Tworzenie kowalencyjnych adduktów DNA przez enzymatycznie aktywowane czynniki rakotwórcze i leki in vitro oraz ich oznaczanie za pomocą 32p-posttagingu
20 marca 2018
Ocena siły działania chemikaliów i leków środowiskowych, które mają być enzymatycznie bioaktywowane do produktów pośrednich generujących kowalencyjne addukty DNA, jest ważnym polem w rozwoju raka i jego leczeniu. Opisano metody aktywacji związków w celu utworzenia adduktów DNA, a także techniki ich wykrywania i kwantyfikacji.
Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie metod wykorzystujących reakcje katalizowane przez cytochrom p450 i dodatkowe enzymy biotransformacyjne do zbadania siły działania substancji chemicznych lub leków na ich aktywację do metabolitów tworzących kowalencyjne addukty DNA. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w zakresie rozwoju nowotworów i ich leczenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że pokazuje rodzaj metody oceny siły działania chemikaliów środowiskowych lub leków w tworzeniu kowalencyjnych adduktów DNA reprezentujących inicjację rozwoju raka.
Implikacje techniki określającej siłę rakotwórczą substancji chemicznych. Siła działania, toksyny i leki, a także określa stosunkowo proste metody tworzenia kowalencyjnych adduktów DNA utworzonych przez takie związki. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat inicjacji rozwoju raka i jego leczenia, może być również stosowana w innych dziedzinach nauki.
Takich jak badania mechanizmów molekularnych, uszkodzeń DNA i doustne badania nad aktywacją enzymatyczną i toksycznością chemikaliów. Po raz pierwszy zetknąłem się z pomysłem na tę metodę, gdy badałem procesy związane z początkową fazą chemicznej kancerogenezy. Najpierw przygotuj mieszaninę inkubacyjną, dodając wszystkie związki i układy enzymatyczne do końcowej objętości 0,75 mililitra w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Ma to na celu inkubację czynnika rakotwórczego z DNA w obecności cytochromu p450. Następnie do mieszaniny dodaj mikrosomy lub czysty rekombinowany p450 w supersomie. Następnie dodaj 7,5 mikrolitra 0,1 milimolowego leku eliptycznego rozpuszczonego w DMSO i 42,5 mikrolitra wody, aby dostosować końcową objętość do 0,75 mililitra.
Następnie wymieszaj składniki, wirując probówkę przez pięć sekund. Natychmiast po tym inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z otwartą pokrywką przez 30 do 60 minut. Następnie zmieszać fenol lub chloroform fenolowy w stosunku jeden do jednego z mieszaniną inkubacyjną w probówce Eppendorfa.
Spowoduje to usunięcie zanieczyszczenia białkowego z DNA w mieszaninie inkubacyjnej. Następnie wymieszaj mieszaninę, aby utworzyć emulsję. Następnie wiruj mieszaninę 1600 razy g przez trzy minuty w temperaturze otoczenia.
Po zakończeniu wirowania użyj pipety, aby przenieść górną fazę wodną do nowej probówki polipropylenowej. Następnie wyrzuć granicę faz białkowych wraz z fazą organiczną. Następnie wymieszaj fazę wodną z równoważną objętością fenolu i chloroformu w stosunku jeden do jednego.
Następnie powtórz wirowanie. Następnie dodać równe objętości chloroformu do zebranej fazy wodnej i ponownie odwirować. Następnie wytrącić DNA z fazy wodnej, dodając dwie objętości zimnego etanolu utrzymywanego w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.
Następnie dobrze wymieszaj roztwór. Aby przygotować się do znakowania adduktów DNA, należy zmieszać roztwór buforowy biciny ze znakowanym radioaktywnie roztworem ATP w celu znakowania adduktów DNA. Dodać mieszaninę do etykietowania do roztworu NP1 lub mieszanki wzbogacającej butanol.
Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 30 minut. Następnie nanieść około 20 mikrolitrów na całą próbkę na płytce TLC z celulozy PEI. Po wykryciu próbki na płytce TLC z celulozy PEI, pozostaw płytkę do rozwinięcia w kierunku D1, aby oczyścić addukty.
Po wyschnięciu płytki pozostaw ją do rozwinięcia w kierunkach D3 i D4. Aby rozwinąć się w D3, użyj buforu mrówczanu litu o pH 3,5 z mocznikiem. Do rozwoju D4 należy użyć buforu Tris-HCl z chlorkiem litu i mocznikiem.
