Name: Protokoły wytwarzania ekosystemów (EcoFAB) do budowy ekosystemów laboratoryjnych przeznaczonych do badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Poznaj protokoły budowy EcoFAB do badania interakcji roślin z mikroorganizmami w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Metoda wykorzystuje druk 3D i spektrometrię masową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez program Laboratory Directed Research and Development (LDRD) Lawrence Berkeley National Laboratory, wspierany przez Biuro Nauki, Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych na podstawie umowy nr DE-AC02-05CH11231 oraz nagrodę DE-SC0014079 przyznaną przez Biuro Naukowe Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych dla Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley. Prace w Odlewni Molekularnej były wspierane w ramach umowy nr U.S. Department of Energy (U.S. Department of Energy). DE-AC02-05CH11231. Dziękujemy również Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjaminowi P. Bowenowi i Benjaminowi J. Cole'owi z Lawrence Berkeley National Laboratory za całą ich pomoc.

<ol><li>Morrissey, J. P., Dow, J. M., Mark, G. L., O'Gara, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+microbes+at+the+root+of+a+solution+to+world+food+production%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Are microbes at the root of a solution to world food production.</a> EMBO Rep. 5 (10), 922-926 (2004).</li>
<li>Farrar, K., Bryant, D., Cope-Selby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+engineering+beneficial+plant-microbe+interactions%3A+plant+growth+promotion+in+energy+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Understanding and engineering beneficial plant-microbe interactions: plant growth promotion in energy crops.</a> Plant Biotechnol J. 12 (9), 1193-1206 (2014).</li>
<li>Singh, J. S., Abhilash, P. C., Gupta, V. K. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(16)30084-1">Agriculturally Important Microbes in Sustainable Food Production.</a> Trends Biotechnol. 34 (10), 773-775 (2016).</li>
<li>Dubey, R. K., Tripathi, V., Dubey, P. K., Singh, H. B., Abhilash, P. C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959652615019022">Exploring rhizospheric interactions for agricultural sustainability: the need of integrative research on multi-trophic interactions.</a> J Clean Prod. 115, 362-365 (2016).</li>
<li>Hunter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+microbiomes+and+sustainable+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Plant microbiomes and sustainable agriculture.</a> EMBO Rep. 17 (12), 1696-1699 (2016).</li>
<li>van der Heijden, M. G. A., Hartmann, M. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.1002378">Networking in the Plant Microbiome.</a> PLoS Biol. 14 (2), e1002378(2016).</li>
<li>Vessey, J. K. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1026037216893">Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers.</a> Plant Soil. 255 (2), 571-586 (2003).</li>
<li>Yang, J., Kloepper, J. W., Ryu, C. -M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19056309">Rhizosphere bacteria help plants tolerate abiotic stress.</a> Trends Plant Sci. 14 (1), 1-4 (2009).</li>
<li>Reynolds, H. L., Packer, A., Bever, J. D., Clay, K. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1890/02-0298/abstract">GRASSROOTS ECOLOGY: PLANT-MICROBE-SOIL INTERACTIONS AS DRIVERS OF PLANT COMMUNITY STRUCTURE AND DYNAMICS.</a> Ecology. 84 (9), 2281-2291 (2003).</li>
<li>Finkel, O. M., Castrillo, G., Herrera Paredes, S., Salas González, I., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369526617300158">Understanding and exploiting plant beneficial microbes.</a> Curr Opin Plant Biol. 38, 155-163 (2017).</li>
<li>Northen, T. R., Zhang, Z., Gao, J., Swenson, T., Yoshikuni, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK447357/">Advancing Our Understanding of the Chemistry of Soil Microbiomes.</a> National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. 2017. The Chemistry of Microbiomes: Proceedings of a Seminar Series. , The National Academies Press. Washington, DC. (2017).</li>
<li>Busby, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+priorities+for+harnessing+plant+microbiomes+in+sustainable+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture.</a> PLOS Biology. 15 (3), e2001793(2017).</li>
<li>Sanati Nezhad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+platforms+for+plant+cells+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic platforms for plant cells studies.</a> Lab Chip. 14 (17), 3262-3274 (2014).</li>
<li>Oburger, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0098847212002328">Evaluation of a novel tool for sampling root exudates from soil-grown plants compared to conventional techniques.</a> Environ Exp Bot. 87, 235-247 (2013).</li>
<li>Van Der Krift, T. A. J., Berendse, F. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2435.2002.00611.x/full">Root life spans of four grass species from habitats differing in nutrient availability.</a> Funct Ecol. 16 (2), 198-203 (2002).</li>
<li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> P Natl. Acad. Sci. USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li>
<li>Sanati Nezhad, A., Naghavi, M., Packirisamy, M., Bhat, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cellular+penetrative+forces+using+lab-on-a-chip+technology+and+finite+element+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Quantification of cellular penetrative forces using lab-on-a-chip technology and finite element modeling.</a> P Natl. Acad. Sci. USA. 110 (20), 8093-8098 (2013).</li>
<li>Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+chip+for+high-throughput+phenotyping+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis.</a> Lab Chip. 14 (7), 1281-1293 (2014).</li>
<li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.3604788">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98 (26), 263703(2011).</li>
<li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).</li>
<li>Aufrecht, J. A., Ryan, J. M., Hasim, S., Allison, D. P., Nebenführ, A., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+Root+Hair+Morphology+of+Arabidopsis+Seedlings+in+a+Two-layer+Microfluidic+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform.</a> J. Vis. Exp. (126), (2017).</li>
<li>Garvin, D. F., et al. <a target="_blank" href="https://dl.sciencesocieties.org/publications/cs/abstracts/48/Supplement_1/S-69">Development of Genetic and Genomic Research Resources for Brachypodium distachyon, a New Model System for Grass Crop Research.</a> Crop Sci. 48 (Supplement_1), S69-S84 (2008).</li>
<li>Lisensky, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed076p537">Replication and Compression of Surface Structures with Polydimethylsiloxane Elastomer.</a> J. Chem. Educ. 76 (4), 537(1999).</li>
<li>Friend, J., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+devices+using+polydimethylsiloxane%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane.</a> Biomicrofluidics. 4 (2), 026502(2010).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Metabolomics+Datasets+with+High-Performance+Computing+and+Metabolite+Atlases%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Analysis of Metabolomics Datasets with High-Performance Computing and Metabolite Atlases.</a> Metabolites. 5 (3), 431-442 (2015).</li>
<li>Sumner, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+minimum+reporting+standards+for+chemical+analysis+Chemical+Analysis+Working+Group+%28CAWG%29+Metabolomics+Standards+Initiative+%28MSI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Proposed minimum reporting standards for chemical analysis Chemical Analysis Working Group (CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI).</a> Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).</li>
<li>Gao, J., de Raad, M., Bowen, B. P., Zuckermann, R. N., Northen, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Black+Silicon+for+Nanostructure-Initiator+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Application of Black Silicon for Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 88 (3), 1625-1630 (2016).</li>
<li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology-Driven+Control+of+Metabolite+Selectivity+Using+Nanostructure-Initiator+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Morphology-Driven Control of Metabolite Selectivity Using Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 89 (12), 6521-6526 (2017).</li>
