Name: Metoda przeszczepu wysp trzustkowych do sieci u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Naucz się przeszczepu wysp trzustkowych do sieci u myszy z wykorzystaniem hydrogelu. Ta metoda wspiera badania nad terapią cukrzycy typu I i poprawia przeżywalność komórek wyspowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niektórzy autorzy tej pracy byli częściowo wspierani przez granty z National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), Sanming Project of Medicine w Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021).

Wszystkie myszy użyte w tym badaniu zostały pozyskane z Centrum Medycznego dla Zwierząt w prowincji Guangdong. Wykorzystanie zwierząt zostało zatwierdzone przez Komisję ds. Oceny Etyki Drugiego Szpitala Ludowego w Shenzhen, zgodnie z zasadami dobrostanu zwierząt.
1. Przeszczep wysp trzustkowych do sieci
UWAGA: Ten protokół wymaga 2 osób do jego wykonania.
<ol>
	<li>Zbierz materiały chirurgiczne, które są wymienione w Tabeli 1. Przygotuj aseptyczne pole w polu operacyjnym za pomocą sterylnych materiałów, takich jak serwety i materiały jednorazowego użytku, i utrzymuj warunki aseptyczne przez cały czas operacji. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne. Noś sterylne fartuchy.</li>
	<li>Pobrać wysepki za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl pod mikroskopem stereoskopowym. Każda mysz otrzyma 450–500 ekwiwalentu wysepek (IEQ) na tansplant. Dla każdego zwierzęcia umieść wystarczającą ilość wysepek do pojedynczego przeszczepu w sterylnej probówce typu snap-top o pojemności 1,5 ml ze 100 μl pożywki CMRL-1066. 
	UWAGA: Wyspy trzustkowe można wyizolować w dniu przeszczepu, ale lepiej jest je odizolować dzień wcześniej, aby umożliwić powrót do zdrowia w procesie izolacji.</li>
	<li>Trzymaj rurki typu snap-top z wysepkami na lodzie, aż będą gotowe do przesadzenia.</li>
	<li>Rozmrozić hydrożel z matrycą membrany podstawnej i przechowywać go na lodzie po wyjęciu go z zamrażarki o temperaturze -20 °C. Hydrożel jest płynny w temperaturze od 4 °C do 10 °C i krzepnie w wyższych temperaturach.</li>
	<li>Zważ i oznacz wszystkie myszy biorców z cukrzycą. Wstrzyknąć dootrzewnowo 60 mg/kg pentobarbitalu sodu. Przetestuj głębokość znieczulenia, podając szczypanie palca u nogi. Podać dodatkowe 10 mg/kg pentobarbitalu sodu, jeśli zwierzę zareaguje na uszczypnięcie. Jeśli nie ma odruchu wycofania, poziom znieczulenia jest prawidłowy dla operacji.</li>
	<li>Wymaz z miejsca operowanego na brzuchu przy użyciu 70% etanolu. Ogol włosy z tego miejsca za pomocą żyletki i zdezynfekuj obszar za pomocą Jodoforu. Podawaj maść weterynaryjną do oczu, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek okulistycznych otwórz brzuch wzdłuż linii środkowej brzucha z nacięciem od 4 do 5 cm. Przesuń jelita na lewą stronę i przykryj gazą nasączoną solą fizjologiczną, aby zapobiec nadmiernemu odwodnieniu podczas zabiegu chirurgicznego.</li>
	<li>Użyj bawełnianych wacików, aby w pełni odsłonić pole widzenia żołądka i zlokalizować sieć (znajdującą się poniżej żołądka). Użyj dwóch par cienkich kleszczy, aby rozciągnąć sieć. Uważaj, aby nie dopuścić do rozdarcia.</li>
	<li>W tym momencie hydrożel jest całkowicie rozmrożony. Wirować probówkę z wysepkami przez 30 s przy 200 x g i usunąć supernatant. Odessać 50 μl hydrożelu, dodać go do probówki zawierającej wysepki i delikatnie zawiesić mieszankę, unikając tworzenia się pęcherzyków. Podczas zabiegu utrzymuj probówki na lodzie.</li>
	<li>Użyj dwóch kleszczy, aby podnieść krawędzie sieci i delikatnie ją podnieść, aby utworzyć rowek między ścianą żołądka a jelitami, który może pomieścić niewielką objętość płynu z przeszczepem wysp trzustkowych.</li>
