Name: Kwantyfikacja stechiometrii stechiometrii lizyny białek specyficznych dla miejsca przy użyciu spektrometrii mas z akwizycją niezależną od danych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji stechiometrii acetylacji i sukcynilacji lizyny w białkach przy użyciu spektrometrii mas z akwizycją niezależną od danych. Technika ta umożliwia precyzyjne określenie modyfikacji na poziomie konkretnych miejsc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases NIH-NIDDK grant R24 DK085610 (PI: E. Verdin). JGM był wspierany przez stypendium NIH T32 (T32 AG000266, kierownik projektu: J. Campisi). Autorzy potwierdzają wsparcie ze strony grantu NIH na wspólne oprzyrządowanie dla systemu TripleTOF 6600 w Buck Institute (1S10 OD016281, PI: B.W. Gibson).

1. Ilościowe acetylowanie i/lub succynylowanie białek z użyciem znakowanych izotopowo bezwodnika octowego lub bursztynowego
<ol>
	<li>Przygotować w trzech powtórzeniach próbki białka albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w ilości 100 µg każda, o stężeniu 1 µg/µL (łącznie 100 µL), w roztworze mocznika i wodorowęglanu trietyloamoniowego (TEAB) (8 M mocznika, 200 mM TEAB, pH 8). 
	UWAGA: Istotne jest zastosowanie buforu wolnego od amin. Próbki białek użyte w sekcji wyników reprezentatywnych to BSA, ilościowo sukcynilowana BSA oraz ich mieszaniny, co pozwala uzyskać próbki BSA z określonym stopniem wysycenia sukcynylacją wynoszącym odpowiednio 0%, 1%, 10%, 50% i 100% (każda próbka przygotowana w trzech powtórzeniach). Protokół ten przeprowadzono również z użyciem lizatów białkowych Escherichia coli oraz wątroby mysiej4. Protokół można zastosować również do innych lizatów komórkowych lub tkankowych.</li>
	<li>Zredukować 100 µL próbki BSA (100 µg), dodając 8 µL 250 mM ditiotreitolu (DTT), aby osiągnąć końcowe stężenie 20 mM DTT, a następnie inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 min przy mieszaniu przy 1 400 rpm.</li>
	<li>Zalkilować zredukowaną próbkę BSA, dodając 21,6 µL 200 mM jodoacetamidu, aby osiągnąć końcowe stężenie 40 mM jodoacetamidu, i inkubować próbkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 min. 
	UWAGA: Ważne jest, aby stężenie jodoacetamidu było nieco ponad dwukrotnie wyższe od stężenia DTT, aby zapewnić alkilację wszystkich zredukowanych grup tiolowych białek.</li>
	<li>Przejść do przygotowania bezwodnika octowego-d6 (krok 1.4.1) lub bezwodnika bursztynowego-d4 (krok 1.4.2), niezbędnych do chemicznej (ilościowej) acetylacji lub sukcynilacji próbek.
	<ol>
		<li>Wyznaczyć molarność (M) 1 g alikwoty wodnego roztworu bezwodnika octowego-d6 na podstawie masy cząsteczkowej (108,13 g/mol) i gęstości (1,143 g/mL przy 25 °C). 
		UWAGA: Opakowanie 1 g zawiera 9 248 µmol bezwodnika octowego-d6 w objętości 875 µL, co daje roztwór o stężeniu 10,57 M stosowany do pełnej acetylacji próbek.</li>
		<li>Przygotować 5 M roztwór bezwodnika bursztynowego-d4, rozpuszczając proszek w bezwodnym DMSO bezpośrednio przed reakcją, aby uniknąć hydrolizy odczynnika. Rozpuścić 0,24 g bezwodnika bursztynowego-d4 w 461 µL bezwodnego DMSO, aby otrzymać roztwór 5 M.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić ilościową chemiczną acetylację lub sukcynilację, dodając odpowiednio 60 µmol bezwodnika octowego-d6 (6 µL roztworu 10,57 M) lub bezwodnika bursztynowego-d4 (12 µL roztworu 5 M), a następnie inkubować próbkę w temperaturze 4 °C przez 20 min na mieszalniku wortexowym. 
	UWAGA: Ze względu na kwasowość bezwodników białka mogą ulec wytrąceniu. Należy to odnotować i skorygować zgodnie z opisem w kroku 1.6.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 10 µL 7,25 M NaOH, aby zwiększyć pH do ~8 i wyeliminować produkty uboczne O-acylacji. Krótko wymieszać na wortexie i sprawdzić pH próbki, nanosząc 1 µL na papier wskaźnikowy pH. 
	UWAGA: Aby osiągnąć pH 8, może być konieczne dodanie więcej niż 10 µL 7,25 M NaOH. Ponadto potencjalnie wytrącone białka powinny się ponownie rozpuścić.</li>
	<li>Powtórzyć etapy pełnej acylacji i regulacji pH (kroki 1.5 i 1.6) łącznie trzy razy. Sprawdzać wartości pH i odnotowywać objętość dodawanego roztworu zasadowego przy każdym powtórzeniu. Pracować sprawnie podczas powyższych etapów chemicznej acylacji, ponieważ bezwodniki ulegają hydrolizie i tracą reaktywność.</li>
	<li>Po końcowej reakcji znakowania i regulacji pH dodać 10 µL 50% roztworu hydroksaminy, aby odwrócić uboczne reakcje O-acylacji.</li>
</ol>
2. Trawienie przereagowanych próbek białek za pomocą endoproteinazy Glu-C
<ol>
	<li>Rozcień stężenie mocznika do 0,8 M przy użyciu 50 mM TEAB, pH 8 i znormalizuj objętości próbek.</li>
	<li>Przetraw próbki białek, dodając endoproteazę Glu-C w stosunku proteazy do białka substratu 1:50 (w/w), a następnie inkubuj próbki przez noc w temperaturze 37 °C przy mieszaniu z prędkością 1 400 rpm.</li>
	<li>Zakwasz i przerwij trawienie białek, dodając kwas mrówkowy do stężenia 1% objętościowo.</li>
	<li>Odziaлізуj próbki przy użyciu kartridży do ekstrakcji w fazie stałej o zrównoważonej hydrofilowości i lipofilowości (HLB). Użyj jednego kartridża z 30 mg sorbentu na próbkę, maksymalnie 5 mg materiału na kartridż4,18. 
	UWAGA: Ważne jest, aby sorbent wewnątrz kartridża pozostawał zwilżony przez cały proces odsalania. W razie potrzeby wyłącz pompę próżniową, aby spowolnić przepływ rozpuszczalnika lub próbki przez kartridż.
	<ol>
		<li>Włóż kartridż(e) do portów w 24-portowym szklanym bloku kolektora próżniowego i włącz pompę próżniową. Niewykorzystane porty pozostaw zakryte. W razie potrzeby pozostaw jeden lub dwa porty niezakryte, aby utrzymać niższe ciśnienie na manometrze próżniowym.</li>
		<li>Zwilż każdy kartridż dwukrotnie 800 µL roztworu 80% acetonitrylu (ACN)/0,2% kwasu mrówkowego/19,8% wody. Upewnij się, że poziom rozpuszczalnika pozostaje 2–3 mm powyżej poziomu sorbentu. Upewnij się, że manometr na kolektorze wskazuje wartość 16,9–67,7 kPa (5–20 in Hg).</li>
		<li>Urównoważ każdy kartridż trzykrotnie 800 µL 0,2% kwasu mrówkowego w wodzie. Upewnij się, że manometr na kolektorze wskazuje wartość 16,9–67,7 kPa (5–20 in Hg).</li>
		<li>Nałóż próbki peptydów na kartridż. Upewnij się, że manometr na kolektorze wskazuje wartość 6,77–8,47 kPa (2–2,5 in Hg), a szybkość przepływu nie przekracza 1 mL/min.</li>
		<li>Przemyj każdy kartridż trzykrotnie 800 µL 0,2% kwasu mrówkowego w wodzie. Upewnij się, że manometr na kolektorze wskazuje wartość 16,9–67,7 kPa (5–20 in Hg).</li>
		<li>Wyjmij kartridż z kolektora próżniowego i umieść go w mikroprobowce 1,5 mL.</li>
		<li>Eluuj peptydy jednokrotnie 800 µL roztworu 80% ACN/0,2% kwasu mrówkowego/19,8% wody i pozwól rozpuszczalnikowi inkubować z sorbentem przez 2–3 min.</li>
		<li>Użyj pipety, aby przepchnąć rozpuszczalnik przez warstwę sorbentu wewnątrz kartridża. Powtórz czynność dla drugiej elucji 400 µL 80% ACN/0,2% kwasu mrówkowego/19,8% wody do tej samej mikroprobowki 1,5 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysusz eluat za pomocą wirówki próżniowej (stała prędkość wirowania 268 x g), zazwyczaj przez 3 h. 
	UWAGA: W razie potrzeby wysuszone próbki eluatu można przechowywać w zamrożeniu w temperaturze -20 °C do czasu rozpoczęcia frakcjonowania.</li>
</ol>
3. Frakcjonowanie peptydów przy użyciu offline'owej wysokosprawnej chromatografii cieczowej w fazie odwróconej przy zasadowym pH (Basic-pH RP-HPLC)
<ol>
	<li>Przesuspendować próbki po peracylacji i trawieniu Glu-C (przygotowane zgodnie z opisem w sekcjach 1 i 2) w 200 µL Buforu A (10 mM mrzeczanu amonu w wodzie, pH 10), mieszać próbkę przez 10 min na wstrząsarzu typu vortex w temperaturze 4 °C, a następnie odwirować przy 17 500 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Otrzymana próbka peptydowa jest gotowa do frakcjonowania offline za pomocą rozdziału przy wysokim pH19,20.</li>
	<li>Zaprogramować metodę frakcjonowania offline HPLC w zależności od użytego instrumentu i oprogramowania. Poniższa metoda jest przeznaczona dla binarnego systemu pomp HPLC wyposażonego w detektor UV o dwóch długościach fali, autosampler, kolektor frakcji oraz kolumnę C18 (4,6 mm x 250 mm, wielkość cząstek 5 µm) odporną na pH 10.</li>
	<li>Zebrać 40 frakcji, każda po 2,1 min na frakcję, i połączyć co czwartą frakcję, co daje cztery końcowe połączone frakcje4. Można zastosować większą liczbę połączonych frakcji, aby dodatkowo zmniejszyć złożoność próbki kosztem czasu gromadzenia danych spektrometrii masowej.</li>
	<li>Wysuszyć połączone frakcje w liofilizatorze, ponownie suspendować wysuszone próbki peptydowe w 1 mL 50% ACN i 1% kwasu mrówkowego w wodzie, a następnie przenieść do mniejszego pojemnika na próbkę. Wysuszyć przeniesioną próbkę za pomocą wirówki próżniowej (stała prędkość wirowania 268 x g), zazwyczaj przez 1 h. 
