Name: Trójwymiarowe zapalne odpowiedniki tkanek ludzkich dziąsła (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj metodę rekonstrukcji trójwymiarowego modelu zapalnej dziąsła in vitro przy użyciu trzech typów komórek ludzkich. Technika umożliwia badanie gojenia ran, regeneracji tkanek i przesiewanie leków na choroby przyzębia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (26861689 i 17K11813). Autorzy pragną podziękować Panu Nathanielowi Greenowi za korektę.

Ten protokół jest przeznaczony do tworzenia odpowiedników ludzkiej tkanki dziąsełowej, modeli ran dziąsłowych i modeli zapalenia dziąseł. Keratynocyty naskórka ludzkiej skóry (HaCaT) zostały udostępnione dzięki uprzejmości profesora Norberta E. Fuseniga z Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Niemcy)7. Ludzkie fibroblasty dziąseł (HGF) zostały wyizolowane z tkanek dziąseł zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami8. Wcześniej uzyskano świadomą zgodę, a badanie zostało zatwierdzone zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Komisję Etyki, Nippon Dental University School of Life Dentistry w Tokio (numer autoryzacji: NDU-T2012-35). Kroki protokołu 1–3 należy wykonać w kapturze do hodowli komórkowej.
1. Przygotowanie 3D Ludzkich Tkanek Odpowiedników Dziąsła (GTE) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A)
<ol>
	<li>Wymieszaj żel kolagenowy typu I-A z 10% skoncentrowanym MEM-alfa i 10% buforem odbudowującym (2,2 gNaHCO3 i 4,47 g HEPES w 100 ml 0,05 N NaOH) w sterylnej probówce o pojemności 15 ml przez pipetowanie. Mieszany roztwór kolagenu należy przechowywać na lodzie do momentu użycia.</li>
	<li>Umieść 24-dołkowe wkładki hodowlane (wielkość porów 3,0 μm) na 24-dołkowej płytce.</li>
	<li>Usuń HGF z powierzchni hodowli za pomocą 0,25% roztworu trypsyny-EDTA. Zawiesić komórki w 10 ml pożywki hodowlanej A (MEM-alfa + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Policz komórki za pomocą licznika komórek Bürker-Türk.
	<ol>
		<li>Wyekstrahuj żądaną ilość komórek (1-5 x105 komórek/ml), a następnie odwiruj przez 4 minuty przy 190 x g.</li>
		<li>Zawieś komórki w mieszanym roztworze kolagenu. Trzymaj mieszaninę na lodzie do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 0,5 ml mieszaniny komórka-kolagen (0,5–2,5 x 105 komórek/studzienkę) do wkładki hodowlanej, nie wytwarzając żadnych pęcherzyków. Inkubować mieszaninę przez 10–30 minut w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C w celu koagulacji mieszaniny do postaci żelu. 
	UWAGA: Dodaj mieszaninę kolagenu do środka wkładki hodowlanej, aby uniknąć nierównomiernego tworzenia się żelu kolagenowego.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki do dołka i 0,5 ml do wkładki. Inkubować płytkę hodowlaną przez 24 godziny lub przez noc w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usuń komórki HaCaT z powierzchni hodowli za pomocą 0,25% roztworu trypsyny-EDTA. Zawieś komórki w 10 ml pożywki B (DMEM + 10% FBS + 1% GlutaMAX) i policz komórki. Pobrać potrzebną ilość komórek (1–5 x 105 komórek/ml) za pomocą pipety, odwirować przez 4 minuty przy 190 x g. Zawieś komórki w podłożu B.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z wkładek hodowlanych, które zawierają mieszaninę HGF i kolagenu, przez aspirację. Dodaj 0,5 ml zawiesiny komórek HaCaT (0,5–2,5 x 105 komórek/dołek) na wierzch mieszaniny HGF-kolagen. Inkubować kultury przez 24 godziny lub przez noc. 
	UWAGA: W tym momencie pożywka w studzience hodowlanej powinna być pożywką A, podczas gdy pożywką we wstawce hodowlanej powinno być pożywką B.</li>
	<li>Zastąp pożywkę hodowlaną pożywką KSR (pożywka kohodowlana) (MEM-alfa + 15% zamiennika surowicy nokautującej + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Dodać 1 ml pożywki do dołka hodowlanego i 0,5 ml do wkładki hodowlanej. Inkubuj kultury przez 24–48 godzin.</li>
	<li>Zastąp pożywkę hodowlaną pożywką KSR + 1% FBS. Dodaj 1 ml do dołka hodowlanego i 0,5 ml do wkładki hodowlanej. Inkubuj kultury przez 24 godziny lub przez noc.</li>
	<li>Zastąp pożywkę hodowlaną w studzience hodowlanej 0,7–1 ml pożywki KSR. Całkowicie usunąć pożywkę z wkładki hodowlanej (powierzchnia hodowli powinna być wystawiona na działanie powietrza). Inkubuj kultury przez 1–2 tygodnie. Zmieniaj pożywkę w kulturze dwa razy w tygodniu. 
	UWAGA: Nie pozwól, aby poziom podłoża uniósł się ponad powierzchnię kultury (górna warstwa złożona z keratynocytów). Zawsze utrzymuj powierzchnię kultury w suchym miejscu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie rannego GTE (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B)
<ol>
	<li>Przygotuj dziurkacz do tkanek o średnicy 1–3 mm. Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min.</li>
	<li>Wepchnij dziurkacz do tkanek prostopadle do GTE na głębokość około 300 μm i wybij otwór w tkance, aby zasymulować ranę.</li>
