Name: Przedkliniczna konfokalna endomikroskopia laserowo-skaningowa (pCLE) in vivo sprzężona z włóknami światłowodowymi naczyń włosowatych hipokampa u obudzonych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Poznaj metodę pCLE do obrazowania mikrokrążenia w hipokampie myszy. Technika umożliwia jednoczesne rejestracje obrazowania i elektrofizjologiczne w strukturach nerwowych u zwierząt przebudzonych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Projekt został sfinansowany z Nagrody Inicjatywy Badawczej od Amerykańskiego Towarzystwa Epilepsji oraz nagrody od Komisji Badań Biomedycznych Arizony dla S.L.M., a także grantu na wyzwanie od Research to Prevent Blindness Inc. dla Wydziału Okulistyki na SUNY Downstate Health Sciences University, New York State Empire Innovation Program, oraz dalsze granty z National Science Foundation (0726113, 0852636, & 1523614), Barrow Neurological Foundation, Mrs. Marian Rochelle, Mrs. Grace Welton i Dignity Health SEED awards, oraz przez granty federalne z National Science Foundation (0726113, 0852636, & 1523614) oraz przez National Institute of Health (Awards R01EY031971 AND R01CA258021), dla S.L.M i S.M.C. <span lang="EN-US" style="font-size: 12pt; line-height: 107%; font-family: Calibri, sans-serif; color: rgb(34, 34, 34); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">Ta praca była również wspierana przez Biuro Asystenta Sekretarza Obrony ds. Zdrowia w ramach nagrody nr W81XWH-15-1-0138, dla S.L.M.. <span lang="PL-US" style="font-size: 12pt; line-height: 107%; font-family: Calibri, sans-serif; kolor: czerwony; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;"> <span lang="EN-US" style="font-size: 12pt; wysokość linii: 107%; rodzina czcionek: Calibri, bezszeryfowa; Kolor: RGB(34, 34, 34); obraz tła: inicjalny; pozycja-tła: początkowa; rozmiar tła: początkowy; background-repeat: początkowe; tło-przywiązanie: inicjał; background-origin: początkowe; klip tła: początkowy;" >L.-C. był wspierany przez stypendium José Castillejo z hiszpańskiego Ministerstwa Edukacji. Dziękujemy O. Caballero i M. Ledo za ich porady i pomoc techniczną.