	UWAGA: Niska prężność par mrzeczanu amonu może utrudniać całkowite wysuszenie. Jeśli po suszeniu pozostaną znaczne ilości soli mrzeczanu amonu w formie osadu, należy powtórzyć ekstrakcję do fazy stałej.</li>
	<li>Przesuspendować próbki w 20 µL 0,2% kwasu mrówkowego w wodzie z dodatkiem mieszaniny standardów peptydowych do indeksowanego czasu retencji (iRT). 
	UWAGA: Próbki są teraz gotowe do analizy metodą spektrometrii masowej.</li>
</ol>
4. Analiza DIA frakcjonowanych próbek peptydów
<ol>
	<li>Przeanalizuj próbki przy użyciu metody DIA LC-MS/MS, którą można dostosować do dostępnych instrumentów spektrometrii mas. Analizę przeprowadzono przy użyciu systemu nano-LC 2D HPLC połączonego online z ortogonalnym spektrometrem mas z kwadruplem i analizatorem czasu przelotu (QqTOF).
	<ol>
		<li>Zaprogramuj oprogramowanie instrumentu tak, aby mieszaniny peptydów były przenoszone na chip przedkolumnowy C18 (chip C18-CL 200 µm x 6 mm, 3 µm, 300 Å) i płukane z prędkością 2 µL/min przez 10 min rozpuszczalnikiem ładunkowym (H2O/0,1% kwasu mrówkowego) w celu odsolenia.</li>
		<li>Rozdziel peptydy chromatograficznie na chipie C18-CL 75 µm x 15 cm (3 µm, 300 Å) przy szybkości przepływu 300 nL/min z 2-godzinnym gradientem, stosując typowe (i specyficzne dla systemu LC) wodne bufory rozpuszczalnikowe oraz ACN4.</li>
		<li>Stwórz metodę DIA z oknami o zmiennej szerokości, w której okna zakresu masy o zmiennej szerokości (5 do 90 m/z) są przekazywane z kwadrupola Q1 do komory kolizyjnej w krokach przyrostowych w pełnym zakresie mas (m/z 400-1250). 
		UWAGA: Czas cyklu 3,2 s obejmuje 250 ms skanowania jonów prekursorowych, a następnie 45 ms czasu akumulacji dla każdego z 64 segmentów SWATH21,22.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj peptydy, stosując równoległą analizę próbek metodą DDA MS i tworząc biblioteki spektralne lub alternatywnie zidentyfikuj peptydy bezpośrednio z danych DIA przy użyciu oprogramowania PIQED23, które obsługuje wszystkie techniczne etapy przetwarzania danych, identyfikacji i importu do programu Skyline w celu późniejszej kwantyfikacji.</li>
</ol>
5. Przykładowy samouczek analizy danych
<ol>
	<li>Pobierz oprogramowanie Skyline (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) i utwórz konto w PanoramaWeb (https://panoramaweb.org). 
	UWAGA: Szczegółowe samouczki opisujące użytkowanie programu Skyline z danymi znajdują się pod adresem (https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials). Do ekstrakcji pól powierzchni piko-szczytów lekkich i ciężkich jonów fragmentacyjnych z pomiarów DIA można użyć innych algorytmów oprogramowania, takich jak Open SWATH24, wtyczka SWATH 2.0 do PeakView25 oraz Spectronaut26.
	<ol>
		<li>Pobierz plik danych Skyline dla reprezentatywnych wyników sukcynilowanej BSA (Rysunek 3) z Panorama Public: https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url. Na stronie Panorama przejdź do tabeli „Targeted MS Runs” i pobierz plik sky.zip, wybierając łącze DOWNLOAD po prawej stronie. Rozpakuj pobrany folder .zip i dwukrotnie kliknij plik skyline.sky, aby otworzyć go w programie Skyline. Sprawdź drzewo celów jonów fragmentacyjnych peptydów (lewy panel) oraz cztery chromatogramy dla określonych procentów sukcynilacji lekkiej (prawe panele).</li>
		<li>Wybierz menu „View”, przejdź do „Peak Areas | Replicate Comparison”. Po prawej stronie okna pojawi się panel „Peak Areas – Replicate Comparison” zawierający wykresy słupkowe. W panelu Peak Areas kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz „Transitions | Single”, co wyświetli pole powierzchni szczytu jonu fragmentacyjnego dla wybranego jonu fragmentacyjnego. Na koniec kliknij prawym przyciskiem myszy panel „Peak Areas” i wybierz „Order | Document”.</li>
		<li>W panelu drzewa celów po lewej stronie okna kliknij prawym przyciskiem myszy na peptyd „E.LCKVASLRE.T | Ratios To |Oneheavy”, co obliczy stosunek sygnału jonu lekkiego do sygnału jonu ciężkiego, Light/Heavy. 
		UWAGA: Nie jest to to samo, co stosunek stechiometrii zajętości miejsca Light/(Heavy+Light).</li>
		<li>Zauważ, że drzewo celów wyświetla teraz stosunki L/H po prawej stronie lekkich jonów fragmentacyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznacz „różnicujące jony fragmentacyjne”, które zawierają interesującą nas witrynę acylacji. 
	UWAGA: Jak pokazano na Rysunku 3, przedstawiającym ten konkretny przykład, jonami różnicującymi okazały się y7 (najwyższa ranga), y8, b3 oraz b4. Zauważ, że nieróżnicujące jony fragmentacyjne wykazują w drzewie celów stosunek równy 1.
	<ol>
		<li>W drzewie celów w lewym panelu, pod węzłem podrzędnym 588.30++ peptydu E.LCKVASLRE.T, kliknij różnicujący jon fragmentacyjny y7 
		K [y7 ] – 902.49+ (rank1) [5] 
		Zwróć uwagę na zwiększającą się wysokość i pole powierzchni szczytu.</li>
		<li>W drzewie celów w lewym panelu, pod węzłem podrzędnym 588.30++ peptydu E.LCKVASLRE.T, kliknij nieróżnicujący jon fragmentacyjny y5 A[y5 ] – 575.31+ (rank 6) [1]. Zaobserwuj, że chromatogramy i pola powierzchni szczytów jonu fragmentacyjnego y5 pozostają w tym samym zakresie dla wszystkich próbek.</li>
		<li>W panelu drzewa celów przejrzyj inne różnicujące (stosunek inny niż 1) i nieróżnicujące (stosunek 1) jony fragmentacyjne i zwróć uwagę na zmiany i wzorce w słupkowym wykresie pól powierzchni szczytów oraz na chromatogramach.</li>
		<li>Wyznacz dokładne pola powierzchni szczytów dla lekkich i ciężkich par jonów różnicujących w celu obliczenia stechiometrii (dodatkowe szczegóły znajdują się w pracy Meyer et al.4). Kliknij „View | Document Grid”, a następnie pojawi się siatka dokumentu. W lewym górnym rogu siatki dokumentu kliknij „Views | Transition Results”, aby wyświetlić wielokolumnową tabelę z informacjami o jonach fragmentacyjnych, takimi jak sekwencja peptydowa, mz prekursora, nazwa replikatu, itd.</li>
		<li>Zmień format raportu na „pivot”, ponownie klikając „Views” w siatce dokumentu i wybierając „Edit View”, aby otworzyć okno Customize View. W lewym dolnym rogu okna „Customize View” zaznacz „Pivot Replicate Name” i wybierz „Ok”, aby zamknąć okno Customize View. Zaobserwuj, że tabela „Document Grid: Transition Results” została teraz zreorganizowana, aby grupować kolumny Replicate Name, Retention Time, Area, Background, Peak Rank według replikatu (1%, 10%, 50%, 100% sukcynilacji).</li>
		<li>Dla peptydu „E.LCKVASLRE.T” w tabeli „Document Grid: Transition Result” znajdź kolumnę „Precursor Mz”, kolumnę „Fragment Ion” oraz kolumnę 1pct_light_sw1 Area (1% sukcynilacji). Zaobserwuj, że dla tego peptydu istnieją dwa jony prekursora: lekki (Precursor Mz 588.30 w pierwszych 8 wierszach) i ciężki (Precursor Mz 590.32 w ostatnich 8 wierszach).</li>
		<li>W kolumnie „Fragment Ion” znajdź dwa wiersze dla jonu fragmentacyjnego y8 odpowiadające lekkim i ciężkim jonom prekursora. Z tych samych wierszy w kolumnie 1pct_light_sw1 Area zapisz pola powierzchni y8 dla lekkiego (15 820) oraz ciężkiego (1 426 461).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykorzystując te wartości pól powierzchni szczytów, oblicz stechiometrię sukcynilacji, czyli proporcję zmodyfikowaną, zgodnie z poniższą formułą i uzyskaj stosunek stechiometryczny 0,01, czyli 1% sukcynilacji, co odpowiada proporcji lekkiej sukcynilacji w tej zdefiniowanej mieszaninie: 
	<img alt="Formuła obliczania stosunku, pokazująca bilans pól z wartościami L i H dla analizy ilościowej." src="/files/ftp_upload/57209/57209eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"></li>
	<li>Oblicz stosunek stechiometryczny dla 10% sukcynilacji, używając wartości pola powierzchni szczytu różnicującego jonu fragmentacyjnego y8 z kolumny 10pct_light_sw1 Area: 144 953 (lekki) i 1 188 041 (ciężki), aby uzyskać stosunek 0,10, czyli 10% sukcynilacji.</li>
	<li>Oblicz stosunek stechiometryczny dla 100% sukcynilacji, używając wartości pola powierzchni szczytu różnicującego jonu fragmentacyjnego y8 z kolumny 100pct_light_sw1 Area: 954 513 (lekki) i 16 407 (ciężki), aby uzyskać stosunek 0,98, czyli 98% sukcynilacji.</li>
	<li>Podobnie oblicz stosunek stechiometryczny dla 1% sukcynilacji, używając wartości pola powierzchni szczytu różnicującego jonu fragmentacyjnego b3 z kolumny 1pct_light_sw1 Area: 55 697 (lekki) i 3 149 119 (ciężki), aby uzyskać stosunek 0,01, czyli 1% sukcynilacji.</li>
	<li>Kontynuuj obliczenia stosunków stechiometrycznych przy użyciu formuły dla wszystkich różnicujących jonów fragmentacyjnych, zarówno jonów y, jak i b, aby uzyskać wartości stechiometrii sukcynilacji lizyny dla mieszanin o stopniu sukcynilacji 1, 10, 50 i 100%.</li>
</ol>

