Name: Identyfikacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych za pomocą immunofluorescencji z przeciwciałami Pax7 i Laminin (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj metodę immunofluorescencji do identyfikacji komórek satelitarnych mięśni szkieletowych z wykorzystaniem przeciwciał Pax7 i Laminin. Technika ta umożliwia badanie komórek macierzystych mięśni w ich naturalnym środowisku fizjologicznym z minimalną manipulacją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Sekcji Obrazowania Światła NIAMS za dostarczenie mikroskopów i pomoc techniczną. Przeciwciała MF20 i Pax7 uzyskano z Banku Hybrydomy Badań Rozwojowych opracowanego pod auspicjami NICHD i utrzymywanego przez Wydział Nauk Biologicznych Uniwersytetu Iowa w Iowa City. Prace te były wspierane przez Intramural Research Program NIAMS of the National Institutes of Health.

W tym protokole, mięśnie przednich kończyn tylnych dorosłych myszy (2-6 miesięcy), piszczelowe przednie (TA) i prostownikowe długie (EDL), zostały użyte jako przykład do przeprowadzenia barwienia immunofluorescencyjnego na ich SC. Wszystkie etapy postępowania z myszami i sekcjami tkanki mięśniowej zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (ACUC) NIAMS/NIH.
1. Wypreparuj mięsień TA/EDL z tylnej kończyny myszy
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji w komorze eutanazyjnej wypełnionej CO2 zgodnie z wytycznymi ACUC NIH. W razie potrzeby wykonaj zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Połóż mysz ekranem do góry na podkładce sekcyjnej (na wznak). Rozpyl 70% etanolu na skórę brzucha. Wytnij 1-2 cm otwór poziomo na środku skóry brzucha myszy, a następnie wbij mysz, pociągając otwór w kierunku stóp myszy. Odsłoń jedną stronę tylnej kończyny myszy.</li>
	<li>Użyj dwóch ostrych kleszczy: użyj jednego do przytrzymania ścięgien mocujących TA / EDL do kostki, a drugiego użyj do złamania i ścinania powięzi pokrywającej TA / EDL. Po zdjęciu powięzi użyj ostrej końcówki kleszczy, aby odłączyć TA / EDL od kości piszczelowej, przesuwając końcówkę pod mięśniem TA / EDL.</li>
	<li>Odetnij ścięgna kostki nożyczkami, nadal trzymając je kleszczami. Przytnij mięsień nożyczkami wzdłuż linii podłużnej TA/EDL od kostki do kolana, jednocześnie podnosząc TA/EDL od strony kostki za pomocą kleszczy. Przetnij ścięgna po stronie kolana, aby odłączyć całe TA/EDL od kości piszczelowej.</li>
</ol>
2. Krio-osadzanie mięśnia TA/EDL
<ol>
	<li>Przygotować kąpiel z ciekłym azotem w pojemniku, np. kolbie Dewara z ciekłym azotem. Wlej metylobutan do małej plastikowej zlewki (około 20 ml) do połowy pełnej. Następnie umieść zlewkę w kąpieli z ciekłym azotem, aby ją zamrozić. Po kilku minutach sprawdź, czy metylobutan jest zamrożony. 
	UWAGA: Ciekły azot można zastąpić wiadrem suchego lodu, ale czas zamrażania jest wolniejszy.</li>
	<li>Położyć wypreparowany TA/EDL na płaskiej powierzchni małego plastikowego tłoka strzykawki. Całkowicie przykryj TA/EDL kilkoma kroplami środka o optymalnej temperaturze cięcia (O.C.T.) (medium zamrażające).</li>
	<li>Wyjmij zlewkę metylobutanu z kąpieli z ciekłym azotem i rozmroź powierzchnię ciepłym przedmiotem (np. rękojeścią nożyczek). Szybko zanurz pokryty O.C.T. TA / EDL na tłoku w stopionym metylobutanie, aby natychmiast zamrozić tkankę.</li>
	<li>Odłącz osadzoną tkankę od tłoka za pomocą kleszczyków i umieść ją w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Umieść probówkę w ciekłym azocie, aby przechowywać ją podczas pracy z większą liczbą próbek. 
	UWAGA: Osadzona tkanka może być przechowywana w temperaturze -80 °C przez długi czas (2 lata) lub -20 °C przez krótki okres (6 miesięcy).</li>
</ol>
3. Sekcja kriostatu
<ol>
	<li>Dodaj kroplę związku O.C.T. na środek uchwytu na próbki kriostatu. Poczekaj, aż związek OCT prawie zestali się. Szybko przyklej osadzony TA/EDL do mieszanki O.C.T., prostopadle do kostki w dół i kolanem do góry.</li>
	<li>Zamontuj uchwyt próbki na kriostacie, przetnij tkankę w odstępie 10 μm i zbierz krioskwizory na szkiełkach pokrytych szronem z około 4-8 sekcjami na jednym szkiełku.</li>
	<li>Suszyć sekcje w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3 godziny do nocy. 
	UWAGA: Chociaż suszenie sekcji w zamrażarce przez noc lub dłużej jest dopuszczalne, nieuchronnie zwiększy to autofluorescencję. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, susz skrawki przez 0,5 godziny, a następnie natychmiast przystąp do etapu utrwalania i barwienia.</li>
	<li>Zbierz szkiełka do pudełka na szkiełka i użyj ich natychmiast lub przechowuj je w temperaturze -80 °C lub -20 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
</ol>
4. Przygotowanie odczynników do barwienia immunofluorescencyjnego
<ol>
	<li>Przygotuj:
	<ol>
		<li>Przygotuj 2 l 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z 10x PBS.</li>
		<li>Przygotuj 40 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS z 16% PFA.</li>
		<li>Przygotuj 2 L PBST: 1x PBS z 0,1% Triton-100.</li>
		<li>Przygotuj 50 ml PBST-B: PBST z 2% albuminą surowicy bydlęcej (BSA).</li>
		<li>Przygotuj 10 ml PBST-B-G: PBST z 2% BSA i 5% normalnej surowicy koziej.</li>
		<li>Przygotuj 1 ml roztworu blokującego. Rozcieńczyć AffiniPure Fab Fragment kozioł anty-mysi IgG (H+L) (1:10) w PBST-B.</li>
		<li>Przygotuj 200 ml 1x bufor cytrynianowy. 
		UWAGA: Powyższe objętości roztworów są wystarczające na co najmniej 5 slajdów. Objętości należy dostosować w zależności od liczby szkiełek i wielkości pojemników na szkiełka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj barwniki przeciwciał:
	<ol>
		<li>Przeciwciała pierwszorzędowe (stężenie robocze): Przygotować 1,2 ml mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych, rozcieńczając mysie przeciwciało monoklonalne Pax7 (IgG1) (1-5 μg/ml) + poliklonalne przeciwciało królika Lamininy (0,5-2 μg/ml) + mysie przeciwciało monoklonalne MF20 (IgG2b) (0,5-2,5 μg/ml) w PBST-B-G. 