	<li>Na tym etapie użyj rannego GTE do zbadania gojenia się ran i regeneracji tkanek. Alternatywnie, utrwal GTE za pomocą 10% neutralnego roztworu buforowego formaliny do przeprowadzenia analizy histologicznej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zapalnego GTE (iGTE) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B)
<ol>
	<li>Hoduj komórki THP-1 zgodnie z poprzednim raportem9.</li>
	<li>Wymieszaj żel kolagenowy typu I-A z 10% skoncentrowanym RPMI 1640, 10% buforem odbudowującym (2,2 gNaHCO3 i 4,47 g HEPES w 100 ml 0,05 N NaOH) i 10 ng/ml PMA. Mieszany roztwór kolagenu należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.</li>
	<li>Policz 1–2 x 106 komórek THP-1 i wiruj przez 4 minuty przy 190 x g. Zawiesić komórki w 1 ml zmieszanego roztworu kolagenu. Trzymaj mieszaninę na lodzie do następnego kroku.</li>
	<li>Dodaj 10–30 μl mieszaniny kolagenu THP-1 do zranionego obszaru GTE. Zastąp pożywkę hodowlaną na 0,7–1 ml pożywki KSR zawierającej 10 ng/ml PMA.</li>
	<li>Mieszaninę inkubować w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.</li>
	<li>Użyj modelu do badania zapalenia dziąseł lub choroby przyzębia (na przykład dodaj potencjalny lek przeciwzapalny do iGTE, aby zobaczyć jego wpływ na uwalnianie cytokin10). Alternatywnie, pomiń 72-godzinny zabieg PMA, dodaj 2 μg/ml LPS do kultury i inkubuj tkankę w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 48 h11,12.</li>
</ol>
4. Utrwalenie i barwienie immunologiczne całego wierzchowca kultur GTE i iGTE
<ol>
	<li>Fiksacja kultur.
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki 24-dołkowej. Umyj tkanki 2 razy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
		<li>Dodaj 1 ml 10% neutralnego roztworu buforowego formaliny do wkładki i 1 ml do dołka hodowli. Płytkę 24-dołkową należy pozostawić na noc w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Następnego dnia usunąć 10% roztwór buforowy neutralnej formaliny.</li>
		<li>W przypadku barwienia immunologicznego całej wierzchowca, po utrwaleniu należy przemyć tkanki 3-4 razy PBS.</li>
		<li>W przypadku barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz regularnego barwienia immunologicznego należy przystąpić do odwodnienia, zatapiania parafiny i cięcia. 
		UWAGA: W przypadku barwienia immunologicznego całego wierzchowca ten krok można pominąć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunologiczne całej góry 
	UWAGA: Ten protokół został zmodyfikowany w stosunku do protokołu z odnośnika 13.
	<ol>
		<li>Chusteczki myć 3x w PBS 0,5–1% Triton, za każdym razem po 10–30 minut.</li>
		<li>Inkubować tkanki dwukrotnie przez 30 minut w buforze blokującym (PBS 1% Triton + 10% BSA), w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Chusteczki myć 2× w buforze blokującym, za każdym razem 5–10 minut.</li>
		<li>Dodać 50 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w wymaganym rozcieńczeniu/stężeniu do wkładek. Użyj cienkiej plastikowej folii spożywczej do owinięcia wkładek, aby uniknąć wysuszenia chusteczki.</li>
		<li>Inkubować tkankę przez 1-2 dni w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Chusteczki myć 3 razy, przez 30 min w PBS 1% Triton + 10% BSA. Umyj ponownie 3 razy, przez 5 minut w PBS 1% Triton.</li>
		<li>Dodać 50 μl przeciwciała drugorzędowego w buforze blokującym (PBS 1% Triton + 10% BSA) i 5 μl roztworu Hoechst 33342 (barwienie NucBlue Live Cell) do każdej wkładki. Użyj cienkiej plastikowej folii spożywczej do owinięcia wkładek, aby uniknąć wysuszenia chusteczki.</li>
		<li>Inkubować przez 1 do 2 dni w temperaturze 4 °C. Zawinąć 24-dołkową płytkę w mokry ręcznik papierowy, a następnie umieścić ją w plastikowym opakowaniu do stosowania przez cały okres inkubacji.</li>
		<li>Umyj chusteczki 3 razy, przez 10 minut w PBS 1% tryton</li>
		<li>Użyj ostrej igły, aby przeciąć błonę wkładki hodowlanej, aby uzyskać tkankę. Umieść membranę na szkiełku. 
		UWAGA: Tkanka powinna znajdować się na membranie.</li>
		<li>Dodaj 2-3 krople pożywki do montażu fluorescencyjnego. Przykryć chusteczkę szklanym nakryciem i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu analizy.</li>
		<li>Oglądaj tkanki za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (LSM).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+immune+pathways+in+the+pathogenesis+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology+2000%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).</li>
<li>Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Inflammatory+Diseases+and+Systemic+Inflammation%3A+Role+of+the+Macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage.</a> Frontiers in Immunology. 3, 118(2012).</li>
<li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+wound+healing%3A+The+role+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation and wound healing: The role of the macrophage.</a> Expert reviews in molecular medicine. 13, e23(2011).</li>