<ol><li>Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+landscape+of+lysine+acetylation+links+metabolism+and+cell+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).</li>
<li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((50+years+of+protein+acetylation%3A+from+gene+regulation+to+epigenetics%2C+metabolism+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).</li>
<li>Choudhary, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+acetylation+targets+protein+complexes+and+co-regulates+major+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions.</a> Science. 325 (5942), 834-840 (2009).</li>
<li>Meyer, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Lysine+Acetylation+and+Succinylation+Stoichiometry+in+Proteins+Using+Mass+Spectrometric+Data-Independent+Acquisitions+%28SWATH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Quantification of Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry in Proteins Using Mass Spectrometric Data-Independent Acquisitions (SWATH).</a> J Am Soc Mass Spectrom. 27 (11), 1758-1771 (2016).</li>
<li>Hirschey, M. D., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Regulation+by+Lysine+Malonylation%2C+Succinylation%2C+and+Glutarylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Metabolic Regulation by Lysine Malonylation, Succinylation, and Glutarylation.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2308-2315 (2015).</li>
<li>Still, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+mitochondrial+acetylation+dynamics+highlights+prominent+sites+of+metabolic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation.</a> J Biol Chem. 288 (36), 26209-26219 (2013).</li>
<li>Wagner, G. R., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+and+enzyme-independent+N%CE%B5-acetylation+and+N%CE%B5-succinylation+of+proteins+in+the+chemical+conditions+of+the+mitochondrial+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Widespread and enzyme-independent Nε-acetylation and Nε-succinylation of proteins in the chemical conditions of the mitochondrial matrix.</a> J Biol Chem. 288 (40), 29036-29045 (2013).</li>
<li>He, W., Newman, J. C., Wang, M. Z., Ho, L., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+sirtuins%3A+regulators+of+protein+acylation+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism.</a> Trends Endocrinol Metab. 23 (9), 467-476 (2012).</li>
<li>Castano-Cerezo, S., Bernal, V., Rohrig, T., Termeer, S., Canovas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+acetate+metabolism+in+Escherichia+coli+BL21+by+protein+N%28epsilon%29-lysine+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Regulation of acetate metabolism in Escherichia coli BL21 by protein N(epsilon)-lysine acetylation.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 99 (8), 3533-3545 (2015).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+Acetylation+is+a+Highly+Abundant+and+Evolutionarily+Conserved+Modification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Lysine Acetylation is a Highly Abundant and Evolutionarily Conserved Modification in Escherichia coli.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (2), 215-225 (2009).</li>
<li>Kuhn, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kinetic+and+proteomic+characterization+of+acetyl+phosphate-dependent+bacterial+protein+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">kinetic and proteomic characterization of acetyl phosphate-dependent bacterial protein acetylation.</a> PLoS One. 9 (4), e94816(2014).</li>
<li>Baeza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+site-specific+lysine+acetylation+in+an+entire+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of site-specific lysine acetylation in an entire proteome.</a> J Biol Chem. 289 (31), 21326-21338 (2014).</li>
<li>Zhou, T., Chung, Y. H., Chen, J., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Identification+of+Lysine+Acetylation+Stoichiometries+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Identification of Lysine Acetylation Stoichiometries in Mammalian Cells.</a> J Proteome Res. 15 (3), 1103-1113 (2016).</li>
<li>Nakayasu, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+determine+lysine+acetylation+stoichiometries%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A method to determine lysine acetylation stoichiometries.</a> Int J Proteomics. 2014, 730725(2014).</li>
<li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS1+Peptide+Ion+Intensity+Chromatograms+in+MS2+%28SWATH%29+Data+Independent+Acquisitions.+Improving+Post+Acquisition+Analysis+of+Proteomic+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">MS1 Peptide Ion Intensity Chromatograms in MS2 (SWATH) Data Independent Acquisitions. Improving Post Acquisition Analysis of Proteomic Experiments.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2405-2419 (2015).</li>
<li>Gillet, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+data+extraction+of+the+MS%2FMS+spectra+generated+by+data-independent+acquisition%3A+a+new+concept+for+consistent+and+accurate+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
<li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nat Biotechnol. 27 (7), 633-641 (2009).</li>
<li>Svinkina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep%2C+Quantitative+Coverage+of+the+Lysine+Acetylome+Using+Novel+Anti-acetyl-lysine+Antibodies+and+an+Optimized+Proteomic+Workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Deep, Quantitative Coverage of the Lysine Acetylome Using Novel Anti-acetyl-lysine Antibodies and an Optimized Proteomic Workflow.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2429-2440 (2015).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversed-phase+chromatography+with+multiple+fraction+concatenation+strategy+for+proteome+profiling+of+human+MCF10A+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10A cells.</a> Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).</li>
<li>Schilling, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acetylation+dynamics+in+response+to+carbon+overflow+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Protein acetylation dynamics in response to carbon overflow in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 98 (5), 847-863 (2015).</li>
<li>Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+High-Quality+SWATH+Acquisition+Data+for+Label-free+Quantitative+Proteomics+Studies+Using+TripleTOF+Mass+Spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of High-Quality SWATH Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF Mass Spectrometers.</a> Methods Mol Biol. 1550, 223-233 (2017).</li>
<li>Meyer, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIQED%3A+automated+identification+and+quantification+of+protein+modifications+from+DIA-MS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">PIQED: automated identification and quantification of protein modifications from DIA-MS data.</a> Nat Methods. 14 (7), 646-647 (2017).</li>
<li>Rost, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSWATH+enables+automated%2C+targeted+analysis+of+data-independent+acquisition+MS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">OpenSWATH enables automated, targeted analysis of data-independent acquisition MS data.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 219-223 (2014).</li>
<li>Lambert, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+differential+interactomes+by+affinity+purification+coupled+with+data-independent+mass+spectrometry+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping differential interactomes by affinity purification coupled with data-independent mass spectrometry acquisition.</a> Nat Methods. 10 (12), 1239-1245 (2013).</li>
<li>Bruderer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+limits+of+quantitative+proteome+profiling+with+data-independent+acquisition+and+application+to+acetaminophen-treated+three-dimensional+liver+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (5), 1400-1410 (2015).</li>
<li>Weinert, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+Quantification+of+Site-specific+Acetylation+Stoichiometry+Reveals+the+Impact+of+Sirtuin+Deacetylase+CobB+on+the+E.+coli+Acetylome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Accurate Quantification of Site-specific Acetylation Stoichiometry Reveals the Impact of Sirtuin Deacetylase CobB on the E. coli Acetylome.</a> Mol Cell Proteomics. 16 (5), 759-769 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten zapewnia nowatorską i dokładną metodę ilościowego określania specyficznego dla miejsca acetylacji lizyny i obłożenia sukcynylacji, którą można zastosować do całego proteomu. Metoda ta opiera się na pomiarze endogennych lekkich peptydów i egzogennych ciężkich peptydów, z których te ostatnie są generowane in vitro przy użyciu ilościowego chemicznego acylowania białek deuterowanym bezwodnikiem octowym-d 6 lub bezwodnikiem bursztynowym-d 4 (ryc. 1). W podobnych metodach wykorzystano stabilne znakowanie izotopowe natywnych niezmodyfikowanych reszt lizyny i przeprowadzono kwantyfikację zajętości miejsca w oparciu o jony prekursorowe12 lub jony fragmentacyjne z akwizycji DDA 13,14. Protokół ten stosuje kilka etapów podczas przygotowywania próbki w celu poprawy wydajności acylacji i rozszerza etykietowanie chemiczne o sukcynylację. Gromadzenie danych za pomocą akwizycji DIA pozwala uzyskać zarówno intensywność jonów prekursorowych, jak i jonów fragmentacyjnych MS2 w całym wykrywalnym zakresie mas, zmniejszając w ten sposób interferencję jonów fragmentacyjnych. Analiza i kwantyfikacja za pomocą Skyline i niestandardowych skryptów opracowanych we własnym zakresie umożliwiają obliczanie zajętości miejsca dla peptydów zawierających więcej niż jedną resztę lizyny i więcej niż jedną acylację w jednym miejscu.
Na etapie przygotowania próbki w ramach tego protokołu należy wykonać kilka krytycznych kroków, których należy ściśle przestrzegać. Ponieważ cały protokół opiera się na skutecznej modyfikacji chemicznej wszystkich pozostałości lizyny, ten krok ma ogromne znaczenie. Bezwodniki reagują z wolnymi aminami, dlatego należy unikać zawierających aminy lub cząsteczek zanieczyszczeń w lizacie białkowym. Również podczas etapu chemicznej acylacji należy upewnić się, że pH mieszaniny reakcyjnej jest dostosowane z powrotem do pH 8 po każdej z trzech inkubacji z odczynnikiem bezwodnikowym, ponieważ reakcja ta zakwasza mieszaninę i mogą powstawać reakcje uboczne O-acylacji. Ponadto rozcieńczenie mieszaniny reakcyjnej zawierającej 8 M mocznik do około 0,8 M mocznika przed trawieniem i sprawdzenie, czy pH mieści się w optymalnym zakresie, jest ważne dla optymalnej aktywności endoproteinazy Glu-C. Kolejnym kluczowym elementem naszego protokołu jest etap gromadzenia danych i wprowadzenie przepływu pracy DIA, który przezwycięża wszelkie niespójności próbkowania danych DDA i pozwala na kwantyfikację na poziomie jonów fragmentów MS2. Jedną z głównych zalet metodologii DIA jest zmniejszenie zakłóceń, które są zazwyczaj znacznie bardziej podatne i problematyczne podczas ilościowego określania sygnału jonów prekursorowych MS1 (jak sugerowały niektóre z poprzednich publikacji).
Podczas przygotowywania bardzo złożonych próbek można wprowadzić kilka modyfikacji w przepływie pracy. Liczba frakcji połączonych po frakcjonowaniu HPLC w odwróconej fazie zasadowej i pH offline można zmniejszyć, aby obniżyć złożoność połączonych próbek, które zostaną pozyskane przez LC / MS. Ponadto podczas akwizycji można również zastosować dłuższe gradienty chromatograficzne, aby umożliwić lepszą separację peptydów. Alternatywnie, wiele proteaz może być użytych do trawienia próbek w celu wytworzenia większej różnorodności rozszczepionych peptydów i zwiększenia pokrycia reszt białkowych lizyny. Próby i optymalizację można przeprowadzić przy użyciu komercyjnego BSA zawierającego określone wartości procentowe acetylacji lub sukcynylacji.
Jednym z ograniczeń tego protokołu jest potencjalnie niewielkie przeszacowanie zajętości miejsca z powodu nieuwzględnionych innych modyfikacji lizyny, takich jak metylacja lub ubikwitynacja itp., w tym samym miejscu4. Obliczone na podstawie obszarów pików lekkich i ciężkich modyfikacji acylowych, L/(L+H), zajętość miejsca opiera się na założeniu, że całkowity poziom modyfikacji w miejscu lizyny składa się tylko z endogennej "lekkiej" acylacji (L) i chemicznie znakowanej "ciężkiej" acylacji (H). Jednakże rzeczywiste całkowite obłożenie acylacji w miejscu in vivo może obejmować inne modyfikacje poza acetylacją i/lub sukcynylacją. Dodatkowo zgłaszana czystość izotopowa zakupionych odczynników bezwodnik octowy-d 6 (99%) i bezwodnik bursztynowy-d 4 (>98%) może przyczyniać się do niewielkiego przeszacowania nawet o 2% (sukcynyl) lub 1% (acetyl) endogennego poziomu acylacji4. Łącznie te nieznaczne przeszacowania zwiększają trudności w ilościowym określeniu miejsc o obłożeniu poniżej 1%. Duże różnice w liczebności między kompletnymi chemicznie acylowanymi peptydami a natywnymi acylowanymi peptydami również przyczyniają się do potencjalnych błędów ilościowych zajętości miejsca, szczególnie w przypadku nisko endogennych acylowanych peptydów27. Niedawne badanie przeprowadzone przez Weinert i wsp. 27 stwierdziło, że zmniejszone różnice liczebności między kompletnymi peptydami peracetylowanymi mogą zmniejszyć błąd kwantyfikacji27.
Kwantyfikacja stechiometryczna zebrana za pomocą tego protokołu może wskazać ważne punkty zapalne acylacji w określonym białku i sformułować hipotezy dla biologicznych eksperymentów uzupełniających, takich jak mutageneza ukierunkowana na miejsce w niektórych miejscach zainteresowania. Protokół ten może również ujawnić połączone efekty miejsc stechiometrii o niskiej acylacji, które mogą wywierać pośredni lub subtelny wpływ na stabilność strukturalną białek i zlokalizowane środowiska komórkowe. Dodatkowo, wdrożenie tego protokołu do pomiaru acetylacji i sukcynylacji oraz innych możliwych modyfikacji acylacji lizyny poza acetylacją w unikalny sposób dostarczyłoby wglądu w dynamiczne efekty acylacji na białka w różnych warunkach biologicznych.