	<li>Pozwól drugiej osobie asystować w procedurze i zassać zawieszoną mieszaninę wysepki i hydrożelu (całą zawartość probówki) za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl, Dostarczyć zawartość do rowka.</li>
	<li>Upewnij się, że mieszanina jest dobrze umieszczona w rowku, delikatnie podnosząc lub opuszczając krawędzie sieci komórkowej. Całkowite umiejscowienie mieszaniny w ciągu 3 minut, zanim hydrożel zestali się pod wpływem temperatury ciała. Po związaniu hydrożelu złóż sieć tak, aby pokryła przeszczep. 
	UWAGA: Sieć będzie przylegać do otaczającej ściany żołądka w miarę zestalania się hydrożelu.</li>
	<li>Po całkowitym zestaleniu hydrożelu użyj bawełnianych wacików, aby przestawić jelita z powrotem do jamy brzusznej, uważając, aby nie dotknąć miejsca przeszczepu.</li>
	<li>Dodaj 20 μl cefalosporyny (5 ~ 10 mg) do jamy brzusznej, aby zapobiec infekcji, a następnie użyj szwu 4-0, aby zamknąć brzuch.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w klatce i powtórz wszystkie kroki dla każdego odbiorcy myszy. Utrzymuj myszy w cieple i monitoruj wzrokowo, aż w pełni odzyskają wystarczającą świadomość, aby utrzymać leżącą mostek. Trzymaj myszy oddzielnie od innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieją.</li>
	<li>Wstrzykiwać 50 μl cefazoliny sodowej (0,05 mg/ml) codziennie przez tydzień w ramach profilaktyki pooperacyjnej. Podawać Bupiwakainę + Buprenorfinę, tj. Miejscowo nanieść 1-3 krople 0,25% bupiwakainy w miejsce nacięcia przed założeniem klipsów do ran. Podawać buprenorfinę (0,03 mg/ml ze sterylnym 0,9% soli fizjologicznej, 0,05-0,10 mg/kg) drogą dootrzewnową (IP). </li>
	<li>Zmierz poziom glukozy we krwi na czczo z próbki krwi z żyły ogonowej za pomocą glukometru raz dziennie po przeszczepie. Podczas przesadzania do sieci przeszczep wysp trzustkowych może mieć opóźnioną funkcję i nie osiągać całkowicie normalnego poziomu glukozy we krwi przez 2-3 tygodnie.</li>
	<li>W przypadku badania histologicznego należy usunąć przeszczep omentalny z myszy pod koniec eksperymentu po przeszczepie. Napraw tkankę zgodnie z protokołami histologicznymi. Przeszczep może być analizowany pod kątem barwienia immunologicznego lub badań immunofluorescencyjnych.</li>
</ol>
2. Alternatywna metoda przeszczepu do sieci
UWAGA: Alternatywny hydrożel fibrynowo-trombinowy, który jest używany w temperaturze pokojowej, może zostać zastąpiony hydrożelem z matrycą błony podstawnej. Składa się z 2 składników, roztworu białka uszczelniającego fibrynę (50 U/ml trombiny i 10 mg/ml fibrynogenu). Po zmieszaniu składniki tworzą skrzep, który utrzymuje wysepki na miejscu.
<ol>
	<li>Stosować związek hydrożelowy fibryno-tombin w temperaturze pokojowej. Podobnie jak w kroku 1.2, każda mysz otrzyma 450–500 ekwiwalentów wysp trzustkowych (IEQ) na przeszczep. Umieść wysepki w sterylnej probówce typu snap-top o pojemności 1,5 ml ze 100 μl pożywki CMRL-1066. Bezpośrednio przed przeszczepem odessać wyspy trzustkowe do sterylnej rurki PE50 o długości 10 cm i delikatnie odwirować (30 s przy 200 x g), aby utworzyć luźny osad</li>.
	<li>Przygotuj zwierzę, jak opisano powyżej (kroki 1.5-1.8) z rozłożoną siecią zębów. Wymieszać składniki hydrożelu (po 10 μl/każdy) i umieścić na sieci handlowej. (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D)</li>
	<li>Natychmiast wyrzuć wysepki z rurki na hydrożel. Hydrożel tworzy skrzep wokół wysepek. (<silna klasa="xfig">Rysunek 3E)</li>
	<li>Złóż sieć na hydrożel i wysepki, aby utworzyć torebkę. (<silna klasa="xfig">Rysunek 3F) Kontynuuj kroki od 1.13 do 1.18.</li>
</ol>