Protokół jest zgodny z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Instytutu Neurologicznego Barrow.
1. Stereotaktyczne pozycjonowanie do kraniotomii
<ol>
	<li>Zważyć, a następnie znieczulić mysz koktajlem ketaminowo-ksylazynowym (100 mg/kg–10 mg/kg i.p.). Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone, obserwując jego brak reakcji na szczypanie ogona i/lub palca.</li>
	<li>Umieść poduszkę grzewczą pod myszą i użyj termometru doodbytniczego, aby stale monitorować temperaturę ciała podczas początkowej operacji implantacji w znieczuleniu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A).</li>
	<li>Zastosuj maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu.</li>
	<li>Ustabilizuj głowę zwierzęcia w stereotaktycznej ramie dla gryzonia, wyposażonej w adapter myszy. Aby prawidłowo ustawić mysz w ramce stereotaktycznej, umieść zęby zwierzęcia w otworze drążka do gryzienia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A i <silna klasa="xfig">Rysunek 3A, pozycja g). Dokręć zacisk nosowy, aż będzie dobrze dopasowany (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2A, B i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 3A, pozycja h). Ułożenie ciała myszy powinno być tak proste, jak to tylko możliwe (jak w Rysunek 2A).
	<ol>
		<li>Następnie zabezpiecz głowę zwierzęcia za pomocą mysich nauszników z mankietami do mocowania szczęk (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A i <silna klasa="xfig">Ryc. 3A, poz. i), aby mocno zacisnąć wyrostki jarzmowe czaszki. 
		UWAGA: Po zabezpieczeniu główka myszy nie powinna mieć zakresu ruchów poziomych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy mysz jest już dostosowana do ramki stereotaktycznej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B, pozycja j), oczyść i wysterylizuj skórę głowy, przecierając ją peelingiem chlor-heksydynowym 2-3 razy, za każdym razem, a następnie spłukując ją alkoholem. Następnie nałóż miejscowo lidokainę na czubek głowy.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej od tyłu do przodu (rozpocznij nacięcie u podstawy czaszki i zakończ je między oczami; 12-15 mm) wzdłuż strzałkowej linii środkowej czaszki, używając cienkich nożyczek lub ostrza. Cofnij granice skóry głowy za pomocą czterech 28-milimetrowych zacisków serrefine bulldog, aby odsłonić czaszkę i zmaksymalizować obszar roboczy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 3C).</li>
	<li>Użyj skalpela lub mikroszpatułki (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C), aby zeskrobać okostną do krawędzi nacięcia. Użyj nożyczek lub kleszczy oddzielających tkanki (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C), aby ostrożnie cofnąć mięśnie z tyłu szyi (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Osusz górną część czaszki aplikatorem z bawełnianą końcówką, zwilżonym alkoholem lub 30% nadtlenkiem wodoru, aby zoptymalizować wizualizację szwów czaszkowych. Nałóż sól fizjologiczną na czaszkę po usunięciu tkanki łącznej.</li>
	<li>Gdy głowa myszy ustabilizuje się w aparacie stereotaktycznym, umieść końcówkę igły strzykawki (21 G) w uchwycie elektrody (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B, pozycja l) i przymocuj uchwyt elektrody do stereotaktycznego mikromanipulatora, obniżając końcówkę igły do poziomu czaszki (<silna klasa = "xfig"> Rysunek 2D).</li>
	<li>Dostosuj przyśrodkowo-boczny kierunek czaszki, mierząc wysokość czaszki w dowolnej odległości za bregma (tj. -2,0 mm) i w dwóch równych odległościach bocznych od linii środkowej po obu stronach czaszki (tj. ± 1,5 mm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). Staraj się, aby różnica wysokości w różnych miejscach była mniejsza niż 0,05 mm w kierunku grzbietowo-brzusznym.
	<ol>
		<li>Jeśli jest większy niż 0,05 mm, obróć czaszkę myszy za pomocą paska gryzącego lub zmień położenie głowy myszy, ostrożnie poluzowując nauszniki, przesuwając w razie potrzeby bocznie głowę i nauszniki, a następnie ponownie dokręcając nauszniki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po umieszczeniu czaszki w urządzeniu stereotaktycznym określ i zapisz współrzędne stereotaktyczne szwów czaszki bregma i lambda wzdłuż osi przednio-tylnej (AP), przyśrodkowej bocznej (ML) i grzbietowo-brzusznej (DV).</li>
	<li>Zidentyfikuj punkt docelowy (prawy hipokamp) za pomocą atlasu stereotaktycznego. Następnie znajdź na czaszce współrzędne punktu docelowego względem bregmy (AP: -2,7 mm, ML: -2,7 mm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Za pomocą markera chirurgicznego zaznacz cztery rogi okienka obrazowania o wymiarach 1,4 mm x 2 mm na czaszce kropkami, wyśrodkowanymi wokół punktu docelowego bezpośrednio nad hipokampem (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2F), aby następnie kraniotomię.</li>
	<li>Użyj markera chirurgicznego, aby narysować dwie dodatkowe kropki: jedną nad lewą górną kością ciemieniową (Rysunek 2G), a drugą nad prawą kością czołową (Rysunek 2H), aby wskazać przyszłe umiejscowienie dwóch kostnych (Rysunek 3A, pozycja b), które zakotwiczą nasadkę głowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B, pozycja m) do czaszki.</li>
	<li>Użyj markera chirurgicznego, aby narysować trzy dodatkowe kropki wskazujące, gdzie zostaną wprowadzone elektrody rejestrujące zewnątrzoponowe EEG: jedna kropka umieszczona 1 mm po obu stronach linii środkowej i jedna dodatkowa kropka na linii środkowej umieszczona 1 mm za Lambdą (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E, <silna klasa="xfig">Rysunek 4A i <silna klasa="xfig">Rysunek 5B).</li>
</ol>
2. Instalacja głowicy
<ol>
	<li>Używając zadziorów o średnicy 0,7 mm (<klasa silna="xfig">Rysunek 3C), ostrożnie wywierć dwa małe otwory w czaszce, w miejscach kropki wskazujących położenie kostnych (patrz krok 1.15 powyżej). Następnie weź dwie kostne (ze stali nierdzewnej z rowkiem, długość: 4 mm; średnica: 0,85 mm) uprzednio zdezynfekowane etanolem 70-80% i przykręć je do czaszki dla dodatkowej stabilności główki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2I-J i <silna klasa="xfig">Rysunek 3A, pozycja b).
	<ol>
		<li>Upewnij się, że końcówki nie wystają poza dno kości do jamy czaszki, ryzykując uszkodzenie mózgu. Zauważ, że jedna z dwóch kostnych będzie znajdować się przed dwiema z walcowym, a druga z tyłu od nich (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G-J).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spryskaj czaszkę solą fizjologiczną, aby ją schłodzić i wyczyścić. Następnie całkowicie osusz czaszkę i nałóż cienką warstwę cyjanoakrylanu wokół.</li>
	<li>Użyj niestandardowego elementu wyrównującego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A, pozycja c) przymocowanego do mikronapędu zamontowanego na urządzeniu stereotaktycznym (<silna klasa="xfig">Rysunek 2F-J i <silna klasa="xfig">Rysunek 3A, pozycja d), tak aby pozycja nasadki była wyrównana wzdłuż linii środkowej, z przednim grzbietem nad leżącą bregmą. Ten niestandardowy element ze stali nierdzewnej ma kształt litery L (nachylony pod kątem 90 °), z dwoma otworami oddalonymi od siebie o 4 mm (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2F-J i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 3A, pozycja c).
	<ol>
		<li>Użyj manipulatora stereotaktycznego, aby ustawić element wyrównujący w kształcie litery L, z dołączonymi dwiema wkręcającymi z walcowym (M1.6 x 0.35 metryczne grube, 12 mm długości; <silna klasa="xfig">Rysunek 3A, pozycja a) nad bregmą, aż podstawa płasko przylega do czaszki, uważając, aby nie wywierać nacisku na czaszkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 2I-J).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nałóż cyjanoakrylan, a następnie cement dentystyczny, aby przymocować podstawę do czaszki. Uważaj, aby nie zasłaniać znaczników odniesienia okna obrazowania nad hipokampem (<silna klasa="xfig">Rysunek 2K).</li>
</ol>
3. Obrazowanie operacji kraniotomii okiennej
<ol>
	<li>W każdym z położeń znaczników odniesienia kraniotomii, które wskazują rogi okienka obrazowania (patrz krok 1.14 powyżej), wywierć otwór w kształcie zadziorów o średnicy 0,7 mm, a następnie delikatnie narysuj wiertłem obwód okienka kraniotomii 1,4 mm x 2 mm, z iteracyjnie głębszymi cięciami (<silna klasa="xfig">Rysunek 2L).</li>
