Name: Tworzenie kowalencyjnych adduktów DNA przez enzymatycznie aktywowane czynniki rakotwórcze i leki in vitro oraz ich oznaczanie za pomocą 32p-posttagingu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj metodę oceny potencjału chemikaliów i leków do tworzenia kowalencyjnych adduktów DNA przy użyciu enzymów cytochromu P450. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów inicjacji rozwoju nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Czeską Fundację Naukową (GACR, grant 17-12816S).

Autor nie ma nic do zdradzienia.

W artykule przedstawiono szeroko dostępną metodologię badania siły działania substancji chemicznych, które mogą być bioaktywowane do produktów pośrednich metabolizmu, co prowadzi do generowania kowalencyjnych adduktów DNA. Jest to kwestia kluczowa, ponieważ ocena siły działania substancji chemicznych lub leków środowiskowych na ich enzymatyczną aktywację do metabolitów generujących kowalencyjne addukty DNA jest ważną dziedziną w rozwoju nowotworów i ich leczeniu. Modyfikacja DNA przez czynniki rakotwórcze uważana za przy...

Metabolizm ksenobiotyków (substancji chemicznych lub leków) zachodzi w dwóch fazach1. Fazy I i II mają na celu uczynienie pierwotnie hydrofobowych (nierozpuszczalnych w wodzie) związków bardziej hydrofilowymi (rozpuszczalnymi w wodzie), dzięki czemu będą one łatwo wydalane z moczem, kałem lub potem. Reakcje fazy I (funkcjonalizacji) obejmują utlenianie, redukcję i hydroksylację katalizowane przez enzymy, takie jak cytochrom P450 (P450, CYPs), peroksydazy (tj. cyklooksygenaza, COX), reduktazy aldo-ketonowe (AKR) i mikrosomalne monooksygenazy zawierające flawinę (FMO). Faza I obejmuje również reakcje redukcji, w których pośredniczą różne reduktazy, tj. mikrosomalna reduktaza NADPH: cytochromu P450 (POR) i cytozolowa oksydoreduktaza NAD(P)H:chinonu (NQO1), oksydaza ksantynowa (XO) i oksydaza aldehydowa (AO)<klasa sup = "xref">1. W drugiej fazie (koniugacji) grupy funkcyjne, które zostały przyłączone w fazie I, są wykorzystywane do koniugacji małych cząsteczek polarnych w celu dalszego zwiększenia polarności. Przykładami enzymów biorących udział w reakcji fazy II są sulfotransferazy (SULT), N,O-acetylotransferazy (NAT), metylotransferazy, takie jak O-metylotransferaza katecholowa (COMT), S-transferazy glutationowe (GST) i glukuronozylotransferazy difosforanu urydyny (UGT)1. Klasyfikacja enzymów w fazie I lub II nie jest jednak sztywna, a niektóre enzymy można prawdopodobnie zaklasyfikować do dowolnej kategorii.
Enzymy P450 (EC 1.14.14.1) to białka zawierające hem obecne w różnych organizmach, które uczestniczą w biotransformacji wielu substancji chemicznych, katalizując ich konwersję3,4. Enzymy P450 katalizują hydroksylację wielu substratów, przy czym zachodzi reakcja, w której jeden atom ditlenu jest wprowadzany do cząsteczki ksenobiotyków, podczas gdy drugi atom tlenu jest redukowany do postaci wody w reakcji, która wymaga dwóch elektronów [równanie (1)]3,4:
RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)
P450 enzymy zlokalizowane w błonie retikulum endoplazmatycznego komórek ssaków (mikrosomalne systemy P450) są członkami systemu monooksygenazy wieloenzymatycznej, który dodatkowo zawiera reduktazę cytochromu P450 (POR) i cytochrom b5, substrat enzymu określany jako NADH:cytochrom b5 Reduktazy. Ogólnie przyjęta teoria zakłada, że donorem dwóch elektronów potrzebnych do P450 jest układ NADPH / POR. Niemniej jednak cytochrom b5 może również działać jako donor elektronów dla P450, a mianowicie jako donor elektronu redukującego P450 podczas drugiej redukcji jego cyklu reakcji, gdzie działa razem z NADH:reduktaza cytochromu b52,3,4.
Ssaki wykorzystują różne enzymy P450 (np. enzymy z rodzin 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 i 27) do syntezy cennych związków endogennych, takich jak sterydy, i wykorzystują je do katabolizmu produktów naturalnych2,3. Inne enzymy ssaków CYP, takie jak ludzki CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 i 3A4, metabolizują egzogenne substancje chemiczne, które są stosowane jako leki. 5,6 Najważniejszymi enzymami katalizującymi metabolizm leków są CYP z podrodziny 3A, zwłaszcza CYP3A4. Konwersje ksenobiotyków, takich jak czynniki prorakotwórcze i protoksyczne, są pośredniczone przez ludzkie CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 i 3A42,5. Większość z tych CYP jest obecna w wątrobie (z wyjątkiem CYP1A1 i 1B1). Niemniej jednak CYP ulegają również ekspresji w kilku narządach pozawątrobowych. Takie P450 mogą mieć ogromne znaczenie, zwłaszcza gdy uczestniczą w metabolizmie bioaktywacji substancji chemicznych (leków) do reaktywnych produktów pośrednich w tych narządach7. Różne P450 są indukowane przez kilka związków, które są ich substratami, choć niekoniecznie tak jest.