<li>Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+fibroblasts+during+inflammation+and+tissue+repair+in+models+of+organ+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration.</a> Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).</li>
<li>Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Animal+Models+in+Periodontology%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Open+Dentistry+Journal%22%5BJournal%5D)">Experimental Animal Models in Periodontology: A Review.</a> The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).</li>
<li>Han, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Periodontal+Bacteria+and+Human+Oral+Epithelial+Cells%3A+Fusobacterium+nucleatum+Adheres+to+and+Invades+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells.</a> Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).</li>
<li>Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+keratinization+in+a+spontaneously+immortalized+aneuploid+human+keratinocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line.</a> J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).</li>
<li>Xiao, L., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen-rich+water+achieves+cytoprotection+from+oxidative+stress+injury+in+human+gingival+fibroblasts+in+culture+or+3D-tissue+equivalents%2C+and+wound-healing+promotion%2C+together+with+ROS-scavenging+and+relief+from+glutathione+diminishment%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment.</a> Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).</li>
<li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gingival+fibroblasts+are+critical+in+sustaining+inflammation+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontal+Res%22%5BJournal%5D)">Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease.</a> J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).</li>
<li>Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li>
<li>Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+LPS+induced+NF-kappaB+response+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages.</a> BMC Immunol. 8, 1(2007).</li>
<li>Abcam. Whole mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/whole_mount_fluorescent_ihc.pdf">http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/whole_mount_fluorescent_ihc.pdf</a> (2017).</li>
<li>Shetty, S., Gokul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinization+and+its+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Oman+Med+J%22%5BJournal%5D)">Keratinization and its disorders.</a> Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).</li>
<li>Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+initial+gingivitis+in+humans.+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study.</a> J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).</li>
<li>Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+E-cadherin+and+cytokeratin+19+and+net+proliferative+rate+of+gingival+keratinocytes+in+oral+epithelium+in+periodontal+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease.</a> J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).</li>
<li>Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).</li>
<li>Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontal+disease%2C+bacteria%2C+and+pulpal+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Surg+Oral+Med+Oral+Pathol%22%5BJournal%5D)">Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology.</a> Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).</li>
<li>Holness, C. L., Simmons, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+CD68%2C+a+human+macrophage+marker+related+to+lysosomal+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins.</a> Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).</li>
<li>Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+is+secreted+by+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vimentin is secreted by activated macrophages.</a> Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).</li>
<li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+squalane-dissolved+on+adipogenesis-accompanied+oxidative+stress+and+macrophage+in+a+preadipocyte-monocyte+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system.</a> Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).</li>
<li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+hydroxylated+fullerene+localizes+at+the+cytoskeleton+and+inhibits+oxidative+stress+in+adipocytes+and+a+subcutaneous+adipose-tissue+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent.</a> Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół ten opiera się na metodach tworzenia ekwiwalentów tkanki dziąsłowej i podskórnych odpowiedników tkanki tłuszczowej opisanych w poprzednich raportach 8,21,22. Chociaż jest to prosta i łatwa metoda, niektóre kroki wymagają szczególnej uwagi. Na przykład mieszaninę kolagenu należy przechowywać na lodzie do czasu użycia, aby uniknąć tworzenia się żelu w roztworze. Dodając mieszaninę kolagenu do wkładki hodowlanej, upewnij s...