<ol><li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+research+and+clinical+practice%22%5BJournal%5D)">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes research and clinical practice. 103 (2), 137-149 (2014).</li>
<li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+Induction+Immunotherapy+Promotes+Long-Term+Insulin+Independence+After+Islet+Transplantation+in+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Potent Induction Immunotherapy Promotes Long-Term Insulin Independence After Islet Transplantation in Type 1 Diabetes.</a> American Journal of Transplantation. 12 (6), 1576-1583 (2012).</li>
<li>Moberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tissue+factor+by+pancreatic+islet+cells+as+a+trigger+of+detrimental+thrombotic+reactions+in+clinical+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+lancet%22%5BJournal%5D)">Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation.</a> The lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).</li>
<li>Nilsson, B., Ekdahl, K. N., Korsgren, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+instant+blood-mediated+inflammatory+reaction+to+improve+islets+of+Langerhans+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Organ+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Control of instant blood-mediated inflammatory reaction to improve islets of Langerhans engraftment.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 16 (6), 620-626 (2011).</li>
<li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+islet+function+in+islet+allotransplant+and+autotransplant+recipients%2C+despite+lower+islet+mass+in+autotransplants%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants.</a> Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).</li>
<li>Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+cell+transplantation+for+the+treatment+of+type+1+diabetes%3A+recent+advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+metabolic+syndrome+and+obesity%3A+targets+and+therapy%22%5BJournal%5D)">Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges.</a> Diabetes, metabolic syndrome and obesity: targets and therapy. 7, 211(2014).</li>
<li>Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27834384">Clinical pancreatic islet transplantation.</a> Nature reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).</li>
<li>Cantarelli, E., Piemonti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+transplantation+sites+for+pancreatic+islet+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+diabetes+reports%22%5BJournal%5D)">Alternative transplantation sites for pancreatic islet grafts.</a> Current diabetes reports. 11 (5), 364(2011).</li>
<li>Cantarelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+animal+models+for+preclinical+islet+transplantation%3A+no+model+fits+all+%28research+purposes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Murine animal models for preclinical islet transplantation: no model fits all (research purposes).</a> Islets. 5 (2), 79-86 (2013).</li>
<li>Beli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erratum+to%3A+CX3CR1+deficiency+accelerates+the+development+of+retinopathy+in+a+rodent+model+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Erratum to: CX3CR1 deficiency accelerates the development of retinopathy in a rodent model of type 1 diabetes.</a> J Mol Med (Berl). 95 (5), 565-566 (2017).</li>
<li>Hafner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+Patterns+of+Retinal+Oxygen+Saturation+and+Microvascular+Hemodynamic+Parameters+Preceding+Retinopathy+in+Patients+With+Type+II+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Regional Patterns of Retinal Oxygen Saturation and Microvascular Hemodynamic Parameters Preceding Retinopathy in Patients With Type II Diabetes.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (12), 5541-5547 (2017).</li>
<li>Schmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islets+find+a+new+transplant+home+in+the+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 82017(2017).</li>
<li>Voigt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+Progression+Rate+of+Diabetic+Retinopathy+in+Type+2+Diabetes+Patients+in+Correlation+with+the+Duration+of+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Endocrinol+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prevalence and Progression Rate of Diabetic Retinopathy in Type 2 Diabetes Patients in Correlation with the Duration of Diabetes.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. , (2017).</li>
<li>Baidal, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+of+an+Intraabdominal+Endocrine+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bioengineering of an Intraabdominal Endocrine Pancreas.</a> New England Journal of Medicine. 376 (19), 1887-1889 (2017).</li>
<li>Espes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+restoration+of+vascularity+and+oxygenation+in+mouse+and+human+islets+transplanted+to+omentum+may+contribute+to+their+superior+function+compared+to+intraportally+transplanted+islets%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets.</a> American Journal of Transplantation. , (2016).</li>
<li>Berman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+the+endocrine+pancreas%3A+intraomental+islet+transplantation+within+a+biologic+resorbable+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Bioengineering the endocrine pancreas: intraomental islet transplantation within a biologic resorbable scaffold.</a> Diabetes. 65 (5), 1350-1361 (2016).</li>
<li>Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28109023">Intraportal islet transplantation: the impact of the liver micro-environment.</a> Transplant International. 30 (3), 227-238 (2017).</li>
<li>Espes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+restoration+of+vascularity+and+oxygenation+in+mouse+and+human+islets+transplanted+to+omentum+may+contribute+to+their+superior+function+compared+to+intraportally+transplanted+islets%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets.</a> American Journal of Transplantation. 16 (11), 3246-3254 (2016).</li>
<li>Hajizadeh-Saffar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+VEGF+expression+by+human+embryonic+stem+cell-derived+mesenchymal+stromal+cells+reduces+the+minimal+islet+mass+required+to+reverse+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inducible VEGF expression by human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells reduces the minimal islet mass required to reverse diabetes.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Przeszczep wysp trzustkowych do wątroby przez żyłę wrotną jest najczęściej stosowaną metodą przeszczepiania wysp trzustkowych u ludzi, ale nadal istnieją obawy dotyczące skuteczności i bezpieczeństwa, takie jak zakrzepica żyły wrotnej i stłuszczenie wątroby17. Ostatnie badania pokazują, że sieć może być odpowiednią alternatywą dla wątroby, ale przed translacją kliniczną należy przeprowadzić więcej badań 12,14,18,19.<sup class="x...