		UWAGA: Mysie przeciwciało monoklonalne MF20 (IgG2b) jest opcjonalne.</li>
		<li>Przeciwciała drugorzędowe (stężenie robocze): Przygotuj 1,2 ml mieszanki przeciwciał drugorzędowych, rozcieńczając kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG1 adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 488 (0,5-2 μg / ml) + Koza anty-królicze IgG (H + L) wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor Plus 555 (0,5-2 μg / ml) + przeciwciało wtórne anty-mysie anty-Mysz IgG2b, Alexa Fluor 647 (0,5-2 μg / ml) w PBST-B-G. 
		UWAGA: Alexa Fluor 647 jest opcjonalna.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Etapy barwienia immunofluorescencyjnego
<ol>
	<li>Ponownie nawodnić i naprawić kriosekcje za pomocą PFA.
	<ol>
		<li>Wyjmij kilka szkiełek kriogenicznych TA/EDL z pudełka na szkiełka. Ogrzej szkiełka w tacce na szkiełka w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Użyj pisaka blokującego ciecz (pisak PAP), aby narysować obszar zawierający wszystkie kriosekcje na szkiełku. Ten krąg zapobiegnie spływaniu roztworów ze zjeżdżalni.</li>
		<li>Zanieś tacę do laboratoryjnego dygestorium. Dodaj 300-500 μl 4% PFA na szkiełko w zakreślonym obszarze, aby utrwalić sekcje w temperaturze pokojowej na 10 minut. Umyć PFA za pomocą 1x PBS co najmniej 3x 5 min w pojemniku na szkiełka. 
		UWAGA: PFA jest odpadem toksycznym i niebezpiecznym; Należy go obsługiwać ostrożnie i wyrzucać do pojemnika na odpady niebezpieczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie antygenu
	<ol>
		<li>Napełnij kolejny pojemnik szkiełkowy 200 ml buforu cytrynianowego.</li>
		<li>Przenieś szkiełka do pojemnika. Przenieś pojemnik ze szkiełkami do szybkowaru, aby gotować szkiełka w trybie wysokiego ciśnienia przez 10 minut.</li>
		<li>Schłodzić pojemnik odsączaną wodą przez 10 min. Przenieść wszystkie szkiełka do nowego pojemnika z PBST (200 ml), płukać szkiełka PBST przez co najmniej 3 x 5 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie
	<ol>
		<li>Dodaj nasączone wodą chusteczki kimwipes do tacki trzymającej szkiełka, aby stworzyć wilgotne środowisko i uniknąć wysuszenia szkiełek.</li>
		<li>Przenieś szkiełka z powrotem do tacki i dodaj 200 μl roztworu blokującego na każde szkiełko. Przykryj tackę nakrętką i pozwól blokadzie rozwinąć się przez 30 min. 
		UWAGA: Przeciwciało Pax7 jest mysim przeciwciałem monoklonalnym, więc istnieje niespecyficzne wiązanie mysiej IgG w tkankach mięśniowych myszy, które tworzy wysokie tło. Użycie AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) blokuje niespecyficzne wiązanie myszy z myszą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosuj przeciwciała pierwszorzędowe.
	<ol>
		<li>Przepłukać szkiełka PBST raz w pojemniku na szkiełka. Następnie przenieś szkiełka z powrotem do tacki do barwienia.</li>
		<li>Na każde szkiełko nanieść 200 μl mieszaniny przeciwciał pierwotnych, przykryć tackę nakrętką i pozostawić reakcję do rozwoju w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez noc. 
		UWAGA: Najlepszy wynik daje reakcja nocna w temperaturze 4 °C, chociaż rozwinięcie reakcji w temperaturze pokojowej daje zadowalające wyniki. Przeciwciało miozyny MF20 można dodać do mieszanki w celu wykonania potrójnego (Pax7, Laminin, MF20) znakowania. MF20 barwi zróżnicowane włókna mięśniowe. Ten etap służy również jako kolejny etap blokujący z PBST-B-G w celu zmniejszenia potencjalnego niespecyficznego wiązania z przeciwciałami drugorzędowymi (przeciwciałami kozami) w następnym kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosuj przeciwciała drugorzędowe.
	<ol>
		<li>Wypłukać przeciwciała pierwszorzędowe PBST w temperaturze pokojowej co najmniej 3 x 5 min.</li>
		<li>Dodać 200 μl mieszaniny przeciwciał wtórnych do każdego szkiełka i pozostawić reakcję do rozwoju w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godz. 
		UWAGA: W przypadku Pax7 + Laminin użyj Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa 488 i Goat Anti-Rabbit Alexa 555. 
		W przypadku Pax7 + Laminin + MF20 dodaj do mieszanki Goat Anti-Mouse IgG2b Alexa 647.</li>
		<li>Wypłukać przeciwciała drugorzędowe PBST co najmniej 3 x 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol) przeciwplami i mocowaniu
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć DAPI (1:20 000) w PBST w pojemniku szkiełkowym, np. 10 μl DAPI w 200 ml PBST.</li>
		<li>Zabarwić szkiełka w pojemniku DAPI przez 3 min.</li>
		<li>Płucz DAPI za pomocą PBST przez co najmniej 5 x 5 minut.</li>
		<li>Zamontuj prowadnice za pomocą medium montażowego. Przykryj szkiełka szkiełkami nakrywkowymi. 
		UWAGA: DAPI jest toksyczny i niebezpieczny; Należy obchodzić się z nim ostrożnie i wyrzucać do butelki na odpady niebezpieczne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Mikroskopia fluorescencyjna
UWAGA: Opisany powyżej protokół barwienia immunofluorescencyjnego pozwoli na wizualizację SCs za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego o szerokim polu widzenia. Początkowo identyfikacja SC może być trudna. Oto kilka zalecanych kroków, które mogą być pomocne.
<ol>
	<li>Użyj kanału DAPI i obiektywów o małym powiększeniu, aby zobrazować sekcje na slajdach.</li>
	<li>Przełącz powiększenie z niskiego na wysokie. Do obserwacji SC wymagany jest obiektyw o powiększeniu co najmniej 20x).</li>
	<li>Użyj podwójnej kostki filtra dla 488 (FITC)/555 (rodamina), aby obserwować sygnały Pax7 i Laminin w tym samym czasie, aby zidentyfikować SC. Przy tym ustawieniu sygnał barwienia Pax7 ma lepszy kontrast z szumem tła.</li>
	<li>Szybko zmień kanał z FITC na DAPI, aby poprawnie zidentyfikować SC. Wszystkie SC powinny być Pax7/DAPI-dodatnie.</li>
</ol>

