Metoda przeszczepu wysp trzustkowych do sieci u myszy

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przeszczepiania wysp trzustkowych, takie jak przeszczep wysp trzustkowych do sieci komórkowej. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię cukrzycy typu I, ponieważ sieć ponownie pojawia się jako potencjalne miejsce do przeszczepu wysp trzustkowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że izolowane wysepki miesza się z hydrożelem, a mieszaninę umieszcza się w woreczku sieci myszy z cukrzycą.

Zacznij od przygotowania aseptycznego pola w polu operacyjnym ze sterylnego materiału, takiego jak serwety i materiały jednorazowego użytku. Umieść wysterylizowane narzędzia chirurgiczne w polu aseptycznym . Pobrać wysepki dawcze pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Dla każdego zwierzęcia należy pobrać od 450 do 500 wysepek i przenieść do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki typu snap z 100 mikrolitrami pożywki CMRL 10 66. Umieść probówkę na lodzie, aż będzie gotowa do przesadzenia. Po zebraniu wysepek rozmrozić hydrożel z matrycą błony podstawnej na lodzie.

Zważ i oznacz wszystkie myszy biorców z cukrzycą. Po znieczuleniu pierwszej myszy zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonym protokołem, przetestuj głębokość znieczulenia, podając szczypanie palca u nogi. Jeśli nie ma odruchu odstawienia, poziom znieczulenia jest prawidłowy do operacji.

Podawaj maść weterynaryjną do oczu, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Przetrzyj jamę brzuszną 70% etanolem. Następnie zgolić włosy z miejsca operacji.

Przykryj zwierzę sterylną zasłoną i zdezynfekuj obszar peelingiem jodowym. Po użyciu nożyczek okulistycznych do wykonania 4 do 5 centymetrowego nacięcia wzdłuż linii środkowej brzucha, przesuń jelita na lewą stronę i przykryj gazą nasączoną solą fizjologiczną, aby zapobiec odwodnieniu podczas zabiegu chirurgicznego. Następnie użyj bawełnianych wacików, aby całkowicie odsłonić żołądek i zlokalizować sieć poniżej żołądka.

W tym momencie hydrożel powinien zostać całkowicie rozmrożony. Obracać probówkę zawierającą wysepki 200 razy g przez 30 sekund. Po wirowaniu usunąć supernatant.

Następnie odessać 50 mikrolitrów hydrożelu, dodać go do probówki zawierającej wysepki i delikatnie wymieszać, unikając tworzenia się pęcherzyków. Następnie użyj dwóch par kleszczy, aby podnieść krawędzie sieci i delikatnie ją podnieść, aby utworzyć rowek między ścianą żołądka a jelitami. Na tym etapie operacji potrzebna jest druga osoba, która odessie mieszaninę hydrożelu z zawieszonymi wyspami trzustkowymi za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów i dostarczy ją do rowka.

Upewnij się, że mieszanina jest dobrze umieszczona w rowku, delikatnie podnosząc lub opuszczając krawędzie sieci komórkowej. Zakończ pozycjonowanie mieszaniny w ciągu trzech minut, zanim hydrożel zestale się. Po związaniu hydrożelu złóż sieć tak, aby pokryła przeszczep.

Sieć przylega do otaczającej ściany żołądka, gdy hydrożel zestala się. Gdy hydrożel całkowicie zastygnie, użyj bawełnianych wacików, aby zmienić położenie jelit w jamie brzusznej, uważając, aby nie dotknąć miejsca przeszczepu. Następnie dozuj 200 mikrolitrów odpowiedniego antybiotyku do jamy brzusznej, aby zapobiec infekcji.

Następnie użyj szwu 4 O, aby zamknąć brzuch. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ miejsca sieci u myszy są małe i męczące do oceny. Umieść mysz w rozgrzanej klatce regeneracyjnej, aż w pełni odzyska zewnętrzną stabilność.

Następnego dnia, a następnie codziennie przez tydzień, wstrzykuj antybiotyk w ramach profilaktyki pooperacyjnej. Mierz również poziom glukozy we krwi na czczo z próbki krwi z żyły ogonowej za pomocą glukometru raz dziennie po przeszczepie. Podczas przesadzania do sieci przeszczep wysp trzustkowych może mieć opóźnioną funkcję i nie osiągać całkowicie normalnego poziomu glukozy we krwi przez dwa do trzech tygodni.

Przeszczepiona tkanka została pobrana od myszy poddanej eutanazji 14 dni po przeszczepie. Tutaj przeszczep jest widoczny jako skupisko jąder po barwieniu DAPI. Funkcjonalność przeszczepionej tkanki ujawnia się poprzez barwienie immunofluorescencyjne przeciwciałami antyinsulinowymi.

Barwienie H&E pokazuje przeszczepione tkanki otoczone adipocytami sieci komórkowej. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy również pamiętać, że sieć myszy jest delikatna.

Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak stosowane w różnych szkołach średnich, wydajność MB we wszystkim, co odpowie na konkretne pytania, takie jak rozprzestrzenianie się wysp trzustkowych w unaczynieniu i wydajność. Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się transplantacją do zbadania leczenia cukrzycy typu I w więcej niż jednym fragmencie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeszczepić wyspy trzustkowe do sieci u myszy.