	<li>Uważaj, aby nie wiercić zbyt głęboko lub ze zbyt dużą siłą w czaszce, która jest cienka i delikatna, o grubości około 300 μm. Gdy płat kostny jest gotowy, podważ luźny płatek czubkiem skalpela, uważając, aby nie uszkodzić leżącej pod spodem opony twardej.</li>
	<li>Zakryj otwarte okno woskiem kostnym (<silna klasa="xfig">Rysunek 2M).</li>
	<li>Używając zadziorów o średnicy 0,9 mm, wywierć trzy otwory do przyszłego umieszczenia elektrod zewnątrzoponowych EEG (patrz krok 1.15 powyżej), uważając, aby nie przeciąć opony twardej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E,L).</li>
	<li>Przykryj trzy otwory woskiem kostnym.</li>
	<li>Delikatnie nałóż cyjanoakrylan wokół krawędzi okienka obrazowego pokrytego woskiem kostnym i otworów EEG, uważając, aby nie uszczelnić kraniotomii (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2L).</li>
	<li>Zbuduj ścianę z cementu dentystycznego, która obejmuje okienko obrazowania i otwory EEG i wiąże je z wcześniej zacementowaną nasadką głowy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2M i <silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B, pozycja m).</li>
	<li>Pozostaw cement do wyschnięcia na co najmniej 10 minut.</li>
	<li>Zamknij luźne brzegi rany prostymi, przerywanymi szwami, używając czarnego plecionego jedwabiu 4-0 lub 5-0 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2N i <silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C).</li>
</ol>
4. Po operacji
<ol>
	<li>Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby nałożyć maść z lidokainą na odsłoniętą skórę, aby zagłuszyć uczucie wokół krawędzi rany.</li>
	<li>Użyj sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby nałożyć Neosporin na odsłoniętą skórę.</li>
	<li>Usuń zwierzę z ramki stereotaktycznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2N).</li>
	<li>Wstrzyknąć ketoprofen (5 mg/kg) IP lub domięśniowo w celu znieczulenia pooperacyjnego.</li>
	<li>Obserwuj zwierzę, aż stanie się czujne i będzie się poruszać (zwykle nastąpi to w ciągu kilku minut).</li>
	<li>Umieścić zwierzę w ciepłej klatce i kontynuować monitorowanie jego powrotu do zdrowia, aż do momentu, gdy wypije lub zje i będzie gotowe do przeniesienia do pomieszczenia dla zwierząt.</li>
	<li>Sprawdzaj stan zwierzęcia co najmniej raz dziennie przez około tydzień po operacji, obserwując, czy nie ma żadnych oznak apatycznego zachowania i/lub nieodpowiedniego jedzenia/picia (<silna klasa="xfig">Ryc. 2O).</li>
</ol>
5. Wstrzykiwanie barwnika i zapis EEG
<ol>
	<li>Odczekaj co najmniej jeden dzień po operacji wszczepienia nasadki na głowę, aby rozpocząć nagrywanie.</li>
	<li>Umieść mysz w urządzeniu ograniczającym piankę, uformowanym do jej ciała, w ramie stereotaktycznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B, pozycje n i j).</li>
	<li>Przymocuj nasadkę głowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B-I, pozycja m) do niestandardowego pręta montażowego, który jest przymocowany do ramy stereotaktycznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A,B, pozycje e i j, oraz <silna klasa="xfig">Rysunek 4A). Długi fragment elementu e (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A,B) powinien mieć długość pomiędzy 9.4 – 13 mm. Przymocuj element f (płyta montażowa o wymiarach 1,5 cm x 0,5 cm, z dwoma otworami oddalonymi od siebie o 4 mm od środka do środka) do elementu e (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A,B, pozycje e, f i k). Ten system wyrównywania bezpiecznie ustawi obudzoną mysz w ramce stereotaktycznej podczas sesji obrazowania (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4).</li>
	<li>Włóż zewnątrzoponowe elektrody rejestrujące EEG (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5A), umieszczając elektrody uziemiające (białe przewody) w tylnym centralnym otworze, a elektrody rejestrujące (czerwone przewody) w przednim lewym i prawym otworze (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2E, <silna klasa = "xfig">Rysunek 4E i <silna klasa = "xfig">Rysunek 5E). Umieść każdy z przewodów w kształcie litery L między czaszką a oponą twardą (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5C), aby zoptymalizować kontakt elektryczny.</li>
	<li>Wstrzyknąć do żyły ogonowej zielony dekstran utrwalany lizyną fluoresceinową (0,2 ml / 25 g masy ciała fluoresceiny 5% w/w), aby uwidocznić przepływ krwi w hipokampie.
	<ol>
		<li>Aby zwiększyć rozszerzenie żyły centralnej ogona myszy przed wstrzyknięciem, należy zastosować jedną lub więcej z następujących strategii: a) Nałóż 70% etanolu na żyłę centralną za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką; b) Zanurz ogon w ciepłej wodzie (35-40 °C) na 1-3 minuty; c) Wystaw ogon na działanie lampy grzewczej na kilka minut.</li>
		<li>Zabezpiecz ogon myszy dwoma palcami i zlokalizuj żyłę centralną, która leży bezpośrednio pod skórą. Włóż igłę (ultracienką strzykawkę insulinową ze zintegrowaną igłą 30G), skosem do góry, do żyły, mniej więcej w połowie do dwóch trzecich od podstawy ogona. Podczas wstrzyknięcia należy trzymać igłę równolegle do ogona.</li>
		<li>Barwnik wstrzykiwać powoli i równomiernie, uważając, aby uniknąć jakichkolwiek zmian w położeniu igły lub ogonka. 
		UWAGA: Po naciśnięciu tłoka strzykawki nie powinno być oporu.</li>
		<li>Po zakończeniu iniekcji należy wyjąć igłę i delikatnie uciskać miejsce nakłucia, aby uszczelnić naczynie.</li>
		<li>Pozwól na wystąpienie krzepnięcia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Przedkliniczna konfokalna endomikroskopia skaningowa (pCLE) in vivo sprzężona z wiązkami światłowodów
<ol>
	<li>Bezpośrednio po wstrzyknięciu żyły ogonowej (krok 5.5.3 powyżej) zacisnąć ściętą wiązkę światłowodową o ukosie 300 μm (zawierającą 5000–7000 włókien 3 μm w każdej wiązce) w orientacji skierowanej w dół do ruchomego ramienia zrobotyzowanego napędu stereotaktycznego.</li>
	<li>Usuń wosk kostny z kraniotomii.</li>
	<li>Usunąć oponę twardą za pomocą zgiętej końcówki igły strzykawki.</li>
	<li>Korzystając z zrobotyzowanego systemu pozycjonowania, najpierw przesuń obiektyw światłowodowy do odpowiedniej lokalizacji stereotaktycznej przednio-tylnej i lewo-prawej, z końcówką wyzerowaną w osi z na powierzchni kory.</li>
	<li>Zainicjuj zapis EEG (<silna klasa="xfig">Rysunek 5D).</li>
	<li>Rozpocznij konfokalne skanowanie laserowe tylnej płaszczyzny światłowodowego obiektywu, a następnie bezpośrednio powoli schodząc w dół obiektywu w osi z za pomocą elementów sterujących z mikronapędu robota, aż osiągnie docelową głębokość w mózgu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4C). Przeglądaj wyniki obrazowania w oprogramowaniu mikroskopowym podczas schodzenia.
	<ol>
		<li>Jeśli końcówka światłowodu znajduje się w docelowym obszarze zapisu X-Y-Z, a dwa lub więcej naczyń wejdzie w pole widzenia okna obrazowania, zatrzymaj opadanie i rozpocznij nagrywanie wideo. Uzyskaj na żywo filmy poklatkowe całego pola przepływu krwi przy 11,7 Hz za pomocą oprogramowania do obrazowania Cellvizio Lab. (Wyższe prędkości można uzyskać przy mniejszym polu widzenia). Nagrania mogą trwać jednorazowo 4-5 godzin, w razie potrzeby w kolejnych dniach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając strzykawki o pojemności 10 ml ze ściętymi silikonowymi rurkami przymocowanymi do końcówki igły, nakarm zwierzę podczas nagrań, okresowo podając pastę wykonaną z mysich granulek zmielonych wodą.</li>
	<li>Pod koniec sesji obrazowania zakończ nagrywanie.</li>
	<li>Delikatnie wyjmij przewody EEG i wyczyść je za pomocą Tergazyme.</li>
	<li>Powoli usuń wiązkę światłowodu z mózgu zwierzęcia, odwracając włókno wzdłuż osi z wejścia.</li>
	<li>Uwolnić zwierzę z zagłówka i pasów przytrzymujących.</li>
	<li>W razie potrzeby postępuj zgodnie z niezbędnymi protokołami eutanazji i przetwarzania tkanek w celu wizualizacji naczyń krwionośnych i przeprowadzenia immunohistochemii.</li>
	<li>Jeśli planujesz nagrywać z tego samego zwierzęcia w przyszłej sesji, zakryj okienko obrazowania woskiem kostnym lub silasticem.</li>
</ol>

