Identyfikacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych za pomocą immunofluorescencji z przeciwciałami Pax7 i Laminin

Ogólnym celem tego protokołu jest identyfikacja dorosłych komórek satelitarnych mięśni szkieletowych za pomocą immunofluorescencji. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z liczbą i rozmieszczeniem komórek macierzystych mięśni zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że można zidentyfikować komórki macierzyste mięśni w ich środowisku fizjologicznym przy użyciu jedynie ograniczonej manipulacji.

Procedurę zademonstruje Faiza Naz, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Na początek przygotuj kąpiel z ciekłym azotem, wlewając ciekły azot do kolby Dewara. Następnie wlej 10 mililitrów metylobutanu do 20-mililitrowej plastikowej zlewki i przenieś zlewkę do kąpieli z ciekłym azotem.

Połóż wypreparowany mięsień piszczelowy przedni na płaskiej powierzchni małego plastikowego tłoka strzykawki. Następnie przykryj wycięty mięsień kilkoma kroplami związku Optimal Temperature Temperature lub O.C.T.Wyjmij zlewkę z metylobutanem z kąpieli ciekłego azotu, a następnie rozmroź powierzchnię za pomocą uchwytów nożyczek. Szybko zanurz tkankę pokrytą OCT w stopionym metylobutanie, aby ją zamrozić.

Następnie za pomocą kleszczy odłącz osadzoną tkankę od tłoka i przenieś ją do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Następnie przechowuj probówkę mikrowirówki w ciekłym azocie. Aby rozpocząć dzielenie kriostatu, dodaj kroplę związku OCT na środek uchwytu próbki kriostatu i pozwól mu częściowo zestalić się.

Następnie wbij osadzoną tkankę w związek OCT kostką do dołu i kolanem do góry. Następnie zamontuj uchwyt próbki na kriosacie i przetnij tkankę w odstępach 10 mikrometrów. Zbierz od czterech do ośmiu kriosekcji na każdym szkiełku pokrytym szronem.

Suszyć skrawki w temperaturze pokojowej przez trzy godziny, a następnie zebrać szkiełka do pudełka na szkiełka i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie wyjmij szkiełko z pudełka na szkiełka i podgrzej je do temperatury pokojowej. Następnie użyj pisaka blokującego płyny, aby zaznaczyć obszar wokół kriosekcji, aby zapobiec spływaniu płynów z boku.

W dygestorium dodaj od 300 do 500 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do zaznaczonego obszaru. Inkubuj szkiełko w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby utrwalić sekcje. Następnie spłucz paraformaldehyd ze szkiełka za pomocą PBS w pojemniku na szkiełka.

Aby rozpocząć pobieranie antygenu, napełnij pojemnik na szkiełko 200 mililitrami buforu cytrynianowego i przenieś szkiełko do pojemnika. Następnie przenieś pojemnik na szkiełka do szybkowaru pod wysokim ciśnieniem na 10 minut. Etap pobierania antygenu jest opcjonalny, jeśli skrawki są suszone w temperaturze pokojowej przez 30 minut i kontynuowane natychmiast.

Wtedy etap pobierania antygenu nie jest konieczny. Ale jeśli skrawki są suszone w temperaturze pokojowej przez ponad trzy godziny, a następnie przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, wymagany jest etap pobierania antygenu. Następnie schłodzić pojemnik na szkiełko pod bieżącą wodą przez 10 minut.

Następnie przenieś szkiełko do nowego pojemnika z 200 mililitrami PBST i spłucz PBST. Dodaj nasączone wodą chusteczki laboratoryjne do tacy, a następnie oznacz wypłukany szkiełko pisakiem PAP i umieść je w tacy. Dodaj 200 mikrolitrów roztworu blokującego do szkiełka.

Następnie przykryj tacę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Etap blokowania jest bardzo ważny, ponieważ stosowane przeciwciało Pax7 jest mysim przeciwciałem monoklonalnym. Krok blokowania myszy na myszy zmniejsza nieokreślone powiązania.

Następnie przepłukać szkiełko za pomocą PBST w pojemniku na szkiełka i umieścić je z powrotem na tacy. Dodać 200 mikrolitrów mieszanki przeciwciał pierwotnych do szkiełka i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie przepłucz szkiełko PBST, a następnie dodaj 200 mikrolitrów mieszanki przeciwciał drugorzędowych i inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Po okresie inkubacji przepłukać szkiełko PBST. Rozcieńczyć DAPI w szkiełku podstawowym i inkubować szkiełko w pojemniku przez trzy minuty. Następnie płucz DAPI PBST przez pięć minut.

Na koniec zamontuj szkiełko z nośnikiem montażowym i nałóż szkiełko nakrywkowe. W tym badaniu komórki satelitarne są z powodzeniem wizualizowane w sekcjach mięśni spoczynkowych dorosłych pod mikroskopem fluorescencyjnym. Szum tła zwykle obserwowany w dorosłej tkance mięśniowej i niektórych rodzajach włókien jest redukowany przez zastosowanie blokowania myszy na myszy.

Specyficzne sygnały immunostainowe są wzmacniane przez zastosowanie przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z jasnymi barwnikami Alexa. Dwufotonowy mikroskop konfokalny rejestruje ostrzejszy obraz w porównaniu z szerokokątnym mikroskopem fluorescencyjnym. Ten sam protokół można również zastosować do tkanki mięśniowej młodych myszy, zarodków myszy i uszkodzonych tkanek mięśniowych dorosłych.

Zarówno młodociane, jak i embrionalne tkanki mięśniowe wykazują bardziej aktywowane komórki satelitarne lub prekursory miogenne Pax7 ze stosunkowo większymi jądrami. W ten sposób łatwiej jest wizualizować komórki satelitarne młodszych myszy niż dorosłych myszy. W uszkodzonej tkance mięśniowej widocznych jest więcej aktywowanych komórek Pax7-dodatnich.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że szum pochodzący z autofluorescencji i niespecyficzne wiązanie immunologiczne myszy z myszą nie mogą być całkowicie wyeliminowane, ale dzięki temu protokołowi szum można znacznie zmniejszyć. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak identyfikować komórki satelitarne w kriosekcjach mięśni.