Wiele enzymów P450 odgrywa rolę w toksyczności chemicznej (lekowej). Mogą przekształcać ksenobiotyki nie tylko w metabolity detoksykacyjne, ale także aktywować je do form reaktywnych, które modyfikują endogenne makrocząsteczki, które dodatkowo wykazują różne właściwości biologiczne, zwykle powodując ich toksyczność. DNA, lipidy i białka mogą być celem ich modyfikacji przez reaktywne elektrofile i rodniki generowane przez aktywowane substancje chemiczne. W przypadku DNA znane jest już rozwiązanie kilku ważnych odpowiedzi genów i ich mechanizmy2,3,4,5.
Zmiany w DNA mogą powodować zmniejszenie kontroli wzrostu komórek, a zjawisko to jest uważane za główny czynnik prowadzący do rozwoju procesów rakotwórczych. Wytwarzanie kowalencyjnych adduktów DNA z substancjami chemicznymi o działaniu rakotwórczym jest oceniane jako jeden z najważniejszych etapów w fazie inicjacji procesów rakotwórczych8,9,10,11. Wykazano, że zachodzą związki między powstawaniem adduktów DNA a nowotworzeniem się, przy czym zmniejszenie ilości adduktów DNA jest odpowiedzialne za chemoprewencję8,9,10,11,12,13,14. Powstawanie rakotwórczych/pochodnych leków adduktów DNA zależy od poszczególnych zasad DNA i zależy od sekwencji tych zasad w DNA. Naprawa adduktów DNA zależy od ich lokalizacji (na transkrybowanej lub nietranskrybowanej nici DNA) oraz typów zmodyfikowanych sekwencji nukleotydowych8,11,12,15,16.
W tym artykule opisujemy procedury wykorzystujące katalizowaną enzymatycznie konwersję substancji chemicznych (leków) do zbadania ich siły aktywacji w metabolity, które modyfikują DNA (generując addukty DNA). W przypadku kowalencyjnego wiązania DNA badany związek powinien być zwykle aktywowany przez reakcje oksydacyjne lub redukcyjne, w zależności od poszczególnych leków. Aktywacja oksydacyjna lub redukcyjna badanych substancji chemicznych odbywa się za pośrednictwem układu enzymatycznego zależnego od P450 obecnego we frakcji subkomórkowej mikrosomalnej lub przez redukcję za pomocą reduktaz obecnych zarówno w mikrosomach (POR, NADH: reduktaza cytochromu b5, enzymy P450), jak i w komórkowych cytozolowych frakcjach subkomórkowych (NQO1, XO, AO, peroksydaza). Reaktywne metabolity wiążą się następnie z DNA, tworząc addukty DNA. Ponieważ zarówno reakcje utleniające, jak i redukcyjne są ważne dla aktywacji kilku leków do tych reaktywnych gatunków, opisano procedury eksperymentalne wykorzystujące układ enzymatyczny utleniania/redukcji. Ponadto szczegółowo opisano odpowiednie metody zdolne do wykrywania i ilościowego określania tych adduktów DNA.
Zalecane są dwie niezależne procedury w celu określenia, czy badana substancja chemiczna, aktywowana przez systemy enzymatyczne, jest związana z DNA: technika znakowania 32P i wykorzystanie związku znakowanego radioaktywnie (np. 3H lub 14C). W przypadku pierwszego pilotażu zaleca się przeprowadzenie badania przesiewowego testu 32P-postlabeling. Oznaczanie zawartości DNA w roztworach, dokładnie ocenione, musi poprzedzać obie metody.
Technika 32P-postlabeling wykorzystuje enzymatyczną hydrolizę DNA zmodyfikowanego przez nieradioaktywne substancje chemiczne (rakotwórcze/narkotykowe) do 3'-fosfodeoksynukleozydów, dodatkową fosforylację radioaktywnym fosforem (32P) w pozycji 5'-OH oraz oddzielenie adduktów chemiczno-deoksynukleotydowych od normalnych (niezmodyfikowanych) deoksynukleotydów za pomocą chromatografii17 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). DNA zmodyfikowane przez związek chemiczny jest hydrolizowane przez mieszaninę endonukleazy, nukleazy mikrokokowej i egzonukleazy, znanej jako fosfodiesterazy śledziony. Mieszanina hydrolizowanego DNA zawierająca zarówno normalne (niezmodyfikowane), jak i zmodyfikowane 3'-monofosforany deoksyrybonukleozydu reaguje z [γ-32P]ATP w obecności nośnika (nieradioaktywnego) ATP i kinazy polinukleotydowej T4 o pH 9,5, tworząc 