<li>Woo, H. -K., Northen, T. R., Yanes, O., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructure-initiator+mass+spectrometry%3A+a+protocol+for+preparing+and+applying+NIMS+surfaces+for+high-sensitivity+mass+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nanostructure-initiator mass spectrometry: a protocol for preparing and applying NIMS surfaces for high-sensitivity mass analysis.</a> Nat. Protoc. 3 (8), 1341-1349 (2008).</li>
<li>Rübel, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenMSI%3A+A+High-Performance+Web-Based+Platform+for+Mass+Spectrometry+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">OpenMSI: A High-Performance Web-Based Platform for Mass Spectrometry Imaging.</a> Anal. Chem. 85 (21), 10354-10361 (2013).</li>
<li>López-Bucio, J., Cruz-Ramı́rez, A., Herrera-Estrella, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+nutrient+availability+in+regulating+root+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of nutrient availability in regulating root architecture.</a> Curr Opin Plant Biol. 6 (3), 280-287 (2003).</li>
<li>Lynch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steep%2C+cheap+and+deep%3A+an+ideotype+to+optimize+water+and+N+acquisition+by+maize+root+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Bot%22%5BJournal%5D)">Steep, cheap and deep: an ideotype to optimize water and N acquisition by maize root systems.</a> Ann. Bot. 112 (2), 347-357 (2013).</li>
<li>Rellán-Álvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLO-Roots%3A+an+imaging+platform+enabling+multidimensional+characterization+of+soil-grown+root+systems%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">GLO-Roots: an imaging platform enabling multidimensional characterization of soil-grown root systems.</a> eLife. 4, e07597(2015).</li>
<li>Kamilova, F., Validov, S., Azarova, T., Mulders, I., Lugtenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+for+enhanced+competitive+plant+root+tip+colonizers+selects+for+a+new+class+of+biocontrol+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria.</a> Environ. Microbiol. 7 (11), 1809-1817 (2005).</li>
<li>Klitgaard, A., Nielsen, J. B., Frandsen, R. J. N., Andersen, M. R., Nielsen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Stable+Isotope+Labeling+and+Molecular+Networking+for+Biosynthetic+Pathway+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Combining Stable Isotope Labeling and Molecular Networking for Biosynthetic Pathway Characterization.</a> Anal. Chem. 87 (13), 6520-6526 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawione tutaj protokoły wykorzystania produkcji ekosystemów do tworzenia EcoFAB zapewniają zasoby społecznościowe do systematycznych badań biologii roślin w ściśle kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Postępy w druku 3D zapewniają szeroko dostępne technologie konstruowania i iteracyjnego udoskonalania projektów EcoFAB. Stwierdzono, że przedstawiona tutaj komora korzeniowa dobrze nadaje się do obrazowania mikroskopowego i utrzymywania sterylności, umożliwiając kontrolowane dodawanie drobnoustrojów w celu zbadania interakcji między roślinami a mikroorganizmami. Platforma EcoFAB jest kompatybilna z różnymi gatunkami roślin. Ważne jest, aby rozpoznać fizjologiczne skutki uprawy roślin w wąskiej komorze korzeniowej, tak że konieczne będą dodatkowe eksperymenty w celu uogólnienia wyników na rośliny rosnące w środowisku naturalnym.
Zastosowanie sterylnych komór i światła LED do uprawy umożliwia równoległe badanie wpływu różnych warunków oświetleniowych, w tym długości fali, intensywności i czasu trwania, na wzrost roślin i związane z nimi parametry fizjologiczne. Odwracalne komory korzeniowe pozwalają na stosowanie substratów stałych, a także na przestrzenne pobieranie próbek stałych do analizy biochemicznej i genetycznej. Zastosowania podłoży stałych, takich jak gleba, piasek i kulki kwarcowe, dają możliwości wykorzystania EcoFAB do budowy ekosystemów laboratoryjnych o bardziej ekologicznym znaczeniu. Jednak wszystkie przedstawione tutaj systemy wykorzystują nasycone ciecze (kultury hydroponiczne), które nie są dokładnym odzwierciedleniem większości gleb i ważne będzie dalsze udoskonalanie tych projektów, aby utrzymać kieszenie powietrzne w glebie, tak aby lepiej reprezentowały naturalne gleby.
Opisano użycie zarówno prostych kamer, jak i mikroskopów do obrazowania rozwoju morfologii systemu korzeniowego zarówno na poziomie masowym, jak i komórkowym. Ta przydatność do monitorowania morfologii korzeni, obrazowania i kwantyfikacji będzie prawdopodobnie pomocna w zrozumieniu mechanizmów regulacyjnych sygnałów fizjologicznych i molekularnych roślin wyzwalanych przez adaptacje genotypowe roślin do warunków wzrostu. Ograniczeniem w badaniu fizjologicznego rozwoju korzeni jest jednak obecne poziome rozmieszczenie urządzenia EcoFAB. W środowisku naturalnym reakcja grawitropowa korzeni prowadzi do przeważającego pionowego rozwoju systemu korzeniowego. W związku z tym prezentowany tutaj system poziomy prawdopodobnie różni się pod pewnymi względami od środowiska naturalnego, a wytworzenie systemów EcoFAB z pionowym umieszczeniem komory korzeniowej jest pożądanym celem dla przyszłych wersji EcoFAB. Mimo że obecne urządzenia EcoFAB są umieszczone poziomo, możliwa jest analiza parametrów morfologii korzeni w różnych warunkach lub w odpowiedzi na drobnoustroje. Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości można zastosować do uchwycenia dynamiki kolonizacji korzeni pojedynczych izolatów lub zbiorowisk, dostarczając informacji o tym, które części roślin są skolonizowane w różnych warunkach wystarczającej i niedoboru składników odżywczych. Oczekuje się, że takie badania dostarczą ważnych nowych informacji na temat tego, w jaki sposób budowane są mikrobiomy roślin i jak ta dynamika zmienia się w czasie, na przykład w miarę rozwoju korzeni.
Urządzenia mikroprzepływowe umożliwiają obrazowanie bardzo młodych roślin, a zwykle ilość pobranych metabolitów nie jest wystarczająca do analizy LCMS. Systemy glebowe, takie jak ryzotrony, umożliwiają obrazowanie morfologii korzeni, gdy rośliny są przekształcane za pomocą konstruktu chemiluminescencyjnego (Glo-root) lub metod opartych na NMR 33,34. Ekstrakcja metabolitów z tych układów jest czasochłonna ze względu na dużą objętość próbek. EcoFAB są połączeniem obu: produkcja jest podobna do urządzeń mikroprzepływowych. EcoFABy zostały zaprojektowane tak, aby były proste i niedrogie w rozmnażaniu, ale wielkość komory można dostosować do uprawy roślin o małych lub dużych systemach korzeniowych, aż do ich etapów reprodukcyjnych. Możliwe są jednoczesne obserwacje zmian morfologicznych korzeni i wysięku korzeniowego. System jest sterylny, co umożliwia kontrolowane dodawanie określonych drobnoustrojów.
EkoLAB zaprojektowano tak, aby umożliwić kontrolowane wprowadzanie i pobieranie próbek drobnoustrojów i metabolitów. W szczególności stwierdzono, że próbki pobrane z komór wzrostu korzeni są wystarczające do profilowania metabolitów metodą spektroskopii mas. Integracja obrazowania za pomocą spektrometrii mas (np. technika NIMS przedstawiona tutaj) zapewnia nieniszczące podejście do badania rozkładu przestrzennego metabolitów w systemach korzeniowych. Technika ta będzie prawdopodobnie pomocna w przyszłych eksperymentach ze śledzeniem stabilnych izotopów i mapowaniem lokalizacji drobnoustrojów do określonych metabolitów36. Chociaż protokół ten skupia się na pojedynczych izolatach, ten sam projekt z pewnością może być stosowany w przypadku bardziej złożonych społeczności. Objętości próbek i biomasa w ramach EcoFAB są prawdopodobnie więcej niż wystarczające do dalszej integracji z technologiami sekwencjonowania DNA, które będą ważne dla scharakteryzowania i monitorowania struktury społeczności drobnoustrojów i ekspresji genów.
Podsumowując, protokół ten szczegółowo opisuje wytwarzanie ekosystemów laboratoryjnych przeznaczonych do badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami, z naciskiem na proste i dostępne metody, które mogą być łatwo wdrażane i rozszerzane przez naukowców na całym świecie. Obecne wysiłki mają na celu wykazanie odtwarzalności między laboratoriami i integracji systemu kontroli temperatury, tak aby każdy EcoFAB miał niezależnie kontrolowane światło i temperaturę. Kolejnym krokiem naprzód w rozwoju systemu będzie integracja automatycznego pobierania próbek i ponownego napełniania komór korzeniowych EcoFAB oraz opracowanie powtarzalnych protokołów tworzenia odpowiednich mikrobiomów roślin w ramach EcoFAB.