Choroby przyzębia są główną przyczyną utraty zębów u dorosłych. Zapalenie dziąseł i przyzębia to najczęstsze choroby przyzębia. W obu przypadkach występują ostre lub przewlekłe zmiany zapalne dziąseł wywołane biofilmem. Zapalenie dziąseł charakteryzuje się ostrym stanem zapalnym, podczas gdy zapalenie przyzębia zwykle objawia się przewlekłym stanem zapalnym. Na poziomie histologicznym składniki bakteryjne wyzwalają aktywację komórek odpornościowych, takich jak makrofagi, limfocyty, komórki plazmatyczne i komórki tuczne1,2. Te komórki odpornościowe, zwłaszcza makrofagi, oddziałują z komórkami lokalnymi (w tym komórkami nabłonka dziąseł, fibroblastami, komórkami śródbłonka i osteoblastami), powodując zmiany zapalne w tkance przyzębia3,4. Eksperymentalne modele chorób przyzębia zostały ustalone u różnych typów zwierząt, takich jak szczury, chomiki, króliki, fretki, psy i naczelne. Jednak fizjopatologia modeli zwierzęcych różni się od ludzkiej, co utrudnia analizę mechanizmów komórkowych i molekularnych oraz ocenę nowych leków na choroby przyzębia5. Do zbadania mechanizmu infekcji przyzębia wykorzystano komisję bakterii przyzębia i jednowarstwowych ludzkich komórek nabłonka jamy ustnej6. Niemniej jednak jednowarstwowe hodowle komórek jamy ustnej nie mają trójwymiarowej (3D) architektury komórkowej nienaruszonej tkanki; W związku z tym nie mogą naśladować sytuacji in vitro.
Tutaj, 3D zapalne odpowiedniki tkanek ludzkich dziąseł (iGTE) są ustalane do reprezentowania chorób przyzębia in vitro. Ten model 3D chorób przyzębia zajmuje pozycję pośrednią między monowarstwowymi hodowlami komórkowymi a modelami zwierzęcymi. Trzy rodzaje komórek ludzkich, w tym keratynocyty HaCaT, fibroblasty dziąseł i makrofagi THP-1, są współhodowane na żelu kolagenowym i stymulowane przez inicjatory stanu zapalnego do budowy iGTE. IGTE ściśle symuluje warunki in vivo różnicowania komórek, interakcji komórka-komórka i aktywacji makrofagów w dziąsłach. Model ten ma wiele możliwych zastosowań w badaniach przesiewowych leków i testowaniu nowych podejść farmakologicznych w chorobach przyzębia, a także do analizy mechanizmów komórkowych i molekularnych w gojeniu się ran, stanach zapalnych i regeneracji tkanek.