Według Międzynarodowej Federacji Diabetologicznej (IDF), cukrzyca dotyka obecnie 382 miliony ludzi, z prognozowanym wzrostem do 592 milionów ludzi do 2035 roku1. Zarówno w przypadku allogenicznego, jak i ksenogenicznego przeszczepu wysp trzustkowych konieczne jest ogólnoustrojowe leczenie immunosupresyjne. Bez immunosupresji, odrzucenie immunologiczne jest główną przyczyną utraty przeszczepu2. Istnieje również poważny problem utraty przeszczepionych wysp trzustkowych z powodu natychmiastowej reakcji zapalnej za pośrednictwem krwi (IBMIR)3,4. Jednak nawet w przypadku braku odpowiedzi immunologicznej, takiej jak w modelach syngenicznych lub autotransplantacyjnych, komórki wysp trzustkowych przeszczepione do wątroby przez żyłę wrotną są tracone z powodu stanu zapalnego i/lub niekorzystnych warunków środowiskowych, takich jak słabe ukrwienie ze zmniejszonym natlenieniem i/lub składnikami odżywczymi5,6. W rezultacie, aby zapewnić długotrwałą funkcję metaboliczną, konieczna jest wyższa liczba wysp trzustkowych, aby skompensować początkową utratę komórek, która zmniejsza engraftment7.
W celu optymalizacji wszczepienia wysp trzustkowych, przetestowano eksperymentalnie i klinicznie kilka alternatywnych miejsc anatomicznych, uzyskując obiecujące, ale nie ostateczne wyniki8. Podczas gdy niektóre z alternatywnych miejsc oferują łatwy i bezpieczny dostęp (np. skóra, torebka nerkowa, błona podśluzowa żołądka i przednia komora oka) lub szerszą powierzchnię w przypadku większych mas wysp trzustkowych (np. jama otrzewnowa), przeżycie i fizjologiczna wydajność metaboliczna przeszczepionych wysp trzustkowych są nadal ograniczone i pozostają problemem9. Trwają poszukiwania bardziej odpowiedniego miejsca do szczepienia wysp trzustkowych.
Sieć była jednym z wielu miejsc anatomicznych, które były badane we wczesnym rozwoju przeszczepu wysp trzustkowych i okazała się skutecznym środowiskiem dla wysp trzustkowych10,11,12,13,14. Jednak infuzja z wysp trzustkowych wewnątrzwrotnych stała się wyborem klinicznym, częściowo ze względu na względną prostotę procedury i wczesny sukces w modelach zwierzęcych6. Ponadto, częściowo, negatywy związane z tym miejscem, szczególnie masowa wczesna utrata wysp trzustkowych, były mniej zrozumiałe i mniej ograniczające we wczesnych dniach eksperymentalnego przeszczepu wysp trzustkowych, w miarę dojrzewania pola. Dzięki nowszym przekonującym dowodom wskazującym, że wewnątrznaczyniowa infuzja wysp trzustkowych jest daleka od ideału, sieć ponownie pojawia się jako potencjalnie cenne miejsce do przeszczepu komórek.
Sieć (w formie woreczka na kapsułkę) oferuje względną przewagę nad wątrobą15,16. Jest dobrze unaczyniony i łatwo dostępny. Umożliwia pobranie przeszczepu (jeśli to konieczne) i/lub biopsję. Okres niedokrwienny doświadczany przez wyspy trzustkowe jest skrócony w porównaniu z wątrobą, a sieć może przyjąć stosunkowo duże masy wysp trzustkowych, co nie jest możliwe wewnątrzwrotnie, gdzie wzrost ciśnienia wrotnego może powodować powikłania.
Syngeniczny mysi model transplantacji został wykorzystany w protokole testowanym w badaniu, wykorzystując samce myszy C57BL/6 w wieku od 6 do 8 tygodni o masie ciała 20-25 g. Biorcy wysp trzustkowych zostali uznani za diabetyków po pojedynczym wstrzyknięciu streptozotocyny w dawce 250 mg/kg ip. Indukcję cukrzycy można uznać za udaną, jeśli poziom glukozy we krwi myszy jest większy niż 24 mmol/L 48 godzin po wstrzyknięciu i utrzymuje się powyżej tego poziomu przez co najmniej 5 dni.
Syngeniczne wyspy trzustkowe zostały wyizolowane z trzustki dawców o dopasowanym wieku, stosując wcześniej opublikowane metody z pewnymi modyfikacjami. Krótko mówiąc, kolagenaza została wstrzyknięta do woreczka żółciowego zamiast do przewodu żółciowego. Zostało to zrobione jako ulepszenie w celu ułatwienia wstrzykiwania. Po infuzji kolagenazy następowała inkubacja, rozbijanie tkanek, separacja gradientu gęstości i ręczne zbieranie w celu uzyskania czystych wysepek. Wyspy trzustkowe hodowano przez noc w pożywce CMRL-1066 uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) w kolbach T175 w temperaturze 37 °C, poniżej 95% powietrza-5% CO2 przed przeszczepem.