Zastosowanie pożytecznych mikroorganizmów roślinnych w rolnictwie oferuje ogromny potencjał do zwiększenia zrównoważonej produkcji żywności i biopaliw, aby zapewnić rosnącą populację1,2,3,4. Znaczna ilość pracy potwierdza znaczenie mikrobiomów roślinnych w pobieraniu składników odżywczych przez rośliny, tolerancji na stres i odporności na choroby5,6,7,8. Trudno jest jednak zbadać te mechanizmy interakcji roślina-mikroorganizm w ekosystemach terenowych ze względu na złożoność i związaną z tym niepowtarzalność oraz niemożność precyzyjnego kontrolowania składu mikrobiomu i genetyki (np. przy użyciu mutantów mikrobiologicznych)4,9,10.
Jedną ze strategii jest konstruowanie uproszczonych ekosystemów modelowych, aby umożliwić kontrolowane, replikowane eksperymenty laboratoryjne badające interakcje między roślinami a mikroorganizmami w celu generowania spostrzeżeń, które mogą być dalej testowane w terenie10,11,12. Koncepcja ta opiera się na tradycyjnych podejściach wykorzystujących rośliny uprawiane w doniczkach wypełnionych glebą lub na płytach agarowych w szklarniach lub inkubatorach13. Chociaż prawdopodobnie pozostaną one najpowszechniej stosowanymi podejściami, brakuje im możliwości precyzyjnego monitorowania i manipulowania środowiskiem wzrostu roślin. W związku z tym rizoboxy i ryzotrony stanowią znaczne ulepszenie zdolności do badania procesów zachodzących pod ziemią14,15, a także opublikowano pierwsze protokoły analizy metabolitów ryzosfery w glebie16. Niedawno, aby umożliwić analizę o wysokiej przepustowości, zaawansowane urządzenia mikroprzepływowe13,17, takie jak Plant Chip18,19, RootArray20 i RootChip21, zostały opracowane jako wydajne narzędzia do fenotypowania roślin z rozdzielczością przestrzenną w skali mikrometra do monitorowania wczesnych etapów wzrostu małej rośliny modelowej Arabidopsis Thaliana w podłożu przepływającym ciecz. Niedawno opisano dwuwarstwową platformę obrazowania, która umożliwia obrazowanie włośnika pospolitego Arabidopsis thaliana na etapie siewki za pomocą platformy mikroprzepływowej22.
Tutaj znajdują się szczegółowe protokoły budowy kontrolowanych urządzeń laboratoryjnych (EcoFAB), do badania interakcji mikroorganizmów roślinnych i pokazują, że mogą być używane do badania różnych roślin, w tym Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon23, ekologicznie ważnego dzikiego owsa Avena barbata i rośliny bioenergetycznej Panicum virgatum (Rózga rózgowata). EcoFAB to sterylna platforma do uprawy roślin, która składa się z dwóch podstawowych elementów: urządzenia EcoFAB i sterylnego przezroczystego pojemnika wielkości rośliny. Urządzenie EcoFAB jest wykonane w procesie produkcyjnym polidimetylosiloksanu (PDMS), który polega na odlewaniu warstw PDMS z wydrukowanej w 3D plastikowej formy i sklejaniu warstw PDMS na szkiełkach mikroskopowych przy użyciu wcześniej opisanych metod24,25. Szczegółowe procedury przepływu pracy EcoFAB, takie jak produkcja urządzenia, sterylizacja, kiełkowanie nasion, przesadzanie sadzonek, inokulacja/kouprawa drobnoustrojów, przygotowanie próbki i analiza, są opisane w tym protokole (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Opisano dalsze modyfikacje podstawowego przepływu pracy, w tym instalację sterowanych komputerowo lamp LED do uprawy i wykorzystanie stałych podłoży. Opisano wykorzystanie technik obrazowania do badania zmian morfologii korzeni, kolonizacji mikrobiologicznej korzeni oraz obrazowania spektroskopowego mas wysięków korzeniowych. Przewidujemy, że prosty, niedrogi projekt oparty na łatwo dostępnych materiałach, a także przedstawione tutaj szczegółowe protokoły, zamienią platformę EcoFAB w zasób społecznościowy, standaryzujący laboratoryjne badania mikrobiomu roślinnego.