<table><tbody><tr><td>Kolagen typu I-A</td><td>Nitta Gelatin Inc</td><td></td><td>Do wytwarzania skóry właściwej GTE</td></tr><tr><td>MEM-alpha</td><td>Thermo Fisher Scientific 11900073</td><td></td><td>Pożywka do hodowli</td></tr><tr><td>komórkowych Wkładka do hodowli komórkowych (na płytkę 24-dołkową), wielkość porów 3,0 i mu; m</td><td>Corning, Inc.</td><td>353096</td><td>Do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Odczynnik do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31600034</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>KnockOut Wymiana surowicy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Odczynnik do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Dziurkacz do tkanek</td><td>Shibata system service co., LTD</td><td>SP-703</td><td>Do dziurkowanie otworów w GTE</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31800022</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>Do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td>Do znakowania jąder</td></tr><tr><td>Podłoże do montażu fluorescencyjnego</td><td>Dako</td><td></td><td>Do mocowania próbek po barwieniu immunologicznym</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-cytokeratyny 8 + 18 [5D3]</td> <td>abcam</td><td>ab17139</td><td>Do identyfikacji nabłonka</td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>Hitachi, Ltd.</td><td>HITACHI S-4000</td><td>Do obserwacji topografii i składu powierzchni próbek</td></tr>: <tr><td>Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa,</td><td>LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Sp. z o.o.</td><td>LSM 700</td><td>Do obserwacji barwienia immunofluorescencyjnego próbek Przeciwciało</td></tr><tr><td>anty-cytokeratyny 19</td><td>abcam</td><td>ab52625</td><td>Do identyfikacji nabłonka</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-wimentynowe</td><td>abcam</td><td>ab92547</td><td>Do identyfikacji fibroblastów i aktywowanych makrofagów</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-TE-7</td><td>Millipore</td><td>CBL271</td><td>Do identyfikacji fibroblastów w skórze właściwej</td></tr><tr><td>Anty-CD68 przeciwciało</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB2700244</td><td>Do identyfikacji makrofagów</td></tr><tr><td>Ludzkie przeciwciało CD14</td><td>R& D Systems</td><td>MAB3832-SP</td><td>Do identyfikacji makrofagów</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-sprzężone wtórne kozie przeciwciało anty-królicze</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11012</td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-sprzężone wtórne kozie przeciwciało anty-mysie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego</td></tr><tr><td>EVOS FL System obrazowania komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> Do obserwacji komórek THP-1 <td>barwienia immunofluorescencyjnego próbki</td></tr> Bank <tr><td>komórek Riken BRC</td><td>RCB1189</td><td>Do wytwarzania iGTE</td><td></td></tr><tr><td>PMA (12-mirystynian 13-octanu)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>Do różnicowania komórek THP-1</td></tr></tbody></table>