5'-32znakowane P 3',5'-bisfosforany ("standardowa" procedura w <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Zastosowane zasadowe pH jest zdolne do zminimalizowania aktywności enzymatycznej kinazy T4-polinukleotydowej w celu defosforylacji 3'-monofosforanów deoksyrybonukleozydu w pozycji 3'. Separację i rozdzielczość 32adduktów znakowanych P od znakowanych deoksynukleotydów, które nie są modyfikowane przez chemikalia, przeprowadza się za pomocą wielokierunkowej chromatografii cienkowarstwowej anionowej wymiany anionowej (TLC) na celulozie polietylenoiniminowej (PEI) (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2). W pierwszym i drugim etapie elucji (w kierunku D1 i D2) znakowane normalne (niezmodyfikowane) deoxynukleotydy oraz [32P]fosforan są eluowane od początku płytki celulozowej TLC-PEI za pomocą wodnych roztworów elektrolitu na krótkim kawałku bibuły chromatograficznej nałożonej na wierzch płytki TLC, podczas gdy deoksynukleotydy zawierające związane substancje chemiczne wykazujące właściwości hydrofobowe (rakotwórcze/addukty leków) są utrzymywane na początku płytki celulozowej PEI jako dodatkowo rozwiązany za pomocą kilku różnych układów rozpuszczalnikowych w kierunkach D3 i D4 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Lokalizacja przywodzików odbywa się za pomocą autoradiografii wspomaganej ekranem; oddzielone addukty są wykrywane jako ciemne, rozpoznawalne plamy na kliszach rentgenowskich. Obszary plam są wycinane z płytki i wykorzystywane do ilościowego oznaczania promieniotwórczości za pomocą scyntylacji cieczy lub liczenia Cerenkowa. Obecnie stosuje się również metodę obrazowania fosforu akumulacyjnego, która została dostosowana do mapowania i ilościowego oznaczania adduktów DNA na chromatogramach wykrytych w teście 32posttagów P. 18 Maszyna Instant Imager jest często wykorzystywana do takiego wykrywania i ilościowego oznaczania adduktów DNA. Ta metoda zapewnia ponad 10-krotnie wyższą czułość wykrywania 32P niż technika autoradiografii wzmocnionej ekranem19.
Ilości adduktów DNA są określane jako wartości względnego znakowania adduktów (RAL), obliczane za pomocą równania (2) w następujący sposób:
 cpm. w deoksynukleotydach adduktów 
RAL = ----------------------------------------------------------------------------------------- (2) 
Specyficzna aktywność 32P-ATP (w cpm./pmol) x pmol deoksynukleotydów
Wartości RAL są stosunkiem szybkości zliczania adduktowanych deoksynukleotydów do współczynników zliczania całkowitych [przywiedzionych i normalnych (niezmodyfikowanych) deoxynukleotydów] deoksynukleotydów20,21. Jednak obliczenia te opierają się na równych wydajnościach znakowania adduktów i normalnych deoksynukleotydów22. Klasyczna ("standardowa") procedura techniki znakowania 32P jest odpowiednia dla różnych adduktów DNA (adduktów masywnych i/lub niemasywnych), jednak jej czułość nie jest zadowalająca do wykrywania adduktów znajdujących się w małych ilościach w DNA. Za pomocą tej procedury można wykryć ilość adduktu w 107 niezmodyfikowanych deoksynukleotydach w DNA (0,3 fmol addukt / μg DNA).
Różne modyfikacje tej klasycznej procedury 32P-postlabeling zostały wykorzystane do podniesienia czułości tej techniki. Do 10 do 100-krotnie wyższa czułość oznaczania adduktów za pomocą znakowania 32P została osiągnięta przy użyciu granicznych poziomów [γ-32P]ATP (procedura intensyfikacji). 23,24 Kolejna procedura zapewniająca zwiększenie czułości metody 32P-postlabeling wykorzystuje inkubację strawionego DNA zawierającego addukty z nukleazą P1 (z Penicillium citrinum)21 (Rysunek 1). Enzym ten preferuje defosforylację niezmodyfikowanych 3'-monofosforanów deoksyrybonukleozydu, podczas gdy deoksynukleotydy ze związanymi substancjami chemicznymi (addukowane nukleotydy) zasadniczo nie są substratami tego enzymu. Dlatego zdefosforylowane deoksyrybonukleozydy 3'-monofosforany (tj. Deoksyrybonukleozydy) nie są fosforylowane przez kinazę polinukleotydową T4 przez [32P]fosforan z γ-32 P]ATP. Jednak niektóre nukleotydy, w których związki chemiczne są związane (addukowane deoxynukleotydy), takie jak addukty aryloaminy podstawione w C8 deoksyguanozyny, mogą być bedefosforylowane przez ten enzym. W przeciwieństwie do tego, większość innych adduktów (np. addukty podstawione w N2 deoksyguanozyny) nie jest defosforylowana przez nukleazę P1. Ta modyfikacja 32P-postlabeling sprawia, że metoda ta jest znacznie bardziej czuła, zwiększając jej czułość o ponad trzy rzędy wielkości. Co więcej, ta wersja 32P-posttaging zapewnia metodę, w której można wykorzystać większe ilości DNA (5-10 μg) i nadmiar wolnego od nośników [γ-32P] ATP.