Aby uniknąć problemów z wywoływaniem w kierunku D4, należy również wywołać płytki w kierunku D5. Po pierwsze, technika znakowania końcowego P32 jest wykorzystywana do badania skuteczności mikrosomalnej bioaktywowanej eliptycyny p450 w tworzeniu adduktów DNA. Wyniki wskazują na tworzenie kowalencyjnych adduktów DNA w deoksyguanozynie DNA grasicy cielęcej w obecności mikrosomów wątrobowych zarówno szczurów, jak i/lub ludzi; Jednak w grupie kontrolnej nie powstają addukty.
Następnie badany jest potencjał aktywowanej eliptycyny zależnej od enzymu peroksydazy. Obraz przedstawia tworzenie kowalencyjnych adduktów DNA w DNA grasicy cielęcej w obecności peroksydazy chrzanowej, laktoperoksydazy bydlęcej i ludzkiej mieloperoksydazy. W rzeczywistości addukty DNA powstają również z DNA wątroby, gdy szczury są traktowane 40 miligramami na kilogram masy ciała eliptycyny in vivo.
Co ciekawe, ludzki enzym cytochromu p450 CYP3A4 wykazuje również duży potencjał do skutecznego utleniania eliptycyny do metabolitów, takich jak 12-hydroksyeliptycyna i 13-hydroksyeliptycyna. Metabolity te mogą łatwo wiązać się z DNA, tworząc addukty. Następnie metody wzbogacania nukleazy P1 i n-butanolu są stosowane do badania tworzenia adduktów DNA po aktywacji 3-nitrobenzantronu reduktazą cytozolową, taką jak NQ01 od szczura i człowieka.
Wyniki wskazują na tworzenie do pięciu adduktów DNA z DNA grasicy cielęcej uzyskanego od szczura, ludzkiej cytozolu wątrobowego, a także wątroby myszy. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o stabilności zastosowanych systemów enzymatycznych.
Aktywność enzymu może się zmniejszyć, jeśli nie jest przechowywana na lodzie. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biochemii, biochemii chemicznej kancerogenezy, do zbadania natury zjawiska od procesów inicjacji rozwoju nowotworów w organizmach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić siłę działania środowiskowych substancji chemicznych lub leków, które są enzymatycznie aktywowane w celu metabolizowania genetycznych kowalencyjnych adduktów DNA.
Proces ten ma duże znaczenie dla rozwoju metod leczenia raka. Nie zapominaj, że pracujesz z chemikaliami, które mogą być bardzo niebezpieczne. Potencjalne czynniki rakotwórcze, radioaktywne chemikalia, na przykład fosfor ATP.
Dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak laboratoryjne rękawice lateksowe i arkusze pleksi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metody oceny potencjału substancji chemicznych pochodzenia środowiskowego oraz leków, które mogą ulegać enzymatycznej bioaktywacji w celu tworzenia kowalencyjnych adduktów DNA, odgrywających kluczową rolę w rozwoju nowotworów. Przedstawione techniki umożliwiają detekcję i kwantyfikację tych adduktów DNA, dostarczając informacji na temat ich potencjału rakotwórczego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad rakiem
- Toksykologia
- Biochemia
Wstęp
- Kowalencyjne addukty DNA powstają, gdy reaktywne metabolity wiążą się z DNA.
- Zrozumienie aktywacji substancji chemicznych jest niezbędne do oceny ich ryzyka kancerogennego.
- Enzymy cytochromu P450 odgrywają istotną rolę w biotransformacji tych związków.
- Metoda ta może być stosowana w różnych dziedzinach nauki poza badaniami nad nowotworami.
Cel badania
- Ocena potencjału substancji chemicznych pochodzenia środowiskowego oraz leków w tworzeniu adduktów DNA.
- Przedstawienie metody oceny inicjacji rozwoju nowotworu.
- Zbadanie znaczenia aktywacji chemicznej w leczeniu nowotworów.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie cytochromu P450 oraz innych enzymów biotransformacji.
- Aktywacja związków w celu generowania reaktywnych produktów pośrednich.
- Techniki detekcji i kwantyfikacji adduktów DNA.
- Zastosowanie stosunkowo prostych metod powstawania adduktów.
Główne wyniki
- Wykazano skuteczność metod w ocenie potencji chemicznej.
- Przedstawiono spostrzeżenia dotyczące mechanizmów kancerogenezy.
- Podkreślono znaczenie tych metod w badaniach nad rakiem i jego leczeniu.
