue na zakończenie niedrożności tętnicy środkowej mózgu i początek okresu reperfuzji.

Dwadzieścia cztery godziny później, w głębokiej narkozy, układ krążenia zwierzęcia zostaje wypłukany z Evans Blue i mózg zostaje usunięty. Następnie dwie półkule mózgowe są rozdzielane, homogenizowane i odwirowywane, a ostatecznie supernatanty tkanek są używane do pomiaru stężenia niebieskiego Evansa za pomocą spektrofotometru. Znieczulenie i przepływometria.

Wywołać znieczulenie za pomocą 4%izofluranu i utrzymywać je za pomocą izofluranu 1-1,5% w mieszaninie 70% podtlenku azotu i 13% tlenu przez cały czas trwania zabiegu. Umieść znieczulone zwierzę w pozycji leżącej na kocu grzewczym ze sprzężeniem zwrotnym i utrzymuj temperaturę ciała w normalnym zakresie fizjologicznym za pomocą sondy doodbytniczej podłączonej do tego urządzenia grzewczego. Ogolić obszar chirurgiczny po lewej stronie czaszki i nałóż roztwór Betadine za pomocą gaziku, aby zdezynfekować skórę.

Zastąp sterylną podkładką zawierającą 70% etanolu i powtórz oba kroki w trzech cyklach. Wykonaj jednocentymetrowe nacięcie skóry na czaszce, rozciągające się od bocznej kantu lewego oka do podstawy lewego ucha i wypreparuj lewy mięsień skroniowy, aby odsłonić czaszkę. Następnie wytnij mały otwór na pięć milimetrów bocznych i jeden milimetr za bregmą, aby ułatwić umieszczenie końcówki sondy ołówkowej przepływomierza dopplerowskiego.

Obróć szczura z pozycji leżącej na leżąco, a następnie umieść laserową sondę ołówkową w wcześniej wywierconym otworze czaszki, aby monitorować regionalny przepływ krwi w mózgu. Zapisz wyjściowy regionalny przepływ krwi w mózgu każdego zwierzęcia i potraktuj go jako 100% indukcję ogniskowego niedokrwienia mózgu. Ogol okolice szyi i zdezynfekuj skórę roztworem Betadine i 70% etanolem.

Wstrzyknąć 0,2 mililitra 0,5% bupiwakainy podskórnie w miejsce operacji w celu znieczulenia. Wykonaj dwucentymetrowe nacięcie chirurgiczne na brzusznej powierzchni szyi, aby uzyskać dostęp do lewej tętnicy szyjnej wspólnej. Odizoluj wspólną tętnicę szyjną od sąsiedniej powięzi i nerwu błędnego, aby uzyskać dostęp do rozwidlenia tętnicy szyjnej zewnętrznej i tętnicy szyjnej wewnętrznej.

Podwiązać na stałe lewą tętnicę szyjną wspólną lub tętnicę szyjną zewnętrzną za pomocą szwu workowego 5-0 i rozciąć tętnicę szyjną wewnętrzną do poziomu tętnicy skrzydłowo-podniebiennej. Luźno umieść szew workowy 5-0 wokół tętnicy szyjnej wspólnej, a następnie tymczasowo zaciśnij tętnicę szyjną wewnętrzną za pomocą mikroklipsa naczyniowego. Wykonaj małe nacięcie na tętnicy szyjnej wspólnej przed wcześniej założonym luźnym opaskiem, a następnie włóż nylonowy szew 4-0 pokryty silikonem do przestrzeni świetlnej tętnicy szyjnej wewnętrznej i zaciśnij szew wokół tętnicy szyjnej wspólnej, aby zabezpieczyć szew nylonowy i zapobiec wyciekowi krwi.

Usuń mikroklips naczyniowy z tętnicy szyjnej wewnętrznej. Następnie przesuwaj pokryte silikonem włókno śródświetlne, aż zaobserwujesz wyraźny spadek regionalnego przepływu krwi w mózgu, który wskazuje na niedrożność pochodzenia środkowej tętnicy mózgowej. Warto zauważyć, że niedrożność przyśrodkowej tętnicy mózgowej rozpoczyna się, gdy wykrywa się zmniejszenie regionalnego przepływu krwi w mózgu o ponad 80%.

W tym modelu tymczasowo blokujemy tętnicę skrzydłowo-podniebienną za pomocą mikro klamry, aby prawidłowo wprowadzić włókno do ścieżki przedsionkowej. Należy pamiętać, że ten krok jest bardzo ważny dla powodzenia niedrożności przyśrodkowej tętnicy mózgowej. Kaniulacja żyły szyjnej i wstrzyknięcie Evans Blue.