Inna metoda wzbogacania adduktów, opisana przez Gupta25, wykorzystuje właściwości fizykochemiczne dużych adduktów deoksynukleotydowych, które mogą być ekstrahowane do n-butanolu w obecności czynnika przenoszącego fazę chlorku tetrabutyloamoniowego (TBA) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) przed [32znakowanie fosforanów, podczas gdy niemodyfikowane deoksynukleotydy są słabo ekstrahowane przez ten rozpuszczalnik organiczny. Jednak mniej hydrofobowe addukty, składające się na przykład z deoksynukleotydów zmodyfikowanych niearomatycznymi grupami o dużej objętości lub małymi resztami alkilowymi, nie są skutecznie ekstrahowane n-butanolem. W związku z tym są one zasadniczo niewykrywalne, gdy są analizowane za pomocą tej modyfikacji metody 32P-postlabeling.
Obie wcześniej wymienione wersje 32P-postlabeling ogromnie zwiększają czułość i kwantyfikację adduktów DNA (do trzech rzędów wielkości), będąc w stanie wykryć jeden addukt na 109,10 normalnych nukleotydów (0,3 - 3 amol/μg DNA). Te dwie metody są zalecane do testowania substancji chemicznych pod kątem ich zdolności do kowalencyjnego wiązania się z DNA i dlatego zostały szczegółowo opisane w tej pracy.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Roth</td><td>0032.8</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/chloroform/alkohol izoamylowy</td><td>Roth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Penta</td><td>70390-11000</td><td></td></tr><tr><td>Grasica cielęca DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4522</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>NADP+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5755</td><td></td></tr><tr><td>NADPH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7505</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza 6-fosforan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647001</td><td></td></tr><tr><td>Dehydrogenaza</td> <td>D-glukozySigma-Aldrich</td><td>G6378</td><td></td></tr><tr><td>Supersomy</td><td>Corning Gentest</td><td>456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202 Mikrosomy</td><td></td></tr><tr><td>ludzkiej wątroby</td><td>Corning Gentest</td><td>452172</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Hipoksantyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77662</td><td></td></tr><tr><td>2-hydroksypirymidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H56800</td><td></td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437549</td><td></td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179272</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza mikrokokkowa z Staphylococcus aureus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>Fosfodiesterazy śledziony ze śledziony cielęcej, typ II</td><td>Calbiochem</td><td>524711</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza P1 z Penicillium citrinum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8630</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>163791</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek tetrabutyloamoniowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86870</td><td></td></tr><tr><td>n-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437603</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza polinukleotydowa</td><td>T4 USB Corp</td><td>70031Y</td><td></td></tr><tr><td>[&gamma;-32P]ATP</td><td>Hartman Analytic GmbH</td><td>FP-201</td><td></td></tr><tr><td>Celulozowe płytki TLC impregnowane PEI</td><td>Macherey-Nagel</td><td>801053</td><td></td></tr><tr><td>Packard Instant Imager A202400</td><td>Packard</td><td>G120337</td><td></td></tr><tr><td>Ellipticine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>285730</td><td></td></tr><tr><td>3-nitrobenzantron</td><td>przygotowany (zsyntetyzowany), jak pokazano w ref. 40</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tworzenie kowalencyjnych adduktów dna przez enzymatycznie aktywowane czynniki rakotwórcze i leki in vitro oraz ich oznaczanie za pomocą 32p-posttagingu