N Ɛ-acylacja białek reszt lizyny jest ważnym regulatorem funkcji białek. Uważa się, że acetylacja lizyny i inne acylacje, takie jak sukcynylacja, malonylacja i glutarylacja, regulują metabolizm, sygnalizację komórkową i inne procesy komórkowe1,2,3,4 i mają wpływ na zaburzenia metaboliczne5. Liczne badania wykazały, że modyfikacje acylu lizyny ulegają dużym zmianom fałdowania w różnych warunkach w tkankach i liniach komórkowych ssaków5,6,7,8 a także bakterie9,10,11, jednak te względne zmiany fałdowania nie dają wglądu w proporcję całkowitego zmodyfikowanego białka. Badania przedstawiające pomiary zajętości miejsc acylacji są rzadkie12,13,14, pomimo znaczenia i potrzeby takich badań, ponieważ dostarczają one więcej szczegółów niż względna zmiana krotności. Na przykład 10-krotna zmiana może oznaczać wzrost obłożenia witryny z 0,01 do 0,1%, z 1 do 10%, a nawet z 10 do 100%. Dokładne pomiary stechiometryczne są niezbędne do interpretacji biologicznego znaczenia acylacji i przewidywania wpływu na wielkość zmian strukturalnych i ewentualnie funkcjonalnych białek.
Jedna z poprzednich metod ilościowego określania zajętości miejsca wykorzystuje ciężkie chemiczne znakowanie stabilnymi izotopami niezmodyfikowanych reszt lizyny, a następnie spektrometrię mas do pomiaru stosunku między endogenną "lekką" acetylacją w porównaniu do egzogennej, chemicznie znakowanej "ciężkiej" acetylo-lizyny przy użyciu intensywności jonów prekursorowych<klasa sup="xref">12. Inne niedawne badanie przeprowadzone przez Zhou i wsp. 13 opisał podobne podejście do oceny stechiometrii acetylacji lizyny, które również wykorzystywało pełną chemiczną acetylację wszystkich niezmodyfikowanych reszt lizyny w białkach ze stabilnym znakowaniem izotopowym, ale wykorzystywało intensywność fragmentów jonów mierzoną przez DDA. Nakayasu i wsp. 14 użył podobnego podejścia DDA, ale zamiast tego użył stosunku lekkich i ciężkich jonów acetylo-lizyny imonu do kwantyfikacji. Kwantyfikacja na podstawie jonów fragmentacyjnych, jonów imonowych lub jonów sekwencyjnych (MS2) w większości przypadków skutkuje mniejszymi zakłóceniami sygnału w porównaniu z przetwarzaniem nienaruszonych jonów prekursorowych peptydów (MS1). Jednak kwantyfikacja jonów fragmentacyjnych z widm MS/MS generowanych przez DDA może cierpieć z powodu stochastycznych niedoborów w próbkowaniu, w których jony prekursorowe o wysokiej obfitości są bardziej prawdopodobne, że zostaną wybrane do MS/MS, a tym samym prowadzą do stronniczego i niekompletnego próbkowania jonów prekursorowych.
Ten nowatorski przepływ pracy4 (Rysunek 1) wykorzystuje koncepcyjnie metodę znakowania chemicznego stabilnych izotopów, pierwotnie opracowaną przez Baeza et al. 12, jednak przepływ pracy jest następnie sprzężony z DIA w celu zebrania zarówno prekursorów, jak i wielu ilości jonów fragmentacyjnych w wykrywalnym zakresie mas15,16 zapewniając dokładne obliczenia stechiometryczne.
Obszary pików z jonów fragmentacyjnych, które zawierają interesujące miejsce acylacji, lub 'jony różnicujące fragmenty', są używane do ilościowego określenia zajętości miejsca acylacji (Rysunek 2). Jony fragmentacyjne, które nie zawierają modyfikacji, mają identyczne wartości m/z światła i ciężkości i są używane do identyfikacji peptydów, ale nie do oznaczania ilościowego. Skyline software17 służy do wyodrębniania obszarów pików prekursorów i fragmentów. Obecność jonów wielofragmentacyjnych zawierających dane miejsce acylacji zapewnia elastyczność w przypadku wykrycia zakłóceń w niektórych jonach fragmentacyjnych. Wizualizacja danych w Skyline pozwala na krytyczną kontrolę proporcji jonów odłamkowych lekkich do ciężkich. Oprócz ręcznej analizy danych opracowano napisany przez siebie pakiet R o otwartym kodzie źródłowym, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), który wykorzystuje dane dotyczące jonów prekursorowych i jonów fragmentacyjnych zebrane za pomocą DIA i określa ilościowo stechiometrię acylacji specyficznej dla miejsca z peptydów zawierających wiele reszt lizyny, co nie jest możliwe w przypadku pomiarów intensywności tylko jonów prekursorowych4.
Ten protokół pokazuje również użycie endoproteinazy Glu-C, która jest specyficzna dla C-końcowego rozszczepienia na resztach kwasu glutaminowego i asparaginowego, zamiast używania trypsyny lub proteazy Arg-C, ponieważ te ostatnie często generują bardzo duże i potencjalnie wielokrotnie acylowane peptydy proteolityczne wynikające z zablokowanego rozszczepienia trypsyny na acylowane reszty lizyny. Procedura znakowania chemicznego została również rozszerzona o zastosowanie bezwodnika bursztynowego (<klasa silna="xfig">Rysunek 1), umożliwiając w ten sposób ilościowe określenie stechiometrii sukcynylometrycznej sukcynylacji. Oprócz ulepszeń w przygotowaniu próbek, wdrożenie frakcjonowania peptydów poprzez separację peptydów w trybie offline, zasadowym pH i odwróconej fazie (bRP) jeszcze bardziej zmniejszyło zakłócenia kwantyfikacji, umożliwiając lepszą dekonwolucję stechiometrii acylacji w całych próbkach proteomu. Łącznie metoda ta ma i podkreśla kilka zalet: (1) zwiększona wydajność acylacji chemicznej; (2) pomiar stechiometrii sukcynylacji białek oprócz acetylacji; oraz (3) poprawiona dokładność kwantyfikacji. Lepsza kwantyfikacja wynika ze zmniejszenia zakłóceń w sygnałach jonów fragmentacyjnych z DIA w porównaniu z sygnałem prekursorowym DDA, a także z wdrożenia wstępnego frakcjonowania peptydów off-line przez bRP.

