Protokoły wytwarzania ekosystemów (EcoFAB) do budowy ekosystemów laboratoryjnych przeznaczonych do badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami
10 kwietnia 2018
Ten artykuł opisuje szczegółowe protokoły do produkcji urządzeń ekosystemowych (EcoFAB), które umożliwiają badania roślin i interakcji roślina-mikroorganizm w ściśle kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.
Ogólnym celem tego protokołu jest zdefiniowanie ustandaryzowanych podejść do budowy uproszczonych modelowych ekosystemów roślinnych, zwanych EcoFAB, które umożliwiają kontrolowane, replikowane eksperymenty laboratoryjne w celu zbadania interakcji mikroorganizmów roślinnych, które można dalej testować w terenie. Metoda ta może być wykorzystana do badania interakcji mikroorganizmów roślinnych w kontrolowanych środowiskach, co pozwala nam uzyskać szczegółowy mechanistyczny wgląd w funkcje mikrobiomów, co pozwoli nam wykorzystać je w zrównoważonym rolnictwie. Pomogliśmy zaprojektować ten pierwszy Eco-FAB, który wykorzystuje różnorodne dostępne technologie druku 3D i sterylizuje komory wzrostu roślin, które umożliwiają zarówno nierozpraszające obrazy o wysokiej rozdzielczości, jak i analizę chemiczną.
Opracowane w ten sposób urządzenie Eco-FAB doskonale nadaje się do analizy interakcji mikroorganizmów roślinnych, ponieważ obejmuje analizę morfologii korzeni i obrazowanie metodą spektroskopii mas. Po skonstruowaniu form Eco-FAB, przy użyciu druku 3D zgodnie z protokołem tekstowym, w jednorazowym pojemniku o pojemności jednego litra wymieszaj 40 mililitrów bazy elastomeru siloksanowego z różnymi objętościami utwardzacza, w zależności od eksperymentu. Umieścić pojemnik w komorze próżniowej na co najmniej 30 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z mieszaniny elastomerów.
Następnie usuń mieszaninę i wlej ją do zmontowanej plastikowej formy wydrukowanej w 3D. Aby wytworzyć jednolitą warstwę PDMS, pęcherzyki powietrza muszą zostać ostrożnie usunięte. Użyj sprężonego powietrza, aby zdmuchnąć wszelkie pozostałości powietrza po przeniesieniu mieszaniny do formy.
Trzymaj formę na bloku grzewczym w temperaturze 85 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Pozostaw formę do ostygnięcia przez pięć minut. Następnie delikatnie wyciągnij wkładkę z formy i za pomocą noża uniwersalnego powoli oddziel PDMS od ramy odlewniczej.
Wyciśnij podstawę formy z PDMS z ramy odlewniczej. Następnie za pomocą noża lub innych narzędzi delikatnie oddziel warstwę PDMS od podstawy formy na krawędziach i powoli oderwij ją od powierzchni formy. Używając, igły o rozmiarze 15, utwórz kanał wlotowy na warstwach PDMS, wykonując w tej części otwory o średnicy 1,6 milimetra.
Następnie użyj nożyczek, aby przyciąć krawędzie warstw PDMS. Aby trwale przymocować warstwy PDMS do szkiełek mikroskopowych, należy użyć metanolu do przepłukania strony wiążącej warstwy PDMS na szkiełku mikroskopowym o wymiarach 7,6 na pięć centymetrów, a następnie wydmuchać je do sucha sprężonym powietrzem lub pistoletem do ultraczystego azotu. Umieść szkiełko mikroskopowe i warstwę PDMS w myjce plazmowej stronami łączącymi do góry.
Zamknij komorę i zawór odpowietrzający gaz. Następnie włącz próżnię i pompuj komorę w dół przez jedną minutę. Włącz zasilanie generatora plazmy i przełącz częstotliwość radiową lub poziom RF na wysoki na jedną minutę.
Następnie wyłącz zarówno pompę próżniową, jak i zasilanie plazmy, a następnie odpowietrz komorę do atmosfery. Wyjmij szkiełko mikroskopowe i warstwę PDMS z komory plazmowej i szybko dociśnij wszystkie cztery krawędzie warstwy PDMS do szkiełka z równomiernym naciskiem. Upewnij się, że środkowy owalny obszar, który jest komorą korzeniową, nie dotyka szkiełka.
Używając ultraczystej wody, wypłucz urządzenia Eco-FAB. Umieść jedno urządzenie Eco-FAB w pojemniku Eco-FAB i dodawaj 70% etanolu, aż urządzenie zostanie zanurzone. Następnie zamknij pokrywę pojemnika i delikatnie potrząśnij nią, aby zwilżyć wszystkie powierzchnie wewnątrz etanolem, upewniając się, że komora wzrostu korzeni urządzenia Eco-FAB jest wypełniona etanolem, z bardzo małą ilością pęcherzyków powietrza lub bez pęcherzyków powietrza.
Po inkubacji urządzeń w temperaturze pokojowej przez 30 minut, odlej 70% etanol i zastąp go 100% etanolem. Następnie inkubuj urządzenia przez pięć minut. Po inkubacji odcedź etanol i pozostaw wysterylizowany Eco-FAB w okapie z przepływem laminarnym na 16 godzin, aby całkowicie wyschł.