trójwymiarowe zapalne odpowiedniki tkanek ludzkich dziąsła

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

Choroby przyzębia (takie jak zapalenie dziąseł i przyzębia) są głównymi przyczynami utraty zębów u dorosłych. Stan zapalny dziąseł jest podstawową fizjopatologią chorób przyzębia. Obecne eksperymentalne modele chorób przyzębia zostały ustalone u różnych typów zwierząt. Jednak fizjopatologia modeli zwierzęcych różni się od ludzkiej, co utrudnia analizę mechanizmów komórkowych i molekularnych oraz ocenę nowych leków na choroby przyzębia. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół rekonstrukcji ludzkich odpowiedników tkanki zapalnej dziąsła (iGTE) in vitro. Najpierw budujemy ludzkie tkankowe odpowiedniki dziąseł (GTE), wykorzystując dwa rodzaje komórek ludzkich, w tym ludzkie fibroblasty dziąseł (HGF) i keratynocyty naskórka ludzkiej skóry (HaCaT), w warunkach trójwymiarowych. Tworzymy model rany, używając dziurkacza do tkanek do wybicia w GTE. Następnie ludzkie monocyty THP-1 zmieszane z żelem kolagenowym są wstrzykiwane do otworu w GTE. Poprzez adimistrację 10 ng / ml 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) przez 72 godziny, komórki THP-1 różnicują się w makrofagi, tworząc ogniska zapalne w GTE (iGTE) (IGTE można również stymulować 2 μg / ml lipopolisacharydów (LPS) przez 48 godzin, aby zainicjować stan zapalny). IGTE to pierwszy model zapalenia dziąseł in vitro wykorzystujący ludzkie komórki o trójwymiarowej architekturze. IGTE odzwierciedla główne zmiany patologiczne (aktywność immunocytów, interakcje wewnątrzkomórkowe między fibryoblastami, komórkami nabłonkowymi, monocytami i makrofagami) w chorobach przyzębia. GTE, wounded GTE i iGTE mogą być wykorzystywane jako wszechstronne narzędzia do badania gojenia się ran, regeneracji tkanek, stanów zapalnych, interakcji komórka-komórka i badań przesiewowych potencjalnych leków na choroby przyzębia.

