Kwantyfikacja stechiometrii stechiometrii lizyny białek specyficznych dla miejsca przy użyciu spektrometrii mas z akwizycją niezależną od danych
4 kwietnia 2018
Tutaj prezentujemy bezstronną kwantyfikację specyficznej dla miejsca acetylacji białek i/lub zajętości sukcynylacji (stechiometria) całego proteomu poprzez analizę ratiometryczną endogennych modyfikacji modyfikacji wprowadzonych po ilościowym acylowaniu chemicznym przy użyciu stabilnych bezwodników znakowanych izotopami. W połączeniu ze spektrometrią mas akwizycji niezależnym od wrażliwych danych, uzyskuje się dokładne pomiary zajętości obiektu.
Ogólnym celem tego nowatorskiego przepływu pracy jest określenie zajętości lub stechiometrii modyfikacji potranslacyjnych białek w określonych miejscach acetylacji. Ten nowatorski przebieg pracy spektrometrii mas zapewnia wyższy poziom precyzji oznaczania ilościowego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące odwracalnej regulacji białek poprzez modyfikację potranslacyjną, taką jak acetylacja lizyny lub sukcynylacja, miejsca są najbardziej zmodyfikowane i mogą zmieniać funkcję białka. Główną zaletą tej techniki jest to, że stechiometria acetylacji lizyny oraz sukcynylacji i sukcynylacji na poziomie miejsca są dokładnie określone, a metoda może określić stechiometrię na podstawie peptydów z wieloma resztami lizyny. Technika ta jest bardzo istotna, ponieważ ujawnia stechiometrię acetylacji i sukcynylacji lub proporcje zmodyfikowane w porównaniu z niezmodyfikowanymi, zamiast mierzyć bezwymiarową względną zmianę obfitości. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, gdy zdałem sobie sprawę, że wykorzystanie niezależnych od danych akwizycji i kwantyfikacji opartej na MS2 do analizy stechiometrycznej znacznie poprawi dokładność pomiaru. Przygotowanie trzech powtórzeń po 100
Przegląd
W niniejszym badaniu przedstawiono nowatorski schemat analizy spektrometrycznej do ilościowego oznaczania potranslacyjnych modyfikacji białek, a konkretnie acetylacji i succynylacji. Metoda ta zwiększa dokładność pomiarów poprzez wyznaczanie stopnia zajętości lub stechiometrii tych modyfikacji w konkretnych miejscach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Spektrometria mas
- Proteomika
Wprowadzenie
- Modyfikacje potranslacyjne odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu białek.
- Zrozumienie procesów acetylacji i succynylacji jest niezbędne do badania odwracalnej regulacji białek.
- Tradycyjne metody mogą charakteryzować się niską precyzją w ilościowym określaniu tych modyfikacji.
- Celem niniejszego badania jest poprawa dokładności pomiarów stechiometrii.
Cel badania
- Opracowanie schematu postępowania dla dokładnej kwantyfikacji acetylacji i succynylacji białek.
- Zidentyfikowanie najbardziej zmodyfikowanych miejsc lizynowych oraz ich wpływu na funkcję białek.
- Zapewnienie metody umożliwiającej analizę peptydów z wieloma resztami lizyny.
Zastosowane metody
- Analiza ratiometryczna modyfikacji endogennych.
- Ilościowa acylacja chemiczna z użyciem anhydrydów znakowanych stabilnymi izotopami.
- Spektrometria mas z wykorzystaniem akwizycji niezależnej od danych (DIA).
- Przygotowanie wielu powtórzeń w celu zapewnienia dokładności.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na precyzyjne określenie stechiometrii na poziomie konkretnych miejsc modyfikacji.
- Umożliwia ona poznanie proporcji zmodyfikowanych i niemodyfikowanych reszt lizyny.
- Zapewnia wyższą dokładność pomiaru w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Pozwala zidentyfikować kluczowe miejsca acetylacji i succynylacji wpływające na funkcję białka.
Wnioski
- Ten schemat postępowania znacząco usprawnia kwantyfikację modyfikacji białek.
- Pozwala on na lepsze zrozumienie regulacji funkcji białek poprzez acetylację i succynylację.