<ol><li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+and+cell+lineages+that+underlie+the+formation+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).</li>
<li>Buckingham, M., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX3+and+PAX7+as+upstream+regulators+of+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis.</a> Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).</li>
<li>Relaix, F., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+insect+eye+to+vertebrate+muscle%3A+redeployment+of+a+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network.</a> Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).</li>
<li>Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+Cells+in+Muscular+Dystrophy+-+Lost+in+Polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity.</a> Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).</li>
<li>Kuang, S., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+biology+of+satellite+cells+and+their+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential.</a> Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).</li>
<li>Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+the+engines+of+muscle+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, the engines of muscle repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).</li>
<li>Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%3A+therapeutic+potential+and+roadblocks%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks.</a> Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).</li>
<li>Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells+and+adult+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).</li>
<li>Giordani, L., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+skeletal+muscle+regeneration%3A+Integrating+genetic+determinants+and+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes.</a> FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+acts+directly+on+the+zebrafish+dermomyotome+to+promote+myogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation.</a> Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).</li>
<li>Juan, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+EZH2+controls+self-renewal+and+safeguards+the+transcriptional+identity+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells.</a> Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).</li>
<li>Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+fiber-specific+green+autofluorescence%3A+potential+for+stem+cell+engraftment+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts.</a> Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).</li>
<li>Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+satellite+cells+and+embryonic+muscle+progenitors+have+distinct+genetic+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements.</a> Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Powyższy protokół został oparty na metodzie barwienia Pax7/MF20 na mięśniach szkieletowych danio pręgowanego12. Zastosowane rozwiązania i kroki blokujące są identyczne lub podobne. Stosowane przeciwciała są identyczne. Dostosowane kroki opierały się na cechach tkanki mięśniowej myszy i SC. Po pierwsze, do mieszanki dodano przeciwciało Laminina, aby pomóc w wizualizacji i potwierdzeniu pozycji SC. Szczególnie pomocne było policzenie liczby SC pod mikroskopem podczas korzystania z podwójnej kostki f...