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Kowalencyjne addukty DNA utworzone przez chemikalia lub leki o rakotwórczym potencjale są oceniane jako jeden z najważniejszych czynników w fazie inicjacji procesów rakotwórczych. To kowalencyjne wiązanie, które jest uważane za przyczynę nowotworzenia, jest obecnie oceniane jako centralny dogmat chemicznej kancerogenezy. W tym miejscu opisano metody wykorzystujące reakcje katalizowane przez cytochrom P450 i dodatkowe enzymy biotransformacyjne w celu zbadania siły działania substancji chemicznych lub leków na ich aktywację do metabolitów tworzących te addukty DNA. Przedstawiono procedury izolacji frakcji komórkowych posiadających enzymy biotransformacji (próbki mikrosomalne i cytozolowe z cytochromami P450 lub innymi enzymami biotransformacji, tj. peroksydazami, oksydoreduktazą NADPH:cytochromu P450, oksydoreduktazą NAD(P)H:chinonem lub oksydazą ksantynową). Ponadto opisano metody, które można wykorzystać do metabolicznej aktywacji analizowanych substancji chemicznych przez te enzymy, a także do izolacji DNA. Ponadto szczegółowo przedstawiono odpowiednie metody zdolne do wykrywania i ilościowego określania adduktów DNA pochodzących z substancji chemicznych/leków, tj. różne modyfikacje techniki znakowania końcowego 32P i zastosowanie analizowanych substancji chemicznych znakowanych radioaktywnie.