<table><tbody><tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 cala (12-13 cm) Nożyczki</td><td>RWD Nauki przyrodnicze&nbsp;</td><td>S12030-11</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze cienkie</td><td>RWD Life Science</td><td>F11010-13</td><td></td></tr><tr><td>Klipsy do małych ran</td><td>RWD Life Science</td><td>R33003-01</td><td></td></tr><tr><td>Acutenaculum</td><td>RWD Life Science</td><td>F31044-13</td><td></td></tr> 2 <tr><td>pary kleszczyków do tkanek</td><td>RWD Life Science</td><td>&nbsp; F13023-10</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Szew z igłą</td><td>Chenghe, Chiny</td><td>17094</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipeta i końcówki</td><td>Gilson</td><td>PN11</td><td></td></tr><tr><td>One Touch ultraeasy Podstawowy system monitorowania stężenia glukozy we krwi&nbsp; &nbsp;</td><td>Johnson & Żyletka Johnson</td><td>33391713</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Philips</td><td>HC1099/15</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Materiał i zwierzęta</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sód</td><td></td><td>Sigmaaldrich.com P3761</td><td>Do znieczulenia&nbsp;</td></tr><tr><td>Hydrożel&nbsp;</td><td>bdbiosciences.com</td><td>356234</td> Hydrożel fibrynowo-trombinowy z <td>matrycą błony podstawnej</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Baxter.com</td><td>1501250</td><td>Składniki skrzepają po zmieszaniu</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Yingniu medical, Anhui, Chiny</td><td>23170608</td><td></td></tr><tr><td>Iodophor</td><td>Lierkang medical technology, Shangdong, Chiny</td><td>170521</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna zwykła</td><td>Baxter.com</td><td>2B1324</td><td></td></tr><tr><td>Cefalosporyna</td><td>Lukang medical, Shangdong, Chiny</td><td>150303</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolin</td><td>Baxter.com</td><td>2G3508</td><td></td></tr><tr><td>smarująca maść do oczu</td><td>Główne farmaceutyki</td><td>203964</td><td></td></tr><tr><td>streptozotocyna</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>kolagenaza typu V</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>C9262</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066 media</td><td>celltrans, Wenzhou, Chiny</td><td>X018D1</td><td></td></tr><tr><td>histopaque</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>10771</td> gradient <td>gęstości</td></tr><tr><td>rury PE50</td><td>Braintreesci.com</td><td>PE50 100 FT</td><td>Polietylen .023" x .038</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>C1359</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>optymalna temperatura cięcia związek (OCT)</td><td>Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL</td><td>4583</td><td>osadzanie pożywki</td></tr><tr><td>z przeciwciałem przeciwko insulinie</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej, Danvers, MA 01923</td><td>8138S</td> media do barwienia hematoksyliny <td></td></tr><tr><td></td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej, Danvers, MA 01923</td><td>14166S</td><td></td></tr><tr><td>media do barwienia eozyny</td><td>Beyotime Biotech, Chiny</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&nbsp;</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 Myszy</td><td>Centrum Medyczne dla Zwierząt w prowincji Guangdong</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>SH30084</td><td></td></tr><tr><td>Kolby T175</td><td>Falcon</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki zatrzaskowe</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda przeszczepu wysp trzustkowych do sieci u myszy