<table><tbody><tr><td>wodny bezwodnik octowy-d6</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>175641-1G</td><td>1% czystości izotopowej</td></tr><tr><td>bezwodnik bursztynowy-d4</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>293741</td><td>2% czystości izotopowej</td></tr><tr><td>stopień sekwencjonowania endoproteinaza Glu-C</td><td>Roche, Indianapolis, IN, USA (przez Sigma)</td><td>10791156001</td><td>1:50 stosunek proteazy do białka substratu (wt:wt)</td></tr><tr><td>Wkłady do ekstrakcji w fazie stałej (SPE) Oasis HLB</td><td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td><td>094225</td><td></td></tr><tr><td>HPLC acetonitryl</td><td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td><td>BJAH015-4</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy HPLC</td><td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td><td>BJAH365-4</td><td></td></tr><tr><td>jodoacetamid</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>I1149-25G</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol (DTT)</td> <td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>D9779-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy FLUKA (FA) do specyfikacji masy</td><td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td><td>C988C27</td> <td>~ 98%</td></tr> <tr><td>mocznika</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>PI29700</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td> <td>Pierce, Rockford, IL, Stany</td><td>Zjednoczone 88341</td><td></td></tr><tr><td>wodorowęglan trietyloamonu (TEAB)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>T7408-100ML</td><td></td></tr><tr><td>bezwodny dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA</td><td>43998</td><td></td></tr><tr><td>wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>EMDMillipore, Burlington, MA, USA</td><td>SX0590</td><td></td></tr><tr><td>50% roztwór hydroksyloaminy w wodzie</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>438227-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy LC-MS</td><td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td><td>BJLC365-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS acetonitryl</td><td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td><td>BJLC015-4</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Themomixer Compact</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy</td><td>T1317-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Savant SPD131DDA Koncentrator SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>SPD131DDA-115</td><td></td></tr><tr><td>Podwójny system pomp HPLC Waters 1525</td><td>Waters Corp., Milford, MA, Stany</td><td>Zjednoczone WAT022939</td><td></td></tr><tr><td>Detektor UV o podwójnej długości fali Waters 2487</td><td>Waters Corp., Milford, MA, Stany Zjednoczone</td><td>WAT081110</td><td></td></tr><tr><td>Waters 717plus Autosampler</td><td>Waters Corp., Milford, MA, Stany</td><td>Zjednoczone WAT022939</td><td></td></tr><tr><td>Zbieracz frakcji Waters III</td><td>Waters Corp., Milford, MA, Stany Zjednoczone</td><td>186001878</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Agilent Zorbax 300Extend C18</td><td>Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA</td><td>770995-902</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5</td><td>Labconco, Kansas City MO, USA</td><td>7751000</td><td></td></tr><tr><td>norma peptydu normalizującego indeksowany czas retencji (iRT)</td><td>Biognosys AG, Schlieren, Zurych, Szwajcaria</td><td>Ki-3002-2</td><td></td></tr><tr><td>System HPLC Ultra Plus nano-LC 2D</td><td>Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA</td><td>model # 845</td><td></td></tr><tr><td>ortogonalny kwadrupolowy spektrometr czasu przelotu (QqTOF) Spektrometr masowy TripleTOF 5600</td><td>Sciex LLC, Framingham, MA, USA</td><td>za wycenę</td><td></td></tr><tr><td>ortogonalny kwadrupolowy czas przelotu (QqTOF) Spektrometr masowy TripleTOF 6600</td><td>Sciex LLC, Framingham, MA, USA</td><td>za wycenę</td><td></td></tr><tr><td>Układ przedkolumnowy C18 (200 &mu; m i razy; Układ 6 mm ChromXP C18-CL, 3 i mu; m, 300 & Aring ;)</td><td>Sciex LLC, Framingham, MA, USA</td><td>804-00006</td><td></td></tr><tr><td>Wtyczka SWATH 2.0 do PeakView 2.2</td><td>Sciex LLC, Framingham, MA, USA</td><td>pobieranie oprogramowania Sciex</td><td></td></tr><tr><td>Spectronaut</td><td>Biognosys AG, Schlieren, Zurych, Szwajcaria</td><td>Układ Sw-3001</td><td></td></tr><tr><td>C18-CL (75 &micro; m x 15 cm ChromXP, 3 i mikro; m, 300 & Aring ;)</td><td>Sciex LLC, Framingham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>804-00001</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja stechiometrii stechiometrii lizyny białek specyficznych dla miejsca przy użyciu spektrometrii mas z akwizycją niezależną od danych