Stosując opisane tutaj protokoły wykorzystujące aktywację katalityczną enzymatyczną (t.j. P450, peroksydazę, reduktazę) do badania potencjału substancji chemicznych (karcynogenów/leków) do metabolizowania do produktów pośrednich, które wiążą się kowalencyjnie z DNA (powstawanie adduktów DNA), udało nam się wyjaśnić (i) nowy mechanizm działania farmakologicznego środka przeciwnowotworowego, ellipticine (przegląd w29,30<sup...

Ocena siły działania chemikaliów i leków środowiskowych, które mają być enzymatycznie bioaktywowane do produktów pośrednich generujących kowalencyjne addukty DNA, jest ważnym polem w rozwoju raka i jego leczeniu. Opisano metody aktywacji związków w celu utworzenia adduktów DNA, a także techniki ich wykrywania i kwantyfikacji.

Tworzenie kowalencyjnych adduktów DNA przez enzymatycznie aktywowane czynniki rakotwórcze i leki in vitro oraz ich oznaczanie za pomocą 32p-posttagingu

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie metod wykorzystujących reakcje katalizowane przez cytochrom p450 i dodatkowe enzymy biotransformacyjne do zbadania siły działania substancji chemicznych lub leków na ich aktywację do metabolitów tworzących kowalencyjne addukty DNA. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w zakresie rozwoju nowotworów i ich leczenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że pokazuje rodzaj metody oceny siły działania chemikaliów środowiskowych lub leków w tworzeniu kowalencyjnych adduktów DNA reprezentujących inicjację rozwoju raka.Implikacje techniki określającej siłę rakotwórczą substancji chemicznych. Siła działania, toksyny i leki, a także określa stosunkowo proste metody tworzenia kowalencyjnych adduktów DNA utworzonych przez takie związki. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat inicjacji rozwoju raka i jego leczenia, może być również stosowana w innych dziedzinach nauki.Takich jak badania mechanizmów molekularnych, uszkodzeń DNA i doustne badania nad aktywacją enzymatyczną i toksycznością chemikaliów. Po raz pierwszy zetknąłem się z pomysłem na tę metodę, gdy badałem procesy związane z początkową fazą chemicznej kancerogenezy. Najpierw przygotuj mieszaninę inkubacyjną, dodając wszystkie związki i układy enzymatyczne do końcowej objętości 0,75 mililitra w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Ma to na celu inkubację czynnika rakotwórczego z DNA w obecności cytochromu p450. Następnie do mieszaniny dodaj mikrosomy lub czysty rekombinowany p450 w supersomie. Następnie dodaj 7,5 mikrolitra 0,1 milimolowego leku eliptycznego rozpuszczonego w DMSO i 42,5 mikrolitra wody, aby dostosować końcową objętość do 0,75 mililitra.Następnie wymieszaj składniki, wirując probówkę przez pięć sekund. Natychmiast po tym inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z otwartą pokrywką przez 30 do 60 minut. Następnie zmieszać fenol lub chloroform fenolowy w stosunku jeden do jednego z mieszaniną inkubacyjną w probówce Eppendorfa.Spowoduje to usunięcie zanieczyszczenia białkowego z DNA w mieszaninie inkubacyjnej. Następnie wymieszaj mieszaninę, aby utworzyć emulsję. Następnie wiruj mieszaninę 1600 razy g przez trzy minuty w temperaturze otoczenia.Po zakończeniu wirowania użyj pipety, aby przenieść górną fazę wodną do nowej probówki polipropylenowej. Następnie wyrzuć granicę faz białkowych wraz z fazą organiczną. Następnie wymieszaj fazę wodną z równoważną objętością fenolu i chloroformu w stosunku