<table><tbody><tr><td>Drukowane w 3D niestandardowe</td> pliki <td>STL formy LBNL</td><td></td><td>dostępne tutaj www.eco-fab.org; Opisane tutaj formy EcoFABs zostały wydrukowane przez FATHOM: http://studiofathom.com</td></tr><tr><td>Dow sylgard 184 zestaw przezroczysty elastomeru silikonowego</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 KG</td><td></td></tr><tr><td>Spray do kurzu pneumatycznego</td><td>VWR</td><td>75780-350</td><td>każdy odkurzacz do sprężonego gazu powinien działać</td></tr><tr><td>igła o rozmiarze 15</td><td>VWR</td><td>89166-240</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 5 ml z końcówką Luer-Lok VWR</td><td></td><td>BD309646</td><td></td></tr><tr><td>3" x2" szkiełko mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>1,75" x 2,56" x 3,56" Pudełko EcoFAB</td><td>Amazon</td><td>B005GAQ25Q</td><td></td></tr><tr><td>4" x 3 i frac14; &rdquo; Szkiełko mikroskopowe</td><td>Ted Pella</td><td>260231</td><td></td></tr><tr><td>4,87 "x 4,87" x 5,50" Pudełko EcoFAB</td><td>Amazon</td><td>B00P9QVOS2</td><td></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmy</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Drukowany w 3D niestandardowy zacisk</td><td>LBNL</td><td></td><td>Pliki STL dostępne w laboratorium Trenta Northena</td></tr><tr><td>Sterylny kaptur</td><td>AirClean Systems</td><td>Stacje robocze PCR serii AC600</td><td></td></tr><tr><td>Rurka strzykawki z PTFE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z117315-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige i Skoog (MS) Baza soli makroskładnikowych</td><td>Fitotechnologie Laboratoria</td><td>M502</td><td></td></tr><tr><td>Murashige i Skoog (MS) Baza soli mikroelementowych</td><td>Fitotechnologie Laboratoria</td><td>M554</td><td></td></tr><tr><td>Gleba</td><td>Hummert International</td><td>Pro-Mix PGX</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71010-52-1</td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana</td><td>Lehle Seeds</td><td>WT-24 Col-4 Columbia dziki typ</td><td></td></tr><tr><td>Brachypodium distachyon</td><td>LBNL</td><td>Standardowa linia Bd-21</td><td>Dostępne w laboratorium Johna Vogela</td></tr><tr><td>Panicum virgatum</td><td>Fundacja Szlachecka Samuela Robertsa</td><td>Taśma mikroporowa Alamo switchgrass</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>56222-182</td><td></td></tr><tr><td>Metanol klasy LC-MS</td><td>VWR</td><td>JT9830-3</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>LABCONCO</td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator SpeedVAC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Savant&trade; SPD111 Filtr odśrodkowy SpeedVac</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC GV-0,22 i mikro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>System chromatografii cieczowej</td><td>Agilent</td><td>Agilent 1290 LC system</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive spektrometr masowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive&trade; Hybrydowy układ Quadrupole-Orbitrap MS</td><td></td></tr><tr><td>NIMS i niestandardowa płytka MALDI</td><td>LBNL</td><td></td><td>Szczegółowy protokół można znaleźć pod adresem: doi:10.1038/nprot.2008.110</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy MALDI</td><td>AB Sciex</td><td>TOF/TOF 5800 MALDI MS</td><td></td></tr><tr><td>Nanopowlekana taśma oświetleniowa LED do uprawy</td> LED <td>World Lighting</td><td>HH-SRB60F010-2835</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>LED World Lighting</td><td>MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler TC420</td><td>Amazon</td><td>B0197U7R8Q</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowe klipsy LED</td><td>Amazon</td><td>B00N9X1GI0</td><td></td></tr><tr><td>Pistolet do klejenia na gorąco</td><td>Amazon</td><td>B006IY359K</td><td></td></tr><tr><td>połączeniowy LED żeński na goły LED</td><td>Oświetlenie Świata LED</td><td>HH-F05</td><td></td></tr><tr><td>Przedłużacz złącza żeńskiego na męski</td> LED <td>World Lighting</td><td>HH-MF1</td><td></td></tr><tr><td>20AWG 2-żyłowy</td><td>LED World Lighting</td><td>6102051TFT4</td><td></td></tr><tr><td>WAGO 221-415 Łącznik</td> łączenia <td>LED World Lighting</td><td>221-415</td><td></td></tr></tbody></table>

protokoły wytwarzania ekosystemów (ecofab) do budowy ekosystemów laboratoryjnych przeznaczonych do badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Korzystne interakcje między roślinami a mikroorganizmami oferują zrównoważone rozwiązanie biologiczne z potencjałem do zwiększenia niskonakładowej produkcji żywności i bioenergii. Lepsze mechanistyczne zrozumienie tych złożonych interakcji między roślinami a mikroorganizmami będzie miało kluczowe znaczenie dla poprawy produkcji roślinnej, a także dla przeprowadzenia podstawowych badań ekologicznych badających interakcje roślina-gleba-mikroorganizmy. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy opis wytwarzania ekosystemów, przy użyciu powszechnie dostępnych technologii druku 3D, w celu stworzenia kontrolowanych siedlisk laboratoryjnych (EcoFAB) do mechanistycznych badań interakcji roślina-mikroorganizm w określonych warunkach środowiskowych. Opisano dwa rozmiary EcoFAB, które nadają się do badania interakcji mikrobiologicznych z różnymi gatunkami roślin, w tym Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon i Panicum virgatum. Te urządzenia przepływowe pozwalają na kontrolowaną manipulację i pobieranie próbek mikrobiomów korzeni, chemii korzeni, a także obrazowanie morfologii korzeni i lokalizacji drobnoustrojów. Protokół ten zawiera szczegółowe informacje na temat utrzymywania sterylnych warunków wewnątrz EcoFAB i montażu niezależnych systemów oświetlenia LED na EcoFAB. Opisano szczegółowe metody dodawania różnych form pożywek, w tym gleb, piasku i płynnych pożywek wzrostowych w połączeniu z charakterystyką tych systemów za pomocą obrazowania i metabolomiki. Razem systemy te umożliwiają dynamiczne i szczegółowe badanie konsorcjów roślinnych i roślinno-mikrobiologicznych, w tym manipulowanie składem mikrobiomu (w tym mutantów), monitorowanie wzrostu roślin, morfologii korzeni, składu wysięku i lokalizacji mikrobiologicznej w kontrolowanych warunkach środowiskowych. Przewidujemy, że te szczegółowe protokoły posłużą jako ważny punkt wyjścia dla innych badaczy, najlepiej pomagając w tworzeniu ustandaryzowanych systemów eksperymentalnych do badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami.