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Przeszczep wysp trzustkowych został zaproponowany jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1. Ostatnie przekonujące dowody wskazują, że wewnątrznaczyniowa infuzja wysp trzustkowych jest daleka od ideału, a zatem sieć ponownie pojawia się jako potencjalnie cenne miejsce do przeszczepu wysp trzustkowych. Eksperyment ten wymaga wyizolowania wysokiej jakości wysp trzustkowych i zagnieżdżenia się wysp trzustkowych biorcom z cukrzycą. Przeszczep do sieci wymaga czynności chirurgicznych, które można lepiej zademonstrować wizualnie. Tutaj przedstawiono szczegółowe kroki tej procedury. Opisano tutaj dwie metody mieszania izolowanych wysepek z hydrożelem przed umieszczeniem mieszaniny w woreczku omentalnym myszy z cukrzycą. W różnych warunkach stosuje się różne hydrożele. Poziom glukozy we krwi myszy z cukrzycą, u których zastosowano syngeniczne wyspy trzustkowe w sieci komórkowej, monitorowano przez okres do 35 dni. Niektóre zwierzęta uśmiercono po 14 dniach w celu przeprowadzenia analizy immunohistochemicznej. To podejście oparte na przeszczepianiu przedklinicznym może być wykorzystane jako dane wstępne prowadzące do przełożenia na przeszczep kliniczny.

Stan trzustki po trawieniu przedstawiono na Rysunku 1A. Oczyszczone wysepki przedstawiono na Rysunku 1B. Barwienie dytyzonem oraz testy żywotności wysepek przedstawiono na Rysunku 2. Główne etapy transplantacji wysepek do sieci wielkoprzeponowej przedstawiono na Rysunku 3. Poziomy glukozy we krwi biorców po transplantacji do sieci wielkoprzeponowej przedstawiono na <stro...

Wprowadzono metodę przeszczepiania wysp trzustkowych u myszy. Wyizolowane wysepki miesza się z hydrożelem, a mieszaninę umieszcza się w woreczku omentalnym myszy z cukrzycą. Następnie monitorowany jest poziom glukozy we krwi i wykonywana jest analiza immunohistochemiczna.