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Modyfikacja potranslacyjna (PTM) reszt lizyny białkowej przez N Ɛ-acylację indukuje zmiany strukturalne, które mogą dynamicznie regulować funkcje białek, na przykład poprzez zmianę aktywności enzymatycznej lub pośredniczenie w interakcjach. Precyzyjna kwantyfikacja zajętości acylacji białek specyficznych dla danego miejsca lub stechiometria jest niezbędna do zrozumienia funkcjonalnych konsekwencji zarówno globalnej stechiometrii niskiego poziomu, jak i indywidualnej stechiometrii acylacji wysokiego poziomu specyficznych reszt lizyny. Inne grupy zgłosiły pomiar stechiometrii acetylacji lizyny, porównując stosunek izotopów prekursorowych peptydów z endogennej, naturalnej acylacji obfitości i egzogennej, ciężkiej acylacji znakowanej izotopami wprowadzonej po ilościowej chemicznej acetylacji białek przy użyciu stabilnego bezwodnika octowego znakowanego izotopem. Protokół ten opisuje zoptymalizowane podejście z kilkoma ulepszeniami, w tym: (1) zwiększoną wydajnością acylacji chemicznej, (2) możliwością pomiaru sukcynylacji białek oprócz acetylacji oraz (3) poprawioną dokładnością ilościową dzięki zmniejszonym zakłóceniom przy użyciu kwantyfikacji jonów fragmentowych z akwizycji niezależnych od danych (DIA) zamiast sygnału jonów prekursorowych z akwizycji zależnej od danych (DDA). Wykorzystanie wyekstrahowanych obszarów pików z jonów fragmentacyjnych do kwantyfikacji umożliwia również unikalne różnicowanie stechiometrii acylacji na poziomie miejsca od peptydów proteolitycznych zawierających więcej niż jedną resztę lizyny, co nie jest możliwe przy użyciu sygnałów jonów prekursorowych do kwantyfikacji. Wizualizacja danych w Skyline, ilościowym środowisku proteomicznym typu open source, pozwala na wygodną inspekcję i przegląd danych. Razem ten przepływ pracy oferuje bezstronną, precyzyjną i dokładną ocenę ilościową zajętości całego proteomu w zakresie acetylacji i sukcynylacji lizyny specyficznej dla danego miejsca, co może ujawnić i nadać priorytet biologicznie istotnym miejscom acylacji.