- Technika ta znajduje zastosowanie w szerokim zakresie badań proteomicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna kwantyfikacja stechiometrii specyficznych dla danych miejsc acetylacji i succynylacji lizyny umożliwia precyzyjną ocenę stopnia zajętości modyfikacji potranslacyjnych, co jest kluczowe dla zrozumienia odwracalnej regulacji białek w szlakach celów terapeutycznych. Metoda ta zapewnia bezstronny pomiar poziomów modyfikacji w całym proteomie, wspierając walidację celu poprzez odróżnianie biologicznie istotnych miejsc acylacji od szumu tła. Dostarczając dane stechiometryczne zamiast zmian względnej obfitości, zwiększa ona pewność prognostyczną w zakresie ograniczania ryzyka mechanistycznego podczas wczesnych etapów odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie stopnia acetylacji i succynylacji konkretnych reszt lizyny.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki precyzyjnemu pomiarowi stechiometrii modyfikacji, co pozwala wyjaśnić ich wpływ funkcjonalny na aktywność białka.
- Wartość predykcyjna: Zwiększa pewność co do wyboru celu poprzez identyfikację miejsc modyfikacji, które z największym prawdopodobieństwem zmieniają funkcję białka, co ułatwia selekcję projektów w portfolio.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów prac, dostarczając danych o stopniu zajętości miejsc acylacji na poziomie konkretnych reszt.
- Wynik ilościowy: Wykorzystuje pola powierzchni pików jonów fragmentacyjnych z DIA-MS, co umożliwia dokładną, ograniczoną przez interferencje kwantyfikację, odpowiednią do standaryzacji analizy.
- Skalowalność: Ułatwia przygotowanie do screeningu poprzez powtarzalną, zdolną do multipleksowania analizę proteomiczną acetylacji i succynylacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy profilowanie modyfikacji w fazie odkrywania z walidacją przedkliniczną poprzez identyfikację miejsc acylacji istotnych dla danej choroby.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Skupia się na wartości predykcyjnej poprzez określanie stechiometrii z peptydów z wieloma resztami lizyny, co umożliwia rozdzielczość specyficzną dla danego miejsca.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje go/no-go poprzez ujawnienie, które modyfikacje lizyny są funkcjonalnie istotne, a które mają charakter stochastyczny.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z continuum procesu odkrywania leków – od wczesnej walidacji celu po identyfikację związku wiodącego – dostarczając danych stechiometrycznych dotyczących acetylacji i succynylacji, co pozwala na lepsze zrozumienie mechanizmów oraz wpływu związków na funkcję białek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez ilościowe określanie stopnia zajętości specyficznych miejsc modyfikacji w odpowiedzi na zaburzenia.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki zestandaryzowanemu, ilościowemu pomiarowi poziomów modyfikacji w próbkach proteomicznych.
- Analityka: Zapewnia precyzyjne pomiary stechiometrii poprzez ilościowe wyznaczanie jonów fragmentacyjnych w DIA-MS, co pozwala na dokładne porównanie stanów modyfikacji.
- Badania translacyjne: Zapewniają ciągłość przedkliniczną poprzez identyfikację miejsc acylacji o wysokim stopniu zajętości, które mogą służyć jako biomarkery lub odczyty mechanistyczne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako powtarzalna metoda proteomiczna do spójnego profilowania PTM w różnych projektach i klasach celów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną dzięki dokładnej stechiometrii acetylacji i succynylacji na poziomie konkretnych miejsc, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Gwarantuje standaryzację i powtarzalność dzięki zastosowaniu DIA-MS oraz kwantyfikacji w programie Skyline, co minimalizuje zmienność techniczną.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go poprzez identyfikację miejsc modyfikacji o wysokim stopniu zajętości i istotnym znaczeniu funkcjonalnym, co redukuje ryzyko biologiczne na późniejszych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o dowody funkcjonalne wynikające z modyfikacji.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie proteomiki opartej na spektrometrii mas oraz technik wzbogacania PTM.
- Zależność od aparatury obsługującej analizę DIA oraz generowanie bibliotek widm w celu dokładnej kwantyfikacji jonów fragmentacyjnych.
- Wymaga standaryzacji przygotowania próbek i protokołów acylacji chemicznej między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji podczas stosowania schematu pracy w różnych systemach modelowych lub typach tkanek.
- Wiąże się z praktycznymi ograniczeniami dotyczącymi wykrywalności peptydów oraz dostępności reszt lizyny w złożonych mieszaninach.
Najczęstsze pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
1:18
Quantitatively Acetylate and/or Succinylate Proteins Using Isotope-labeled Acetic or Succinic Anhydride
3:48
Digest Reacted Protein Samples Using Glu-C Endoproteinase
6:27
Fractionate Peptides Using Offline Basic-pH Reversed Phase HPLC
8:15
Example Data Analysis Tutorial
10:28
Results: Succinylation Stoichiometry Ratio Calculation of Pre-succinylated BSA
11:13
Conclusion