Każdy system EcoFAB składa się z urządzenia EcoFAB oraz przezroczystego plastikowego pojemnika dostosowanego do rozmiaru rośliny. Urządzenie EcoFAB posiada zbiornik na roślinę, komorę wzrostu korzeni, wlot przepływu o średnicy 1,6 mm oraz wylot o średnicy 1,6 mm w przypadku standardowego urządzenia EcoFAB (Ryc. 2D i Ryc. 3H) lub wylot o średnicy 10 mm w przypadku urządzenia EcoFAB z szerokim wylotem (Ryc. 2F i Ryc. 3I). Zbiornik na roślinę ma kształt trapezu z otworem górnym o szerokości 6 mm i otworem dolnym o szerokości 3 mm; taka konstrukcja zmniejsza ryzyko wycieku podczas wstrzykiwania cieczy, a jednocześnie zapewnia wystarczającą przestrzeń do wzrostu rośliny. Komora wzrostu korzeni ma kształt owalny i głębokość 2 mm, aby pomieścić systemy korzeniowe wielu roślin modelowych, co pokazano na Ryc. 2C i E. Zarówno kanał wlotowy, jak i wylotowy standardowego urządzenia EcoFAB mogą być połączone rurkami z PTFE, dzięki czemu roztwory odżywcze mogą wpływać do komory wzrostu korzeni bez konieczności otwierania pojemnika EcoFAB. Urządzenie EcoFAB z szerokim wylotem znacznie redukuje opór przepływu na wylocie i jest preferowane podczas uprawy roślin o grubych systemach korzeniowych lub w przypadku okresowego pobierania wysięków korzeniowych po wykształceniu przez rośliny złożonych systemów korzeniowych.
Formy odlewnicze do wytwarzania warstw PDMS w urządzeniach EcoFAB są projektowane w oprogramowaniu do projektowania, a następnie drukowane w 3D z sztywnych, nieprzezroczystych fotopolimerów, jak pokazano na Rysunku 2 i Rysunku 3. Rośliny wewnątrz urządzeń EcoFAB można bezpośrednio obserwować pod mikroskopem z dużym odległością roboczą, co zapewnia zachowanie sterylnego środowiska wzrostu (Rysunek 8A, Plik uzupełniający 1). Urządzenia EcoFAB z roślinami mogą również zostać umieszczone na stoliku mikroskopu o wysokiej rozdzielczości, co umożliwia obrazowanie oddziaływań roślina-mikrob z wyższą rozdzielczością (Rysunek 8B, Plik uzupełniający 2). W takim środowisku sterylność nie jest zachowana, dlatego obrazowanie o wysokiej rozdzielczości nadaje się wyłącznie do pomiarów końcowych.
Systemy EcoFAB zostały zaprojektowane w celu umożliwienia systematycznych badań roślin, takich jak ich morfologia, metabolizm i społeczności mikrobiologiczne na różnych etapach wzrostu w obrębie ich cykli życiowych. W niniejszej pracy sprawdzono przydatność EcoFAB jako ogólnej platformy do badania różnorodnych gatunków roślin. Rysunek 8C-E przedstawia 7-dniowe Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon oraz Panicum virgatum rosnące w EcoFABs. Stwierdzono, że wszystkie trzy rośliny dobrze rosną w EcoFAB przez ponad miesiąc. Zarówno dwuliścienna Arabidopsis thaliana, jak i jednoliścienna Brachypodium distachyon dotrwały w systemach EcoFAB do etapów reprodukcyjnych.
Odwracalny system uszczelniania umożliwia wykorzystanie podłoży stałych (np. gleby) w urządzeniach EcoFABs (krok 2.2). To odwracalne podejście do uszczelniania pozwala na wprowadzanie podłoży stałych do komór wzrostu korzeni oraz umożliwia pobieranie próbek z konkretnych obszarów ryzosfery korzeniowej. Rysunek 8F-H przedstawia grupę 14-dniowych Brachypodium distachyon rosnących w podłożu hydroponicznym, a także w piasku i glebie uzupełnionych odpowiednio podłożem hydroponicznym (piasek) i wodą (gleba). Cienka warstwa podłoża stałego w komorach wzrostu korzeni pozwala na przenikanie światła, co umożliwia obrazowanie mikroskopowe systemów korzeniowych.
Morfologia korzenia jest definiowana jako konfiguracja przestrzenna i rozkład systemu korzeniowego rośliny i została uznana za istotną odpowiedź fizjologiczną na różnorodne warunki wzrostu, takie jak dostępność składników odżywczych lub wody32,33,34. Systemy EcoFABs zapewniają wygodne podejście do badania morfologii roślin w czasie lub w różnych warunkach odżywczych. Rysunek 9A-F przedstawia przykład zastosowania EcoFABs do śledzenia morfologii korzeni Brachypodium distachyon w ciągu pierwszych trzech tygodni. Siewka Brachypodium distachyon została przeniesiona do urządzenia EcoFAB, a struktura jej korzeni została zarejestrowana przez kamerę wewnątrz obrazera żeli BIO-RAD. Programy do przetwarzania obrazu, takie jak Image J, python i matlab, mogą być dalej wykorzystane do ilościowego określenia zmian morfologii korzeni w czasie lub w różnych środowiskach pożywek. Ilościowe oznaczenie całkowitej powierzchni korzeni w ciągu trzech tygodni wykazało stopniowy wzrost w fazie wczesnej (&lt;1 tydzień), po którym nastąpił trend wzrostu liniowego aż do końca trzeciego tygodnia, jak pokazano na Rysunku 9G.
Główną motywacją do konstrukcji urządzenia EcoFAB jest badanie interakcji między roślinami a mikroorganizmami. Jak opisano w kroku 5.4, mikroorganizmy są przenoszone do komór wzrostu korzeni urządzeń EcoFAB poprzez kanał wlotowy. Jak pokazano na Rysunku 10, do systemów korzeniowych roślin z koncentracją 106 komórek na roślinę wprowadzono Pseudomonas simea (dawniej fluorescens) WCS417 (WCS417), czyli ryzobakterie wspomagające wzrost roślin z etykietami chemiluminescencyjnymi. Sygnał WCS417 wykryto za pomocą obrazowacza żeli, co wskazało na wyraźny rozkład przestrzenny drobnoustrojów WCS417 w komorach wzrostu korzeni. Zarówno w płynnej pożywce MS z dodatkiem stałego podłoża piaskowego, jak i bez niego, drobnoustroje WCS417 kolonizowały powierzchnie całych systemów korzeniowych, koncentrując się wokół obszarów wierzchołków korzeni, co prawdopodobnie wynika z aktywnej produkcji składników odżywczych przez wierzchołki korzeni (Rysunek 10G&amp;H)35. Z kolei drobnoustroje WCS417 w podłożu glebowym gromadziły się wokół regionu zbiornika rośliny, a nie przy wierzchołkach korzeni (Rysunek 10I). Ponieważ mikroorganizmy wprowadzono przez kanał wylotowy, były one również w stanie przemieszczać się w podłożu glebowym, lecz nie gromadziły się na korzeniu, co obserwowano w pożywce płynnej z piaskiem lub bez niego. Może to wskazywać, że gleba jest wystarczającym źródłem składników odżywczych, a mikroorganizmy migrowały do zbiornika rośliny w celu zapewnienia optymalnych warunków oddychania.
W celu zbadania profilowania metabolitów wysięków korzeni roślin, a także pobierania i uwalniania metabolitów w interakcjach roślina-mikrob, roztwory wysięków z komór wzrostu korzeni zbierano na różnych etapach wzrostu roślin w EcoFABs. Zgodnie z opisem w kroku 6, próbki wysięków są następnie ekstrahowane do analizy LC-MS. Przy użyciu tej metody wykryto szereg metabolitów wydzielanych przez rośliny i zużywanych przez mikroby; obecnie badane jest powiązane profilowanie metabolitów wysięków korzeniowych z kolonizacją mikrobiologiczną i bez niej.
<img alt="Schemat konfiguracji kiełkowania dla EcoFAB, przenoszenie roślin, dodawanie mikroorganizmów, monitorowanie wzrostu korzeni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat działania EcoFAB. Rośliny są kiełkowane na płytce, a następnie przenoszone do wysterylizowanego systemu EcoFAB, do którego można dodać mikroorganizmy. Pobieranie próbek nieniszczących: możliwość pobierania i obrazowania eksudatów korzeniowych oraz wizualizacji morfologii korzeni. Pobieranie próbek niszczących umożliwia szczegółową analizę parametrów mikroorganizmów, korzeni i pędów.