Metoda przeszczepu wysp trzustkowych do sieci u myszy

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przeszczepiania wysp trzustkowych, takie jak przeszczep wysp trzustkowych do sieci komórkowej. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię cukrzycy typu I, ponieważ sieć ponownie pojawia się jako potencjalne miejsce do przeszczepu wysp trzustkowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że izolowane wysepki miesza się z hydrożelem, a mieszaninę umieszcza się w woreczku sieci myszy z cukrzycą.Zacznij od przygotowania aseptycznego pola w polu operacyjnym ze sterylnego materiału, takiego jak serwety i materiały jednorazowego użytku. Umieść wysterylizowane narzędzia chirurgiczne w polu aseptycznym . Pobrać wysepki dawcze pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 mikrolitrów.Dla każdego zwierzęcia należy pobrać od 450 do 500 wysepek i przenieść do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki typu snap z 100 mikrolitrami pożywki CMRL 10 66. Umieść probówkę na lodzie, aż będzie gotowa do przesadzenia. Po zebraniu wysepek rozmrozić hydrożel z matrycą błony podstawnej na lodzie.Zważ i oznacz wszystkie myszy biorców z cukrzycą. Po znieczuleniu pierwszej myszy zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonym protokołem, przetestuj głębokość znieczulenia, podając szczypanie palca u nogi. Jeśli nie ma odruchu odstawienia, poziom znieczulenia jest prawidłowy do operacji.Podawaj maść weterynaryjną do oczu, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Przetrzyj jamę brzuszną 70% etanolem. Następnie zgolić włosy z miejsca operacji.Przykryj zwierzę sterylną zasłoną i zdezynfekuj obszar peelingiem jodowym. Po użyciu nożyczek okulistycznych do wykonania 4 do 5 centymetrowego nacięcia wzdłuż linii środkowej brzucha, przesuń jelita na lewą stronę i przykryj gazą nasączoną solą fizjologiczną, aby zapobiec odwodnieniu podczas zabiegu chirurgicznego. Następnie użyj bawełnianych wacików, aby całkowicie odsłonić żołądek i zlokalizować sieć poniżej żołądka.W tym momencie hydrożel powinien zostać całkowicie rozmrożony. Obracać probówkę zawierającą wysepki 200 razy g przez 30 sekund. Po wirowaniu usunąć supernatant.Następnie odessać 50 mikrolitrów hydrożelu, dodać go do probówki zawierającej wysepki i delikatnie wymieszać, unikając tworzenia się pęcherzyków. Następnie użyj dwóch par kleszczy, aby podnieść krawędzie sieci i delikatnie ją podnieść, aby utworzyć rowek między ścianą żołądka a jelitami. Na tym etapie operacji potrzebna jest druga osoba, która odessie mieszaninę hydrożelu z zawieszonymi wyspami trzustkowymi za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów i dostarczy ją do rowka.Upewnij się, że mieszanina jest dobrze umieszczona w rowku, delikatnie podnosząc lub opuszczając krawędzie sieci komórkowej. Zakończ pozycjonowanie mieszaniny w ciągu trzech minut, zanim hydrożel zestale się. Po związaniu hydrożelu złóż sieć tak, aby pokryła przeszczep.Sieć przylega do otaczającej ściany żołądka, gdy hydrożel zestala się. Gdy hydrożel całkowicie zastygnie, użyj bawełnianych wacików, aby zmienić położenie jelit w jamie brzusznej, uważając, aby nie dotknąć miejsca przeszczepu. Następnie dozuj 200 mikrolitrów odpowiedniego antybiotyku do jamy brzusznej, aby zapobiec infekcji.Następnie użyj szwu 4 O, aby zamknąć brzuch. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ miejsca sieci u myszy są małe i męczące do oceny. Umieść mysz w rozgrzanej klatce regeneracyjnej, aż w pełni odzyska zewnętrzną stabilność.Następnego dnia, a następnie codziennie przez tydzień, wstrzykuj antybiotyk w ramach profilaktyki pooperacyjnej. Mierz również poziom glukozy we krwi na czczo z próbki krwi z żyły ogonowej za pomocą glukometru raz dziennie po przeszczepie. Podczas przesadzania do sieci przeszczep wysp trzustkowych może mieć opóźnioną funkcję i nie osiągać całkowicie normalnego poziomu glukozy we krwi przez dwa do trzech tygodni.Przeszczepiona tkanka została pobrana od myszy poddanej eutanazji 14 dni po przeszczepie. Tutaj przeszczep jest widoczny jako skupisko jąder po barwieniu DAPI. Funkcjonalność przeszczepionej tkanki ujawnia się poprzez barwienie immunofluorescencyjne przeciwciałami antyinsulinowymi.Barwienie H&E pokazuje przeszczepione tkanki otoczone adipocytami sieci komórkowej. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy również pamiętać, że sieć myszy jest delikatna.Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak stosowane w różnych szkołach średnich, wydajność MB we wszystkim, co odpowie na konkretne pytania, takie jak rozprzestrzenianie się wysp trzustkowych w unaczynieniu i wydajność. Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się transplantacją do zbadania leczenia cukrzycy typu I w więcej niż jednym fragmencie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeszczepić wyspy trzustkowe do sieci u myszy.

a-method-for-islet-transplantation-to-the-omentum-in-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nasz protokół został opracowany w celu czystego i łatwego wprowadzania wysepek lub komórek pod torebkę nerkową myszy. Komórki są zagęszczane w postaci pelletów w końcowej części cewki używanej do transplantacji komórek pod torebkę nerkową. Prostota tej techniki zmniejsza stres dla komórek oraz myszy.

Transplantacja wysepek trzustkowych do torebki nerki u myszy z cukrzycą

Przeszczepianie wyizolowanych wysepek zostało zaproponowane jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1. W niniejszym materiale opisujemy metodę izolacji wysepek z trzustek myszy oraz ich transplantacji do przestrzeni podtorebkowej nerki.

Metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki

Ten film opisuje protokół szczepienia ludzkich wysp trzustkowych do przedniej komory oka myszy w celu monitorowania rewaskularyzacji ludzkich przeszczepów wysp trzustkowych in vivo. Pomaga również zrozumieć udział komórek biorcy i dawcy w promowaniu enkapsulacji i unaczynienia przeszczepu.

Szczepienie wysp trzustkowych: metoda wszczepiania wysp trzustkowych do przedniej komory oka myszy w celu obrazowania in vivo

W tym filmie opisujemy procedurę wprowadzania komórek wysp trzustkowych do żyły wrotnej wątroby, a następnie aplikacji pianki żelowej, aby skutecznie zapobiec krwawieniu. Krwawienie pooperacyjne jest częstą przyczyną wysokiej śmiertelności podczas przeszczepu wysp trzustkowych.

Mysi model przeszczepu wysp trzustkowych: chirurgiczna metoda wprowadzania wysp trzustkowych do żyły wrotnej i zapobiegania krwawieniu pooperacyjnemu

Ten protokół demonstruje izolację mysich wysepek i zasiewanie ich na rusztowaniu zdecelularycznym. Wyspy trzustkowe wsparte na rusztowaniach przeszczepiono do poduszeczki tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ). Wyspy trzustkowe przetrwały w miejscu przeszczepu i odwróciły stan hiperglikemii.

Wspomagany rusztowaniem przeszczep wysp trzustkowych w poduszce tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą

Przeszczep wysp trzustkowych jest sposobem na osiągnięcie normoglikemii w cukrzycy typu 1. Ten artykuł koncentruje się na technice przeszczepiania drogą wewnątrzwrotną w celu utrzymania prawidłowego poziomu glukozy u myszy z cukrzycą.

Wewnątrzportalowy przeszczep wysp trzustkowych w modelu mysim

Tutaj prezentujemy protokół walidacji in vivo terapii komórkowej opartej na hydrożelu, zilustrowany przykładem przeszczepu wysp trzustkowych. Implantacja h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING) pozwala na implantację mieszaniny komórkowo-hydrożelowej między warstwami omentalnymi, w pobliżu naczyń krwionośnych, aby zmaksymalizować wszczepienie w odpowiednim środowisku metabolicznym.

Przeszczep wysp trzustkowych wewnątrzomentalnych za pomocą h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING)

W tym protokole opisana jest metoda izolacji i przeszczepu mysich wysp trzustkowych do pachwinowej podskórnej białej tkanki tłuszczowej. Izolowane syngeniczne mysie wysepki są przeszczepiane mysiemu biorcy za pomocą hydrożelu z błony podstawnej. Monitorowany jest poziom glukozy we krwi biorców i przeprowadzana jest analiza histologiczna przeszczepów wysp trzustkowych.

Pachwinowy podskórny model przeszczepu białej tkanki tłuszczowej (ISWAT) mysich wysp trzustkowych

Ta metoda przeszczepiania wysp trzustkowych pokrytych tłuszczem jest odpowiednia do wykrywania wszczepionych wysp trzustkowych w jamie wewnątrzotrzewnowej. Co ważne, nie wymaga stosowania środków wiążących biologicznie ani szycia.

Przeszczep wysp trzustkowych pokrytych tłuszczem z wykorzystaniem białej tkanki tłuszczowej najądrza

Tutaj prezentujemy wyrafinowane procedury chirurgiczne dotyczące skutecznego przeprowadzenia przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrz portalu, klinicznie istotnej, ale technicznie trudnej procedury chirurgicznej u myszy.

Minimalizacja krwawienia z żyły wrotnej po infuzji podczas przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrzwątrobowych u myszy

W tym protokole omawiamy implementację modelu udanego ortotopowego przeszczepu wątroby (OLT) u myszy. Dodatkowo omówiono adiuwanty do dalszej analizy drożności przeszczepu allogenicznego po udanym OLT u myszy, w szczególności z wykorzystaniem skanów tomografii mikrokomputerowej (microCT).

Udany ortotopowy przeszczep wątroby u myszy z wykorzystaniem angiografii tomografii mikrokomputerowej

Naucz się przeszczepu wysp trzustkowych do sieci u myszy z wykorzystaniem hydrogelu. Ta metoda wspiera badania nad terapią cukrzycy typu I i poprawia przeżywalność komórek wyspowych.

Metoda przeszczepu wysp trzustkowych do sieci u myszy

Przeglądaj więcej filmów