<ol><li>Denk, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+functional+imaging+of+neurons+using+2-photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).</li>
<li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniature+head-mounted+two-photon+microscope.+High-resolution+brain+imaging+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals.</a> Neuron. 31, 903(2001).</li>
<li>Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+capillary+blood+flow+in+olfactory+bulb+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).</li>
<li>Larson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-soluble+quantum+dots+for+multiphoton+fluorescence+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo.</a> Science. 300, 1434-1436 (2003).</li>
<li>Hirase, H., Creso, J., Singleton, M., Bartho, P., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+brain+pericytes+in+vivo+using+dextran-conjugated+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes.</a> Glia. 46, 95-100 (2004).</li>
<li>Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+level+imaging+of+local+cerebral+blood+flow+in+bicuculline-induced+epileptic+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci.</a> Neuroscience. 128, 209-216 (2004).</li>
<li>Schaffer, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+cortical+surface+microvessels+reveals+a+robust+redistribution+in+blood+flow+after+vascular+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion.</a> PLoS Biology. 4, 22(2006).</li>
<li>Leal-Campanario, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+Capillary+Vasodynamics+Contribute+to+Ictal+Neurodegeneration+in+Epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Abnormal Capillary Vasodynamics Contribute to Ictal Neurodegeneration in Epilepsy.</a> Scientific Reports. 7, 43276(2017).</li>
<li>Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+control+of+CNS+capillary+diameter+by+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes.</a> Nature. 443, 700-704 (2006).</li>
<li>Yemisci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+contraction+induced+by+oxidative-nitrative+stress+impairs+capillary+reflow+despite+successful+opening+of+an+occluded+cerebral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery.</a> Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).</li>
<li>Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+in+capillaries+are+contractile+in+vivo%2C+but+arterioles+mediate+functional+hyperemia+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).</li>
<li>Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S. Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeal-Campanario%2C+R+%22Neurostereology%3A+Unbiased+Stereology+of+Neural+Systems%22">Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems</a>. Mouton, P. R. , John Wiley & Sons, Inc. Ames, USA. (2013).</li>
<li>Smart, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+the+K%28V%291.1+potassium+channel+causes+epilepsy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice.</a> Neuron. 20, 809-819 (1998).</li>
<li>Zuberi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+the+human+voltage-gated+potassium+channel+gene+%28Kv1.1%29+associates+with+episodic+ataxia+type+1+and+sometimes+with+partial+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy.</a> Brain. 122, 817-825 (1999).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Opracowaliśmy system utrzymywania nasadki głowy do jednoczesnych eksperymentów elektrofizjologicznych i światłowodowych pCLE na obudzonych myszach, zmniejszając potencjalne zanieczyszczenie odpowiedzi spowodowane lekami znieczulającymi. Nasadka na głowę i aparatura montażowa są proste w konstrukcji i nadają się do wielokrotnego użytku do eksperymentów obrazowych z przewlekłym czuwaniem. Sprawdziliśmy jakość nagrań w odniesieniu do złotego standardu mikroskopowego obrazowania przepływu krwi in vivo, TPLSM.
<p class="j...