Mięśnie szkieletowe składają się z wielojądrowych komórek mięśniowych, zwanych miotubami, zorganizowanych w włókna mięśniowe, które generują siłę i ruchy poprzez skurcz. Większość mięśni szkieletowych, z wyjątkiem niektórych mięśni twarzoczaszki, wywodzi się z tymczasowej struktury embrionalnej zwanej somitem1. Miogenne komórki prekursorowe rozwarstwiają się z somitu nabłonka, stając się mioblastami. Mioblasty dalej różnicują się w miocyty, które łączą się, tworząc miotuby, tworząc wielojądrzaste włókna mięśniowe. Powyższy proces nazywa się miogenezą i charakteryzuje się czasowo regulowaną kontrolą ekspresji genów. Prekursory miogenne wyrażają Pax3 i Pax7, podczas gdy mioblasty wyrażają MyoD i/lub Myf5, a miocyty wyrażają miogeninę i miozyny2,3. Wzrost mięśni to proces, w którym włókna mięśniowe stają się większe poprzez włączenie większej liczby mięśni do istniejących włókien (hiperplazja) i poprzez wzrost rozmiaru włókien mięśniowych (hipertrofia)4. Podczas wzrostu mięśni istnieje zrównoważone źródło komórek miogennych, które mają właściwości komórek macierzystych, ponieważ mogą się różnicować i samoodnawiać. Komórki te są nazywane komórkami satelitarnymi w oparciu o ich fizyczną lokalizację między sarcolemmą (błoną komórkową włókna mięśniowego) a blaszką podstawną5. SC energicznie przyczyniają się do wzrostu mięśni w stadium młodocianym (pierwsze 2-3 tygodnie myszy po urodzeniu), ale stają się spokojne w spoczynku dorosłego mięśnia6. Co ciekawe, mogą być reaktywowane w odpowiedzi na urazy mięśni i różnicować się w nowe komórki mięśniowe w celu naprawy uszkodzonego mięśnia7.
Właściwości komórek macierzystych sprawiają, że badanie SC jest istotne zarówno dla podstawowej biologii mięśni, jak i terapii chorób mięśni8. W rezultacie, w ostatnich dziesięcioleciach był to obszar intensywnych badań. Dokonano ogromnego postępu w analizowaniu genetyki i epigenetyki SCs9,10. Techniki związane z izolacją i identyfikacją SC in situ zostały opracowane i zoptymalizowane w trakcie procesu11. Barwienie immunofluorescencyjne umożliwia identyfikację SC poprzez zastosowanie specyficznych przeciwciał, w tym przeciwciał przeciwko Pax7. Jednak niedobór i mały rozmiar SC w połączeniu z silną autofluorescencją dorosłej tkanki mięśni szkieletowych sprawiają, że wizualizacja jest wyzwaniem. W tym miejscu opisujemy protokół barwienia immunofluorescencyjnego zoptymalizowany pod kątem tkanki mięśniowej myszy dla Pax7 i oparty na istniejącej metodzie dla danio pręgowanego muscle12. Ponadto przeciwciało Laminina znakowane wyraźnym fluoroforem jest wykorzystywane do identyfikacji blaszki podstawnej, pod którą znajdują się SC. Protokół ten konsekwentnie umożliwia wizualizację Pax7-dodatnich SC i prekursorów miogennych we wszystkich badanych warunkach fizjologicznych i etapach rozwoju.