Wykonaj jednocentymetrowe podłużne nacięcie w szyi po lewej stronie linii środkowej, a następnie tępo odetnij powięź powierzchowną, aby uzyskać dostęp do zewnętrznej gałęzi lewej żyły szyjnej. Następnie na stałe podwiązać róg końca żyły szyjnej za pomocą szwu workowego 5-0. Luźno umieść dwie opaski wokół żyły, a następnie tymczasowo zaciśnij sercowy koniec żyły szyjnej za pomocą mikrozacisku naczyniowego.

Wykonaj małe nacięcie na żyle szyjnej za pomocą dwóch szwów, a następnie wprowadź cewnik wypełniony heparyną wypełnioną surowicą do przestrzeni świetlnej żyły i przesuń go o około 10 milimetrów. Następnie zaciśnij ligatury wokół żyły, aby zabezpieczyć cewnik i zapobiec krwawieniu. Wstrzyknąć niewielką ilość surowicy, aby uniknąć zapadnięcia się żyły.

Pod koniec okresu niedokrwiennego, czyli 90 minut, należy rozpocząć reperfuzję poprzez wycofanie szwu śródświetlnego. Na początku okresu reperfuzji powoli wstrzykiwać barwnik Evans Blue jeden mililitr na kilogram 2% roztworu w soli fizjologicznej przez okres pięciu minut. Następnie umyj kaniulę przez wstrzyknięcie 0,5 mililitra soli fizjologicznej i wyjmij kaniulę iniekcyjną z żyły.

Zwróć uwagę na zmianę koloru tkanki po wstrzyknięciu Evans Blue. Na koniec zszyj nacięcia szyi i głowy i umieść zwierzę w klatce regeneracyjnej. Ocena przepuszczalności bariery krew-mózg

Po 24 godzinach reperfuzji głęboko znieczulij zwierzę tiopentalem sodu. Następnie otwórz klatkę piersiową, robiąc mały otwór pod mostkiem. Zrób mały otwór w prawym przedsionku i wstrzyknij 250 mililitrów wstępnie podgrzanej soli fizjologicznej przez lewą komorę przez 15 minut, aby zmyć Evans Blue z krążenia, aż normalna sól fizjologiczna, która jest pozostawiona w przedsionku, stanie się bezbarwna.

Natychmiast usuń mózg z czaszki i umieść go w macierzy mózgowej. Wypreparuj opuszkę węchową i móżdżek, a następnie za pomocą czystej żyletki oddziel prawą półkulę mózgu od lewej wzdłuż linii środkowej. Zważ każdą półkulę i homogenizuj je osobno w 2,5 mililitra soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, a następnie wymieszaj z 2,5 mililitra 16% kwasu trichlorooctowego przez dwie minuty za pomocą maszyny wirowej.

Odwiruj próbki mózgu przez 30 minut i pozwól im ostygnąć w lodówce przez 10 minut. Użyj supernatantów, aby oszacować absorbancję błękitu Evansa za pomocą spektrofotometru na 610 nanometrach. Reprezentatywne wyniki.

U zwierząt operowanych pozorowanych stężenie niebieskiego Evansa w tkankach przygotowanych dla obu półkul mózgu jest bardzo małe i nie ma istotnej różnicy w porównaniu ze sobą. Indukcja niedokrwienia w ciągu 90 minut, po którym nastąpiła 24 reperfuzja, spowodowała znaczny wzrost poziomu niebieskiego Evansa w uszkodzonej półkuli mózgu u szczurów z niedokrwieniem. Łącznie odkrycia te wskazują, że w normalnych warunkach Evans Blue nie może łatwo przekroczyć bariery krew-mózg do miąższu mózgu, a uszkodzenia niedokrwienne mózgu wywołane wynaczynieniem Evansa Blue przez wewnętrzną przepuszczalność bariery krew-mózg.

Fotografia pokazuje mózg u zwierząt pozorowanych i niedokrwionych. Należy zauważyć, że intensywność wynaczynienia Evansa w tkance mózgowej, która ma niebieski kolor, wynika z zakresu przerwania bariery krew-mózg w uszkodzonej półkuli. Konkluzja. Ocena in vivo bariery krew-mózg pozwala badaczowi na zbadanie możliwych mechanizmów patofizjologicznych naczyniopochodnego obrzęku mózgu wywołanego niedokrwieniem oraz na znalezienie nowych interwencji terapeutycznych.

Ta technika jest prosta i niezawodna. Badacz musi wziąć pod uwagę kilka punktów technicznych, aby jeszcze bardziej zwiększyć wydajność techniki i zapewnić jej dokładność. Stałe rejestrowanie regionalnego przepływu krwi w mózgu za pomocą laserowego przepływomierza dopplerowskiego i stosowanie włókna pokrytego silikonem może zwiększyć wskaźnik sukcesu MCAO i zmniejszyć śmiertelność.

Dawkowanie i punkt czasowy wstrzyknięcia to dwa podstawowe parametry dla uzyskania wiarygodnych wyników ze względu na dynamiczny charakter bariery krew-mózg po urazach niedokrwiennych.