<img alt="Schematy projektowe komponentów formy z wymiarami i szczegółami montażu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Komponenty form drukowanych w technologii 3D do wytwarzania urządzeń EcoFAB. (A) Widoki z góry i pod kątem ramy odlewniczej. (B) Widoki z góry i pod kątem wkładki. (C) Widoki z góry i pod kątem standardowej podstawy formy. (E) Widoki z góry i pod kątem podstawy formy z szerokim wylotem. (D, F) Zmontowane formy odpowiednio do wytwarzania standardowych i szerokich urządzeń EcoFAB. Wymiary owalu wynoszą 51 mm x 34 mm dla małej formy EcoFAB oraz 76 mm x 62 mm dla dużej formy EcoFAB. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Sekwencja wytwarzania urządzenia mikrofluidycznego, obejmująca przygotowanie formy, odlewanie, utwardzanie i oddzielanie od formy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wytwarzanie urządzenia EcoFAB. (A) Wlewanie mieszaniny bazy elastomerowej i utwardzacza do formy. (B) Podgrzewanie formy z mieszaniną w temperaturze 85 °C przez 4 h. (C) Wyjmowanie wkładki z formy. (D) Oddzielanie PDMS od ramy odlewniczej. (E) Wypychanie podstawy formy z ramy odlewniczej. (F) Użycie noża do oddzielenia PDMS od formy wzdłuż krawędzi. (G) Powolne odrywanie warstwy PDMS od podstawy formy. (H) Wykonywanie otworów dla kanałów wlotowego i wylotowego w standardowej warstwie PDMS. (I) Wykonywanie otworu dla kanału wlotowego w warstwie PDMS z szerokim wylotem. (J) Warstwa PDMS (wykonana z mieszaniny bazy elastomerowej i utwardzacza w stosunku 15:1) oraz szkiełko przedmiotowe są płukane, a następnie przenoszone do urządzenia do czyszczenia plazmowego w celu bondującia. (K) Użycie zacisków do przymocowania warstwy PDMS (wykonanej z mieszaniny bazy elastomerowej i utwardzacza w stosunku 5:1) do szkiełka przedmiotowego. (L) Przyciskanie warstwy PDMS (wykonanej z mieszaniny bazy elastomerowej i utwardzacza w stosunku 30:1) bezpośrednio do szkiełka przedmiotowego. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schematy formy wykonawczej z wymiarami, widoki z góry i izometryczne (A, B, C)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Konstrukcja niestandardowych zacisków. (A) Widok z góry i widok pod kątem górnej płyty zacisku. (B) Widok z góry i widok pod kątem dolnej płyty zacisku. (C) Widok z góry i widok pod kątem złożonego zacisku z czterema zestawami śrub z łbem sześciokątnym. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Montaż kostki LED z wymiarami; ustawienie oświetlenia; schemat zasilacza 24V; eksperyment oświetleniowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Instalacja oświetlenia LED do uprawy. (A) Wyznaczanie miejsc dla 9 uchwytów LED w kształcie spirali wokół pojemnika EcoFAB. (B) Uchwyty LED przymocowane do pojemnika EcoFAB. (C) Przeciąganie paska LED przez uchwyty. (D) Podłączenie paska LED do sterownika połączonego z zasilaczem 24V. (E) Schemat połączeń przewodów ze sterownikiem. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment z kiełkowaniem roślin z nasionami na agarze, zestaw z strzykawką, przenoszenie siewek, uszczelnianie pojemnika." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Przenoszenie siewek do EcoFAB-ów. (A) Rośliny Brachypodium distachyon hodowane przez 2 dni na płytce z pożywką 0.5 MS. (B) Napełnianie komory korzeniowej podłożem do wzrostu roślin. (C) Użycie pęsety do ostrożnego wprowadzenia korzenia do zbiornika roślinnego. (D) Uszczelnienie pojemnika EcoFAB taśmą micropore po dodaniu 3 mL wody do dna pojemnika. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wzrost roślin w układzie mikroprzepływowym; analiza za pomocą spektrometrii mas. Schemat przedstawiający dane m/z." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Obrazowanie NIMS korzeni roślin w EcoFABs. (A) Brachypodium distachyon rosnący w sterylnym EcoFAB. (B) Mocowanie warstwy PDMS z rośliną do chipa NIMS przez 20 min. (C) Użycie taśmy miedzianej do przymocowania chipa NIMS do dedykowanej płytki MALDI i wprowadzenie go do spektrometru mas MALDI. (D-G) Jedna 7-dniowa i jedna 20-dniowa roślina Brachypodium distachyon wykorzystana do obrazowania NIMS (D, E) oraz odpowiadające im obrazy NIMS (F, G). Dominujące jony zaznaczono kolorami czerwonym, zielonym i niebieskim. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment wzrostu roślin; układ hydroponiczny z kukurydzą; etapy kiełkowania nasion; rozwój korzeni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Ogólne zastosowania EcoFABs. (A) Bezpośrednia rejestracja wzrostu korzeni Brachypodium distachyon w EcoFAB przy użyciu zestawu z mikroskopem o dużej odległości roboczej. (B) Bezpośrednia obserwacja interakcji korzeń-mikrob przy użyciu zestawu z mikroskopem o wysokiej rozdzielczości. (C-E) 7-dniowe rośliny Arabidopsis thaliana (C), Brachypodium distachyon (D) oraz Panicum virgatum (E) w hydroponicznym medium 0.5 MS, (F-H) 14-dniowe rośliny Brachypodium distachyon hodowane w hydroponice 0.5 MS (F), w piasku (G) i w podłożu glebowym (H), odpowiednio z dodatkiem medium 0.5 MS i wody. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Etapy wzrostu korzeni Brachypodium (A-F) i wykres zwiększającej się powierzchni (G), skala 1 cm, obrazujące wpływ wieku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9: Wykorzystanie EcoFABs do badania morfologii korzeni. (A-F) Rozwój korzeni Brachypodium distachyon rosnącego w EcoFABs wypełnionych pożywką 0,5 MS podczas pierwszych trzech tygodni: (A) 2 dni, (B) 4 dni, (C) 7 dni, (D) 11 dni, (E) 14 dni, (F) 21 dni wzrostu. (G) Średnie powierzchnie korzeni zostały oszacowane za pomocą oprogramowania ImageJ. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig9large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu kiełkowania z etapami wzrostu nasion w kąpieli wodnej; analiza rozwoju korzeni pod mikroskopem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10: Wykorzystanie EcoFABs do badania oddziaływań korzeń-mikroby. (A, B, C) Grupa 15-dniowych roślin Brachypodium distachyon kolonizowanych przez Pseudomonas fluorescens WCS417 w różnych formach podłoży: w płynnym roztworze MS, w piasku oraz w glebie. (D, E, F) Zdjęcia systemów korzeniowych wykonane w polu jasnym. (G, H, I) Odpowiadające im obrazy chemiluminescencyjne tych systemów korzeniowych po 14 dniach wspólnej inkubacji. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Plik uzupełniający 1. Wykorzystanie systemu EcoFAB do rejestracji wzrostu korzeni. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video1_capture_growing_roots_(2).mp4">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2. Wykorzystanie EcoFAB do rejestrowania interakcji między korzeniami a mikrobami. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video2_capture_root_microbes_interaction.avi">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten artykuł opisuje szczegółowe protokoły do produkcji urządzeń ekosystemowych (EcoFAB), które umożliwiają badania roślin i interakcji roślina-mikroorganizm w ściśle kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