Jeśli to możliwe, wysterylizuj system, włączając światło UV w okapie na jedną godzinę. Aby przeprowadzić sterylizację i kiełkowanie nasion, namocz nasiona w 70% etanolu przez dwie minuty. Następnie za pomocą pipety usuń etanol i użyj sterylnej wody, aby trzykrotnie spłukać nasiona.
Następnie namocz nasiona w 10% roztworze wybielacza przez pięć minut. Następnie usuń roztwór wybielacza i użyj sterylnej wody, aby dokładnie umyć nasiona trzy razy. Po umyciu dodaj sterylną wodę do nasion i inkubuj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez siedem dni.
Równomiernie rozprowadź nasiona na 0,5 Murashige i Skoog, czyli pożywce MS, z 0,6% vitagelu. I za pomocą taśmy z mikroporami uszczelnij płytki. Następnie wyhoduj rośliny do długości korzeni około pięciu mililitrów.
Aby przenieść sadzonki do Eco-FAB, za pomocą sterylnej strzykawki lub mikropipety i sterylnej wody, należy trzykrotnie przepłukać komorę korzeniową urządzenia Eco-FAB, a następnie wypełnić komorę korzeniową odpowiednią pożywką wzrostową, taką jak pożywka 0,5 MS. Teraz ostrożnie włóż pojedynczą sadzonkę do zbiornika roślinnego urządzenia Eco-FAB. Ważne jest, aby sadzonki były ostrożnie przenoszone z talerza do Eco-FAB, aby korzenie się nie złamały.
Dodaj trzy mililitry sterylnej wody do pojemnika, unikając urządzenia Eco-FAB. Zwiększy to wilgotność i zmniejszy parowanie podłoża z komory korzeniowej. Następnie zamknij pojemnik i użyj taśmy z mikroporami, aby uszczelnić pokrywkę.
Umieść Eco-FAB w inkubatorze roślin lub wykorzystaj system oświetlenia Eco-FAB w środowisku o kontrolowanej temperaturze, odpowiednim dla wzrostu danej rośliny. Następnie ustaw komorę na 24 stopnie Celsjusza. Na koniec przeprowadzić profilowanie metabolitów i spektrometrię mas, zgodnie z protokołem tekstowym.
Rysunki te pokazują siedmiodniowe Aabidopsis thaliana, brachypodium distachyon i panicum virgatum rosnące w Eco-FAB. Stwierdzono, że zarówno rośliny dwuliścienne, jak i jednoliścienne spełniają swoje etapy rozrodu w Eco-FAB. Siewki te reprezentują grupę 14-dniowych brachypodium distachyon rosnących w podłożu hydroponicznym, a także w piasku i glebie uzupełnionej odpowiednio podłożem hydroponicznym i wodą.
Cienka, solidna warstwa podłoża i komory wzrostu korzeni umożliwiają przenikanie światła w celu mikroskopowego obrazowania systemów korzeniowych. W tym przypadku sadzonka dystachionu brachypodium została przeniesiona do urządzenia Eco-FAB, a jej struktura korzeniowa została zarejestrowana przez kamerę znajdującą się w obrazie żelowym firmy Biorad. Kwantyfikacja całkowitej powierzchni korzeni w ciągu trzech tygodni wykazała stopniowy wzrost na wczesnym etapie, po którym nastąpił liniowy trend wzrostu aż do końca.
Na tym rysunku Eco-FAB zawierający ryzobakterie wspomagające wzrost roślin, Pseudomonas simiae, WCS417 został dodany do systemu korzeniowego roślin w ilości od 10 do 6 komórek na roślinę. Mikroorganizmy WCS147 skolonizowały powierzchnię całego systemu korzeniowego za pomocą drobnoustrojów skoncentrowanych wokół obszarów wierzchołków korzeni. Podczas odświeżania podłoża uprawowego i zbierania wysięków korzeniowych z Eco-FAB należy pamiętać, aby wszystkie prace wykonać w sterylnym kapturze, aby uniknąć zanieczyszczenia.
Urządzenia Eco-FAB mogą być również wytwarzane przy użyciu odwracalnego, fizycznego uszczelnienia za pomocą zacisku wydrukowanego w 3D lub poprzez zmianę lepkości PDMS. Umożliwia to stosowanie stałych pożywek wzrostowych i bezpośredniego obrazowania metodą spektroskopii mas. Po opracowaniu projektu Eco-FAB system ten umożliwi naukowcom z całego świata wykorzystanie tych laboratoryjnych modelowych ekosystemów do badania interakcji mikroorganizmów roślinnych przy użyciu biologii systemowej i technologii obrazowania.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyprodukować system Eco-FAB, a także jego szerokie zastosowania w badaniach ekosystemów. Mamy nadzieję, że ten projekt Eco-FAB pozwoli innym naukowcom osiągnąć ich konkretne cele naukowe. Co ważniejsze, mamy nadzieję, że inni naukowcy wykorzystają ten projekt Eco-FAB i ulepszą go, a także podzielą się nim z innymi naukowcami, abyśmy jako społeczność mogli zbudować te ekosystemy laboratoryjne, które pozwolą nam lepiej zrozumieć interakcje mikroorganizmów roślinnych.