Po akwizycji danych, z proteolitycznych peptydów acylowanych wyznaczono różnicujące jony fragmentacyjne MS2, a następnie przetworzono ekstrakcyjne chromatogramy jonowe (XIC) w programie Skyline i wyeksportowano odpowiadające im pola powierzchni pików lekkich i ciężkich, które ostatecznie wykorzystano do obliczenia stopnia zajętości miejsca modyfikacji. Rycina 2A przedstawia koncepcyjną ilustrację tego, jak może wyglądać XIC jonów prekursorowych z sygnałami peptydów lekkich i ciężkich, a Rycina 2B prezentuje przykład odpowiadających im XIC jonów fragmentacyjnych z kodowaniem kolorystycznym (czerwony = lekki; niebieski = ciężki) w celu odróżnienia jonów fragmentacyjnych zawierających modyfikacje acylacji lizyny.
Rysunek 3 przedstawia dane z eksperymentu dotyczącego stopnia zajętości, opisanego powyżej, w którym analizowano zdefiniowane proporcje lekkiej/ciężkiej sukcynilowanej BSA otrzymanej wewnętrznie na poziomach 1, 10, 50 lub 100%, oraz wyznaczano stopień zajętości sukcynilowania. Import danych o zajętości z DIA do programu Skyline umożliwia łatwą wizualizację drzewa celów, wyświetlanie sekwencji peptydów oraz jonów fragmentacyjnych zarówno dla lekkich, jak i ciężkich jonów prekursorowych (Rysunek 3A). Dane z DIA-MS dla każdego zdefiniowanego stosunku sukcynilowanej BSA bezpośrednio ujawniły różnice względne w stosunku jonu y7 lekkiego do ciężkiego, który był najwyżej sklasyfikowanym różnicującym jonem fragmentacyjnym z zidentyfikowanego dopasowania widma peptydowego (oznaczone na czerwono, Rysunek 3B). Rysunek 4 przedstawia przegląd przetworzonych wyników z obliczeń zajętości MS2, które potwierdziły procentowy stopień zajętości sukcynilowania białka wejściowego, w tym przypadku pre-sukcynilowanej BSA. Zmierzony stopień zajętości sukcynilowania lizyny dla 20 proteolitycznych peptydów sukcynilowanych uzyskanych z komercyjnej pre-sukcynilowanej BSA, sukcynilowanej w określonych procentach (np. 0, 1, 10, 50 i 100%), przedstawiono w Tabeli 2. Dla każdego z 20 proteolitycznych peptydów BSA najwyżej sklasyfikowany, różnicujący jon fragmentacyjny MS2 został użyty do obliczenia stopnia zajętości sukcynilowania lizyny (Ksucc) jako L/(L+H) w %. Ogólnie rzecz biorąc, kwantyfikacja oparta na MS2 wykazała bardzo wysoką dokładność w wyznaczaniu stopnia zajętości acylacji nawet przy niskich stechiometriach.
<img alt="Proces modyfikacji chemicznej, schemat HPLC-MS: peracetylacja i persuccynylacja, trawienie GluC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat wyznaczania stechiometrii. (A) Białka inkubuje się trzykrotnie z bezwodnikiem octowym-d6, aby zaacetylować niemodyfikowane reszty lizyny. Następnie zaacetylowane białka trawi się endoproteinazą Glu-C, po czym przeprowadza się frakcjonowanie peptydów proteolitycznych za pomocą chromatografii odwróconej fazy w pH zasadowym. Na koniec peptydy analizuje się metodą LC-MS z użyciem DIA ze zmienną szerokością okien prekursorów. (B) Ten sam schemat postępowania stosuje się do wyznaczenia stechiometrii succynylacji, jak opisano w punkcie (A), z wyjątkiem zamiany ciężkiego odczynnika acylującego na bezwodnik bursztynowy-d4. Rysunek zaadaptowano z Meyer et al.4 (J. Am. Soc. Mass Spectrom., Open Choice). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Diagram intensywności jonów w spektrometrii mas, metoda SWATH; XIC prekursorów/fragmentów, analiza peptydów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykład możliwych do uzyskania danych i obliczeń stechiometrycznych. (A) Lekkie (L) i ciężkie (H) jony prekursorowe MS1 zawierające jedną acetylowaną lizynę różnią się o 3 jednostki masy. Wykresy XIC zostały wygenerowane zarówno dla lekkich, jak i ciężkich obwiedni izotopowych, zaznaczonych odpowiednio na czerwono i niebiesko. (B) Kwantyfikacja na podstawie XIC jonów fragmentacyjnych MS2 z pomiarów DIA może być przeprowadzona z wykorzystaniem „rozróżniających” lekkich i ciężkich jonów fragmentacyjnych zawierających miejsce acetylowania, zaznaczone na czerwono i niebiesko. Wspólne jony fragmentacyjne są wyświetlone jako czarne linie przerywane i nie zawierają miejsca modyfikacji. Rycina zaadaptowana z Meyer et al.4 (J. Am. Soc. Mass Spectrom., Open Choice). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Chromatogramy Skyline, dane o jonach fragmentacyjnych; analiza białek. Schemat przedstawia intensywność w funkcji czasu retencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wizualizacja w programie Skyline sukcynilowanego peptydy proteolitycznego BSA przy różnych poziomach zajętości. (A) Drzewo celów (Target Tree) w programie Skyline pokazujące peptyd proteolityczny LCKsuccVASLRE oraz powstałe z niego jony fragmentacyjne. (B) Wyekstrahowane chromatogramy jonów fragmentacyjnych w programie Skyline przy różnych poziomach zajętości sukcynilacji. Najwyżej oceniony jon różnicujący, y7, wykazuje wzrost pola powierzchni piku dla wartości 1, 10, 50 i 100%, co koreluje z procentową zawartością wprowadzonego wcześniej sukcynilowanego BSA (przygotowanego wewnętrznie). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres analizy stechiometrii peptydów z sukkynylacją K; wykres pudełkowy przedstawiający stosunki zajętości K-sukkynyl." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Ocena stechiometrii acylacji uprzednio sukkynylowanej BSA. Pięć różnych próbek BSA o określonych procentach modyfikacji ciężkiej (np. 0, 1, 10, 50 i 100%) poddano oznaczeniu zajętości metodą MS2. Zajętość miejsc dla 20 sukkynylowanych peptydów BSA określono na podstawie najwyżej ocenionych różnicujących jonów fragmentacyjnych dla pięciu różnych próbek BSA o określonych procentach modyfikacji lekkiej (np. 0, 1, 10, 50 i 100%). Wykres pudełkowy (Box Whisker plot) przedstawia rozkład 20 peptydów sukkynylnych; wartości dla 50% peptydów znajdują się w „pudełku” (od 25. do 75. percentyla), górny wąs wskazuje wartości od 75. percentyla do maksimum (100%), a dolny wąs wskazuje wartości od 25. percentyla do minimum (0. percentyl). (J. Am. Soc. Mass Spectrom., Open Choice). Ilościowe zestawienie pomiarów znajduje się w Tabeli 2. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Czas (minuta)</td>
			<td>% A</td>
			<td>% B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.27</td>
			<td>92</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45.27</td>
			<td>73</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>49.27</td>
			<td>69</td>
			<td>31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65.27</td>
			<td>61</td>
			<td>39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72.27</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80.00</td>
			<td>10</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85.00</td>
			<td>10</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>86.00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120.00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Przepływ: 0.7 mL/min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Bufor A: 10 mM formatu amonu w wodzie, pH 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Bufor B: 10 mM formatu amonu w 90% ACN i 10% wody, pH 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Uwaga: pH obu faz ruchomych skorygowano do 10 za pomocą czystego amoniaku</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Gradient dla frakcjonowania metodą HPLC w układzie odwróconym przy zasadowym pH w trybie offline. Długość gradientu: 120 min. Bufor A: 10 mM formatu amonu w wodzie, pH 10. Bufor B: 10 mM formatu amonu w 90% ACN i 10% wody, pH 10.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >L/L+H w %</td>
			<td >L/L+H w %</td>
			<td >L/L+H w %</td>
			<td >L/L+H w %</td>
			<td >L/L+H w %</td>
		</tr >
		<tr >
			<td > Ksucc 0%</td>
			<td >Ksucc 1%</td>
			<td >Ksucc 10% </td>
			<td >Ksucc 50% </td>
			<td >Ksucc 100% </td>
		</tr >
		<tr >
			<td >0.2</td >
			<td >1.7</td >
			<td >11.1</td >
			<td >50.9</td >
			<td >99.2</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >1.2</td >
			<td >2.3</td >
			<td >12.3</td >
			<td >49.4</td >
			<td >97.6</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2.9</td >
			<td >3.8</td >
			<td >14</td >
			<td >48.6</td >
			<td >99.5</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >0.5</td >
			<td >1.8</td >
			<td >11.7</td >
			<td >50.8</td >
			<td >99.5</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >0.2</td >
			<td >1.7</td >
			<td >11.1</td >
			<td >48.3</td >
			<td >98.2</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >0.2</td >
			<td >1.2</td >
			<td >11</td >
			<td >47.5</td >
			<td >96.1</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >0.3</td >
			<td >1.6</td >
			<td >12.8</td >
			<td >51</td >
			<td >99.2</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >3.7</td >
			<td >5.2</td >
			<td >14.7</td >
			<td >51.9</td >
			<td >89.5</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >1.5</td >
			<td >1.8</td >
			<td >12.5</td >
			<td >47.2</td >
			<td >91.1</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >0.8</td >
			<td >1.5</td >
			<td >11.3</td >
			<td >48.4</td >
			<td >96.8</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >0.2</td >
			<td >1.6</td >
			<td >13.9</td >
			<td >49.7</td >
			<td >98.9</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >0.1</td >
			<td >1.1</td >
			<td >10.7</td >
			<td >48.2</td >
			<td >98.6</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >0.2</td >
			<td >0.9</td >
			<td >10.3</td >
			<td >49.4</td >
			<td >99.4</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >0.5</td >
			<td >2.5</td >
			<td >17.2</td >
			<td >52.3</td >
			<td >97.5</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >0.1</td >
			<td >3.5</td >
			<td >20.8</td >
			<td >51</td >
			<td >99</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >0.3</td >
			<td >1.9</td >
			<td >10.7</td >
			<td >49.6</td >
			<td >98.2</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2</td >
			<td >1.7</td >
			<td >10.9</td >
			<td >47.7</td >
			<td >96.3</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >0.3</td >
			<td >1.2</td >
			<td >10</td >
			<td >53</td >
			<td >98</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >1.1</td >
			<td >1.8</td >
			<td >12.9</td >
			<td >57.9</td >
			<td >94.1</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >0.2</td >
			<td >1.4</td >
			<td >11.6</td >
			<td >48.6</td >
			<td >98.8</td >
		</tr >
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Ilościowe oznaczenie stopniay zajęcia sukcynylacji lizyny w BSA dla 20 peptydów proteolitycznych poddanych sukcynylacji. Peptydy sukcynylowane otrzymano z komercyjnej, uprzednio sukcynylowanej BSA, sukcynylowanej w określonych procentach (np. 0, 1, 10, 50 i 100%). Dla każdego z 20 proteolitycznych peptydów BSA najwyżej oceniony, różnicujący jon fragmentu MS2 został wykorzystany do obliczenia stopnia zajęcia sukcynylacji lizyny (Ksucc) jako L/(L+H) w %.