jeden do jednego.Następnie powtórz wirowanie. Następnie dodać równe objętości chloroformu do zebranej fazy wodnej i ponownie odwirować. Następnie wytrącić DNA z fazy wodnej, dodając dwie objętości zimnego etanolu utrzymywanego w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Następnie dobrze wymieszaj roztwór. Aby przygotować się do znakowania adduktów DNA, należy zmieszać roztwór buforowy biciny ze znakowanym radioaktywnie roztworem ATP w celu znakowania adduktów DNA. Dodać mieszaninę do etykietowania do roztworu NP1 lub mieszanki wzbogacającej butanol.Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 30 minut. Następnie nanieść około 20 mikrolitrów na całą próbkę na płytce TLC z celulozy PEI. Po wykryciu próbki na płytce TLC z celulozy PEI, pozostaw płytkę do rozwinięcia w kierunku D1, aby oczyścić addukty.Po wyschnięciu płytki pozostaw ją do rozwinięcia w kierunkach D3 i D4. Aby rozwinąć się w D3, użyj buforu mrówczanu litu o pH 3,5 z mocznikiem. Do rozwoju D4 należy użyć buforu Tris-HCl z chlorkiem litu i mocznikiem.Aby uniknąć problemów z wywoływaniem w kierunku D4, należy również wywołać płytki w kierunku D5. Po pierwsze, technika znakowania końcowego P32 jest wykorzystywana do badania skuteczności mikrosomalnej bioaktywowanej eliptycyny p450 w tworzeniu adduktów DNA. Wyniki wskazują na tworzenie kowalencyjnych adduktów DNA w deoksyguanozynie DNA grasicy cielęcej w obecności mikrosomów wątrobowych zarówno szczurów, jak i/lub ludzi; Jednak w grupie kontrolnej nie powstają addukty.Następnie badany jest potencjał aktywowanej eliptycyny zależnej od enzymu peroksydazy. Obraz przedstawia tworzenie kowalencyjnych adduktów DNA w DNA grasicy cielęcej w obecności peroksydazy chrzanowej, laktoperoksydazy bydlęcej i ludzkiej mieloperoksydazy. W rzeczywistości addukty DNA powstają również z DNA wątroby, gdy szczury są traktowane 40 miligramami na kilogram masy ciała eliptycyny in vivo.Co ciekawe, ludzki enzym cytochromu p450 CYP3A4 wykazuje również duży potencjał do skutecznego utleniania eliptycyny do metabolitów, takich jak 12-hydroksyeliptycyna i 13-hydroksyeliptycyna. Metabolity te mogą łatwo wiązać się z DNA, tworząc addukty. Następnie metody wzbogacania nukleazy P1 i n-butanolu są stosowane do badania tworzenia adduktów DNA po aktywacji 3-nitrobenzantronu reduktazą cytozolową, taką jak NQ01 od szczura i człowieka.Wyniki wskazują na tworzenie do pięciu adduktów DNA z DNA grasicy cielęcej uzyskanego od szczura, ludzkiej cytozolu wątrobowego, a także wątroby myszy. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o stabilności zastosowanych systemów enzymatycznych.Aktywność enzymu może się zmniejszyć, jeśli nie jest przechowywana na lodzie. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biochemii, biochemii chemicznej kancerogenezy, do zbadania natury zjawiska od procesów inicjacji rozwoju nowotworów w organizmach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić siłę działania środowiskowych substancji chemicznych lub leków, które są enzymatycznie aktywowane w celu metabolizowania genetycznych kowalencyjnych adduktów DNA.Proces ten ma duże znaczenie dla rozwoju metod leczenia raka. Nie zapominaj, że pracujesz z chemikaliami, które mogą być bardzo niebezpieczne. Potencjalne czynniki rakotwórcze, radioaktywne chemikalia, na przykład fosfor ATP.Dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak laboratoryjne rękawice lateksowe i arkusze pleksi.