- Wskazano potencjalne zastosowania w innych dziedzinach nauki.
Wnioski
- Opisane metody są wartościowe w ocenie potencjału kancerogennego substancji chemicznych występujących w środowisku.
- Zrozumienie procesu powstawania adduktów DNA jest kluczowe dla strategii zapobiegania nowotworom.
- Niniejszy protokół może pomóc w opracowywaniu bezpieczniejszych leków i substancji chemicznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kwantyfikacja tworzenia kowalencyjnych adduktów DNA przez enzymatycznie aktywowane kancerogeny i leki jest kluczowa dla wczesnej walidacji celu oraz mechanistycznej redukcji ryzyka w procesach badawczych w onkologii i toksykologii. Podejście to umożliwia predykcyjną ocenę potencjału genotoksycznego, wspierając selekcję portfolio i decyzje o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka. Integracja tych testów z procesami odkrywania leków zwiększa pewność w wyborze związków i dostarcza informacji niezbędnych do opracowania strategii translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę mechanizmów uszkodzeń DNA indukowanych przez związki chemiczne i leki.
- Wspiera walidację funkcjonalną szlaków aktywacji metabolicznej istotnych w procesie kancerogenezy.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie bioaktywacji z efektami genotoksycznymi.
- Zapewnia wiarygodność prognostyczną przy ustalaniu priorytetów dla związków w portfolio onkologicznych i bezpieczeństwa.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane systemy in vitro do oceny tworzenia adduktów DNA w bibliotekach związków.
- Zapewnia ilościowe, powtarzalne wyniki za pomocą postlabelingu 32P w celu rzetelnej standaryzacji testu.
- Umożliwia skalowalny screening profili aktywacji metabolicznej i reaktywności DNA.
- Wspiera późniejszą integrację z wysokoprzepustowymi testami genotoksyczności i bezpieczeństwa.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia spójność translacyjną poprzez korelację danych o adduktach DNA in vitro z opracowywaniem biomarkerów in vivo.
- Umożliwia wstępną ocenę ryzyka w badaniach przedklinicznych poprzez mapowanie szlaków aktywacji metabolicznej u różnych gatunków.
- Wspiera identyfikację biomarkerów translacyjnych służących do wczesnego wykrywania efektów genotoksycznych.
- Minimalizuje ryzyko przy wyborze kandydatów poprzez powiązanie wyników mechanistycznych z punktami końcowymi badań przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta łączy wczesną fazę odkrywania, identyfikację związków wiodących oraz przedkliniczną ocenę bezpieczeństwa, zapewniając mechanistyczny związek między metabolizmem związku a uszkodzeniami DNA.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących aktywacji metabolicznej i tworzenia adduktów DNA jako wczesne etapy ograniczania ryzyka.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe, powtarzalne wyniki do porównywania profili genotoksyczności związków.
- Analityka: Pozwala na czułą detekcję i kwantyfikację adduktów DNA w celu podejmowania decyzji w oparciu o dane.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów i zachowanie ciągłości między modelami in vitro a in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje ustandaryzowaną platformę, którą można dostosować do różnych klas związków i systemów biologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu oraz zrozumienie mechanistyczne genotoksyczności.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność, standaryzację i skalowalność testu dla zespołów interdyscyplinarnych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go i zmniejsza odsetek niepowodzeń na późnych etapach z powodu nieprzewidzianego ryzyka genotoksyczności.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój bezpieczniejszych i skuteczniejszych kandydatów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu enzymologii, znakowania izotopowego oraz analizy adduktów DNA.
- Wymaga dostępu do układów cytochromu P450, enzymów biotransformacji oraz infrastruktury do pracy z substancjami radiochemicznymi.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w celu uzyskania powtarzalnych danych.
- Metoda jest możliwa do adaptacji w różnych systemach modelowych, lecz wrażliwa na stabilność enzymów i warunki przechowywania.
- Wiąże się z pracą z materiałami niebezpiecznymi i radioaktywnymi, co wymaga ścisłego przestrzegania protokołów bezpieczeństwa.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
2:01
Incubation of Carcinogen and Drugs with DNA in the Presence of Enzymatic Systems
3:04
Isolation of the DNA from the Incubate
4:30
32P-postlabeling for Detection of DNA Adduct Formation
5:04
TLC Separation of Adducted Deoxyoligonucleotides
5:43
Results: Study of the Potency of Metabolically Active Ellipticine Drug in Generating Covalent DNA Adducts
7:33
Conclusion