Nie zapominaj, że praca z drobnoustrojami i ostrymi narzędziami może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności.
Przegląd
Ten artykuł opisuje szczegółowe protokoły budowy EcoFAB, które ułatwiają badania interakcji roślin i roślin-mikrobów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Interakcje roślin-mikrobów
- Kontrolowanie tworzenia ekosystemów
- Rozwój protokołów laboratoryjnych
Tło
- EcoFAB to uproszczone ekosystemy modelowe zaprojektowane do eksperymentów laboratoryjnych.
- Umożliwiają kontrolowane i powtarzalne badania interakcji roślin-mikrobów.
- Metoda ma na celu zapewnienie mechanistycznych wnikliwości w funkcje mikrobiomu.
- Wykorzystanie technologii druku 3D poprawia projektowanie tych urządzeń.
Cel badania
- Zdefiniowanie standaryzowanych podejść do budowy EcoFAB.
- Badanie interakcji roślin-mikrobów w kontrolowanym środowisku.
- Umożliwienie dalszego testowania wyników w warunkach terenowych.
Stosowane metody
- Budowa form EcoFAB przy użyciu druku 3D.
- Przygotowanie i sterylizacja komór do wzrostu roślin.
- Protokoły sterylizacji nasion i kiełkowania.
- Profilowanie metabolitów i spektrometria masowa do analizy.
Główne wyniki
- Skuteczna roślinność różnych gatunków roślin w EcoFAB.
- Szczegółowa analiza morfologii korzeni i interakcji.
- Wykazanie użyteczności EcoFAB do wysokiej rozdzielczości obrazowania.
- Wgląd w rolę mikrobiomów w zrównoważonym rolnictwie.
Wnioski
- EcoFAB zapewniają solidną platformę do badania interakcji roślin-mikrobów.
- Ustanowione protokoły mogą być zastosowane do różnych gatunków roślin.
- Wyniki mogą przyczynić się do postępów w zrównoważonych praktykach rolniczych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
EcoFABs provide a standardized, reproducible platform for mechanistic studies of plant-microbe interactions under controlled laboratory conditions. This enables de-risking of target validation in agricultural biotechnology by clarifying functional roles of microbiomes in plant health and stress response. The system supports predictive confidence in lead identification for microbiome-based bioinputs through dynamic monitoring of root exudates, microbial localization, and plant growth phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by manipulating microbiome composition, including mutant strains, to assess causal effects on plant phenotypes.
- Operational Value: Supports functional target validation through controlled addition of plant growth promoting rhizobacteria such as Pseudomonas simiae WCS417 and quantification of colonization patterns.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking microbial interventions to measurable outputs like root morphology, exudate composition, and growth kinetics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling sterile, reproducible mounting of seedlings and controlled media exchange in flow-through devices.
- Quantitative Outputs: Generates standardized metrics including total root area over time, microbial localization via mass spectrometry imaging, and exudate profiling for compound screening.
- Platform Reuse: Designed for scalability across plant species (Arabidopsis, Brachypodium, Panicum) and growth media (hydroponic, sand, soil), supporting cross-project standardization.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models plant-soil-microbe interactions relevant to sustainable agriculture and bioenergy feedstock production.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by allowing progression from sterile lab conditions to defined soil/sand systems with supplemental media.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on reproducible phenotypes under controlled stress or nutrient conditions prior to field testing.
Pipeline & Workflow Integration
EcoFABs integrate into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, supporting iterative design-test cycles for microbiome-based agricultural solutions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling manipulation of microbiome composition and environmental variables while monitoring plant responses.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through sterile fabrication, controlled hydration, and sealed incubation systems that minimize evaporation and contamination.
- Analytics: Provides quantitative measurements including root morphology imaging, metabolite profiling, and mass spectrometry data to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by supporting validation in increasingly complex media (sand, soil) while maintaining controlled variables.
- Enterprise Reuse: Designed as a reusable platform rather than a single-use tool, with modular design allowing adaptation across labs and plant models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in plant-microbe interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through detailed sterilization protocols, 3D-printed molds, and controlled environmental conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of microbiome-based leads before field trials.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, reproducible phenotypes linked to microbial interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique, 3D printing, and PDMS handling for device fabrication.
- Depends on access to plasma cleaners, vacuum chambers, and imaging systems for bonding and analysis.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for seed transfer, media exchange, and contamination control.
- Requires adaptation considerations when switching between liquid, sand, or soil-based growth media while maintaining sterility.
- Limited by the need for aseptic workflows during exudate sampling and media refresh to prevent biofilm formation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:13
EcoFAB Device Fabrication: Casting PDMS Layers
3:22
EcoFAB Device Fabrication: Chemically Attached PDMS Layers onto Microscope Slides
4:50
EcoFAB Sterilization
5:59
Growing Plants in EcoFABs
8:31
Results: Plant-microbe Interactions Using Ecosystem Fabrication Protocols
10:18
Conclusion