<table><tbody><tr><td>metylobutan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Optymalna temperatura skrawania (O.C.T.) związek</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>62550-01</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco, Themo Fisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>16% PFA</td><td>TED PELLA</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Normalna kozia surowica</td><td>Thermo Fisher</td><td>0 1-6201</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Fragment Koza anty-mysie IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-007-003</td><td></td></tr><tr><td>20x Bufor cytrynianowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>00 500</td><td></td></tr><tr><td>Pax7 monoklonalne mysie przeciwciało monoklonalne (IgG1) (supernatant)</td><td>Badanie rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalne przeciwciało królika Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>MF20 monoklonalne przeciwciało myszy (IgG2b) (supernatant)</td><td>Badanie rozwojowe Hybrydoma Bank</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG1 wchłonięte krzyżowo, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Goat anty-mysie przeciwciało wtórne IgG2b wchłonięte krzyżowo, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21242</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) Wysoce zaadsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr>Kriostat <td></td><td></td><td></td><td>Leica CM1860</td></tr><tr><td>Szerokokątny mikroskop</td><td></td><td></td><td></td>fluorescencyjny Leica DM6000</tr><tr><td>Szerokokątny mikroskop</td><td></td><td></td><td></td>fluorescencyjny Leica DMR</tr><tr>Mikroskop <td></td><td></td><td></td><td>konfokalny Zeiss LSM510</td></tr><tr>Mikroskop <td></td><td></td><td></td><td>konfokalny Zeiss LSM780</td></tr><tr><td>Szybkowar</td><td></td> <td>elektroniczny Cuisinart</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych za pomocą immunofluorescencji z przeciwciałami pax7 i laminin