Komórki HaCaT wykazywały typową morfologię keratynocytów podczas obserwacji pod mikroskopem fazowo-kontrastowym (Rysunek 2A). Obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego (SEM) wykazały, że powierzchnie komórek HaCaT były pokryte licznymi mikrokosmkami. Połączenia międzykomórkowe między komórkami HaCaT były zapośredniczone przez wypustki błonowe (Rysunek 2B). Komórki HaCaT wykazywały ekspresję markera nabłonka dziąseł K8/18<s...

Celem protokołu jest zbudowanie modelu zapalenia ludzkiego dziąsła in vitro. Ten model tkankowy współhoduje trzy typy komórek ludzkich, keratynocyty HaCaT, fibroblasty dziąseł i makrofagi THP-1, w warunkach trójwymiarowych. Model ten można zastosować do badania chorób przyzębia, takich jak zapalenie dziąseł i przyzębia.

Trójwymiarowe zapalne odpowiedniki tkanek ludzkich dziąsła

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest rekonstrukcja trójwymiarowego modelu zapalnej tkanki dziąseł przy użyciu trzech typów komórek ludzkich in vitro. Ta metoda może pomóc w badaniu gojenia się ran, regeneracji tkanek, stanów zapalnych i badaniach przesiewowych potencjalnych leków na choroby przyzębia. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to pierwsza metoda budowy modelu zapalenia dziąseł in vitro z wykorzystaniem komórek ludzkich o trójwymiarowej architekturze.W sterylnej probówce o pojemności 15 mililitrów dodaj kolagen typu I-A, 10% skoncentrowany MEM-alfa i 10% bufor rekonstrukcyjny. Następnie pozostaw mieszaninę kolagenu na lodzie do następnego użycia. Następnie umieść 24-dołkowe wkładki hodowlane z porami o wielkości trzech mikrometrów w 24-dołkowej płytce hodowlanej.Następnie użyj 25% roztworu trypsyny-EDTA, aby odłączyć HGF od kolby hodowlanej. Następnie zawiesić oderwane komórki w 10 mililitrach pożywki hodowlanej. Następnie policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek Burkera-Turka.Po wyizolowaniu pożądanej liczby komórek odwirować komórki w temperaturze 190 razy g przez cztery minuty. Następnie zawiesić osad komórkowy roztworem kolagenu i pozostawić probówkę na lodzie. Następnie dodaj 5 mililitrów mieszaniny komórkowo-kolagenowej do wkładki hodowlanej, nie wytwarzając żadnych pęcherzyków powietrza.Następnie inkubuj wkładkę hodowlaną z mieszaniną komórkowo-kolagenową w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 10 do 30 minut. Po inkubacji dodać jeden mililitr pożywki do dołka i 5 mililitrów pożywki do wkładki. Następnie inkubuj płytkę hodowlaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez jeden dzień.Następnie użyj 25% roztworu trypsyny-EDTA, aby odłączyć komórki HaCaT od płytki hodowlanej. Po odłączeniu komórek dodaj do nich 10 mililitrów pożywki B. Następnie policz numer komórki.Po wyizolowaniu pożądanej liczby komórek odwirować komórki w temperaturze 190 razy g przez cztery minuty. Po odwirowaniu rozpuść osad komórkowy w pożywce B. Następnie odessać pożywkę z wkładki hodowlanej. Następnie dodaj 5 mililitrów zawiesiny komórek HaCaT na mieszaninę HGF i kolagenu.Pozostaw wkładkę hodowlaną w inkubatorze na jeden dzień. Następnego dnia wymień pożywkę hodowlaną. Dodać jeden mililitr pożywki KSR do kokultury uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą do dołka hodowlanego i 5 mililitrów do wkładki hodowlanej.Następnie inkubuj płytkę hodowlaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia należy zastąpić pożywkę hodowlaną pożywką KSR z kohodowli uzupełnioną 1% płodową surowicą bydlęcą. Po 24 godzinach dobrze usunąć całą pożywkę zarówno z wkładki hodowlanej, jak i z kultury.Następnie dodaj świeże 7 do jednego mililitra pożywki KSR tylko do kultury i kontynuuj hodowlę przez dwa tygodnie. Pamiętaj, aby dobrze zmieniać podłoże w kulturze dwa razy w tygodniu. Przygotuj dziurkacz do tkanek o średnicy od jednego do trzech milimetrów i sterylizuj go w autoklawie w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 20 minut.Po sterylizacji wepchnij dziurkacz do tkanek prostopadle do GTE na głębokość około 30 mikrometrów, aby zrobić ranę w tkance. Następnie wymieszaj 10 nanogramów na mililitr PMA, 10% buforu rekonstrukcyjnego i 10% skoncentrowanej pożywki RPMI z żelem kolagenowym typu I-A. Następnie pozostaw mieszaninę kolagenu na lodzie do następnego użycia.Następnie odwiruj komórki THP-1 w temperaturze 190 razy g przez cztery minuty. Po odwirowaniu zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze roztworu kolagenu i pozostawić na lodzie. Następnie dodaj od 10 do 30 mikrolitrów mieszaniny komórek i kolagenu THP-1 do zranionego obszaru GTE.Następnie zastąp pożywkę hodowlaną 7 do jednego mililitra pożywki KSR zawierającej 10 nanogramów na mililitr PMA. Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny. W celu scharakteryzowania zrekonstruowanego GTE, H i E przeprowadza się barwienie H i E oraz skaningową mikroskopię elektronową.Zdjęcia pokazują GTE wykazującą strukturę tkankową podobną do dziąsła z wieloma warstwami nabłonka i blaszki właściwej. Obrazy pokazują również, że komórki HGF w zrekonstruowanych GTE wykazują wyraźne cechy morfologiczne fibroblastów otoczonych włóknami kolagenowymi. Następnie wykonuje się barwienie immunofluorescencyjne w celu zbadania ekspresji markerów skórnych i nabłonkowych.Ma to na celu sprawdzenie, czy GTE i iGTE mają cechy molekularne prawdziwego zapalnego ludzkiego dziąsła. Zdjęcia pokazują, że wimentyna i TE-7 są silnie obecne w blaszce właściwej GTE. K19, specyficzny marker nabłonka skrzyżowania w zapaleniu przyzębia, choć słabo ulega ekspresji w nabłonku GTE, jest wystarczająco silny w nabłonku iGTE.Wreszcie, w celu wytworzenia ognisk zapalnych w iGTE, monocyty THP-1 traktowane PMA są wstrzykiwane w zraniony obszar tkanki. Po 72 godzinach od leczenia PMA komórki THP-1 różnicują się w komórki podobne do makrofagów. Barwienie immunologiczne w całości potwierdziło, że komórki te wyrażają dwa ważne markery makrofagów, CD14 i wimentynę, i tworzą ogniska zapalne.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech tygodni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby uniknąć zanieczyszczenia. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak użycie LPS do stymulowania odpowiedzi zapalnych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak sposób wywołania stanu zapalnego poprzez interakcje gospodarz-biofilm.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się stanami zapalnymi, regeneracją tkanek i gojeniem się ran do zbadania mechanizmu komórkowego i molekularnego oraz badań przesiewowych potencjalnych leków na choroby przyzębia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbudować model 3D zapalnej tkanki dziąseł in vitro.

three-dimensional-inflammatory-human-tissue-equivalents-of-gingiva

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

To badanie opisuje skuteczną technikę izolowania i przetwarzania tkanek dziąseł z jamy ustnej myszy w celu wytworzenia hodowli jednokomórkowej. Uzyskane w ten sposób komórki mogą być dalej wykorzystywane do analizy cytometrii przepływowej i badań molekularnych.