W przeciwieństwie do innych metod obrazowania mikroskopowego1,2,3,4,5,6,7,8, mikroskopia konfokalna oparta na światłowodach in vivo umożliwia pomiar dynamiki przepływu krwi w dowolnym obszarze mózgu, na dowolnej głębokości, z dużą prędkością (do 240 Hz w zależności od wielkości pola widzenia<klasa sup="xref">9). Sonda światłowodowa umożliwia konfokalne obrazowanie skaningowe in vivo z rozdzielczością 3 μm, ponieważ końcówka sondy (obiektyw bezsoczewkowy składający się z wiązki pojedynczych włókien o średnicy 5000-6000 3 μm) może być pozycjonowana z dokładnością mikroelektrody, w odległości 15 μm od interesującego nas obiektu fluorescencyjnego. Podobnie jak w przypadku obrazowania dwufotonowego in vivo, fluorofory muszą być wcześniej wprowadzone do celu obrazowania. Na przykład dekstran fluoresceinowy (lub kropki kwantowe) może być wstrzykiwany do układu krwionośnego lub genetycznie kodowane białka fluorescencyjne mogą być transfekowane do komórek, lub barwniki fluorescencyjne, takie jak Oregon Green BAPTA-1, mogą być masowo ładowane do komórek przed obrazowaniem.
Ostatnie badania wykorzystujące te techniki wykazały, że aktywność motoryczna komórek ściennych prowadzi do skurczów naczyń włosowatych w nagłym naczyniu — nagłych zwężeń, które występują w miejscu komórek ściennych podczas napadów9—może przyczyniać się do neurodegeneracji w hipokampie ictal9. Podczas gdy poprzednie badania obrazowe wykazały zwężenia perycytów in vitro i in vivo związane z aplikacjami leków6,7,10,11,12, Leal-Campanario i in. znaleźli pierwsze dowody na spontaniczne zwężenia naczyń włosowatych in vivo w mózgu myszy. Aby ustalić związek z padaczką skroniową u ludzi, przebadali męskie (P30-40 stary) myszy z nokautem (KO) Kv1.1 (kcna1-null) myszy14,15 (JAX stock #003532), genetyczny model ludzkiej epizodycznej ataksji typu 115. Perycyty napędzały zarówno patologiczne, jak i fizjologiczne zwężenia naczyń w hipokampie9 u spontanicznie chorych na padaczkę zwierząt i ich rodzeństwa z miotu typu dzikiego (WT). Obserwacje te powtórzono u zwierząt z padaczką po podaniu kwasu kainowego, co wskazuje na ich uogólnienie na inne formy padaczki. Leal-Campanario i wsp. ustalili ponadto, korzystając z nowatorskich podejść mikroskopii stereologicznej, że apoptotyczne – ale nie zdrowe – neurony u zwierząt padaczkowych były przestrzennie sprzężone z mikrokrążeniem hipokampa. Ponieważ ekscytotoksyczność nie ma znanego związku przestrzennego z układem naczyniowym, wynik ten wskazuje, że nieprawidłowe niedotlenienie wywołane niedokrwieniem naczyń włosowatych przyczynia się do neurodegeneracji w padaczce. Rysunek 1 pokazuje schemat ogólnej konfiguracji.