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescencja to skuteczna metoda, która pomaga identyfikować różne typy komórek na odcinkach tkanki. W celu zbadania pożądanej populacji komórek, na skrawki tkanek nakłada się przeciwciała przeciwko określonym markerom komórkowym. W dorosłych mięśniach szkieletowych komórki satelitarne (SC) są komórkami macierzystymi, które przyczyniają się do naprawy i regeneracji mięśni. Dlatego ważne jest, aby wizualizować i śledzić populację komórek satelitarnych w różnych warunkach fizjologicznych. W spoczynkowych mięśniach szkieletowych SC znajdują się między blaszką podstawną a błoną plazmatyczną włókien mięśniowych. Powszechnie stosowanym markerem do identyfikacji SC na włóknach mięśniowych lub w hodowli komórkowej jest sparowane białko pudełkowe Pax7. W artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół immunofluorescencji Pax7 na odcinkach mięśni szkieletowych, który minimalizuje niespecyficzne barwienie i tło. Dodano również inne przeciwciało, które rozpoznaje białko (lamininę) blaszki podstawnej, aby pomóc w identyfikacji SC. Podobne protokoły można również wykorzystać do przeprowadzenia podwójnego lub potrójnego znakowania za pomocą Pax7 i przeciwciał dla dodatkowych białek będących przedmiotem zainteresowania.

Po wykonaniu powyższych kroków komórki satelitarne (SCs) można z sukcesem zwizualizować w przekrojach spoczywającego mięśnia dorosłych osobników pod mikroskopem fluorescencyjnym (Rysunek 1). Mimo że tkanka mięśniowa dorosłych osobników wykazuje silną autofluorescencję w określonych typach włókien, jasne barwniki z serii Alexa pozwalają zniwelować szum tła, dzięki czemu sygnał jest wyraźny (Rysunek 1A, B; groty st...

Precyzyjna identyfikacja komórek satelitarnych jest niezbędna do badania ich funkcji w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych. W artykule przedstawiono protokół identyfikacji komórek satelitarnych na wycinkach dorosłych mięśni szkieletowych za pomocą barwienia opartego na immunofluorescencji.

Identyfikacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych za pomocą immunofluorescencji z przeciwciałami Pax7 i Laminin