formation-covalent-dna-adducts-enzymatically-activated-carcinogens

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Prezentujemy montaż i zastosowanie urządzenia w skali molekularnej zasilanego białkiem topoizomerazą. Konstrukcja ta stanowi biomolekularny czujnik, który znakuje dwa główne rodzaje pęknięć DNA w przekrojach tkanek poprzez przyłączenie dwóch różnych fluoroforów do ich końców.

In vitro montaż półsztucznej maszyny molekularnej i jej zastosowanie w detekcji uszkodzeń DNA

Chemia biomimetyczna oparta na rodnikach została zastosowana do tworzenia bibliotek niezbędnych do rozwoju biomarkerów.

Wolne rodniki w biologii chemicznej: od zachowania chemicznego do rozwoju biomarkerów

Lasery są często używane w badaniach nad odpowiedzią komórkową na uszkodzenie DNA. Generują jednak zmiany, których odstępy, częstotliwość i kolizje z widełkami replikacyjnymi są rzadko charakteryzowane. W tym miejscu opisujemy podejście, które umożliwia określenie tych parametrów za pomocą laserowo zlokalizowanych wiązań międzypasmowych.

Analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

α-hydroksylacja rakotwórczych nitrozoamin przez cytochrom P450s jest akceptowanym szlakiem metabolicznym, który wytwarza produkty pośrednie uszkadzające DNA, które powodują mutacje. Jednak nowe dane wskazują, że może dojść do dalszego utleniania do nitrozamidów. Opisujemy ogólną metodę wykrywania nitrozamidów wytwarzanych w wyniku katalizowanego in vitro metabolizmem nitrozoamin katalizowanym cytochromem P450.

Ogólna metoda wykrywania powstawania nitrozamidów w metabolizmie nitrozoamin in vitro przez cytochrom P450

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie naprawy zdefiniowanych wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidowym DNA. Uszkodzone plazmidy są transfekowane do linii komórkowych ssaków biorcy i zbierane o niskiej masie cząsteczkowej w wielu punktach czasowych po transfekcji. Kinetykę naprawy DNA określa się ilościowo za pomocą specyficznego dla nici wydłużania startera, a następnie qPCR.

Prosty, szybki i ilościowy test do pomiaru naprawy wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidach transfekowanych do komórek ssaków

Opisujemy tutaj metody czułego i dokładnego oznaczania zmian 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxodGuo), 1,N 6-etheno-2'-deoksyadenozyny (1,N 6-dAdo) i 1,N 2-etheno-2'-deoksyguanozyny (1,N 2-dGuo) w DNA. Metody te zastosowano do oceny wpływu drobnego pyłu zawieszonego (PM2,5) w tkankach (płuca, wątroba i nerki) narażonych myszy A/J.

Kwantyfikacja trzech zmian DNA za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Tutaj prezentujemy prosty i szybki protokół wykrywania oddziaływań białek w miejscach uszkodzenia DNA.

Test ligandów zbliżeniowych do lokalizacji białek w miejscach uszkodzenia DNA

Poznaj metodę oceny potencjału chemikaliów i leków do tworzenia kowalencyjnych adduktów DNA przy użyciu enzymów cytochromu P450. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów inicjacji rozwoju nowotworów.

Tworzenie kowalencyjnych adduktów DNA przez enzymatycznie aktywowane czynniki rakotwórcze i leki in vitro oraz ich oznaczanie za pomocą 32p-posttagingu (Wideo) | JoVE Journal

Tworzenie kowalencyjnych adduktów DNA przez enzymatycznie aktywowane czynniki rakotwórcze i leki in vitro oraz ich oznaczanie za pomocą ³²p-posttagingu

Przeglądaj więcej filmów