Protokoły wytwarzania ekosystemów (EcoFAB) do budowy ekosystemów laboratoryjnych przeznaczonych do badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

Ogólnym celem tego protokołu jest zdefiniowanie ustandaryzowanych podejść do budowy uproszczonych modelowych ekosystemów roślinnych, zwanych EcoFAB, które umożliwiają kontrolowane, replikowane eksperymenty laboratoryjne w celu zbadania interakcji mikroorganizmów roślinnych, które można dalej testować w terenie. Metoda ta może być wykorzystana do badania interakcji mikroorganizmów roślinnych w kontrolowanych środowiskach, co pozwala nam uzyskać szczegółowy mechanistyczny wgląd w funkcje mikrobiomów, co pozwoli nam wykorzystać je w zrównoważonym rolnictwie. Pomogliśmy zaprojektować ten pierwszy Eco-FAB, który wykorzystuje różnorodne dostępne technologie druku 3D i sterylizuje komory wzrostu roślin, które umożliwiają zarówno nierozpraszające obrazy o wysokiej rozdzielczości, jak i analizę chemiczną.Opracowane w ten sposób urządzenie Eco-FAB doskonale nadaje się do analizy interakcji mikroorganizmów roślinnych, ponieważ obejmuje analizę morfologii korzeni i obrazowanie metodą spektroskopii mas. Po skonstruowaniu form Eco-FAB, przy użyciu druku 3D zgodnie z protokołem tekstowym, w jednorazowym pojemniku o pojemności jednego litra wymieszaj 40 mililitrów bazy elastomeru siloksanowego z różnymi objętościami utwardzacza, w zależności od eksperymentu. Umieścić pojemnik w komorze próżniowej na co najmniej 30 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z mieszaniny elastomerów.Następnie usuń mieszaninę i wlej ją do zmontowanej plastikowej formy wydrukowanej w 3D. Aby wytworzyć jednolitą warstwę PDMS, pęcherzyki powietrza muszą zostać ostrożnie usunięte. Użyj sprężonego powietrza, aby zdmuchnąć wszelkie pozostałości powietrza po przeniesieniu mieszaniny do formy.Trzymaj formę na bloku grzewczym w temperaturze 85 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Pozostaw formę do ostygnięcia przez pięć minut. Następnie delikatnie wyciągnij wkładkę z formy i za pomocą noża uniwersalnego powoli oddziel PDMS od ramy odlewniczej.Wyciśnij podstawę formy z PDMS z ramy odlewniczej. Następnie za pomocą noża lub innych narzędzi delikatnie oddziel warstwę PDMS od podstawy formy na krawędziach i powoli oderwij ją od powierzchni formy. Używając, igły o rozmiarze 15, utwórz kanał wlotowy na warstwach PDMS, wykonując w tej części otwory o średnicy 1,6 milimetra.Następnie użyj nożyczek, aby przyciąć krawędzie warstw PDMS. Aby trwale przymocować warstwy PDMS do szkiełek mikroskopowych, należy użyć metanolu do przepłukania strony wiążącej warstwy PDMS na szkiełku mikroskopowym o wymiarach 7,6 na pięć centymetrów, a następnie wydmuchać je do sucha sprężonym powietrzem lub pistoletem do ultraczystego azotu. Umieść szkiełko mikroskopowe i warstwę PDMS w myjce plazmowej stronami łączącymi do góry.Zamknij komorę i zawór odpowietrzający gaz. Następnie włącz próżnię i pompuj komorę w dół przez jedną minutę. Włącz zasilanie generatora plazmy i przełącz częstotliwość radiową lub poziom RF na wysoki na jedną minutę.Następnie wyłącz zarówno pompę próżniową, jak i zasilanie plazmy, a następnie odpowietrz komorę do atmosfery. Wyjmij szkiełko mikroskopowe i warstwę PDMS z komory plazmowej i szybko dociśnij wszystkie cztery krawędzie warstwy PDMS do szkiełka z równomiernym naciskiem. Upewnij się, że środkowy owalny obszar, który jest komorą korzeniową, nie dotyka szkiełka.Używając ultraczystej wody, wypłucz urządzenia Eco-FAB. Umieść jedno urządzenie Eco-FAB w pojemniku Eco-FAB i dodawaj 70% etanolu, aż urządzenie zostanie zanurzone. Następnie zamknij pokrywę pojemnika i delikatnie potrząśnij nią, aby zwilżyć wszystkie powierzchnie wewnątrz etanolem, upewniając się, że komora wzrostu korzeni urządzenia Eco-FAB jest wypełniona etanolem, z bardzo małą ilością pęcherzyków powietrza lub bez pęcherzyków powietrza.Po inkubacji urządzeń w temperaturze pokojowej przez 30 minut, odlej 70% etanol i zastąp go 100% etanolem. Następnie inkubuj urządzenia przez pięć minut. Po inkubacji odcedź etanol i pozostaw wysterylizowany Eco-FAB w okapie z przepływem laminarnym na 16 godzin, aby całkowicie wyschł.Jeśli to możliwe, wysterylizuj system, włączając światło UV w okapie na jedną godzinę. Aby przeprowadzić sterylizację i kiełkowanie nasion, namocz nasiona w 70% etanolu przez dwie minuty. Następnie za pomocą pipety usuń etanol i użyj sterylnej wody, aby trzykrotnie spłukać nasiona.Następnie namocz nasiona w 10% roztworze wybielacza przez pięć minut. Następnie usuń roztwór wybielacza i użyj sterylnej wody, aby dokładnie umyć nasiona trzy razy. Po umyciu dodaj sterylną wodę do nasion i inkubuj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez siedem dni.Równomiernie rozprowadź nasiona na 0,5 Murashige i Skoog, czyli pożywce MS, z 0,6% vitagelu. I za pomocą taśmy z mikroporami uszczelnij płytki. Następnie wyhoduj rośliny do długości korzeni około pięciu mililitrów.Aby przenieść sadzonki do Eco-FAB, za pomocą sterylnej strzykawki lub mikropipety i sterylnej wody, należy trzykrotnie przepłukać komorę korzeniową urządzenia Eco-FAB, a następnie wypełnić komorę korzeniową odpowiednią pożywką wzrostową, taką jak pożywka 0,5 MS. Teraz ostrożnie włóż pojedynczą sadzonkę do zbiornika roślinnego urządzenia Eco-FAB. Ważne jest, aby sadzonki były ostrożnie przenoszone z talerza do Eco-FAB, aby korzenie się nie złamały.Dodaj trzy mililitry sterylnej wody do pojemnika, unikając urządzenia Eco-FAB. Zwiększy to wilgotność i zmniejszy parowanie podłoża z komory korzeniowej. Następnie zamknij pojemnik i użyj taśmy z mikroporami, aby uszczelnić pokrywkę.Umieść Eco-FAB w inkubatorze roślin lub wykorzystaj system oświetlenia Eco-FAB w środowisku o kontrolowanej temperaturze, odpowiednim dla wzrostu danej rośliny. Następnie ustaw komorę na 24 stopnie Celsjusza. Na koniec przeprowadzić profilowanie metabolitów i spektrometrię mas, zgodnie z protokołem tekstowym.Rysunki te pokazują siedmiodniowe Aabidopsis thaliana, brachypodium distachyon i panicum virgatum rosnące w Eco-FAB. Stwierdzono, że zarówno rośliny dwuliścienne, jak i jednoliścienne spełniają swoje etapy rozrodu w Eco-FAB. Siewki te reprezentują grupę 14-dniowych brachypodium distachyon rosnących w podłożu hydroponicznym, a także w piasku i glebie uzupełnionej odpowiednio podłożem hydroponicznym i wodą.Cienka, solidna warstwa podłoża i komory wzrostu korzeni umożliwiają przenikanie światła w celu mikroskopowego obrazowania systemów korzeniowych. W tym przypadku sadzonka dystachionu brachypodium została przeniesiona do urządzenia Eco-FAB, a jej struktura korzeniowa została zarejestrowana przez kamerę znajdującą się w obrazie żelowym firmy Biorad. Kwantyfikacja całkowitej powierzchni korzeni w ciągu trzech tygodni wykazała stopniowy wzrost na wczesnym etapie, po którym nastąpił liniowy trend wzrostu aż do końca.Na tym rysunku Eco-FAB zawierający ryzobakterie wspomagające wzrost roślin, Pseudomonas simiae, WCS417 został dodany do systemu korzeniowego roślin w ilości od 10 do 6 komórek na roślinę. Mikroorganizmy WCS147 skolonizowały powierzchnię całego systemu korzeniowego za pomocą drobnoustrojów skoncentrowanych wokół obszarów wierzchołków korzeni. Podczas odświeżania podłoża uprawowego i zbierania wysięków korzeniowych z Eco-FAB należy pamiętać, aby wszystkie prace wykonać w sterylnym kapturze, aby uniknąć zanieczyszczenia.Urządzenia Eco-FAB mogą być również wytwarzane przy użyciu odwracalnego, fizycznego uszczelnienia za pomocą zacisku wydrukowanego w 3D lub poprzez zmianę lepkości PDMS. Umożliwia to stosowanie stałych pożywek wzrostowych i bezpośredniego obrazowania metodą spektroskopii mas. Po opracowaniu projektu Eco-FAB system ten umożliwi naukowcom z całego świata wykorzystanie tych laboratoryjnych modelowych ekosystemów do badania interakcji mikroorganizmów roślinnych przy użyciu biologii systemowej i technologii obrazowania.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyprodukować system Eco-FAB, a także jego szerokie zastosowania w badaniach ekosystemów. Mamy nadzieję, że ten projekt Eco-FAB pozwoli innym naukowcom osiągnąć ich konkretne cele naukowe. Co ważniejsze, mamy nadzieję, że inni naukowcy wykorzystają ten projekt Eco-FAB i ulepszą go, a także podzielą się nim z innymi naukowcami, abyśmy jako społeczność mogli zbudować te ekosystemy laboratoryjne, które pozwolą nam lepiej zrozumieć interakcje mikroorganizmów roślinnych.Nie zapominaj, że praca z drobnoustrojami i ostrymi narzędziami może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności.