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Ogólnym celem tego protokołu jest identyfikacja dorosłych komórek satelitarnych mięśni szkieletowych za pomocą immunofluorescencji. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z liczbą i rozmieszczeniem komórek macierzystych mięśni zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że można zidentyfikować komórki macierzyste mięśni w ich środowisku fizjologicznym przy użyciu jedynie ograniczonej manipulacji.Procedurę zademonstruje Faiza Naz, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Na początek przygotuj kąpiel z ciekłym azotem, wlewając ciekły azot do kolby Dewara. Następnie wlej 10 mililitrów metylobutanu do 20-mililitrowej plastikowej zlewki i przenieś zlewkę do kąpieli z ciekłym azotem.Połóż wypreparowany mięsień piszczelowy przedni na płaskiej powierzchni małego plastikowego tłoka strzykawki. Następnie przykryj wycięty mięsień kilkoma kroplami związku Optimal Temperature Temperature lub O.C.T.Wyjmij zlewkę z metylobutanem z kąpieli ciekłego azotu, a następnie rozmroź powierzchnię za pomocą uchwytów nożyczek. Szybko zanurz tkankę pokrytą OCT w stopionym metylobutanie, aby ją zamrozić.Następnie za pomocą kleszczy odłącz osadzoną tkankę od tłoka i przenieś ją do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Następnie przechowuj probówkę mikrowirówki w ciekłym azocie. Aby rozpocząć dzielenie kriostatu, dodaj kroplę związku OCT na środek uchwytu próbki kriostatu i pozwól mu częściowo zestalić się.Następnie wbij osadzoną tkankę w związek OCT kostką do dołu i kolanem do góry. Następnie zamontuj uchwyt próbki na kriosacie i przetnij tkankę w odstępach 10 mikrometrów. Zbierz od czterech do ośmiu kriosekcji na każdym szkiełku pokrytym szronem.Suszyć skrawki w temperaturze pokojowej przez trzy godziny, a następnie zebrać szkiełka do pudełka na szkiełka i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie wyjmij szkiełko z pudełka na szkiełka i podgrzej je do temperatury pokojowej. Następnie użyj pisaka blokującego płyny, aby zaznaczyć obszar wokół kriosekcji, aby zapobiec spływaniu płynów z boku.W dygestorium dodaj od 300 do 500 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do zaznaczonego obszaru. Inkubuj szkiełko w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby utrwalić sekcje. Następnie spłucz paraformaldehyd ze szkiełka za pomocą PBS w pojemniku na szkiełka.Aby rozpocząć pobieranie antygenu, napełnij pojemnik na szkiełko 200 mililitrami buforu cytrynianowego i przenieś szkiełko do pojemnika. Następnie przenieś pojemnik na szkiełka do szybkowaru pod wysokim ciśnieniem na 10 minut. Etap pobierania antygenu jest opcjonalny, jeśli skrawki są suszone w temperaturze pokojowej przez 30 minut i kontynuowane natychmiast.Wtedy etap pobierania antygenu nie jest konieczny. Ale jeśli skrawki są suszone w temperaturze pokojowej przez ponad trzy godziny, a następnie przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, wymagany jest etap pobierania antygenu. Następnie schłodzić pojemnik na szkiełko pod bieżącą wodą przez 10 minut.Następnie przenieś szkiełko do nowego pojemnika z 200 mililitrami PBST i spłucz PBST. Dodaj nasączone wodą chusteczki laboratoryjne do tacy, a następnie oznacz wypłukany szkiełko pisakiem PAP i umieść je w tacy. Dodaj 200 mikrolitrów roztworu blokującego do szkiełka.Następnie przykryj tacę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Etap blokowania jest bardzo ważny, ponieważ stosowane przeciwciało Pax7 jest mysim przeciwciałem monoklonalnym. Krok blokowania myszy na myszy zmniejsza nieokreślone powiązania.Następnie przepłukać szkiełko za pomocą PBST w pojemniku na szkiełka i umieścić je z powrotem na tacy. Dodać 200 mikrolitrów mieszanki przeciwciał pierwotnych do szkiełka i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie przepłucz szkiełko PBST, a następnie dodaj 200 mikrolitrów mieszanki przeciwciał drugorzędowych i inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez godzinę.Po okresie inkubacji przepłukać szkiełko PBST. Rozcieńczyć DAPI w szkiełku podstawowym i inkubować szkiełko w pojemniku przez trzy minuty. Następnie płucz DAPI PBST przez pięć minut.Na koniec zamontuj szkiełko z nośnikiem montażowym i nałóż szkiełko nakrywkowe. W tym badaniu komórki satelitarne są z powodzeniem wizualizowane w sekcjach mięśni spoczynkowych dorosłych pod mikroskopem fluorescencyjnym. Szum tła zwykle obserwowany w dorosłej tkance mięśniowej i niektórych rodzajach włókien jest redukowany przez zastosowanie blokowania myszy na myszy.Specyficzne sygnały immunostainowe są wzmacniane przez zastosowanie przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z jasnymi barwnikami Alexa. Dwufotonowy mikroskop konfokalny rejestruje ostrzejszy obraz w porównaniu z szerokokątnym mikroskopem fluorescencyjnym. Ten sam protokół można również zastosować do tkanki mięśniowej młodych myszy, zarodków myszy i uszkodzonych tkanek mięśniowych dorosłych.Zarówno młodociane, jak i embrionalne tkanki mięśniowe wykazują bardziej aktywowane komórki satelitarne lub prekursory miogenne Pax7 ze stosunkowo większymi jądrami. W ten sposób łatwiej jest wizualizować komórki satelitarne młodszych myszy niż dorosłych myszy. W uszkodzonej tkance mięśniowej widocznych jest więcej aktywowanych komórek Pax7-dodatnich.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że szum pochodzący z autofluorescencji i niespecyficzne wiązanie immunologiczne myszy z myszą nie mogą być całkowicie wyeliminowane, ale dzięki temu protokołowi szum można znacznie zmniejszyć. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak identyfikować komórki satelitarne w kriosekcjach mięśni.