Tutaj prezentujemy bezstronną kwantyfikację specyficznej dla miejsca acetylacji białek i/lub zajętości sukcynylacji (stechiometria) całego proteomu poprzez analizę ratiometryczną endogennych modyfikacji modyfikacji wprowadzonych po ilościowym acylowaniu chemicznym przy użyciu stabilnych bezwodników znakowanych izotopami. W połączeniu ze spektrometrią mas akwizycji niezależnym od wrażliwych danych, uzyskuje się dokładne pomiary zajętości obiektu.

Kwantyfikacja stechiometrii stechiometrii lizyny białek specyficznych dla miejsca przy użyciu spektrometrii mas z akwizycją niezależną od danych

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Ogólnym celem tego nowatorskiego przepływu pracy jest określenie zajętości lub stechiometrii modyfikacji potranslacyjnych białek w określonych miejscach acetylacji. Ten nowatorski przebieg pracy spektrometrii mas zapewnia wyższy poziom precyzji oznaczania ilościowego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące odwracalnej regulacji białek poprzez modyfikację potranslacyjną, taką jak acetylacja lizyny lub sukcynylacja, miejsca są najbardziej zmodyfikowane i mogą zmieniać funkcję białka. Główną zaletą tej techniki jest to, że stechiometria acetylacji lizyny oraz sukcynylacji i sukcynylacji na poziomie miejsca są dokładnie określone, a metoda może określić stechiometrię na podstawie peptydów z wieloma resztami lizyny. Technika ta jest bardzo istotna, ponieważ ujawnia stechiometrię acetylacji i sukcynylacji lub proporcje zmodyfikowane w porównaniu z niezmodyfikowanymi, zamiast mierzyć bezwymiarową względną zmianę obfitości. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, gdy zdałem sobie sprawę, że wykorzystanie niezależnych od danych akwizycji i kwantyfikacji opartej na MS2 do analizy stechiometrycznej znacznie poprawi dokładność pomiaru. Przygotowanie trzech powtórzeń po 100

quantification-site-specific-protein-lysine-acetylation-succinylation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy metodę wykorzystującą spektrometrię mas MALDI oraz chemię redukcyjnego metylowania do ilościowego określania zmian w metylowaniu lizyny.

Zastosowanie metody MassSQUIRM do ilościowych pomiarów aktywności demetylazy lizyny

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Znakowanie stabilnych izotopów peptydów metodą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) to szybka, tania strategia dla dokładnej proteomiki ilościowej opartej na spektrometrii mas. W tym miejscu demonstrujemy solidną metodę przygotowania i analizy mieszanin białkowych przy użyciu podejścia ReDi, którą można zastosować do prawie każdego rodzaju próbki.

Proteomika ilościowa wykorzystująca dimetylację redukcyjną do znakowania stabilnych izotopów

Ten protokół opisuje wymagane kroki do przeprowadzenia testów deacetylacji in vitro i in vivo w celu ustalenia roli białek jako specyficznych substratów deacetylacji dla sirtuin i dalszego badania roli odwracalnej acetylacji lizyny jako modyfikacji potranslacyjnej.

Testy deacetylacji w celu rozwikłania wzajemnych zależności między sirtuinami (SIRT2) a specyficznymi substratami białkowymi

Ten protokół przedstawia w pełni zintegrowany przepływ pracy do charakteryzowania modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą spektrometrii mas (MS). Przepływ pracy obejmuje oczyszczanie histonów z kultur komórkowych lub tkanek, derywatyzację i trawienie histonów, analizę MS za pomocą nanoprzepływowej chromatografii cieczowej oraz instrukcje analizy danych. Protokół jest przeznaczony do wypełnienia w ciągu 2 - 3 dni.

Kompletny przepływ pracy do analizy modyfikacji potranslacyjnych histonów przy użyciu spektrometrii mas od dołu do góry: od ekstrakcji histonów do analizy danych

Rozszerzenie kodu genetycznego służy jako potężne narzędzie do badania szerokiego zakresu procesów biologicznych, w tym acetylacji białek. Tutaj demonstrujemy prosty protokół wykorzystania tej techniki do generowania jednorodnie acetylowanych białek w określonych miejscach w komórkach Escherichia coli.

Łatwy protokół do generowania specyficznie specyficznych dla miejsca acetylowanych białek w Escherichia coli

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) to wysoce czuła, niezawodna i łatwa do wykonania metoda wykrywania odwracalnej modyfikacji lipidów reszt cysteiny (S-acylacji) w różnych próbkach biologicznych.

Wykrywanie S-acylacji białek za pomocą wychwytywania wspomaganego żywicą acylową

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Poznaj metodę kwantyfikacji stechiometrii acetylacji i sukcynilacji lizyny w białkach przy użyciu spektrometrii mas z akwizycją niezależną od danych. Technika ta umożliwia precyzyjne określenie modyfikacji na poziomie konkretnych miejsc.

Kwantyfikacja stechiometrii stechiometrii lizyny białek specyficznych dla miejsca przy użyciu spektrometrii mas z akwizycją niezależną od danych (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja stechiometrii stechiometrii lizyny białek specyficznych dla miejsca przy użyciu spektrometrii mas z akwizycją niezależną od danych

Przeglądaj więcej filmów