<table><tbody><tr><td>Frez o średnicy 0,7 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-07</td><td>Do nr 19010-00</td></tr><tr><td>Frez o średnicy 0,9 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-09</td><td></td></tr><tr><td>ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS</td><td>z rozwiązania rękojeści</td><td>AEU12C</td><td></td></tr><tr><td>Bull dog serrifine clump</td><td>Fine Science Tools</td><td>18050-28</td><td></td></tr><tr><td>CellVizio dwuzakresowa</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellVizio jednopasmowa</td> Mikrosonda konfokalna <td>Mauna Kea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mikronów (Serie S)</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wykonany na zamówienie element wyrównujący</td><td>w kształcie litery L (nachylony pod kątem 90 stopni) i wykonany ze stali nierdzewnej z wywierconymi w nim dwoma otworami, z odstępem 4 mm od środka do środka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pręt</td> <td>montażowy na zamówienieDługi przekrój listwy montażowej powinien wynosić od 9,4 do 13 mm. Przymocowana do tego elementu pręta montażowego, umieść płytę ze stali nierdzewnej o długości 1.5 cm i szerokości 0.5 cm, która ma wywiercone dwa otwory oddalone od siebie o 4 mm od środka do środka, w tej samej odległości, co element wyrównujący w kształcie litery L.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy-Super Glue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Żywica DuraLay Inlay &ndash; Pakiet standardowy</td><td>: Reliance Dental Mfg Co.</td><td>602-7395 (od patterson dental)</td><td></td></tr><tr><td>walcowy, napęd szczelinowy, M1,6x0,35 metryczny zgrubny, 12mm długość pod, śruba maszynowa</td><td>MSC industrial direct co.</td><td></td><td></td>2834117</tr><tr><td>Nożyczki Fine</td><td>Point Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina 5% w/w dekstran utrwalany lizyną (2MD)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>D7137</td><td></td></tr><tr><td>Gładki uchwyt na igły Halsey</td><td>Fine Science Tools</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Igła do szwów Kalt 3/8 zakrzywiona</td><td>Fine Science Tools</td><td>12050-03</td><td></td></tr><tr><td>standard laboratoryjny stereotaktyczny, szczur i mysz</td><td>Stoelting Co. 51704</td><td>51670</td><td></td></tr><tr><td>Methocel 2%</td><td>Omnivision GmbH</td><td>PZN: 04682367</td><td>Maść do oczu zapobiegająca wysuszeniu.</td></tr><tr><td>Mysz Regulator temperatury, sonda (YSI-451), mała podkładka grzewcza-TC-1000 Mysz</td><td>CWE Inc.</td><td>08-13000</td><td></td></tr><tr><td>Nadajniki PhysioTel F20-EET</td><td>DSI</td><td>270-0124-001</td><td></td></tr><tr><td>Robot stereotaktyczny, ramię manipulatora, ADD-ON, 3 osie, LEWE</td><td>Stoelting Co.C13</td><td>51704</td><td></td></tr><tr><td>Wkręty do kości do gwintowania</td><td>Fine Science Tools</td><td>19010-10</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe nauszniki i gumowe końcówki do myszy Stereotaxic</td><td>Stoelting Co</td><td>51648</td><td></td></tr><tr><td>Szew Nici - Plecione Jedwab/Rozmiar 4/0</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>Mikroszpatułka do separacji tkanek</td><td>Fine Science Tools</td><td>10091-121</td><td></td></tr></tbody></table>