identification-skeletal-muscle-satellite-cells-immunofluorescence

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Izolacja i hodowla czystej populacji spokojnych komórek satelitarnych, populacji komórek macierzystych mięśni, jest niezbędna do zrozumienia biologii i regeneracji komórek macierzystych mięśni, a także przeszczepu komórek macierzystych do terapii dystrofii mięśniowej i innych chorób zwyrodnieniowych.

Izolacja, hodowla i przeszczep satelitarnych komórek mięśniowych

Systemy hodowli in vitro okazały się niezbędne dla naszego zrozumienia miogenezy kręgowców. Jednak wiele pozostaje do nauczenia się na temat rozwoju i wzrostu mięśni szkieletowych innych niż ssaki, szczególnie w taksonach podstawowych. Skuteczny i solidny protokół izolowania dorosłych komórek macierzystych tej tkanki, miogennych komórek prekursorowych (MPC) i utrzymywania ich samoodnawiania, proliferacji i różnicowania w warunkach hodowli pierwotnej, pozwala na identyfikację konserwatywnych i...

Przygotowanie pierwotnych miogennych kultur komórek prekursorowych/mioblastów z bazalnych linii kręgowców

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Ten protokół opisuje izolację komórek satelitarnych z mięśni głowy skrzelowych 9-tygodniowego szczura. Mięśnie wywodzą się z różnych łuków skrzelowych. Następnie komórki satelitarne są hodowane na punktowej powłoce o rozmiarach milimetra w celu zbadania ich różnicowania. Takie podejście pozwala uniknąć rozszerzania się i przechodzenia komórek satelitarnych.

Izolacja i charakterystyka komórek satelitarnych z mięśni skrzelowych głowy szczura

Aktywna autofagia jest związana z produktywną regeneracją mięśni, która jest niezbędna do aktywacji komórek macierzystych mięśni (MuSC). W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania in situ LC3, markera autofagii w MyoD-dodatnich MuSC skrawków tkanki mięśniowej od myszy kontrolnych i rannych.

In Situ Barwienie immunofluorescencyjne autofagii w komórkach macierzystych mięśni

Opisujemy metodę in vivo do badania funkcjonalnej utraty określonego genu w komórkach satelitarnych za pomocą kombinacji uszkodzenia mięśni szkieletowych za pośrednictwem kardiotoksyny i wstrzyknięcia samodostarczającego siRNA.

Analiza funkcji komórek satelitarnych podczas regeneracji mięśni szkieletowych przez uszkodzenie kardiotoksyny i wstrzyknięcie samodostarczającego siRNA in vivo

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

W tym protokole opisana jest metoda hodowli in vitro i analizy funkcjonalnej komórek macierzystych mięśni, która zachowuje większość ich interakcji z ich endogenną niszą.

Test pojedynczej hodowli włókien mięśniowych do oceny funkcjonalności dorosłych komórek macierzystych mięśni ex vivo

Mięśnie szkieletowe składają się z wielu typów komórek, w tym rezydentnych komórek macierzystych, z których każda ma szczególny wkład w homeostazę i regenerację mięśni. W tym miejscu opisano hodowlę 2D komórek macierzystych mięśni i niszy komórek mięśniowych w warunkach ex vivo, które zachowują wiele cech fizjologicznych, in vivo i środowiskowych.

Niefrakcjonowana masowa hodowla mięśni szkieletowych myszy w celu podsumowania spoczynku niszy i komórek macierzystych

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Poznaj metodę immunofluorescencji do identyfikacji komórek satelitarnych mięśni szkieletowych z wykorzystaniem przeciwciał Pax7 i Laminin. Technika ta umożliwia badanie komórek macierzystych mięśni w ich naturalnym środowisku fizjologicznym z minimalną manipulacją.

Identyfikacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych za pomocą immunofluorescencji z przeciwciałami Pax7 i Laminin

Przeglądaj więcej filmów