ecosystem-fabrication-ecofab-protocols-for-construction-laboratory

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Urządzenia mikrofluidyczne mogą być wykorzystywane do wizualizacji złożonych procesów naturalnych w czasie rzeczywistym i w odpowiednich skalach fizycznych. Opracowaliśmy proste urządzenie mikrofluidyczne, które naśladuje kluczowe cechy naturalnych ośrodków porowatych, służące do badania wzrostu i transportu bakterii w podłożu gruntowym.

Okno na mikroświat: Proste systemy mikrofluidyczne do badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych

Źródło: Nathoo, N., et al. Hydroponiczny system kouprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych roślina/mikroorganizm oraz sygnalizacji. J. Vis. Exp. (2017).Ten film przedstawia hydroponiczny system wspólnej uprawy do badania interakcji między roślinami a bakteriami w sterylnych warunkach. Sadzonki roślin przenosi się do sterylnego, kwaśnego podłoża wzrostowego, inkubuje i sprawdza pod kątem zanieczyszczenia przed zaszczepieniem Agrobacterium. Aktywowane bakterie...

System wspólnej uprawy do badania reakcji molekularnych gospodarzy roślinnych i bakterii oddziałujących na siebie

Rozwój społeczności mikroorganizmów zależy od kombinacji czynników, w tym architektury środowiska, liczebności członków, cech i interakcji. Protokół ten opisuje syntetyczne, mikrofabrykowane środowisko do jednoczesnego śledzenia tysięcy społeczności zawartych w studniach femtolitrowych, w którym można przybliżyć kluczowe czynniki, takie jak wielkość niszy i zamknięcie.

Montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy Microwell Array

Opisany system kouprawy hydroponicznej wspiera nienaruszone rośliny za pomocą metalowych siatek i współhoduje je z bakteriami. Tkanki roślinne, bakterie i wydzielane cząsteczki mogą być następnie oddzielnie zbierane do dalszych analiz, co jednocześnie pozwala na zbadanie odpowiedzi molekularnych zarówno gospodarzy roślinnych, jak i oddziałujących na siebie mikroorganizmów lub mikrobiomów.

Hydroponiczny system wspólnej uprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych między roślinami a mikroorganizmami oraz sygnalizacji

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Ze względu na nieprzezroczystość gleby, interakcje między jej składowymi mikroorganizmami nie mogą być łatwo zobrazowane za pomocą rozdzielczości komórkowej. Zaprezentowano tu dwa narzędzia mikroprzepływowe, które dają nowe możliwości badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych. Urządzenia są wszechstronne i proste w użyciu, umożliwiając wysoką kontrolę czasoprzestrzenną i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na poziomie komórkowym.

Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym

Szybka i ustandaryzowana procedura tworzenia synergicznych wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z różnych gleb ryzosfery jest przedstawiona tutaj. Jest to unikalny protokół przeznaczony do badania i symulacji złożonej mikrobioty glebowej ryzosfery.

Podejście do konstruowania wielogatunkowych zbiorowisk biofilmu z gleby ryzosfery

Tutaj prezentujemy badanie przeprowadzone w iDiv Ecotron, naziemnych komorach mezokosmicznych z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi nad i pod ziemią, w celu zbadania niezależnego i interaktywnego wpływu historii roślin i historii gleby na funkcjonowanie ekosystemu zbiorowisk trawiastych wzdłuż gradientu różnorodności roślin.

JenaTron - eksperymentalne podejście do badania wpływu historii roślin i historii gleby na funkcjonowanie ekosystemów użytków zielonych

Ten protokół szczegółowo opisuje montaż układów mini-bioreaktorów, które mają być wykorzystane do hodowli złożonego przepływu złożonych zbiorowisk kałowych w warunkach beztlenowych. Omówiono również metody montażu, inokulacji i pobierania próbek z reaktorów do dalszej analizy.

Montaż bioreaktora do ciągłej hodowli złożonych zbiorowisk kałowych

Minibioreactor Array (MBRA) to wysokowydajny, konfigurowalny system hodowli o ciągłym przepływie, który umożliwia hodowlę złożonych społeczności drobnoustrojów, wspierając równoległe eksperymenty w celu badania dynamiki mikrobiomu, interakcji terapeutycznych i reakcji drobnoustrojów na czynniki środowiskowe.

Zaktualizowany protokół montażu i użytkowania macierzy minibioreaktorów (MBRA)

Poznaj protokoły budowy EcoFAB do badania interakcji roślin z mikroorganizmami w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Metoda wykorzystuje druk 3D i spektrometrię masową.

Protokoły wytwarzania ekosystemów (EcoFAB) do budowy ekosystemów laboratoryjnych przeznaczonych do badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami (Wideo) | JoVE Journal

Protokoły wytwarzania ekosystemów (EcoFAB) do budowy ekosystemów laboratoryjnych przeznaczonych do badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami

Przeglądaj więcej filmów