przedkliniczna konfokalna endomikroskopia laserowo-skaningowa (pcle) in vivo sprzężona z włóknami światłowodowymi naczyń włosowatych hipokampa u obudzonych myszy

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE) of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

Celem tego protokołu jest opisanie przedklinicznej konfokalnej laserowo-skaningowej endomikroskopii (pCLE) sprzężonej z wiązką światłowodową w jej specyficznym zastosowaniu do wyjaśnienia efektów przepływu krwi w naczyniach włosowatych podczas napadów, napędzanych przez komórki ścienne. Obrazowanie kory mózgowej in vitro i in vivo wykazało, że zwężenia naczyń włosowatych wywołane przez perycyty mogą wynikać z funkcjonalnej lokalnej aktywności neuronalnej, a także z zastosowania leków u zdrowych zwierząt. W tym miejscu przedstawiono protokół dotyczący wykorzystania pCLE do określenia roli dynamiki mikrokrążenia w zwyrodnieniu neuronalnym w padaczce, na dowolnej głębokości tkanki (szczególnie w hipokampie). Opisujemy technikę przytrzymywania głowy, która została przystosowana do rejestrowania pCLE u przytomnych zwierząt, aby przeciwdziałać potencjalnym skutkom ubocznym środków znieczulających na aktywność neuronalną. Dzięki tym metodom zapisy elektrofizjologiczne i obrazowe mogą być prowadzone przez kilka godzin w głębokich strukturach nerwowych mózgu.

Zaprojektowaliśmy te metody, aby ocenić, czy powodowane przez perycyty skurcze naczyń włosowatych w hipokampie – występujące jako skutek napadów padaczkowych – mogą prowadzić do jawnej hipoksji przyczyniającej się do śmierci komórek w ognisku padaczkowym9,13.
Rozwój nakładki głowowej oraz jej prawidłowa instalacja zapewniły wysoką stabilność rejestracji, umożliwiając jednoczesne rejestrowanie EEG i przepływu krwi w głębokich obszarach ...

Podczas gdy obrazowanie wielofotonowe jest skuteczne tylko na ograniczonych głębokościach od powierzchni tkanki, możliwe jest osiągnięcie obrazowania o rozdzielczości 3 μm na dowolnej głębokości za pomocą pCLE. W tym miejscu przedstawiamy protokół do przeprowadzania obrazowania pCLE w celu pomiaru dynamiki mikronaczyniowej w hipokampie myszy ictal i dzikich myszy.

Przedkliniczna konfokalna endomikroskopia laserowo-skaningowa (pCLE) in vivo sprzężona z włóknami światłowodowymi naczyń włosowatych hipokampa u obudzonych myszy

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application ...