Izolacja, przetwarzanie i analiza mysich komórek dziąseł

Opisano metody tworzenia ludzkich tkanek nowotworowych 3D jako systemów testowych. Technologie te opierają się na bezkomórkowym biologicznym rusztowaniu unaczynionym (BioVaSc), pierwotnych komórkach ludzkich i linii komórek nowotworowych, które mogą być hodowane zarówno w warunkach statycznych, jak i dynamicznych w bioreaktorze przepływowym.

Inżynieria tkankowa ludzkiego systemu badań 3D nowotworów in vitro

Celem tego protokołu jest stworzenie trójwymiarowego odpowiednika skóry o pełnej grubości, który przypomina naturalną skórę. Dzięki specjalnie skonstruowanemu zautomatyzowanemu urządzeniu do nawijania można generować precyzyjne i powtarzalne rany przy zachowaniu bezpłodności.

Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

Ten manuskrypt opisuje produkcję, charakterystykę i potencjalne zastosowania konstruktu przełyku 3D wykonanego z normalnego pierwotnego ludzkiego fibroblastu przełyku i płaskonabłonkowych komórek nabłonkowych umieszczonych w pozbawionym komórek rusztowaniu wieprzowym. Wyniki wskazują na tworzenie się dojrzałego nabłonka warstwowego podobnego do normalnego ludzkiego przełyku.

Produkcja, charakterystyka i potencjalne zastosowania 3D modelu błony śluzowej przełyku dla człowieka opartego na inżynierii tkankowej

Ustaliliśmy technikę izolacji, charakterystyki fenotypowej i analizy funkcjonalnej komórek odpornościowych z mysiego dziąsła.

Izolacja, charakterystyka i badanie funkcjonalne sieci komórek odpornościowych dziąseł

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

To badanie wprowadza protokół pomiaru mikrokrążenia w błonie śluzowej jamy ustnej człowieka za pomocą laserowego obrazowania z kontrastem. Monitorowanie gojenia się ran po przedsionkowoplastyce w połączeniu z ksenogennym przeszczepem kolagenu przedstawiono na przykładzie klinicznym.

Nowatorskie podejście do monitorowania neowaskularyzacji przeszczepu w ludzkim dziąśle

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie dynamicznej ko-hodowli ludzkich makrofagów i miofibroblastów w rurowych rusztowaniach elektroprzędzonych w celu zbadania regeneracji tkanek sterowanej materiałem, przy użyciu bioreaktora, który umożliwia oddzielenie naprężeń ścinających od cyklicznego rozciągania.

Bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu

Prezentowany tutaj jest protokół generowania zmodyfikowanych tkanek łącznych do równoległej hodowli 48 tkanek na wielodołkowej płytce z podwójnymi biegunami, odpowiedni do badań mechanistycznych, modelowania chorób i badań przesiewowych. Protokół jest zgodny z fibroblastami z różnych narządów i gatunków, a jego przykładem są tutaj pierwotne fibroblasty serca ludzkiego.

Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

Tutaj opisujemy konstrukcję podstawowego, trójwymiarowego (3D) modelu linii komórkowej jelitowej oraz protokołu osadzania parafiny do mikroskopowej oceny stałych jelitowych odpowiedników. Barwienie wybranych białek umożliwia analizę wielu parametrów wzrokowych z jednego eksperymentu do potencjalnego wykorzystania w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków.

Podstawowy trójwymiarowy (3D) model jelitowy z komponentem odpornościowym

Obecny protokół opisuje zastosowanie organotypowych modeli tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro. W szczególności opisany system modelowy wykorzystuje wielowarstwowy nabłonek jamy ustnej narażony na działanie mikroorganizmów związanych z biofilmami (płytką nazębną) w kontekście zdrowia jamy ustnej w porównaniu z chorobą.

Organotypowe systemy modelowania tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro

Poznaj metodę rekonstrukcji trójwymiarowego modelu zapalnej dziąsła in vitro przy użyciu trzech typów komórek ludzkich. Technika umożliwia badanie gojenia ran, regeneracji tkanek i przesiewanie leków na choroby przyzębia.

Trójwymiarowe zapalne odpowiedniki tkanek ludzkich dziąsła

Przeglądaj więcej filmów