Niniejszy protokół pozwolił nam na wykorzystanie konfokalnego laserowego skaningowego endomikroskopu światłowodowego do jednoczesnego obrazowania i rejestracji elektrofizjologicznej in vivo przez kilka godzin z struktur neuronalnych na dowolnej głębokości mózgu u zwierzęcia przebudzonego lub w relatywnym znieczuleniu. Opracowaliśmy bezbolesną metodę unieruchomienia, która umożliwia obrazowanie głębokich struktur mózgu u przebudzonych zwierząt przy użyciu metod stosowanych wcześniej w rejestracjach elektrofizjologicznych. Metoda ta była wykorzystywana do badania funkcjonalnych nieprawidłowości naczyniowych w rodentyjnych modelach epilepsji oraz zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem.Jest to skuteczna technika oceny wpływu patologii przepływu krwi w wielu, jeśli nie w większości organów dotkniętych chorobami. Chociaż technika ta została opracowana do badania dynamiki przepływu krwi w mózgu w czasie rzeczywistym, wykorzystaliśmy ją do badania przepływu krwi w siatkówce in vivo. Nie ogranicza się ona jedynie do badań naczyniowych w tkance nerwowej.Procedurę zademonstruje Jose Maria Gonzalez Martin, wysoko wykwalifikowany technik z mojego laboratorium. Po potwierdzeniu braku re

in-vivo-fiber-coupled-pre-clinical-confocal-laser-scanning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Maruoka, H., et. al. Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. J. Vis. Exp. (2022) Ten film przedstawia procedurę mikroskopii dwufotonowej do obrazowania aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju u obudzonej myszy podczas stymulacji wzrokowej, podkreślając stany przejściowe wapnia i interakcje komórkowe.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u wybudzonej myszy

Źródło: Ulivi, A. F., et. al. Podłużne dwufotonowe obrazowanie grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy. J. Vis. exp. (2019) Ten film pokazuje podłużne obrazowanie dwufotonowe znakowanych fluorescencyjnie neuronów piramidowych u żywej myszy,  prezentacja preparatu, wyrównania kaniuli oraz obrazowania dendrytów i kolców dendrytycznych w celu zbadania struktury neuronalnej w regionie CA1 hipokampa.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe znakowanych fluorescencyjnie neuronów w żywym hipokampie myszy 

Źródło: Kamei, R., et al., In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)Film przedstawia proces konfiguracji i obrazowania do mikroskopii dwufotonowej in vivo dynamiki mikrogleju w hipokampie CA1 (Cornu ammonis 1) i zakręcie zębatym, zapewniając optymalne wyrównanie optyczne i ocenę integralności strukturalnej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo dynamiki mikrogleju w hipokampie myszy

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Przezczaszkowe obrazowanie optyczne umożliwia szerokie obrazowanie transportu płynu mózgowo-rdzeniowego w korze mózgowej żywych myszy przez nienaruszoną czaszkę.

Obrazowanie in vivo transportu płynu mózgowo-rdzeniowego przez nienaruszoną czaszkę myszy za pomocą makroskopii fluorescencyjnej

Ten artykuł demonstruje przygotowanie specjalnego okna obrazowania uzupełnionego o kaniulę infuzyjną i jej implantację w regionie CA1 hipokampa u myszy.

Procedura kraniotomii do wizualizacji aktywności neuronalnej w hipokampie zachowujących się myszy

Przedstawiamy protokół użycia światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii (CLM) do nieinwazyjnego badania czasoprzestrzennego rozkładu liposomów w oku po wstrzyknięciu podspojówkowym.

Przestrzenno-czasowe obrazowanie in vivo ocznych systemów dostarczania leków za pomocą światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii

Ten artykuł opisuje metodę przewlekłej obserwacji in vivo spoczynkowego mikrogleju w mysim hipokampie CA1 przy użyciu precyzyjnie kontrolowanej chirurgii i mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Stosując całkowicie optyczne podejście, udar niedokrwienny jest indukowany, jednocześnie rejestrując aktywność neuronów Ca2+ za pomocą fluorescencyjnego biosensora w wyłaniającym się rdzeniu udaru czujnej, zachowującej się myszy.

Jednoczesna fotozakrzemia i fotometria włókien w celu wywołania i monitorowania udaru niedokrwiennego u zachowujących się myszy

Ten protokół dostarcza kompleksowego opisu metody jednoczesnego rejestrowania sygnałów wapniowych z neuronów i astrocytów w wielu obszarach mózgu związanych z pamięcią i demonstruje jej zastosowanie w paradygmacie zachowania uczenia się i pamięci.

Metoda fotometrii światłowodowej dwukolorowej do rejestracji aktywności astrocytów-neuronów w wielu regionach mózgu podczas nauki i zachowań pamięciowych

Poznaj metodę pCLE do obrazowania mikrokrążenia w hipokampie myszy. Technika umożliwia jednoczesne rejestracje obrazowania i elektrofizjologiczne w strukturach nerwowych u zwierząt przebudzonych.

Przedkliniczna konfokalna endomikroskopia laserowo-skaningowa (pCLE) in vivo sprzężona z włóknami światłowodowymi naczyń włosowatych hipokampa u obudzonych myszy (Wideo) | JoVE Journal

Przedkliniczna konfokalna endomikroskopia laserowo-skaningowa (pCLE) in vivo sprzężona z włóknami światłowodowymi naczyń włosowatych hipokampa u obudzonych myszy

Przeglądaj więcej filmów